MXPA99004331A - Vectores de expresion mejorados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a construcciones deácído recombinante aislado que incluyen un promotor bacterial doble enlazado de manera operativa a unácido heterólogo que codifica un polipéptido deseado. Las construcciones sonútiles para la expresión de los polipéptidos deseados en las células bacteriales en niveles altos.

Description

VECTORES DE EXPRESIÓN MEJORADOS Esta solicitud es una continuación parcial de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/029,545, presentada el 8 de Noviembre de 1996, que se incorpora a la presente por referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a vectores mejorados y protocolos de fermentación para la expresión de proteínas recombinantes en células bacteriales. La invención puede utilizarse para la expresión de cualquier proteína deseada, incluyendo enzimas útiles en la sintesis enzimática de los oligosacáridos. ANTECEDENTES DE AL INVENCIÓN La producción de polipéptidos y proteínas biológicamente activas es importante económicamente para la manufactura de fórmulas farmacéuticas humanas y animales, enzimas y otros químicos especializados. Las técnicas de ADN recombinante que utilizan células bacteriales, fúngales, mamíferas o de insectos como huéspedes de expresión son medios particularmente útiles para la producción de grandes cantidades de polipéptidos. La producción recombinante de proteínas deseadas por lo general implica la transfección de células huésped con un vector de expresión que contiene señales que, al enlazarse de manera operativa con un gene que codifique la proteína, controlan la expresión del gene. Las células se desarrollan bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína recombinante. Las señales de control de la expresión por lo general incluyen un promotor, que influencia la velocidad a la . cual se transcribe un gene localizado en sentido descendente del promotor dentro del ARN y determina el sitio de inicio de la transcripción. Las señales de control de la expresión se eligen de tal forma que sean funcionales en la célula huésped utilizada para la producción de la proteína deseada. Por ejemplo, la bacteria E. coli se utiliza comúnmente para producir proteínas recombinantes en producciones altas . Varias referencias presentan métodos para la utilización de E. coli y otras bacterias para producir proteínas de manera recombinante. ( consul tar, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,565785; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,673,641; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,738,921 Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,795,706; y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica No. 4,710,473) . Para las proteínas producidas de manera recombinante que están destinadas para el uso comercial, en particular, es conveniente obtener un nivel alto de expresión de la proteína deseada a partir de las células huésped. Al aumentar la cantidad de proteína deseada producida por célula se pueden reducir los costos de producción debido al volumen disminuido de células que deben desarrollarse para obtener una cantidad dada del producto, y también puede facilitar la purificación porque el producto deseado constituye un porcentaje mayor de la proteína total producida por las células huésped. Por lo tanto, existe la necesidad de señales de control de la expresión que sean capaces de expresar una proteína deseada a niveles altos. La presente invención cumple con ésta y otras necesidades. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona construcciones de ácido nucleico recombinante aislado que incluyen un promotor bacterial doble enlazado de manera operativa con un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido deseado. Las construcciones son útiles para expresar un polipéptido deseado en las células huésped bacteriales a altos niveles. Los promotores dobles incluyen un primer componente derivado de un promotor relacionado con tac y un segundo componente promotor obtenido a partir de un gene bacterial u operón que codifica una enzima o enzimas implicadas en el metabolismo de la galactosa. Puede utilizarse cierto número de promotores de galactosa como el segundo componente promotor; un promotor ejemplo es la UDPgalactosa-4-epimerasa (también conocido como UDPglucosa-4-epimerasa) promotor como el derivado del Streptococcus thermophilus . También la invención proporciona vectores de expresión que incluyen un promotor bacterial doble enlazado de manera operativa a un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido deseado. Los vectores de expresión pueden incluir además otros componentes como un marcador seleccionable. Las construcciones también pueden incluir un origen de una secuencia de duplicación que funciona en E. coli u otra célula huésped. Una construcción preferida de la invención el plásmido pTGK (descrito con detalle posteriormente) se depositó en la Recolección de Cultivos Tipo Americano bajo el Número de Acceso el 22 de Mayo de 1996. La invención también proporciona una célula bacterial que contiene un cartucho de expresión recombinante que incluye la unidad del promotor bacterial doble enlazado de manera operativa a un ácido nucleico heterólogo. El cartucho de expresión puede integrarse dentro del genoma de la célula huésped o estar presente en un plásmido de duplicación independiente. La célula bacterial preferida es E. coli . La invención además proporciona métodos para la elaboración de un polipéptido deseado. Los métodos incluyen el cultivo en células bacteriales de un medio adecuado que contienen un cartucho de expresión recombinante que posee una unidad del promotor bacterial doble enlazada de manera operativa a un ácido nucleico heterólogo bajo condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico heterólogo. Por lo general, E. coli se utiliza como la célula huésped. Los métodos y construcciones pueden utilizarse para expresar una amplia variedad de polipéptidos en las células bacteriales. Los polipéptidos de ejemplo incluyen hormonas, factores de crecimiento, y similares, así como enzimas útiles en las síntesis de los carbohidratos. Estas enzimas incluyen CMP-sintetasa de ácido siálico, UDP-pirofosforilasa de glucosa, quinasa de adenilato, quinasa de piruvato, aldolasa de ácido siálico, UDP-GlcNAc pirofosforilasa y mioquinasa, galactosiltransferasa, y N-acetil glucosaminiltransferasa. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS ILUSTRACIONES La Figura 1 es un mapa del plásmido pPH0X2. La Figura 2 muestra el espaciamiento entre el sitio de enlace del ribosoma (secuencia Shine-Dalgarno) y el codón de iniciación del gene recombinante en los vectores de la invención (ID SEC No: 2) . La Figura 3 es un mapa del plásmido pPHOX2/galE/Kan. La Figura 4 es un mapa del plásmido pTGK. Este pásmido es esencialmente el mismo que el pPHOX2/galE/Kan, con la excepción de que el sitio 5 'Xbal de la región del promotor y el sitio ífindlll en el gene de resistencia de la canamicina (kan1) han sido eliminados.

Las Figuras 5A y 5B muestran que se puede mantener un espaciado óptimo entre el sitio de enlace del ribosoma y el codón de iniciación del gene que será expresado en los vectores de la invención mediante la amplificación del ADN que será expresado utilizando como iniciadores los oligonucleótidos que comienzan con el codón de iniciación ATG. La Figura 5A muestra la relación entre le sitio de enlace del ribosoma (RBS) y el sitio de restricción Srfl en el plásmido pTGKS (ID SEC No: 3) . La digestión con Srfl deja un extremo romo al cual un gene recombinante de extremo romo que comience con el codón de iniciación ATG puede ligarse tal como se muestra en la Figura 5B (ID SEC No: 4) . La Figura 6 muestra la secuencia del nucleótido de una forma de realización de un promotor doble tac-gal de la invención, flanqueado por las secuencias pPHOX2 tal como se indica (ID SEC No:l). Las secuencias del concenso -35 y -10 de los promotores tanto tac como galE se muestran, tal como las ubicaciones de los sitios Xfoal y HindIII que son útiles para insertar un gene recombinante para la expresión. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece promotores y vectores mejorados para la expresión recombinante de polipéptidos deseados. Los promotores y vectores de la invención son particularmente adecuados para la expresión de proteínas recombinantes en huéspedes bacteriales, como por ejemplo E. coli . También se proporcionan protocolos de fermentación para obtener altos niveles de expresión de la proteína recombinante utilizando los promotores y vectores de la invención. Definiciones Gran parte de la nomenclatura y los procedimientos de laboratorio generales que se requieren en esta solicitud pueden encontrarse en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación Molecular: Un Manual De Laborarlo) (2a Edición), Volumen 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. El manual se referirá a partir de este momento como "Sambrook y colaboradores" . A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que es comprendido comúnmente por cualquier persona capacitada en la técnica a la cual pertenezca esta invención. Singleton y colaboradores (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, (Diccionario de Microbiología y Biología Molecular) , Segunda Edición, John Wiley and Sons (Nueva York) proporciona una técnica con un diccionario general de varios de los términos utilizados en esta invención. A pesar de que puede utilizarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente, en al práctica o la prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos serán descritos posteriormente. Para propósitos de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación. El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero de desoxiribonucleótido o ribonucleótido en forma ya sea de uno o dos filamentos, y a menos que se limite de alguna otra forma, incluye análogos conocidos de nucleótidos naturales que se hibridan en ácidos nucleicos de manera similar a los nucleótidos de ocurrencia natural. A menos que se indique otra cosa, una secuencia particular de ácido nucleico incluye la secuencia complementaria de la misma. El término "enlazado de manera operativa" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión del ácido nucleico (como por ejemplo un promotor, secuencia de señal o una disposición de los sitios de enlace del factor de transcripción) y una segunda secuencia del ácido nucleico, donde la secuencia del control de expresión afecta la transcripción y/o la traducción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia. El término "recombinante" cuando se utiliza con referencia a una célula, indica que la célula duplica un ácido nucleico heterólogo, o expresa un péptido o proteína codificada por medio de un ácido nucleico heterólogo. Las células recombinantes pueden expresar genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes también pueden expresar genes que se encuentran en la forma nativa de la célula, pero donde los genes se modifican y se vuelven a introducir dentro de la célula por medios artificiales. Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo", tal como se utiliza en la presente, es aquel que se origina de una fuente extraña (o especie) o, si proviene de la misma fuente, se modifica de su forma original. De esta forma, un ácido nucleico heterólogo enlazado de manera operativa a un promotor proviene de una fuente diferente a la fuente de dónde se derivó el promotor, o, si proviene de la misma fuente, está modificada de su forma original. Por ejemplo, un promotor del gene UDP glucosa 4-epimerasa puede enlazarse a un gene estructural codificando un polipéptido que no sea UDP glucosa 4-epimerasa nativa. La modificación de la secuencia heteróloga puede ocurrir, por ejemplo, tratando el ADN con una enzima de restricción para generar un fragmento de ADN que sea capaz de enlazarse de manera operativa al promotor. Las técnicas como por ejemplo la mutagénesis dirigida en el sitio también son útiles para modificar una secuencia heteróloga. Un "cartucho de expresión recombinante" o sencillamente un "cartucho de expresión" es una construcción del ácido nucleico, generada de manera recombinante o sintética, con elementos del ácido nucleico que son capaces de afectar la expresión de un gene estructural en huéspedes que son compatibles con estas secuencias. Los cartuchos, de expresión incluyen por lo menos promotores y opcionalmente, señales de terminación de la transcripción. Por lo general, el cartucho de expresión recombinante incluye un ácido nucleico que deberá ser transcrito (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado) y un promotor (por ejemplo, un promotor doble que contiene un componente del promotor tac y un componente del promotor gal) . También pueden utilizarse factores adicionales necesarios o útiles para llevar a cabo la expresión tal como se describe en la presente. Por ejemplo, un cartucho de expresión también puede incluir secuencias del nucléotido que codifican una secuencia de la señal que dirige la secreción de una proteína expresada a partir de la célula huésped. El término "aislado" se refiere al material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que por lo general acompañan al material tal como se encuentra en su estado -nativo. De esta manera, una proteína aislada, por ejemplo, no incluye materiales asociados normalmente con su ambiente in si tu . Por lo general, las proteínas aisladas de la invención son por lo menos aproximadamente 80% puras, por lo general por lo menos aproximadamente 90% y de preferencia por lo menos aproximadamente 95% puras conforme a la medición mediante intensidad de banda en un gel con tinte plata u otro método para determinar la pureza. En la presente invención los polipéptidos se purifican a partir de células transgénicas . La UDP glucosa 4-epimerasa (E. C.5.1.3.2) también se conoce como UDP galctosa-4-epimerasa y epimerasa de fosforibulosa. Estos términos se utilizan de manera intercambiable en la presente. Se dice que dos polinucleótidos o polipéptidos son "idénticos" si la secuencia de residuos del aminoácido o los nucleótidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima. La alineación óptima de la secuencias para comparación puede llevarse a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl . Math . (Matemáticas Aplicadas Avanzadas) 2:482 (1981) , mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol . Biol . (Boletín de Biología Molecular) 48:443 (1970), mediante la investigación para el método de similaridad de Pearson y Lipman Proc. Nati . Acad. Sci . (U. S.A . ) (Pocedimientos de la Academia Científica Nacional (E. U.A. ) 85:244 (1988), mediante las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software, de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl) , o mediante inspección.

El término "identidad sustancial" aplicado a los polipéptidos significa que un polipéptido incluye una secuencia que es por lo menos 80% idéntica, de preferencia 90%, de manera más preferente 95% más, a una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de aproximadamente 20 residuos a aproximadamente 600 residuos, por lo general aproximadamente 50 a aproximadamente 500 residuos, con frecuencia aproximadamente 250 a 300. Los valores de la identidad porcentual se determinan utilizando los programas anteriores. Los términos "identidad sustancial" o "identidad de la secuencia sustancial" tal como se aplica a las secuencias del ácido nucleico y tal como se utiliza en la presente denota una característica de una secuencia del polinucéotido, donde el polinucleótido incluye una secuencia que posee por lo menos 85 por ciento de identidad de la secuencia, de preferencia por lo menos 90 a 95 por ciento de la identidad de secuencia, y de manera más preferente por lo menos 99 por ciento de identidad de la secuencia en comparación con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de por lo menos 20 posiciones del nucleótido, con frecuencia sobre una ventana de por lo menos 25-50 nucleótidos, donde el porcentaje de la identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia del polinucleótido que puede incluir supresiones o añadiduras que totalizan el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande . Otro indicio de que las secuencias del nucleótido son sustancialmente idénticas es si dos moléculas se hibridan entre sí bajo condiciones severas. Las condiciones severas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Por lo general, las condiciones severas se seleccionan como de aproximadamente 5o a aproximadamente 20 °C, por lo general aproximadamente 10 °C a aproximadamente 15 °C, menores al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica en una resistencia iónica definida y pH. El Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica y pH definido) en la cual el 50% de la secuencia meta se híbrida a una sonda adaptada perfectamente. Por lo general, las condiciones severas serán aquellas en donde la concentración de sal sea de aproximadamente 0.02 molar a un pH 7 y la temperatura sea de por lo menos aproximadamente 60 °C. Por ejemplo, en un procedimiento estándar de hibridación Southern, las condiciones severas incluirán un lavado inicial en 6X SSC a 42 °C seguido por uno o más lavados adicionales en 0.2X SSC a una temperatura de por lo menos aproximadamente 55 °C, por lo general aproximadamente 60 °C y con frecuencia aproximadamente 65 °C.

Las secuencias del nucleótido también son sustancialmente idénticas para propósitos de esta invención cuando los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. De esta forma, cuando una secuencia de ácido nucleico codifica esencialmente el mismo polipéptido como una segunda secuencia del ácido nucleico, las dos secuencias del ácido nucleico son sustancialmente idénticas, aún cuando no se hibridarían bajo condiciones severas debido a sustituciones silenciosas permitidas por el código genético ( consul tar, Darnell y colaboradores (1990) Molecular Cell Biology (Biología Celular Molecular) , Segunda Edición Scientific American Books (Libros Científicos Norteamericanos) , W.H. Freeman and Company, Nueva York, para una explicación de la degeneración del codón y el código genético) . La pureza u homogeneidad de la proteína pueden indicarse por cierto número de medios bastante conocidos en la técnica, como por ejemplo la electroforesis con gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguida por la visualización después del teñido. Par ciertos propósitos, será necesaria la alta resolución y la HPLC o se utilizará un medio similar para la purificación. La práctica de esta invención implica la construcción de ácidos nucleicos recombinantes y la expresión de genes en células bacteriales transfectadas. Las técnicas de clonación molecular para lograr estos fines son conocidas en la técnica. Una amplia variedad de métodos de clonación y amplificación in vi tro, adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes como vectores de expresión son bastante conocidos para personas capacitadas. Los ejemplos de estas técnicas e instrucciones suficientes para instruir a personas capacitadas a través de diferentes ejercicios de clonación se encuentran en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (Guía para Técnicas de Clonación Molecular, Métodos de Enzimología) , Volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger) ; y Current Protocols in Molecular Biology, (Protocolos Actuales en Biología Molecular) , F.M. Ausubel y colaboradores, eds., Current Protocols, a empresa de coinversión entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento 1994) (Ausubel). Los ejemplos de protocolos suficientes para dirigir a personas capacitadas a través de métodos de amplificación in vi tro, incluyendo la reacción en cadena de polimerasa (PCR) , la reacción en cadena de ligaza (LCR) , la amplificación Qß-replicasa y otras técnicas mediadas con polimerasa de ARN se encuentran en Berger, Sambrook y Ausubel, así como en Mullís y colaboradores (1987) , Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Protocolos PCR, una Guía para Métodos y Aplicaciones ) (ediciones Innis y colaboradores) Academic Press Inc., San Diego, CA (1990) (Innis) ; Arnheim & Levinson (1 de Octubre de 1990) C&EN 36 - 47; The Journal Of NIH Research (El Boletín de Investigación NIH) (1991) 3,81-94; (Kwoh y colaboradores (1989) Proc. Nati .

Acad. Sci . USA 86, 1173; Guatelli y colaboradores, (1990) Proc. Nati . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Científica Nacional, EUA) , 87 ,1874 ; Lomell y colaboradores (1989), J". Clin. Chem. (Boletín de Química Clínica) 35, 1826; Landegren y colaboradores, (1988) Science (Ciencias) 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology (Biotecnología) 8,291-294; Wu y Wallace, (1989) Gene (Gene) 4,560; y Barringer y colaboradores (1990) Gene (Gene) 89,117. Los métodos mejorados para la clonación in vi tro de ácidos nucleicos amplificados se describen en Wallace y colaboradores, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,426,039. Descripción de la Invención La invención ofrece cartuchos de expresión que son útiles para expresar genes recombinantes en células bacteriales, como por ejemplo E. coli , a altos niveles. También se proporcionan vectores que incluyen los cartuchos de expresión, así como protocolos de fermentación para utilizar los cartuchos de expresión con el fin de obtener la expresión de una proteína heteróloga deseada. Los cartuchos de expresión de la invención contienen un promotor doble enlazado de manera operativa a un ácido nucleico heterólogo que codifica un producto del gene deseado, por lo general un polipéptido. Los promotores dobles incluyen un componente del promotor tac enlazado a un componente del promotor obtenido a partir de un gene o genes que codifican las enzimas implicadas en el metabolismo de la galactosa (por ejemplo, un promotor proveniente de un gene de UDP galactosa 4-epimerasa (gralE) ) . El promotor doble tac-gal ofrece un nivel de expresión que es mayor al proporcionado por cualquiera de los promotores por sí solo. El promotor doble puede tener un efecto sinergístico, teniendo un efecto mayor al aditivo en el nivel de expresión. Para obtener una expresión de alto nivel de un gene clonado, los cartuchos de expresión pueden incluir otras secuencias como los sitios de enlace del ribosoma para la iniciación de la traducción y las secuencias del terminador de transcripción/traducción. Para permitir la selección de células que incluyen las construcciones, se incluyen de manera conveniente uno o más genes marcadores seleccionables (por ejemplo, genes resistentes a los antibióticos) dentro de los vectores de expresión. Los vectores pueden incluir otras secuencias para permitir que el vector sea clonado en huéspedes procarióticos, como por ejemplo el origen del procariote del rango del huésped amplio de duplicación. Una persona capacitada en la técnica reconocerá que cada uno de estos componentes del vector puede modificarse sin afectar sustancialmente su función. Un componente de los promotores dobles de la invención es un promotor tac que es una combinación de los promotores lac y trp. Un ejemplo de un vector de expresión que contiene el promotor Tac es pKK223-3 (Brosius y Holy, Proc . Nat 'l . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Científica Nacional EUA) , 81:6929 (1984)); este vector está disponible comercialemente (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway NJ) . Los variantes del promotor Tac, como por ejemplo el tre (Amann y colaboradores, Gene (Gene) 69:301 (1988) , también son útiles como un primer componente de los promotores dobles reclamados . Un segundo componente de los promotores dobles de la invención es un promotor obtenido a partir de un gene o genes que codifican las enzimas implicadas en el metabolismo de la galactosa. En las bacterias, estos genes por lo general se encuentran en racimo, con más de un gene gal presente en proximidad cercana a los demás. Por ejemplo, en el Streptococcus thermophilus los genes que codifican al UDP galactosa-4-epimerasa (galE ; también conocida como UDPglucosa-4-epimerasa) y la aldosa 1-epimerasa (mutarotasa) (gralM) están enlazados estrechamente (Poolman y colaboradores . , J. Bacteriol (Boletín de Bacteriología) 172:4037-4047 (1990)). En E. coli , están enlazados 4 genes gal (galE, galT (UDPglucosa-hexosa-1-fosfato uridilitransferasa) , galK (galactoquinasa) , y gralM) (Bouffard y colaboradores , J. Mol . Biol . (Boletín de Biología Molecular) 244:269-278 (1994) ) . De manera similar, el operón de gal del Klebsiella pneumoniae también incluye varios genes (en el orden galE, galT, y galK.) (Peng y colaboradores, J. Biochem. (Boletín de Bioquímica) 112:604-608 (1992)), mientras que el de Hemophilus influenzae incluye, en orden, gal , galK, y galM en un solo operón (Maskell y colaboradores, Mol . Microbiol .

(Microbiología Molecular) 6:3051-3063 (1992)) y el operón gal del Streptomyces lividans posee el orden de genes galT , galE, y galK (Adams y colaboradores, J. Bacteriol . (Boletín de Bacteriología 170) 203-212 (1988)). Los operones de galactosa se expresan bajo el control de uno o más promotores. Por ejemplo, el operón de gal de S. lividans incluye dos promotores, uno (gal/Pl) que es inducible por galactosa y dirige la transcripción de los genes galT , galE, y galK y un segundo promotor (galP2 ) que se localiza dentro del operón justo en sentido ascendente del gene gralE y se expresa constitutivamente (Fornwald y colaboradores, Proc . Nat 'l . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Científica Nacional EUA) , 84:2130-2134(1987)). El operón de gal de E. coli también incluye, además de un promotor inducible, un promotor constitutivo colocado en sentido ascendente del gene gra?E(Xd) . En una forma de realización preferida, el promotor doble incluye un promotor proveniente de un gene bacterial de UDPgalactosa 4-epimerasa (galE) . El gene de UDPgalactosa-4-epimerasa del Streptococcus thermophilus descrito por Poolman y colaboradores (J. Bacteriol (Boletín de Bacteriología) 172 : 4037-4047 (1990) ) es un ejemplo particular de un gene a partir del cual se puede obtener un promotor que es útil en la presente invención. Los promotores provenientes de los genes de UDPglucosa 4-epimerasa de otros organismos pueden utilizarse en la presente invención, siempre y cuando los promotores funcionen en E. coli u otra célula huésped bacterial deseada. Los organismos de ejemplo que poseen genes que codifican la UDPglucosa 4-epimerasa incluyen E. coli , K. pneumoniae, S. lividans, y E. stewartii , así como las especies de Salmonella y Streptococcus . El aislamiento de los genes gal y sus promotores puede lograrse mediante un número de técnicas bastante conocidas para las personas capacitadas en ésta. Por ejemplo, las sondas del oligonucleótido que se hibridan selectivamente en el gene ejemplificado de UDPglucosa 4-epimerasa o el promotor descrito posteriormente pueden utilizarse para identificar el gene deseado en el ADN aislado de otro organismo. El uso de estas técnicas de hibridación para identificar genes homólogos es bastante conocido en la técnica y no necesita describirse posteriormente. Los promotores obtenidos son idénticos por lo general o muestran una identidad de secuencia sustancial con el promotor de glucosa epimerasa del ejemplo descrito posteriormente. Alternativamente, los polinucleótidos que poseen la secuencia del nucleótido de los fragmentos del promotor deseado pueden sintetizarse mediante técnicas bastante conocidas que se describen en la literatura técnica. Consul tar, por ejemplo, Carruthers y colaboradores, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . (Biología Cuant . Simp. de Cold Spirng Harbor) 47:411-418 (1982), y Adams y colaboradores, J. Am . Chem. Soc. (Boletín de la Sociedad Norteamericana de Química) 105:661 (1983) . De esta forma se pueden obtener fragmentos del ADN de dos filamentos ya sea sintetizando el filamento complementario y fortaleciendo los filamentos entre sí bajo condiciones adecuadas, o agregando el filamento complementario utilizando polimerasa del ADN con una secuencia del iniciador adecuado. Los promotores tac y gal que incluyen a los promotores dobles de la invención pueden ser idénticos a los promotores correspondientes en las células bacteriales tipo silvestre, o pueden ser modificados según se desee, como por ejemplo mediante la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos. Estas modificaciones mantendrán las porciones de las secuencias del promotor que sean necesarias para la función del promotor. Por ejemplo, las secuencias del siálico -lOy -35 para los promotores de las bacterias gram-positivas y gram-negativas ( consul tar, por ejemplo, Graves y colaboradores, J. Biol . Chem. (Boletín de Química y Biología) 261 : 11409-11415 (1986) ; Singer y Berg, Genes & Genomes, (Genes y Genomas) , University Science Books, Mili Valley, CA, 1991, pp. 140-143) serán mantenidas al grado necesario para obtener la expresión. Los nucleótidos que son importantes para la función adecuada de un promotor en E. coli se muestran, por ejemplo, en Singer y Berg en la página 143. Las regiones de las secuencias del promotor que no son esenciales para la función del promotor pueden modificarse conforme a lo deseado, por ejemplo, para facilitar la clonación mediante la inserción de un sitio de restricción adyacente a o dentro de las regiones del promotor. Tanto los componentes del promotor tac como gal , por* lo general tendrán un sitio de enlace para la proteína receptora cAMP (CRP, que es el producto del gene erp) . La cAMP es ampliamente conocida como una señal para la disponibilidad de la fuente de carbono, con sus niveles inversamente correlacionados con el estado energético de la célula tal como se comprueba mediante el crecimiento de células en fuentes pobres de carbono (por ejemplo, fructosa, glicerol, acetato) produciendo niveles más altos de cAMP que los desarrollados en una fuente buena de carbono (por ejemplo, glucosa) . la cAMP regula la expresión del gene enlazándose al CRP. Este enlace de alta afinidad produce un cambio de conformación en el complejo dimérico, que puede entoncies enlazarse a un sitio específico del ADN en sentido ascendente del sitio de enlace de la polimerasa del ARN. La transcripción se activa acelerado el enlace inicial (incrementando K^) de la forma Es70 de la polimerasa del ARN, por lo menos en el caso del operón gral . El componente del promotor tac de los promotores dobles de la invención se localiza por lo general en sentido ascendente del componente del promotor gal . Por lo general, los dos componentes del promotor están separados por 0.1 a 2 kb de ADN. De manera más preferente, aproximadamente de 0.5 a 1.5 kb separan los dos componentes del promotor. En una forma de realización más preferida, el componente del promotor tac se localiza aproximadamente a lkb en sentido ascendente del componente del promotor gal . La fuente del ADN que separa los dos componentes de promotor no es particularmente crítica, siempre y cuando el ADN no contenga secuencias que interfieran con la expresión del gene, como por ejemplo los terminadores de la transcripción. Por ejemplo, en una forma de realización, el componente del promotor tac se separa del componente del promotor gal mediante el ADN obtenido a partir de la región de flanco 5 ' nativa del componente del promotor gal . En una forma de realización preferida, aproximadamente uno kb del ADN de la región del flanco 5' del gene galE S. thermophilus separan el compontente del promotor tac del compontente del promotor gral . La secuencia del nucleótido de un promotor doble preferido se muestra en la ID SEC No:l. Tal como se muestra, el promotor doble está insertado dentro del sitio .Xbal del vector de expresión pPH0X2, destruyendo el sitio en sentido ascendente Xbal . Los nucleótidos 1-146 y 1490-1561 de la secuencia son del pPHOX2. La secuencia del siálico -35 y -10 del promotor tac se encuentran en los nucleótidos 362-367 y 384-389, respectivamente. La secuencia del siálico del promotor GalE se encuentran en los nucleótidos 1438-1443 (-35) y 1462-1467 (-10) . Un sitio de enlace del ribosoma (RBS) se encuentra en los nucleótidos 1483-1488. Para facilitar la inserción de un gene que será expresado en sentido descendente del promotor doble, el RBS va seguido por un sitio de restricción Xbal y un sitio HíndlII está presente en la secuencia pPHOX2 justo a 3' del sitio Xbal. Los vectores de la invención también pueden incluir una secuencia del ácido nucleico que permite que el vector se duplique de manera independiente en una o más células huéspedes seleccionadas. Por lo general, esta secuencia es aquella que permite al vector duplicarse de manera independiente del ADN cromosómico huésped, e incluye orígenes de duplicación o secuencia de duplicación de manera autónoma. Estas secuencias son bastante conocidas para una variedad de bacterias. Por ejemplo, el origen de duplicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Grara-negativas . Los vectores también incluyen genes marcadores seleccionables para permitir la selección de células bacteriales que portan la construcción deseada. Estos genes codifican una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células huéspedes transformadas desarrolladas en un medio de cultivo selectivo. Las células huéspedes no transformadas con el vector que contiene el gene de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típica codifican las proteínas que confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, como por ejemplo la ampicilina, neomicina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Alternativamente, los marcadores seleccionables pueden codificar proteínas que complementen las deficiencias auxotróficas o suministre nutrientes importantes no disponibles del medio del complejo, por ejemplo, el gene que codifica la D-alanina racemasa para los. Bacilos. Cierto número de marcadores seleccionables son conocidos para las personas capacitadas en la técnica y se describen por ejemplo en Sambrook y colaboradores, mencionado anteriormente. Un marcador seleccionable preferido para utilizarse en el empleo del promotor doble tac-lac para expresar un polipéptido deseado es un marcador resistente a la canamicina (Vieira y Messing, Gene (Gene) 19:259 (1982)). El uso de la selección de canamicina tiene ventajas, por ejemplo, sobre la selección de la ampicilina porque la ampicilina se degrada rápidamente con ß-lactamasa en el medio de cultivo, eliminando de esta forma la presión selectiva y permitiendo que el cultivo se desarrolle adicionalmente con células que no contienen el vector. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes antes mencionados emplea técnicas de ligadura estándar conforme a lo descrito en la referencia citada anteriormente. Los plásmidos aislados o los fragmentos del ADN se fermentan, se ajustan y se vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos . Para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, los plásmidos se analizan mediante técnicas estándares como por ejemplo la digestión de la endonucleasa de restricción y/o la secuenciación de acuerdo con métodos conocidos . Cierto número de células huésped bacteriales pueden utilizarse con los vectores de la invención. Los ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas , Klebsielia, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vi treoscilla, y Paracoccus . Los huéspedes adecuados del E. coli incluyen las siguientes cepas: JM101, RR1, DH5a, y otras. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando técnicas estándares adecuadas para estas células. Las técnicas adecuadas incluyen el tratamiento de calcio que emplea cloruro de calcio, glicol de polietileno o electroporación. La invención también ofrece métodos para la utilización de los promotores dobles tac-gal para obtener una expresión de alto nivel de un polipéptido deseado. Las células huésped se transforman con los vectores que contienen los cartuchos de expresión del promotor doble y se cultivan en el medio de cultivo bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido deseado. Las células pueden desarrollarse en matraces de agitación u otros recipientes, a pesar de que para la preparación a gran escala del polipéptido se prefiere el desarrollo en un fermentador. Para obtener el nivel máximo de expresión, se agrega galactosa al medio del nutriente en un momento adecuado en el ciclo de crecimiento para inducir una expresión creciente del polipéptido deseado. Por ejemplo, el crecimiento de las células huésped puede iniciarse en el medio de cultivo que contenga fructosa (0.25% de concentración final) como la fuente de carbono; otros azúcares (por ejemplo, glicerol, acetato) que provocan un incremento en la concentración de la cAMP intracelular (adenosina 3 ', 5 ' -monofosfato cíclico) también pueden utilizarse como fuentes de carbono. Aproximadamente 5-6 horas después de haber iniciado el cultivo, o una vez que las células han alcanzado un densidad adecuada (ca. 3-6 A600) , se agrega una solución de fructosa y galactosa (concentración final de 3% de fructosa, 0.6% de galactosa) al medio (en un modo de alimentación por lote para un fermentador) . La galactosa incrementa el nivel de expresión a partir de los cartuchos de expresión del promotor doble tac-gal de la invención. La velocidad de alimentación de la solución de fructosa/galactosa puede aumentar durante el ciclo de crecimiento (de una manera gradual o acelerada) a medida que el cultivo se vuelva denso con el crecimiento celular. De preferencia, la solución de fructosa/galactosa se alimenta a través del final del ciclo de crecimiento. Los promotores dobles de la invención son útiles para la expresión de cualquier polipéptido deseado o proteína a niveles de producción muy altos. Los polipéptidos pueden ser homólogos a la célula huésped bacterial, o de preferencia, son heterólogos a la célula huésped. Por ejemplo, se pueden expresar proteínas de levadura, fúngales, mamíferas y de plantas a niveles muy altos utilizando los promotores dobles. Muchos polipéptidos producidos utilizando los promotores dobles reclamados serán enzimáticamente activos. A pesar de que ciertos polipéptidos, como por ejemplo aquellos que requieren la glucosilación u otro procesamiento específico de eucariotes para una actividad, pueden ser no producidos en una forma activa en las células huésped bacteriales, los polipéptidos inactivos de todas formas, encuentran uso como, por ejemplo, sustancias inmunógenas para la inducción de anticuerpos, marcadores de peso molecular, y similares. Los polipéptidos bacteriales de ejemplo que se pueden expresar utilizando los promotores dobles incluyen ß-lactamasa, enzimas metabolizadoras de carbohidratos, fosfatasa alcalina, enzimas de restricción, polimerasas de ADN y ARN, ligasas, quinasas, endo y exonucleasas, y similares. Los polipéptidos fúngales de ejemplo incluyen ligninasas, proteasas, glucosiltransferasas, y similares. Los polipéptidos mamíferos de ejemplo que se pueden expresar en las células huésped bacteriales utilizando los promotores dobles reclamados incluyen hormonas como por ejemplo la insulina, hormonas de crecimiento (incluyendo la hormona de crecimiento humano y la hormona de crecimiento bovino), activador plasminógeno tipo tejido (t-PA), renina, fartores de coagulación como por ejemplo el factor VIII y el factor IX, bombesina, trombina, factor de crecimiento hemopoyético, albúmina de suero, receptores para hormonas o factores de crecimiento, interleucinas, factores de estimulación de colonias, receptores de células T, polipéptidos MHC, antígenos virales, glucosiltransferasas, y similares. Esta lista de enzimas se proporciona como ejemplo, no es exclusiva, ya que los promotores dobles de la invención son útiles para obtener la transcripción de cualquier unidad de expresión de ácido nucleico que esté enlazada de manera operativa a los promotores dobles. Estas unidades de expresión incluyen no solamente aquellas que codifican polipéptidos, sino también aquellas para las cuales el producto deseado es un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN de antisentido. Los vectores son particularmente útiles para expresar enzimas que son útiles en la síntesis enzimática de los carbohidratos. El uso de la síntesis enzimática del carbohidrato ofrece ventajas sobre los métodos químicos debido a la estereoselectividad virtualmente completa y la especificidad de enlace ofrecidas por las enzimas (Ito y colaboradores, Puré Appl . Chem . , (Química Aplicada Pura) 65:753 (1993); Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,352,670 y 5,374,541). Cierto número de ciclos de la glucosiltranferasa (por ejemplo, los ciclos de la sialiltransferasa, los ciclos de la galactosiltransferasa, y lo ciclos de la fucosiltransferasa) se describen en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,374,541 y la Patente Internacional WO 9415615 A. Otros ciclos de la glucosiltranferasa se describen en Ichikawa y colaboradores, J. Am. Chem . Soc . (Boletín de la Sociedad Norteamericana de Química) 114:9283 (1992), Wong y colaboradores, J. Org. Chem . (Boletín de Química Orgánica) 57:4343 (1992), DeLuca y colaboradores, J. Am . Chem . Soc. (Boletín de la Sociedad Norteamericana de Química) 117:5869-5870 (1995), e Ichikawa y colaboradores , en Carbohydrates and Carbohydrate Polymers (Carbohidratos y Polímeros de Carbohidratos) . Yaltami, ed. (ATL Press, 1993). Las enzimas de ejemplo útiles en la síntesis de los carbohidratos que se pueden expresar utilizando los promotores dobles reclamados también incluyen la CMP-sintetasa de ácido siálico, UDPglucosa pirofosforilasa quinasa de adenilato, quinasa de piruvato, aldolasa de ácido siálico, UDP-GlcNAc pirofosforilasa, mioquinasa, galactosiltransferasas, glucosiltranferasas codificadas por el sitio los de Neisseria gonorrhoeae ( consul tar, por ejemplo, la solicitud internacional WO 96/10086) y las N-acetil glucosaminiltransferasas . Cualquiera de las enzimas descritas en esta referencias y utilizadas en estos ciclos pueden expresarse de manera recombinante utilizando los vectores de la invención. Un ejemplo típico de un ciclo de glucosiltransferasa para el cual pueden producirse las enzimas requeridas utilizando los promotores dobles tac-gal reclamados es un ciclo de galactosiltransferasa. El medio de reacción para un ciclo de galactosiltransferasa incluirá de preferencia, además de una galactosiltransferasa, substrato del donador, azúcar del admisor y un catión de metal divalente, un sistema de reciclado del substrato del donador que incluye por lo menos 1 mol de glucosa- 1-fosfato por cada mol del azúcar del admisor, un donante de fosfato, una quinasa capaz de transferir el fosfato desde el donante de fosfato hacia los difosfatos del nucleósido, y una pirofosforilasa capaz de formar UDP-glucosa a partir de UTP y glucosa- 1-fosfato y cantidades catalíticas de UDP y una UDP- galactosa-4-epimerasa. Una galactosiltransferasa es la enzima principal en este ciclo. Las galactosiltransferasas de ejemplo incluyen ß(l,3) galactosiltransferasa, ß(l,4) galactosiltransferasa (E.C. No. 2.4.1.90, consul tar, por ejemplo, Narimatsu y colaboradores, Proc. Nat 'l . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Científica Nacional EUA) , 83:4720-4724 (1986)), a(l,3) galactosiltransferasa (E.C. No. 2.4.1.151, consul tar, por ejemplo, Dabkowski y colaboradores, Transplant Proc. (Procedimientos de Transplantes) 25:2921 (1993) y Yamamoto y colaboradores Nature (Naturaleza) 345:229-233 (1990)) y a(l,4) galactosiltransferasa (E.C. No. 2.4.1.38) . Otras enzimas utilizadas en el ciclo de la galactosiltransferasa incluyen una quinasa (por ejemplo, quinasa de piruvato) , una epimerasa (por ejemplo, UDP-„ galactosa-4-epimerasa) , y una pirofosforilasa (por ejemplo, pirofosforilasa de glucosa) . El ADN que codifica todas estas enzimas puede expresarse utilizando los vectores de la invención. En algunas forma de realización, el ADN que codifica el polipéptido de interés puede expresarse como una fusión con otro polipéptido, de preferencia una secuencia de señal u otro polipéptido que posea un sitio de desdoblamiento específico en el término N del polipéptido maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del ADN del polipéptido que se inserta dentro del vector. La secuencia de la señal heteróloga seleccionada debe ser una que sea reconocida y procesada (es decir, dividida por una peptidasa de la señal) por la célula huésped. Para células huésped bacteriales que no reconozcan y procesen la secuencia de señal del polipéptido nativo, la secuencia de la señal se sustituye por una secuencia de señal bacterial . Una secuencia de señal puede facilitar la purificación del polipéptido deseado dirigiendo la secreción de la proteína deseada desde la célula hacia el medio extracelular. Los polipéptidos producidos por células procariote pueden no doblarse necesariamente de manera adecuada. Durante la purificación a partir de E. coli los polipéptidos, expresados pueden primero desnaturalizarse y después volverse la naturalizar. Esto puede lograrse solubilizando las proteínas producidas bacterialmente dentro de un agente caotrópico como por ejemplo el HCl de guanidina y reduciendo todos los residuos de cisteína con un agente reductor como por ejemplo el beta-mercaptoetanol . Los polipéptidos se vuelven a naturalizar posteriormente, ya sea mediante una diálisis lenta o mediante filtración de gel. Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,511,503. La detección de los polipéptidos expresados se logra por medio de métodos conocidos en la técnica como por ejemplo los radioinmunoensayos, las técnicas de manchado Western, la inmunoprecipitación o los ensayos de actividad. La purificación a partir de E. coli puede lograrse siguiendo los procedimientos descritos en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,511,503. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la presente invención. Ejemplo 1 Construcción del pTGK Construcción del pPHOX2/qalE El plásmido pPHOX2 (Figura 1) incluye un promotor inducible por hambre de fosfato del gene de fosfatasa alcalina (pho A) , que incrementa la transcripción de genes bajó su control cuando los niveles de fosfato llegan a ser extremadamente bajos. Este plásmido contiene un promotor phoA tal como se describe en la Patente Internacional WO 94/12636, así como un terminador ribosómico rrr¡B (obtenido a partir de pKK223-3, Pharmacia Biotech) . El promotor inducible por galactosa a partir del gene de UDP-galactosa-4-epimerasa (gralE) del Streptococcus thermophilus (Poolman y colaboradores, J. Bacteriol (Boletín de Bacteriología) 172:4037-4047 (1990)) y el promotor tac se insertaron dentro del pPH0X2. El plásmido de expresión pTGK se construyó de la siguiente forma. Primero, se amplificó un fragmento del plásmido pHPl/tac (descrito en Poolman y colaboradores, J. Bacteriol (Boletín de Bacteriología) . 172:4037-4047 (1990)) mediante una reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando la polimerasa Pfu y los iniciadores Xbal en las terminaciones de 5' y 3'. El fragmento amplificado contenía un promotor tac aproximadamente a un kb en sentido ascendente del promotor inducible por galactosa a partir del gene de UDP-galactosa-4-epimerasa (gal E) del Streptococcus thermophilus (Poolman y colaboradores, mencionado anteriormente) . El iniciador 5' (5 ' -GCTCTAGACGATCCGTCCGGCGTA-3'; (ID SEC No : 5)) fue diseñado para hibridarse en la región del vector del pBR322 en sentido ascendente del promotor en el pHPl/tac, mientras que el inciador 3' (51-ATTCTAGACCTCCTTTCTCAGAAAAAACAATT-3 ' ; (ID SEC N?:6)) fue diseñado para hibridarse en una región secuenciada del promotor galE que contiene el sitio de enlace del ribosoma Shine-Dalgarno. El espaciado óptimo entre el sitio de enlace del ribosoma galE y el codón de iniciación del gene recombinante pudo mantenerse (Figura 2) . Este fragmento del ADN de 1.3 kb amplificado, que incluía los promotores tanto tac como gralE, fue digerido con Xbal y fue insertado dentro del pPH0X2 digerido por Xbal (Figura 1) , que incluye un promotor inducible por hambre-fosfato del gene de fosfatasa alcalina (phoA, descrito en la Patente Internacional WO 94/12636) , así como un terminador ribosómico rmB (obtenido a partir de pKK223-3, Pharmacia Biotech) . La orientación del promotore doble tac-galE fue revisada mediante la digestión de BamHl. El plásmido resultante se denomina pPHOX2/galE. Añadidura de un sene de resistencia a la canamicina. El pPH0X2 posee un gene de resistencia a la ampicilina codificado por ß-lactamasa. La ampicilina se agrega al cultivo para mantener el plásmido, pero se degrada rápidamente por medio de ß-lactamasa, perdiendo su efectividad. En las células con una presión selectiva fuerte contra la elaboración de la proteína recombinante (por ejemplo, como con la sintetasa de ácido siálico-CMP) , puede ocurrir el crecimiento excesivo de células sin el plásmido. Para resolver este problema, el plásmido fue rediseñado para incluir un gene de resistencia a la canamicina (Kanr) , que proporciona una selección más fuerte ya que la proteína codificada actúa a nivel del sistema de transporte de la membrana . El gene Kanr de 1.3 kb del plásmido pUC4K (Vieira y Messing, Gene (Gene) 19:259 (1982)) fue digerido por EcoRI e insertado dentro del sitio único de EcóRI del plásmido pPH0X2/gralE. Las colonias se seleccionaron por resistencia a la canamicina. El plásmido resultante se denomina pPH0X2/gra!E/Kan (Figura 3) . Mejoras del vector para facilitar la clonación Los sitios de restricción múltiples para el Xbal y el HindlII en el plásmido pH0X2/galE/Kan hacían que la clonación fuera problemática ya que el gene recombinante se insertaba utilizando estos dos sitios. Por lo tanto, el sitio Xbal en la terminación de 5 ' del fragmento del promotor gralE y un sitio HindIII dentro del gene Kanr fueron eliminados. Para borrar el sitio Xbal, el plásmido pPHOX2/galE fue digerido parcialmente con Xbal y se aisló el plásmido linealizado. El sitio Xbal de corte fue llenado con polimerasa Klenow para elaborar un fragmento romo y fue ligado nuevamente. Las colonias se clasificaron por mapeo de restricción para identificar aquellas que poseían un plásmido que carecía del sitio Xbal de 5' (plásmido pPHOX2/galE?Xba) . Un oligonucleótido (ATGCATAAACTTTTGCCATTCTCAC; ?H3 (ID SEC No: 7)) fue diseñado para cambiar el codón AAG del Hind??? (AAGCTT) para eliminar el sitio de restricción pero mantuvo el mismo codón del aminoácido (lisina, AAA) . La primera reacción del PCR amplificó el ADN a partir del plásmido pUC4K utilizando el oligonucleótido ?H3 y el iniciador delantero M13 (New England Biolabs) , generando un fragmento de 620 bp. Una segunda reacción del PCR amplificó el ADN a partir del pUC4K utilizando el iniciador inverso M13 (New England Biolabs) y el fragmento proveniente del primer PCR, generando un fragmento de 1.3 kb. El segundo fragmento se amplificó adicionalmente mediante PCR con los iniciadores delantero e inverso. Este fragmento fue digerido con EcoRI (y el HindlII para cortar los no recombinantes) y se ligó con un fragmento lineal aislado de un digesto del ScoRI parcial del plásmido pPHOX2/galE?Xba. Un digesto Nhel/HindIII se utilizó para determinar el sitio de inserción correcto del fragmento EcóRI . Este vector, que se denomina pTGK (Figura 4), fue depositado ante la Recolección de Cultivos Tipo Norteamericano el 22 de Mayo de 1996, y tiene asignado un número de acceso 98059. Modificaciones del vector pTGK Puede realizarse cierto número de modificaciones al vector pTGK. Por ejemplo, podemos modificar el vector para facilitar la clonación y la expresión de fragmentos del PCR romus . Para hacer esto, el pTGK se digiere con Xbal y los extremos se llenan con polimerasa Klenow. Un oligonucleótido CCCGGG se liga a los extremos romos, volviendo a circular el plásmido, después de lo cual se digiere con Xbal para eliminar los no recombinantes. La digestión con Srfl, o Smal , que da como resultado un corte de extremo romo entre el CCC y el GGG, da como resultado extremos romos a los cuales se puede ligar un fragmento de extremo romo obtenido mediante el PCR u otros métodos. Utilizando como iniciadores para los oligonucleótidos del PCR que inician con el ATG del codón de inciación, el espaciado óptimo entre el codón de iniciación y el sitio de enlace del ribosoma puede mantenerse (Figura 5) . Este vector se denomina pTGKS . Ejemplo 2 Análisis de Expresión a partir del Promotor Doble tac-gal Este experimento probó la capacidad de la galactosa para inducir la expresión del gene de UDP-gal-4-epimerasa de S. thermophilus (galE) en E. coli utilizando el pHPl, que contiene el promotor natural del gene así como el promotor tac. La cepa JMl01 del E. coli que contenía pHPl fue desarrollada toda la noche en un medio LB o M9 que fue suplementado tal como se indica posteriormente. Todos los cultivos se incubaron toda la noche a 37 °C con agitación y lograron una densidad celular equivalente a un Aß00 de aproximadamente 2-3. Las células se cultivaron después de alcanzar la fase estacionaria y se desintegraron mediante un tratamiento celular a presión francés. La actividad de la UDP-galactosa-4-epimerasa se sometió a ensayo tal como se describe en Kalckar y colaboradores, Proc. Nat 'l . Acad. Sci . USA (Procedimientos de la Academia Científica Nacional EUA) , 45:1776 (1959) . Una unidad se define como una µmole del substrato utilizado por minuto. Los resultados de este experimento, que se presentan en la Tabla 1, demostraron que la galactosa induce la expresión del gene de epimerasa en E. coli . Tabla 1 Medio de crecimiento U/L Epimerasa LB 850 LB, 10 mM de Galactosa 2000 M9, 0.5% de Fructosa, 1 mM de Galactosa 2200 M9, 0.5% de Fructosa, 10 mM de Galactosa 3120 M9, 1% de Fructosa, 10 mM de Galactosa 3340 M9, 1.2% de Glicerol 10 mM de Galactosa 2860 Para determinar si la expresión de los genes que no sean el gene nativo gralE es inducible mediante la galactosa cuando se encuentra bajo el control del promotor doble, insertamos un gene que codifica la transferasa de GlcNAc en pTGK. Este vector fue transformado en el JM101 de E. coli , que fue desarrollado en el medio M9 que contenía ya sea fructosa, fructosa y galactosa, o glucosa como fuente de carbono. Tal como se muestra en al Tabla 2, los niveles de expresión fueron relativamente bajos para el GlcNAc; el error experimental alto resultante dio como resultado los datos no conclusivos con referencia a la inducibilidad de la galactosa. Tabla 2 U/L GIcNAc T pTGK/GIcNAcT M9, Fructosa 15 M9, Fructosa + Galactosa 16 M9, Glucosa 12 El promotor tac tiene un efecto significativo en los niveles de expresión. Para determinar si el promotor tac contribuye a la expresión de genes bajo el control del promotor doble tac-galE eliminamos el promotor tac de las construcciones que expresan la transferasa de GlcNAc o la transferasa Gal (Gotschlich, E.C., J. Exp. Med. (Boletín de Medicina Exp. ) 180 : 2181 -2190 (1994) ) . El promotor galE estuvo presente en todas las construcciones . Las cepas se cultivaron en M9 + fructosa + galactosa y se sometieron a ensayo para la actividad de la transferasa de GlcNAc o Gal. Los resultados, mostrados en la Tabla 3, demuestran que el promotor tac contribuye significativamente a los niveles de expresión.

Tabla 3 U/I, A. construccones GlcNAcT pTGK (Pt P -„g,al-,E,3,1 Kan) 16 pTGK (PgalE, Kan) 0.5 B. construcciones galE T pTGK (Ptac, PgalE, Kan) pTGK (PgalE, Kan) Efecto ?ig l=fi pomotores salE y; tac en los niveles de expresión de la quinasa de piruvato Debido a que los niveles de expresión relativamente bajos en la Tabla 2 anterior evitaban una conclusión estadísticamente significativa con respecto a la inducibilidad de expresión de la galactosa de un gene heterólogo bajo el control de un promotor doble, se eligió una enzima expresada de manera más elevada (quinasa de piruvato) para los siguientes experimentos. El promotor GalE fue eliminado del plásmido pTGK que contenía una construcción de quinasa de piruvato, dejando el plásmido únicamente con el promotor tac. Como control, utilizamos la misma contrucción, pero con ambos promotores. El sitio de enlace del ribosoma y el espaciado fueron idénticos en ambas construcciones. Los resultados de estos experimentos, mostrados en la Tabla 4, demuestran que la presencia de la región del promotor galE tiene un efecto significativo en la expresión de la quinasa de piruvato. De manera interesante, se observó la inducción de la galactosa para arabas construcciones, incluyendo aquella que carecía del promotor galE. Tabla 4 U/L. quinasa de piruvato M9, 0.5% Fructosa 1202 3167 M9, 0.5% Fructosa + 10 mM Galactosa 1902 4377 M9, 0.5% Glucosa 1208 2625 En otro experimento, el promotor tac se eliminó de la construcción de la quinasa de piruvato. Esta construcción se transformó en E. coli y se comparó con cepas que contenían ya sea ambos promotores o únicamente el promotor tac. Los resultados de este experimento, que se presentan en la Tabla 5, demuestran que la contribución combinada de los promotores tac y gralE es mayor a la suma de sus actividades individuales. La añadidura de galactosa incrementa los niveles de expresión. Tabla 5 U/L, quinasa de piruvat M9, 0.5% Fructosa 403 1420 3 M9, 0.5% Fructosa + lOmM Galactosa 429 1839 3 Ejemplo 3 Expresión de Genes Recorobxnantes El vector de expresión pTGK de E. coli se ha utilizado para producir varias proteínas recombinantes, incluyendo la CMP-sintetasa de ácido siálico a partir de E. coli , UDP-glucosa pirofosforilasa a partir de Bacillus subtilis, quinasa de adenilato a partir de E. coli , quinasa de piruvato a partir de Bacillus stearothermophilus, aldolasa de ácido siálico a partir de E. coli , UDP-GlcNAc pirofosforilasa a partir de E. coli, mioquinasa de músculo de conejo, Neissseria ßl,4-galactosiltransferasa, y N-acetil glucosaminiltransferasa de Neisseria. Se han obtenido producciones grandes para todas estas proteínas. Por ejemplo, se produjeron 10,000,000 U de mioquinasa de músculo de conejo por kg de células, y 3,500,000 U de quinasa de piruvato por kg de células se expresaron a partir de pTGK. Ejemplo 4 Protocolo de Fermentación Bacterial utilizando pTGK Preparación del medio 1. Pesar los siguientes ingredientes en un vaso de precipitado de 2 litros: 60g Na2HP04 Sigma S0876 30g KH2P04 Sigma P5379 5g NaCl J.T. Baker 3628 50g (NH 2S04 J.T. Baker 0792R 2. Agregar un litro de agua destilada y mezclar para disolver. 3. Pesar los siguiente ingredientes en un vaso de precipitado de 2 litros: 12Og NZAmina A Quest Intl. 50g extracto de Levadura Difco 2 ml Mazu PPG Chemical DF 204 4. Agregar un litro de agua destilada y mezclar para disolver. 5. Agregar las soluciones de los pasos 2 y 4 al fermentador (por ejemplo, New Brunswick BioFlow IV) . Constituir a 10 litros con agua destilada. 6. Someter al autoclave el fermentador durante 60 minutos utilizando esterilización con vapor en el sitio. Esterilizar los puertos durante 15 minutos. 7. Pesar la fructosa para la solución al 50%: 400g Fructosa Sigma F0127 8. Constituir a 800 ml con agua destilada y mezclar. Transferir a una botella de 1 litro. 9. Pesar la galactosa para la solución al 20%: lOOg Galactosa Sigma G0625 10. Constituir a 500 ml con agua destilada y mezclar. Transferir a una botella de 1 litro.

Pesar el MgS04 para la solución de 0.5 M: 6g MgS04 Sigma M7506 Constituir a 100 ml con agua destilada y mezclar. Transferir a una botella de 200 ml . Pesar el CaCl2 para la solución de 1 M: llg CaCl2 J . T . Baker 1411- 01 Constituir a 100 ml con agua destilada y mezclar. Transferir a una botella de 200 ml . Someter al autoclave lo siguiente durante 45 minutos: 50% fructosa (paso 8) 20% galactosa (paso 10) 0.5 Medicamento MgCl2 (paso 12) 1 M CaCl2 (paso 14) botella de 1 litro equipada con tubería para la bomba de alimentación #1 Pesar la canamicina para la solución de 25 mg/ml: 0.5g Canamicina Sigma K400 Constituir a 20 ml con agua destilada y mezclar. Esterilizar con filtrado a través de un filtro esterilizado de 0.2 mieras. Pesar el FeS04 inmediatamente antes de inocular el cultivo en un fermentador: 1.0 g FeS04 Sigma F7002 Constituir a 10 ml con agua destilada y mezclar.

Esterilizar con filtrado a través de un filtro esterilizado de 0.2 mieras. 20. Conectar la solución de NH40H al 50% a la bomba de alimentación #2. Parámetros del Fermentador para un Fermentador New Brunswick PioFlPW IV 1. Calibrar la sonda del oxígeno disuelto (O.D.) si es necesario. El O.D. de inicio debe ser del 100%. 2. Ajustar el O.D. a la derivada integral proporcional (D.I.P.) con un valor programado del 20%. 3. . Ajustar la agitación a la D.I.P. con un valor programado de 300 rpm. Cambiar la D.I.P. a la programación del O.D. y ajustar a 800 rpm. El valor de 800 se invertirá otra vez a 300 en unos cuantos segundos. Esto sirve como instrucción para que se inicie la agitación a 300 rpm pero incrementará las rpm hasta 800 con el fin de mantener el O.D. al 20%. 4. Ajustar el pH a la D.I.P. con un valor programado de 6.8. 5. Ajustar la alimentación #2 a la programación base (la bomba de alimentación #2 controla la añadidura de NH40H) . 6. Ajustar la temperatura a la D.I.P. con un valor programado de 37 °C . 7. Ajustar el aire dentro de un rango de 4.3 a 4.7 litros por minuto . Inoculación del fermentador Preparar la botella de alimentación: 1. Agregar 600 ml de solución de fructosa y 300 ml de la solución galactosa a la botella de alimentación sometida a la autoclave. Conectar la botella a la alimentación # 1 en el fermentador. 2. Determinar la absorvencia a 600 nm del inoculo de crecimiento. Diluir 1/10 del cultivo en agua en un tubo de vidrio de 0.5 ml . Blanquear con agua. 3. Agregar los siguientes ingredientes a un matraz esterilizado de 1 litro: 50 ml de Fructosa 100 ml de MgS04 1 ml de CaCl2 20 ml de Canamicina 2.5 ml de FeS04 Agregar al fermentador cuando se enfríen. 4. Agregar el inoculo al fermentador. Expresión de la proteína deseada Para obtener una proteína de interés utilizando los promotores dobles reclamados, empleando un fermentador, las células se desarrollan inicialmente en un medio que contiene una pequeña cantidad de fructosa como fuente de carbono. Una vez que las células se están proliferando, por lo general aproximadamente 5-6 horas después de la inoculación, se alimenta una solución de galactosa y fructosa dentro del medio en el modo de alimentación por lotes. La velocidad de alimentación puede incrementarse durante la fermentación (de una manera gradual o acelerada) a medida que el cultivo se vuelve denso con el crecimiento celular. La alimentación de la fuente de carbono continúa hasta el final de la fermentación. Si se desea, el polipéptido de interés se purifica posteriormente a partir del medio (en el caso de una proteína secretada) o a partir de las células cultivadas. Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invención pero no limitan este alcance. Otras variantes de la invención serán aparentes fácilmente para las personas capacitadas en la técnica y están incluidas en las reivindicaciones anexadas. Todas la publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente se incorporan a ésta por referencia para todos los propósitos. LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Cytel Corporation (B) CALLE: 3525 John Hopkins Court (C) CIUDAD: San Diego (D) ESTADO: California (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL : 92121 (G) TELEFONO : ( 619) 552 -2794 (H) TELEFONO FAX: (619) 552-3049 (I) TELEX: (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Vectores de Expresión Mej orados (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 7 (iv) DOMICILIO DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Townsend and Townsend and Crew LLP (B) CALLE: Two Embarcader Center, Octavo Piso (C) CIUDAD: San Francisco (D) ESTADO: California (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 94111-3834 (v) FÓRMULA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC IBM compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.3 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: EUA todavía no asignada (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: Todavía no asignada (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA: (A) NUMERO DE SOLICITUD: EUA 60/029,545 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 08 -NOV- 1996 (viii) INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE : (A) NOMBRE: Smith, Timothy L. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 35,367 (C) NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDÍENTE : 0i4i38-0096i?PC (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: (415) 576-0200 (B) TELEFAX: (415) 576-0300 (2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC No: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1561 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: uno (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: promotor (B) UBICACIÓN: 362..389 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "promotor tac" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: promotor (B) UBICACIÓN: 1438..1467 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "promotor galE" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA ID SEC NO: 1: GTAAAGAAGT TATGGAGCNT CTTNGTCAGT AAAAAGTTAT TTTTTTCAAC AGCGTTCATA 60 AAGTGTCACG GCCGGAGAAT TATAGTCGCT TGGTTTTTAT TTTTTAAGTA TTGGTAACTA 12 GTACGCAAGT TCACGTAAAA AGGGTAACTA GATAGACGAN GGTCCGGNGT AGAGGATCCG 18 GGCTTATCGA CTGCACGGTG CACCAATGCT TCTGGGTCAG GCAGCCATCG GAAGCTGTGG 24 TATGGCTGTG CAGGTCGTAA ATCACTGCAT AATTCGTGTC GCTCAAGGCG CACTCCCGTT 30 CTGGATAATG TTTTTTGCGC CGACATCATA ACGGTTCTGG CAAATATTCT GAAATGAGCT 36 GTTGACAATT AATCATCGGC TCGTATAATG TGTGGAATTG TGAGCGGATA ACAATTTCAC 42 ACAGGAAACA GAATTCCCGG GGATCCGTCG ACCTGCAGCT AAAAATGCGG TAGCTTCTGA 48 TTATCCAAAA TGCCAACTTT GTATGGAAAA TGAAGGTTAT TTGGGTCGCA TTAATCACCC 54 AGCCCGCAGC AATCACCGTG TTGTTCGTTT CCAAATGGAA GACAAGGAGT GGGGCTTCCA 60 ATACTCGCCT TATGCCTACT TTAACGAACA TTCTATCTTC TTTTATGGTA AGCACGAACC 66 AATGCACATC AGTCCATTGA CGTTTGGCCG TCTCCTAACA ATTGTTGAAG CATTCCCCTG 72 GTTACTTCGC AGGTTCAAAT GCCGATCTTC CAATTGTAGG TGGTTCAATT CTTACACATG 78 AACACTATCA AGGTGGTCGC CATACCTTCC CAATGGAAGT AGCAGGCATT AAAGAAAAAG 84 TTAGCTTTGA TGGTTACTCT GATGTTGAGG CTGGCATCGT TAATTGGCCT ATGTCTGTTC 90 TTCGTCTAAG AAGTGAAGAC AAGGGAAGAC TTATCGCTCT TGCAACTAAA ATCCTAAATT 96 GCTGGCGTGG TTATTCAGAC GAAAAAGCTG GGGTCTTGGC TGAGTCTGAT GGACAACCTC 10 ACCACACCAT TACTCCAATT GCTCGTAGAA AAGACGGCAA ATTTGAATTG GATTTGGTTC 10 TTCGTGACAA TCAAACTTCT GAAGAATATC CAGACGGTAT CTATCACCCA CATAAAGATG 11 TTCAACATAT TAAGAAAGAA AATATTGGTT TGATTGAAGT TATGGGATTG GCCATTCTTC 12 CACCTCGTTT GAAAACAGAA CTTAAAGATG TTGAAGATTA TCTATTAGGT CAAGGTAACC 12 AAGTTGCTCC AATTCACCAA GAATGGGCAG ATGAACTCAA AGCTAAATC CGAATATTAC 13 GGCTGAGGAA GTGACAGAAG TTGTTCGACA ATCTGTTGCA GATATCTTTG CTCGTGTACT 13 AGAAGATGCA GGTGTTTATA AGACTAATAG TGAAGGCTTG GATCAGTTTA AAGCATTTGT 14 AGATTTTGTA AATTTAGCTG ATTAATTGTT TTTTCTGAAG AAAGGAGGTC TAGAGTCGAC 15 CTGCAGGCAT GCAAGCTTCT GTTTTGGCGG ATGAGAGAAG ATTTTCAGCC TGATACAGAT 15 15 (2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: uno (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA FRECUENCIA: ID SEC NO : 2 : GAAAAGAAGT CTAGANNNAT GNNNNNN (2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: uno (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA FRECUENCIA: ID SEC NO : 3 : GAAAAGAAGT CTAGCCCGGG CTAGA (2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO : 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: uno (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA FRECUENCIA: ID SEC NO : 4 GAAAAGAAGT CTAGCCCATG NNNNNNN (2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: uno (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA FRECUENCIA: ID SEC NO : 5 : GCTCTAGACG ATCCGTCCGG CGTA (2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: uno (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA FRECUENCIA: ID SEC NO: 6: ATTCTAGACC TCCTTTCTCA GAAAAAACAA TT (2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTOS: uno (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (xi) DESCRIPCIÓN DE LA FRECUENCIA: ID SEC NO : 7 ATGCATAAAC TTTTGCCATT CTCAC

Claims (49)

1. REIVINDICACIONES 1. Una construcción de ácido nucleico recombinante que incluye un promotor bacterial doble enlazado de manera operativa a un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido deseado, donde el promotor bacterial doble incluye un componente del promotor tac y un componente del promotor gal .
2. 2 . El ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el compontente del promotor tac es un promotor trc.
3. 3. El ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el compontente del promotor gal es un promotor bacterial de UDP-galactosa-4-epimerasa.
4. 4. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 3 , donde el componente del promotor gal proviene del Streptococcus thermophilus .
5. 5. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el promotor doble da como resultado un nivel más alto de expresión del polipéptido deseado que cualquiera de los componentes del promotor tac o los componentes del promotor gal individualmente .
6. 6. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido bacterial .
7. 7. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 6, donde el ácido nucleico heterólogo se obtiene a partir de un sitio los de Neisseria gonorrhoea .
8. 8. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido mamífero.
9. 9. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido fungal .
10. 10. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido de planta.
11. 11. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico heterólogo codifica una CMP-sintetasa de ácido siálico.
12. 12. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico heterólogo codifica un UDP-glucosa pirofosforilasa.
13. 13. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico heterólogo codifica una quinasa de adenilato.
14. 14. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico heterólogo codifica una quinasa de piruvato.
15. 15. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico heterólogo codifica una aldolasa de ácido siálico.
16. 16. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 27, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la UDP-GlcNAc pirofosforilasa.
17. 17. La construcción del ácido nucleico recombinante de la reivindicación 1, donde el ácido nucleico heterólogo codifica una mioquinasa de músculo de conejo.
18. 18. Un vector de expresión que incluye un marcador seleccionable y una construcción del ácido nucleico recombinante que incluye un promotor bacterial doble enlazado de manera operativa a un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido deseado, donde el promotor bacterial doble incluye un componente del promotor tac y componente del promotor gal .
19. 19. El vector de expresión de la reivindicación 18, donde el marcador seleccionable es un gene de resistencia a la canamicina.
20. 20. El vector de expresión de la reivindicación 18, que además incluye un origen de secuencia de duplicación que funciona en E. coli .
21. 21. Un plásmido que es sustancialmente idéntico a un plásmido depositado ante la Recolección de Cultivos Tipo Americano bajo el número de Acceso 98059.
22. 22. El plásmido de la reivindicación 21, donde el plásmido es idéntico a un plásmido depositado ante la Recolección de Cultivos Tipo Norteamericano bajo el número de Acceso 98059.
23. 23. Una construcción del ácido nucleico recombinante que incluye un promotor de UDP-glucosa-4-epimerasa de Streptococcus thermophilus enlazado de manera operativa a un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido deseado.
24. 24. Una célula bacterial que incluye un cartucho de expresión recombinante que incluye un promotor bacterial doble enlazado de manera operativa a un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido deseado, donde el promotor bacterial doble incluye un componente del promotor tac y un componente del promotor gal .
25. 25. La célula bacterial de la reivindicación 24, donde el componente del promotor gal proviene del Streptococcus thermophilus .
26. 26. La célula bacterial de la reivindicación 24, que es E. coli .
27. 27. La célula bacterial de la reivindicación 24, donde el cartucho de expresión recombinante se localiza en un plásmido de duplicación independiente.
28. 28. La célula bacterial de la reivindicación 27, donde el plásmido incluye además un gene de resistencia a la canamicina.
29. 29. La célula bacterial de la reivindicación 24, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la CMP-sintetasa de ácido siálico.
30. 30. La célula bacterial de la reivindicación 24, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la UDP-glucosa pirofosforilasa .
31. 31. La célula bacterial de la reivindicación 24, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la quinasa de adenilato.
32. 32. La célula bacterial de la reivindicación 24, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la quinasa de piruvato.
33. 33. La célula bacterial de la reivindicación 24, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la aldolasa del ácido siálico.
34. 34. La célula bacterial de la reivindicación 24, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la UDP-GlcNAc pirofosforilasa .
35. 35. La célula bacterial de la reivindicación 24, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la mioquinasa de músculo de conejo.
36. 36. La célula bacterial de la reivindicación 24, donde el ácido nucleico heterólogo se obtiene a partir de un sitio los del Neisseria gonorrhoeae .
37. 37. Un método para la elaboración de un polipéptido deseado, donde el método incluye cultivar en un medio adecuado las células bacteriales que constan de un cartucho de expresión recombinante que incluye un promotor bacterial doble enlazado de manera operativa a un ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido deseado bajo las condiciones que permiten la expresión del polipéptido deseado, donde el promotor bacterial doble incluye un componente del promotor tac y un componente del promotor gral .
38. 38. El método de la reivindicación 37, donde el componente del promotor gal proviene del Streptococcus thermophi lus .
39. 39. El método de la reivindicación 37, donde las células bacteriales son de E. coli .
40. 40. El método de la reivindicación 37, donde las células bacteriales se cultivan en un medio que incluye la canamicina.
41. 41. El método de la reivindicación 37, donde la expresión del polipéptido deseado se induce por la presencia de galactosa en el medio.
42. 42. El método de la reivindicación 37, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la UDP-glucosa pirofosforilasa .
43. 43. El método de la reivindicación 37, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la quinasa de adelinato.
44. 44. El método de la reivindicación 37, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la quinasa de piruvato.
45. 45. El método de la reivindicación 37, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la aldolasa del ácido siálico.
46. 46. El método de la reivindicación 37, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la UDP-GlcNAc pirofosforilasa .
47. 47. El método de la reivindicación 37, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la mioquinasa de músculo de conej o .
48. 48. El método de la reivindicación 37, donde el ácido nucleico heterólogo codifica la CMP-sintetasa de ácido siálico.
49. 49. El método de la reivindicación 37, donde el ácido nucleico heterólogo se obtiene a partir de un sitio los del Neisseria gonorrhoeae.