CN1039843A - 人的上皮细胞成长因子的制法 - Google Patents

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Abstract

一种作为遗传工程方法的hEGF制法，其特征是在载体中组建能对hEGF进行编码的遗传因子，于hEGF遗传因子之上流领域组建能对色氨酸合成酶系遗传因子的启动子进行编码的遗传因子以及能对大肠杆菌碱性磷酸酶遗传因子信号肽进行编码的遗传因子，而在下流领域中组建连续了的2个终止密码子以及复制终止区。

Description

本发明涉及利用遗传工程的方法有效地制造人的上皮细胞成长因子（hEGF）的方法。
现在，人们已经判明hEGF与β-尿抑胃激素是同一物质，而本发明拟大量且方便地提供作为抗溃疡剂等药品为有效的hEGF。
已经公知的遗传工程之方法是以下的一系列操作：（1）把对所需物质进行编码的遗传因子组建到载体中，（2）使用该载体对宿主大肠杆菌进行转化，（3）对如此获得的转化体进行培养，（4）通过从培养液中的回收来获取所需物质，此外还进行了种种研究以通过上述方法来得到对人体有利的微量蛋白质。
Tacon，W.，Carey，N.，Emetage，S.：Molec.gen.Genet.，177，427（1980）。
Tacon，W.，et.al.：Gene        23，255（1983）。
Kawai，S.，et.al.：J.Ferment.Technol.，64，503（1986）。
oka，T.，et.al.：Proc.Natl.Acad.Sci.
USA.82，7212（1985）。还有其它的详细介绍。
根据最新技术已经公开的有这样的方法，例如通过同时具备对来自大肠杆菌碱性磷酸酶遗传因子之启动子进行编码的遗传因子和在其控制下对信号肽进行编码的遗传因子，并把对hEGF进行编码的遗传因子也组建进去而形成重组DNA。最后获得hEGF（特开昭63-003799号公报、特开昭63-003800号公报）。这里，为了达到在培养时能提高得率的目的，例如蛋白质合成能的诱导发生之前是在低温区域进行培养，而在蛋白质合成能诱导后则在高温区域进行培养，或者，蛋白质合成能的诱导发生之前在弱酸性或中性条件下进行培养，而在蛋白质合成能诱导之后则在弱碱性条件下进行培养等，已对其培养方法作了种种研究，且分别取得了成果。
根据以上所述的已有技术，则目的产物hEGF确实能够获得一定程度之得率。然而，在欲进行伴有往培养基的分泌的高密度培养时却存在着不少缺点。例如（1）按照目前的方法，还不能任意控制转化的大肠杆菌开始产生hEGF的时期，（2）因此，还不能在开始产生hEGF之前，先使转化的大肠杆菌充分繁殖，（3）因而，在进行所谓的高密度培养（在本发明说明书中，它是指对借助400        D550以上的大肠杆菌所进行的培养）之时，转化的大肠杆菌不能够控制产生hEGF之过程。
再者，在原理上也不可能适用高密度培养中所必须的Fed-Batch法（在培养过程中一边加入培养基一边继续进行培养的方法）。
根据本发明者们的实验，转化大肠杆菌一旦开始产生hEGF，就会有转化大肠杆菌本身的繁殖受到抑制的现象。其原因未必十分清楚，但是从所产生的hEGF不停留在转化大肠杆菌的细胞内或胞外质（内膜与外膜之间）中而分泌在细胞外这一hEGF特异的现象来看，可以推测在转化大肠杆菌上受有很大的应激，因此也可推测出这是由于在产生hEGF的同时转化大肠杆菌本身的繁殖受到抑制的缘故。
根据以上分析，为了实现高密度培养，有必要在使转化大肠杆菌充分繁殖的时候开始hEGF的产生，为此，就必须做到能对hEGF产生的时间进行任意的控制。
本发明的要点为以下各点：
（1）作为启动子应使用能对trp合成酶系遗传因子的启动子进行编码的遗传因子。
（2）应通过添加3-吲哚丙烯酸（IAA）来对转化大肠杆菌产生hEGF的时期进行控制。
（3）在培养时应使用能对需添加的培养基的添加速度进行变化的Fed-Batch法。
（4）添加培养基的碳源应为葡萄糖、甘油或葡萄糖与甘油的组合物。
（5）进而，在上述（4）中，在使用Fed-Batch法之基础上，作为添加培养基的碳源，应在使用了葡萄糖之后再使用甘油。
以下，就上述各点进行详细描述。
在作为启动子而适用来自大肠杆菌碱性磷酸酶遗传因子的物质时，由于培养基中磷酸盐的存在，hEGF的产生能已停。通过转化大肠杆菌繁殖并在该过程中磷酸盐被消耗而下降到一定浓度，来自大肠杆菌碱性磷酸酶遗传因子的启动子就开始工作，于是开始产生出hEGF。现有技术是通过调节培养液的pH及温度来提高其hEGF的产生能的。
在本发明中，不是使用来自大肠杆菌碱性磷酸酶遗传因子的启动子，而是使用上述trp合成酶系遗传因子的启动子。
根据本发明，是在培养基中事先加入50mg/l左右的色氨酸。随着转化大肠杆菌的繁殖，色氨酸被消耗，降到一定浓度以下之后，trp合成酶系遗传因子的启动子开始工作，于是hEGF开始产生，但如有足够的色氨酸存在于培养基中，则本发明的启动子就不会开始产生hEGF。另外，如以后的实施例所示的那样，尤其是转化大肠杆菌具有一旦分泌hEGF、就会减弱繁殖速度或停止繁殖这样的性质。
由此而了解到，由于具有本发明所用的trp启动子的发现分泌的质粒载体，能容易地进行严密的发现控制，从而极其适合于利用在后述的转化大肠杆菌的高密度培养中。即，为了把hEGF的产生量提高到150mg/l以上，在色氨酸的存在下进行培养，并在转化大肠杆菌已繁殖到充分的高密度时，快速地加入IAA，然后经过短时间（10-18小时）之后，能从培养基中回收产物。
此外，在Fed-Batch法的添加培养基中不事先加入葡萄糖而加入甘油，或者在添加过程中通过把葡萄糖变更为甘油，就可能象以后将说到的那样巧妙地控制trp启动子工作的开始时期。
然而，IAA是色氨酸结构的类似体，而且对于阻遏物蛋白的亲和性要比色氨酸还强，所以通过优先与阻遏物结合来防止阻遏物与启动子（操作者）的结合。因此，即使在培养基中存在着色氨酸之情况下，也能由于在培养基中添加IAA而使该启动子开始工作。
由于以上原因，故能够理解到，在本发明中，在培养过程中的任何一个阶段，通过添加IAA都可使得在高密度培养条件下的往培养基中的分泌所导致的hEGF的产生得以开始。本发明的重要内容实际上就在这里。
如果提高转化大肠杆菌的繁殖，那么可断定其后的hEGF之产生是随之成比例提高的。通过对培养基本身的研究，或通过Fed-Batch法的适用，能提高培养基中转化大肠杆菌的密度，所以如果在通过高密度培养提高了转化大肠杆菌的繁殖之后，使hEGF开始产生，就能以相应的有效率来获得hEGF。
在本发明中，可适当使用通常的遗传工程学上常用的方法。例如，作为宿主大肠杆菌的可使用来自广泛使用着的K12的大肠杆菌株，又，作为载体可以对市售的质粒按遗传工程的方法进行重组。更具体地讲，在本发明中可以使用以下的大肠杆菌。
JM101、TB1、HB101、RR1、DH1、MM294、C600galk-、Y1090（pMC9消失株）
此外，还可使用它们的诱发株。
另外，在本发明中，例如可以使用以下的质粒以及噬菌体DNA。
pDR540[フアルマシヤ公司制造]、M13mp18以及mp19（宝酒公司制造）
再者，在本发明中，还可把以下的培养基用作基础培养基以及添加培养基。
LB培养基（10g/l巴克土（バクトトリプトン）5g/l酵母抽捉物、5g/l食盐）。
M9培养基（6g/l磷酸氢二钠、3g/l磷酸二氢钾、0.5g/l食盐、1g/l氯化铵、2mM硫酸锰、0.1mM氯化钙）
4YTM9培养基（在M9培养基中添加以下成份。32g/l巴克土（バクトトリプトン）、20g/l酵母抽提物）。
另外，在平板培养基上可加入琼脂以使之达到1.5%，而在M13噬菌体上层培养基中可加入琼脂以使之达到0.6%，然后进行调制。在所有含质粒的大肠杆菌的培养过程中，可在培养基中加入氨必西林且使其达到100mg/l之浓度，以防止质粒的脱离。
作为本发明中所使用的限制酶和DNA修饰酶，可适合于使用通常的遗传工程学上常用的方法。例如，可适宜于使用宝酒制造公司、东洋纺织公司、フアルマシヤ公司以及バ-リンガ-マンハイム公司制造的产品。在本发明中，这些产品的使用可通过以下说明书以及文献来进行（Molecular        Cloning;a        Laboratory        Manual.Cold        Spring，Harbor        Laboratory，Cold        Spring        Harbor，New        York）。
另外，在本发明中，大肠杆菌的转化、质粒的精制以及噬菌体DNA的精制，可适宜于使用通常的遗传工程上常用的手法。另外，也可按照文献（Molecular        Cloning）的记载及说明书进行精制。
本发明中的低（聚）核苷酸可以通过通常的DNA合成中常用的方法（例如トリエステル法）进行合成。另一方面，也可以利用市售的DNA合成机（Applied        Biosystem公司制造，型号380        B）进行合成。
此外，本发明中的低（聚）核苷酸的连接，可适合于采用通常的遗传工程学上常用的方法。具体地说，把各合成的低（聚）核苷酸1μg放在20μl的磷酸二氢钾激酶缓冲液（根据Molecular        Cloning）中进行磷酸化处理，然后进行混合，在70℃下加热10分钟之后，又化1小时逐渐冷却至室温，接着，加入与混合液同量的1倍浓度的磷酸二氢钾激酶缓冲液，又加入T4        DNA连接酶，在16℃下放置一个晚上。以后，在70℃下加热10分钟以使T4连接酶失活，再根据乙醇沉淀法交换该缓冲液，然后，为生成目的产物的断片而用两端的限制酶加以切断后，再用8%的聚丙烯酰胺块的凝胶电泳进行区分。用借助缓冲液进行的提取法（根据Molecular        Cloning）从含有目的产物的DNA断片的凝胶提取出DNA并加以精制。这种方法是本发明的低（聚）核苷酸的连接的典型例子。
作为本发明的目的物的hEGF量的测定可适宜使用通常的遗传工程学上常用的方法。具体地说，例如可以市售的hEGF[湧永制药公司制、アマシヤム公司制]为标准，利用放射免疫测定（使用アマシヤム公司的仪器）进行测定。
以下，通过揭示参考例以及实施例来对本发明作更详细的描述。
参考例1
发现分泌的质粒的制备
（1）trp启动子、SD排列、大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽遗传因子的合成。
把要利用的trp启动子及其SD序列（Shine-Dargarno核蛋白体结合部位），规定为以复制开始点的A为+1时的-60位的T至+26位的A。在-60位的T的5′一侧考虑与载体的连结，而设置Hind        Ⅲ切断点。大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽遗传因子是根据天然排列的，但是考虑到与载体的连结以及往hEGF遗传因子的连结，则把开始密码子的GTG变更到ATG，把C末端的GCT变更到GCG，并在其3′一侧设置EcoRⅠ切断点。把以上的排列分成8个低（聚）核苷酸加以合成，根据常用的方法进行连结，接着作为Hind        Ⅲ-EcoR        IDNA断片加以精制。此外，把该断片插入在M        Bmp18噬菌体复制型DNA的Hind        Ⅲ-EcoR        Ⅰ切断点之间，并通过dideoxy法确认其碱的排列（图1）。
（2）hEGF遗传因子的合成。
hEGF遗传因子的排列，是以天然的hEGF的氨基酸排列为基础而加以设计的。在设计排列时考虑了：使用大肠杆菌中使用频率较高的密码子，除去能获得二次结构那样的反复排列，在遗传因子中途为设置连结遗传因子而必要的Sph        Ⅰ切断点。
具体地说，是作为由21个低（聚）核苷酸构成的EcoR        Ⅰ-SacⅠ        DNA断片而制作了hEGF遗传因子。
首先按照普通方法，对构成前半部分的EcoR        Ⅰ-Sac        Ⅰ        DNA断片的11个低（聚）核苷酸进行合成、连结，并将其插入在MBmp18噬菌体复制型DNA的EcoR        Ⅰ-Sac        Ⅰ切断点之间。再采用dide-oxy法确认碱的排列。
接着，也采用常用的方法，对构成后半部分的Sph        Ⅰ-Sac        ⅠDNA断片的10个低（聚）核苷酸进行合成和连结，并将其插入MBmp18噬菌体复制型DNA        SphⅠ-SacⅠ切断点之间，再采用dideoxy法确认碱的排列。
从各自的重组M13噬菌体的复制型DNA，切出前半部分的EcoR        Ⅰ-SacⅠ        DNA断片和后半部分的SphⅠ-SacⅠ        DNA断片，并进行连结，从而制备了hEGF遗传因子。
已完成的hEGF遗传因子上，5′末端变为Eco        RⅠ切断点，这部分相当于hEGF的N末端氨基酸的天门东酰胺。3′末端变为Sac切断点，并形成在它的前面，连续着终止密码子TGA、TAG。此后，把连结了的hEGF遗传因子的Eco        RⅠ-SacⅠDNA断片插入M13mp18噬菌体复制型DNA的EcoRⅠ-SacⅠ切断点，再通过dideoxy法再次确认了碱的排列（图2）。
（3）发现分泌的质粒的制备
首先，通过使用DNA聚合酶Klenow断片和T4连接酶（ligase）的常用方法，使pDR540（ファルマシヤ公司制造）的EcoRⅠ切断点消失，从而制备了pDR540 E-质粒。
此后，在该pDR540 E-DNA的BamHⅠ切断点插入按照通常的方法合成并连结的联结子，并重新导入EcoRⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、PvuⅡ切断点。
再者，在该PvuⅡ切断点插入TrpA终止区序列（フアルマシヤ公司制造），从而制备pATGt质粒。在该pATGt质粒DNA的EcoR        Ⅰ切断点与SacⅠ切断点之间插入含有合成hEGF遗传因子的EcoRⅠ-SacⅠDNA断片，从而制备了pBT19质粒。
接着，把含有trp启动子、SD序列、大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽遗传子的HindⅢ-EcoRⅠDNA断片插入在pBT19的Hind        Ⅲ切断点与EcoR        Ⅰ切断点之间，从而制备了有hEGF分泌发现的质粒pBT23（图3及图4）。
参考例2
hEGF的发现及其分布
使用pBT23DNA，对大肠杆菌C600galk-进行转化，从而获得保持了BT23的转化大肠杆菌。
在0.1l的LB培养基中对保持有该pBT23的C600galk-株进行一夜的振荡培养，并把它作为前培养液。然后在0.5l的振荡烧杯中于0.2l的M9培养基内（含有5g/l的酷蛋白氨基酸、2g/l的葡萄糖、10mg/l的维他命、100mg/l的氨必西林），对上述的前培养液进行4ml植菌（2%植菌），接着在37℃下进行125次/分的振荡，加以培养。在对数繁殖初期（这时的OD约为0.1），添加3-吲哚丙烯酸（IAA），使其达到20mg/l的浓度，进而进行trp启动子的诱发。在培养开始的1、2、4、6、8、24小时后取得试样，进行离心分离而分离出培养基和菌体成分，再通过浸透压振动法（ショツク）从菌体中进一步分离出胞外质组分。培养基和胞外质组分中的hEGF量，通过放射免疫测定法（マシヤム公司的仪器）被作了测定。其结果显示在表1。
表1        hEGF的分布
hEGF量（mg/l）
培养时间        胞外质        培养基
1        0.011        0.017
2        0.016        0.030
4        0.022        0.190
6        0.017        0.430
8        0.014        0.490
24        0.004        0.730
培养开始的24小时后，培养基中hEGF的量为0.73mg/l，成为最大。积蓄在胞外质中的hEGF的量在培养了4小时后达到最大，其量至多不过0.02mg/l之程度，而培养了24小时后，该量就减少，几乎不再存在。
由此可以确认，被分泌的hEGF的几乎全部是存在于培养基中的，因此在以后的实验中对于产生的hEGF，只沉淀了培养基中的量。
参考例3
对宿主大肠菌杆株的探讨
使用pBT23DNA，对大肠杆菌HB101，RR1、DH1、MM294、Y1090（pMC9消失株）、JM101、TB1株进行转化，获得了分别保持了其pB23的转化大肠杆菌。
在与参考例2相同的条件下，与先前的C600yalk转化株一起，进行了培养。借助IAA进行的trp启动子的诱发是在培养开始后的9.5小时时进行，并测定了此时与24小时后培养基中的hEGF的量（表2）。
表2        各种转化大肠杆菌的hEGF量
hEGF量（mg/l）
大肠杆菌株        9.5小时        24小时
C600galk-0.54 1.25
HB101        0.54        1.25
RR1        1.23        0.93
DH1        0.64        0.45
MM294        0.28        0.50
Y1090（pMC9消失株）        0.03        0.02
JM101        0.81        0.67
TB1        2.30        4.00
在8种转化大肠杆菌中，以TB1的产生量为最多，达到了4mg/l。其次是C600galk-和HB101，它们均为1.25mg/l，可以认为这些菌株适合于hEGF的产生。
参考例4
对rep启动子衍生时期的探讨
采用保持有pBT23的HB101转化株，在与参考例2相同的条件下进行培养，在对数繁殖中期、后期和定期中分别添加IAA并使它达到20mg/l并测定了培养基中的hEGF的量。其结果显示在表3。
Figure 891045716_IMG1
可以看出，在对数繁殖中期或定期中添加IAA可获得较多的hEGF的产生量。
参考例5
培养基组成与hEGF的产生量
采用保持有pBT23的TB1转化株，在与参考例2相同的条件下进行了培养（作为培养基的是使用表4的物质）。在把4YM9、M9-1、M9-2用作培养基的场合，经过5小时后添加IAA以使其达到20mg/l，而把M9-3、M9-4用作培养基的场合则经过9小时后添加IAA以使其达到20mg/l，并测定了24小时以后的培养基中的hEGF的量。
表4        培养基组成
4YM9 M9-1 M9-2 M9-3 M9-4
M-培养基                                                        ←                                                                ←                ←                            ←
バヶトトリプトン32g/l    酪蛋白氨基酸10g/l        5g/l                ←                        2g/l
酵母抽提物20g/l                        葡萄糖        5g/l                            ←                    2g/l                        ←
                                                                                    维他命    Bi10mg/l                ←                        ←                            ←
氨比西林100mg/l ← ← ← ←
表5        培养基组成和hEGF产生量
hEGF量（mg/l）
培养基        9小时后        24小时后
4YTM9        0.04        0.09
M9-1        0.68        0.70
M9-2        1.98        1.69
M9-3        3.03        7.25
M9-4        0.91        2.38
在使用M9-3培养基（含有5g/l酷蛋白氨基酸2g/l葡萄糖）之场合，hEGF的产生量达到最大，为7.25mg/l。此外还了解到，以含有大量色氨酸的天然成分为主体的培养基中，hEGF的产生量较少。
参考例6
对基于培养基中的色氨酸的trp启动子的控制
以上各参考例中的培养是这样一种自然诱发系统，即，在培养基中不含有色氨酸，从来自前培养液的色氨酸随着大肠杆菌的繁殖而下降到一定浓度以下的时期开始就发生了trp启动子的诱发。在该系统中，作为诱发物质的IAA尽管能使hEGF的产生量增加，但并未直接使诱发启动子的开关打开。
因此，我们决定事先在培养基中加入色氨酸，以查明能否抑制来自trp启动子的诱发，又，即使能抑制，则能否通过添加IAA来解除抑制。
所加的色氨酸的量为1、3、10、20、30、40mg/l，此外，按照表6所示的浓度加入IAA。
使用保持有pBT23的HB101转化株，在使培养基及其条件与参考例2相同的情况下进行了培养。另外，在培养开始的5小时以后添加IAA，并测定了培养基中的hEGF的量。其结果显示在表6。
表        6-1        培养基中色氨酸的浓度与hEGF产生量
Figure 891045716_IMG3
加入培养基中的色氨酸的浓度在10mg/l以下时，hEGF产生量为6-10mg/l，然而，色氨酸的浓度为20-40mg/l时，EGF的产生量为1-1.5mg/l，已大幅度减少了，从而了解到一定浓度以上的色氨酸会抑制hEGF的产生。
另外，在色氨酸浓度为20mg/l的场合，如添加20或40mg/l        IAA，则hEGF的产生量增加了约8倍，但添加80mg/l时，hEGF产生量的增加停留在约4倍。在色氨酸的浓度为30-40mg/l时，添加80mg/l        IAA而导致的hEGF产生量的增加为1.5倍，相当小。
从以上结果查明了添加适当量的色氨酸（这里为20mg/l）可抑制自trp启动子的诱发，另外，添加IAA（20-40mg/l）可解除这种抑制，并使trp启动子的开关打开。另外，已知，添加微量的色氨酸可促进转化大肠杆菌的繁殖（通过添加10-40mg/l的色氨酸，菌体量会变为1.5-2倍）。另外也已明白，40mg/l以上的过剩量IAA的添加会抑制大肠杆菌的繁殖，因而招致hEGF产生量的低下。
综上所述，得到以下结论。
（1）作为目的物的hEGF，通过充分的培养几乎全部进入到培养液中。
（2）作为宿主大肠杆菌适当的有HB101、TB1或C600galk。
（3）通过IAA进行的trp启动子的诱发，在繁殖后期进行为最适合。
（4）作为培养基为适当的物质有，在M9培养基中加入了5g/l酷蛋白氨基酸、2g/l葡萄糖、10mg/l维他命B1的物质。
（5）培养基中即使存在着色氨酸，但通过添加IAA能进行trp启动子的诱发。
以这些事实为标识，可推测出，我们能够从事通过发酵罐进行的大量的高密度培养，并进行了以下实验。并且，探讨了耐大量实验的大肠杆菌培养上清液中的hEGF的精制法，并设计了以下方法。
实施例1
hEGF的精制法
（1）被阳离子交换树脂（BIO-REX70;バイオテッド公司制造）的吸附（pH3.0）→溶出（醋酸铵pH8.0）→透析（醋酸氨pH5.5）。
（2）阴离子交换柱色谱分析（Q-Scpharose        Fast        Flow;フアルマシヤ公司制造，醋酸铵pH5.5）。
（3）逆相（C18）柱色谱分析（Pep        RPC;フアルマシヤ公司制造，0.1%三氟醋酸/乙腈）→冻结干燥。
该方法不但全部工序只需2-4天，而且不包括通常所使用的硅胶过滤色谱法，因此较容易扩大其规模。
例如，使用该方法，能够从101的培养上清液得到10mg的精制hEGF。
精制hEGF具有与天然型相同的氨基酸组成以及与天然型相同的N末端的氨基酸排列。再者，精制hEGF在以下所述实验中显示了其生物活性。
实施例2
与EGF受体的结合能
按照以下所述的方法，确认了精制hEGF的与人细胞表面EGF受体的结合能。
在含有10%的牛胎血清（ギブコ公司制造）的グルベッコ变法イ-ゲル培养基（DMEM培养基：ニッスイ公司制造）中悬浊人A431细胞，且使其浓度达10细胞ml。然后，在24个洞的培养板上以每一个洞1ml地加入该细胞悬浊液，并在37℃、5%CO2的条件下进行了24小时的培养。接着用含有50mM的N，N-二（2-羟乙基）-2-氨乙基磺酸（BES，pH6.5）、0.1%牛血清白蛋白（BSA：シグマ公司制）的DMEM培养基（结合用缓冲液）对细胞洗净2次，此后加入含有0.2ng/ml的125I标识的hEGF（アマシヤム公司制）与0.1-10，000ng/ml的hFGF的结合用缓冲液（0.3ml）。
在室温下放置1小时之后，用结合用缓冲液对细胞洗净2次，在每一个洞中加入0.3ml的0.2M的氢氧化钠溶液，细胞溶解之后，最后测定了与EGF受体结合的I-hEGF的放射活性。其结果显示在表7。
表7        精制hEGF的与人EGF受体的结合能
hEGF，ng/洞/104细胞 结合阻害率（%）[精制hEGF]
0.1        0
1        8
10        38
100        82
1，000        95
10，000        98
根据以上结果可确认，精制hEGF具有人培养细胞与EGF受体的结合能。
实验例3
细胞繁殖促进作用
根据以下所述方法，确认了精制hEGF的细胞繁殖促进作用。
在含有10%牛胎血清的DMEM培养基中按10细胞/ml的比例悬浊了鼠Swiss3 T3细胞。然后在24个洞的培养板上按照每1个洞1ml的量加入该细胞悬浊液，接着在37℃且5%CO2的条件下进行培养直到细胞达到对数繁殖中期为止。此后，把培养基与含有0.2%牛胎血清的DMEM培养基进行交换，又在37℃且5%CO2的条件下继续进行培养。在几乎所有的细胞都进入定期之处，加入hEGF，再培养8小时。在每一个洞里添加0.5μCi的[甲基-3H]胸腺密啶核苷（247.9G Bq/mmol;アマシヤム公司制造），培养了24小时以后，测定了进入细胞内的[H]-胸腺嘧啶核苷的放射活性。其结果显示在表8。
表8        精制hEGF的细胞增殖促进作用
浓度 ［3H]胸腺嘧啶核 比率
(ng/ml) 苷的进入(cpm)
                    0.0                                                        2864                                                                        1.00
                    0.3                                                        3671                                                                        1.28
                    1.0                                                        3753                                                                        1.31
3.0 4742 1.66
从以上的结果证实了精制hEGF的细胞繁殖促进作用。
实验例4
豚鼠胃壁细胞中酸生成的抑制
根据以下所述方法，就精制hEGF在分离壁细胞中胃酸生成的抑制作用，以14C-胞嘧啶（AP）积蓄为指标进行了确认。
在100%的氧气通气条件下于37℃中对分离壁细胞悬浊液[含有1.80×105细胞/ml、0.2%BSA的Hanks液（ニッスイ公司制造）]进行了20分钟的保温，然后加入0.1 μCi的14C-AP（4.37GBq/mmolアマシヤム公司制造）、精制hEGF以及作为刺激剂入加组胺（半井化学公司制造）（3μM），或加入（dibutylyl cyclic-AMP）（dbc-AMP。
公司制造），使其分别达到3μM和1mM，再次进行保温。60分钟以后，加入冰冷的Hanks液（4ml），接着通过低速冷却离心使反应停止。然后，加入2M的氢氧化钠溶液（0.3ml）使细胞溶解，又在2M的盐酸中进行中和，最后通过液体闪烁计数器测定了放射活性。
14C-AP积蓄，是从刺激时的进入值中扣除控制值，并以此为100%，用%刺激表示精制hEGF的作用，从而被显示在表9
表9        精制hEGF的酸生成抑制作用
%刺激
组铵3μM        100
组铵3μM+EGF 1nM 105
组铵3μM+EGF 10nM 38.1
组铵3μM+EGF100nM 23.1
dbc-AMP1mM        100
dbc-AMP1mM+EGF1nM 106
dbc-AMP1mM+EGF10nM 82.1
dbc-AMP1mM+EGF100nM 50.8
从以上结果可证实，精制hEGF具有抑制因组胺、dbc-AMP的任何一种之刺激所引起的豚鼠胃壁细胞的酸生成。
实施例1
[间歇法]
在通过前述烧杯培养所得到的种种见识之基础上，试验了用10升的发酵罐进行的大量培养。作为发酵罐的是使用容积为10升的东方酵母公司制的台式罐，另外还安装了能调节培养基中pH和溶解的氧气浓度的控制装置。在宿主中使用了HB101。
前培养是在LB基中进行，并对此进行2%的植菌。作为培养基的是使用M9培养基（含有5g/l酷蛋白氨基酸、2g/l的葡萄糖、10mg/l的维他命B1、100mg/l的氨必西林）6升，在37℃且1vvm通气量（体积/体积/分钟;在1分钟内用压缩机压入与培养容量相同量的空气。这里是6升/分）、溶解酸浓度为4ppm（在100-100rpm的范围内改变搅拌桨的旋转数且进行控制）、pH7.0（通过4M氢氧化钠溶液的滴入进行控制）、自动消泡（通过发酵罐上部的传感器测出发泡状态，自动地滴入硅系消泡剂进行消泡）等的条件下进行了培养。经过4.5小时之后添加IAA，添加浓度为20mg/l。
作为对照，用同样的前培养液、同样的培养基组成，并在与参考例2相同的条件下进行了烧杯培养。其结果显示在图5。
发酵罐培养也好烧杯培养也好，经过了4小时之后，hEGF开始产生，到9小时为止，保持着大体相同的产生量，但经24小时之后，可看到在烧杯中的培养，其产生量为9mg/l，而发酵罐中的培养，其产生量与经过9小时几乎相同，仅为2mg/l。
因此可知，采用通常的间歇法不可能提高hEGF的产生量。我们认为其原因是，在发酵罐培养中，培养基中溶解的氧气量和pH被保持一定，始终提供了最适合于大肠菌增殖的条件，因此，培养基中的色氨酸被消耗，下降到某一浓度以下，在trp启动子开始工作时，培养基中的营养源（碳源、氮源）就枯渴了。
所以，如下所述的那样，我们考虑了在培养基中连续地添加新培养基的Fed-Batch法。
实施例2
Fed-Batch法之一
采用与实施例1相同的培养条件，4小时之后在添加IAA的同时加入培养基（含有20g/l酷蛋白氨基酸、200g/l葡萄糖、10mg/l维他命B1、100mg/l氨比西林、20mg/l        IAA的M9培养基），使用管式泵按每小时30ml的速率添加了24小时。作为对照，也进行了烧杯中的培养。其结果显示在图6。
在发酵罐培养中，过了6小时之后，hEGF的产生量增加了，经过9小时后，其产生量为25mg/l，24小时之后为55mg/l，与实施例1的间歇法相比较约增加了25倍。
但是，其最大的产生量也只停留在55mg/l之程度，另外，菌体繁殖也为OD550的6之程度，离开高密度培养的初期目的还相当远，因此，进行了进一步探讨。
由于已知在培养基中如事先加入色氨酸，则其菌体量就会增加，因此我们决定在基本培养基中添加色氨酸来抑制trp启动子的工作，以图增加菌体量。又由于已知，此时在培养基中如残存有色氨酸，则在添加IAA时就会阻碍trp启动子的工作，因此可望，在添加IAA时，色氨酸已被分解。
另一方面，甘油与葡萄糖不一样，它不能形成对分解代谢产物的抑制。另外还知道在分解代谢产物的抑制被解除时，产生了色氨酸酶（色氨酸分解素），因而分解了大肠杆菌内的色氨酸。
所以在添加的培养基中，不是采用葡萄糖，而决定采用甘油。由此可期待如下机理，即存在于基本培养基中的葡萄糖被耗尽时，对分解代谢产物的抑制被解除，而产生色氨酸酶，色氨酸消失，trp启动子的工作开始进行。
此外，还使所添加的培养基的添加速度也随大肠杆菌的繁殖进行变化，进行了细致的研究。
实施例3
Fed-Batch法之二
除在基本培养基中加入色氨酸，以使其浓度达到30mg/l之外，使培养基组成和培养条件均与实施例1相同，从3小时后开始添加培养基（含有5g/l酷蛋白氨基酸、200g/l甘油、10mg/l维他命B1、100mg/氨必西林、5mg/l        IAA的M9培养基），4小时之后添加了IAA。又，由于过剩量的IAA会阻碍大肠菌的繁殖与hEGF的产生，因此只加入到5mg/l。
在培养基的添加中，使用了P1管式泵（フアルマシヤ公司制造）、个人用计算机（9801        VX41，日本电器公司制造）。对添加速度，是以添加过程中总计可变化49次那样编制了程序。大肠杆菌的繁殖与hEGF的产生量显示在图7。
从大肠杆菌的繁殖速度将降低的5小时之后起，hEGF开始产生，24小时以后，hEGF的产生量达到70mg/l。另外，菌体的繁殖也增加到OD550的9。
从以上结果得知，hEGF的产生量是随着菌体量的增加而增加的。
因此，为了进行更高密度的培养，对培养基组成、添加时期进行详细的研究。具体说来，在培养基中加入宿主大肠杆菌的繁殖所必须的氨基酸，在中途把添加培养基中的碳源由葡萄糖变更为甘油。
如上所述，在葡萄糖的存在下，色氨酸会伴随着大肠杆菌的繁殖而被消耗，但并不会因为色氨酸酶而被分解。于是，在最初的添加培养基中事先加入葡萄糖与色氨酸，一边抑制trp启动子的工作，一边使大肠杆菌充分繁殖，然后添加IAA，同时把添加培养基变更为含有甘油的物质，分解残存的色氨酸，以加强IAA的作用，增加hEGF的产生量。
实施例4
Fed-Batch法之三
采用与上述同样的Fed-Batch法，进行了以下的培养。
（1）培养基组成
①基本培养基
在M9培养基中加入以下物质：
2.5g/l酷蛋白氨基酸、10g/l葡萄糖、50mg/l色氨酸、0.5g/l脯氨酸、1.0g/l亮氨酸、10mg/l维他命B1、10mg/l氨必西林、微量金属盐。
②添加培养基1：
在M9培养基中加入以下物质：
40g/l酷蛋白氨基酸、300g/l葡萄糖、50mg/l色氨酸、5g/l脯氨酸、5g/l亮氨酸、10mg/l维他命B1、100mg/l氨必西林、微量金属盐。
③添加培养基2
在M9培养基中加入以下物质：
40g/l酷蛋白氨基酸、300g/l甘油、5g/l脯氨酸、5g/l亮氨酸、10mg/l维他命B1、100mg/l氨必西林、微量金属盐。
（2）培养条件：
质粒（宿主）为pBT23（HB101）
培养容量（基本培养基1添加培养基1添加培养基2）为51+0.51+1.01。
培养温度为37℃，pH为7.0。
通气量为1.5vvm（7.51/分钟）
搅拌速度为900rpm。
消泡过程为自动进行（通过滴入硅系消泡剂来进行）。
培养基添加时期：添加培养基1是在培养开始后的0.5-6小时之内（添加速度可变）;添加培养基2是在培养开始后的6-24小时之内（添加速度一定。50ml/小时）。
IAA的添加时期规定为培养开始的6小时之后，IAA的浓度为5mg/l。
前培养的培养基规定与基本培养基相同。
植菌量规定为10%。
添加培养基1的供给速度是以添加过程中合计变化20次那样编制了程序。大肠杆菌的繁殖与hEGF的产生量显示在图8。
24小时后的OD550为42，达到了培养的高密度化，于是获得160mg/l的hEGF产生量。
4.附图的简要说明
图1        显示了本发明所涉及的trp启动子、SD的序列、大肠杆菌碱性磷酸酶信号肽遗传因子的序列。
图2        显示了本发明所涉及的hEGF遗传因子的序列。
图3        显示了本发明所涉及的发现分泌质粒的制备过程。
图4        显示了本发明所涉及的发现分泌的质粒pBT23的Hind        Ⅲ-BamH        Ⅰ断片的序列。
图5        显示了实施例1的结果。横轴表示培养时间（小时），纵轴表示培养基中hEGF的量（mg/l）。●表示发酵罐中的培养;■表示烧杯中的培养。
图6        表示实施例2的结果。横轴表示培养时间（小时），纵轴表示培养基中hEGF的量（mg/l）。●表示发酵罐中的培养;■表示烧杯中的培养。
图7        表示了实施例3的结果。横轴表示培养时间（小时），纵轴表示培养基中hEGF的量（mg/l）以及菌体量（用OD550表示）。○表示菌体量，●表示hEGF量。
图8表示了实施例4的结果。横轴表示培养时间（小时）、纵轴表示培养基中hEGF的量（mg/l）、以及菌体量（用OD550表示）。○表示菌体量、●表示hEGF量。

Claims (5)

1、一种hEGF的制法是由以下一系列操作构成的遗传工程方法，即：(1)把对所需物质进行编码的遗传因子组建到载体，(2)使用该载体对宿主大肠杆菌进行转化，(3)对如此获得的转化体进行培养，(4)通过从培养液中的回收来获得所需物质，其特征在于：
(a)所需物质为hEGF；
(b)在上述(1)的操作中，于hEGF遗传因子之上流领域组建对色氨酸(trp)合成酶系遗传因子的启动子进行编码的遗传因子以及对大肠杆菌碱性磷酸酶遗传因子的信号肽进行编码的遗传因子，而在下流领域中组建连续了的2个终止密码子以及复制终止区。
2、根据权利要求1所述的hEGF制法，其特征是通过在培养时添加3-吲哚丙烯酸（IAA），对宿主大肠杆菌产生hEGF的时期及量进行控制。
3、根据权利要求2所述的hEGF的制法，其特征是培养方法是使用在添加速度上下了功夫的Fed-Batch法的高密度培养方法。
4、根据权利要求3所述的hEGF的制法，其特征是在Fed-Batch法中，作为要添加的培养基的碳源是采用葡萄糖、甘油或葡萄糖与甘油的组合物。
5、根据权利要求3所述的hEGF的制法，其特征是在Fed-Batch法中，作为要添加的培养基的碳源是使用葡萄糖之后再使用甘油。
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