CN1065292A

CN1065292A - 大量制备戊二酰酰基转移酶的方法

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Publication number: CN1065292A
Application number: CN92101783A
Authority: CN
Inventors: K-P·考雷尔; G·J·里斯; W·阿列茨
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1991-03-18
Filing date: 1992-03-17
Publication date: 1992-10-14
Also published as: KR920018222A; EP0504798B1; JP3366664B2; CZ284405B6; ATE145238T1; CY2115B1; JPH05207879A; DE4136389C2; GR3021610T3; CA2063176A1; ES2096671T3; CA2063176C; KR100211002B1; DE4136389A1; HK1006853A1; EP0504798A1; DE59207509D1; DK0504798T3; IL101258A0; CS80492A3

Abstract

本发明涉及在大肠杆菌中制备戊二酰酰基转移梅(GA)的遗传工程方法，其包括引起包含在质粒 PCM145(DSM6409)中之GA基因的表达。

Description

在以酶学方法由头孢菌素C制备7-氨基头孢菌酸时，最初是形成7β-（4-羧基丁酰氨基）头孢菌酸（戊二酰基-氨基头孢菌酸），后者须借助于戊二酰酰基转移酶（或戊二酰酰胺酶，以下简称“GA”）脱酰基变成7-氨基头孢菌酸。

R.Matsuda和K.I.Kombtsu（J.Bact.163（1985）1222-1228）已描述了以基因工程技术在大肠杆菌中生产GA的方法。然而，该方法只能使GA的比活性有少许增加（对于所用菌株从每毫克0.12单位增加到0.2单位）。

Masuda等人（上述文献）在他们的研究中使用了突变的假单孢菌GK16菌种，但没有指出其保藏登记号。作者的研究工作是从得自Fermantation Research Institute（FRI）的假单孢菌SY-77-1菌种（保藏登记号为FERM 2410）开始的。

现已发现，可从假单孢菌菌株中得到GA编码基因，并可借助该基因在大肠杆菌中产生比活性至少高五倍的酶。从此假单孢菌菌株中分离的上述酶与得自已寄存之菌株的GA差不多。

下文详细解释本发明的优选实施方案及其他方面，并在本专利权利要求中限定之。

已有证据显示，将该基因克隆到高拷贝数载体如PUC18中，在正常诱导条件下可导致对被转化细胞的杀伤。为此已构建了进行继后研究的低拷贝数载体，并已用于建立该菌株基因组的基因库。这些载体，即plac 10、plac 100和plac 200均含有已知质粒pACYC 184（A.C.Y.Chang and S.N.Cohen，J.Bact.134（1978）1141-1156）的复制原点，因此每个细胞中约存在5个拷贝。可用氯霉素选择这些载体，并进而避免可能作用于头孢菌素的β-内酰胺酶的生成。

为了鉴定GA基因，首先用PstⅠ消化含有完整基因组的基因库。用相当于Matsuda等人公开之序列的密码子30-40和41-51的2个探针找出含有3.7Kb PstⅠ插入段的克隆。然后将其重新克隆到噬菌体M13mp19中，以进行部分序列分析。结果发现在氨基酸51至209的区域内，有98%以上的序列与已公开的序列相符。然后对3.7Kb PstⅠ片段作放射标记，以其作为探针筛选将PstⅠ部分切割之菌株DNA克隆到低拷贝数载体plac 100中后所构建成的质粒基因库。进行限制性酶切分析，并与已公开资料作裂解位点的比较，结果显示克隆pCM145含有完整的GA基因及其5′和3′侧翼序列。该克隆包含载体plac 100连同约10Kb的pstⅠ插入段。它可产生约4单位/升GA。已按照布达佩斯条约的有关规定，于1991年3月8日将该克隆保藏在Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH，Braunschweig，保藏登记号为DSM 6409。

图1显示质粒pCM145的限制性酶切图。插入段中标出了对于克隆有重要意义之限制性酶切位点的编号。

在经过再克隆和亚克隆之后，有可能使GA产率增加到大约450单位/升。

已令人惊奇地发现，将发酵温度从37℃降低到23℃，较好是25-30℃，特别是27°-28℃，可使产率得到显著的改善。在这一温度下发酵有可能持续很长时间，而在37℃下用IPTG诱导大肠杆菌，则对宿主菌株是致死性的。

诱导较好在对数生长期，特别是对数生长后期进行。优选菌株是没有或只有很低酯酶活性的大肠杆菌K12菌株，因为这类菌株特别利于以这种方式处理。

生产能力可受宿主菌株的影响。例如，已证明的适用菌株有大肠杆菌MC1061（ATCC 53338）、大肠杆菌W3110（ATCC 27325）或大肠杆菌DH1（ATCC 33849）。

发酵对可使用已知的无机盐培养基和添加酵母浸膏、胨、胰酶解胨或酪蛋白氨基酸的复合培养基。本领域技术人员可根据简单地预试验很容易地确定发酵的最适条件。

当使用大肠杆菌菌株TGI（由Amersham-Buchler，Braunschweig提供）作宿主时，按下文所述的再克隆方法（实施例4）得到的表达载体T307可在工业生产条件下达到大约1000单位/升培养基的产率。质粒T307携带β-内酰胺酶基因，可利用该基因的表达产物即β-内酰胺酶来选择重组克隆。同GA一样，β-内酰胺酶也是定位在细胞周质中的分泌酶。其后令人惊奇地发现，如用氯霉素抗性基因置换部分β-内酰胺酶结构基因，可使产率得到不同程度地改善（比较实施例9，质料T347）。抗氯霉素抗性是由乙酰转移酶介导的，与β-内酰胺酶相反，该酶定位于细胞内。

如删除β-内酰胺酶的整个结构基因，而不只是该酶结构基因的一部分，特别是当删除编码与β-内酰胺酶分泌有关之信号肽的区域，并同时利用氯霉素乙酰转移酶基因作为选择的标志基因时，有可能使产率得到进一步地改善（比较实施例10，质粒T363）。

因此本发明还涉及表达载体的应用，所说的表达载体不含表达分泌型基因产物的基团或表达定位于周质中之酶的选择基因。然后有可能利用高拷贝载体，更好是没有β-内酰胺酶基因的选择载体。已进一步发现，可基于使用大肠杆菌K12菌株W3110M和MC1061获得最佳产率。另外，在这些情况下这些质粒都是稳定的，可能在发酵期间被排除掉。

然而，如果定位于周质或膜中的标志物在戊二酰酰胺酶的生产期内的表达水平能够降低到不会导致质粒不稳定的程度，则可以用该标志来代替在细胞内有活性的选择标志。一个适当的例子是TU1721的四环素抗性基团，其为受到严格调节的（Klock，G.et al.，J.Bacteriol.161，326-332 1988）或相对严格调节的、编码定位于周质或膜中之标志物的基因。

下文详细描述为获得高产率所必需之表达载体的构建。使用的酶得自New England Biolabs（Schwalbach）或Gibco/BRL（Eggenstein），并须按照制造商提供的使用说明书使用之。基因工程操作按Ausubel等人在Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Intersscience，11987及附录中详述的方法进行，在此不作过细地描述。

所有涉及质粒大小（bp）的说明均为近似数据。

下列实施例旨在进一步解释本发明的细节。除特别指出者外，所有百分比都是指重量百分比。

实施例1：质粒plac10的制备

从市售质粒325（Sigma）中分离1.1Kb EcoRⅠ-HindⅢ片段，并连接到得自载体PACYC 184的1.5Kb EcoRⅠ-HindⅢ片段上。用HaeⅡ部分消化以这种方法得到的mini-PACYC并连接到得自含有多聚接头和α-互补lac Z之市售载体PUC12的819 bp HaeⅡ片段上。将所得载体定名为plac10，所说的载体含有插入到PACYC184片段之HaeⅡ位点中的插入段，以此排列方式可使多聚接头含有处于序列Eco RⅠ-HindⅢ中的切割位点，然后是复制原点。

实施例2：载体plac100和plac200的制备

实施例1中所述的mini-PACYC含有两个与HindⅢ酶切位点相邻的ClaⅠ酶切位点。

从plac 10中删除该CaaⅠ片段即得到载体100，后者不再含有用于连接以得到mini-PACYC的HindⅢ酶切位点。

以与实施例1相似的方式用HaeⅡ部分消化plac 100，并用得自PUC18的相应片段取代带有多聚接头的HaeⅡ片段，得到载体200。

实施例3：基因库的建立

用pstⅠ彻底消化假单孢菌菌株的完整DNA，并连接到用pstⅠ切割的plac 10中。用此连接混合物转化大肠杆菌TG1（Pharmacia）。

用于筛选的是最初2个相当于前述已公开之GA序列的密码子30至40和41至50的寡核苷酸。以这种方法分离含有3.7Kb PstⅠ插入段的克隆PWK96。然后使之与两探针杂交，再克隆到噬菌体M13mp19中并作部分序列测定后，显示在氨基酸150至209的区域内，98%以上是与已公开的DNA序列相符的。与已公开的基因图相比较则显示彼此的相关酶切位点也相互吻合。

对插入段进行放射标记，并用作探针以筛选用PstⅠ部分消化完整DNA所建立的基因库，结果发现了含有约10Kb之插入段的克隆pCM145。经限制性酶切分析并与已公开的酶切位点作比较，显示已克隆了完整基因和5′与3′侧翼序列。该克隆提供了每升培养基4单位的GA产率。将其用作进行下述操作的起始材料。

实施例4：再克隆

用EcoRⅠ和HindⅢ切割质粒plac100，并将带有GA基因的片段插入到已用同样的酶切开的市售载体pUC19中。以这种方法得到的克隆T286提供了23.5单位/升的GA产率。在此情况下，有一部分酶被分泌到细胞外（在起始菌株中，该酶只见于细胞周质内）。

为了删除可能阻碍基因在大肠杆菌内表达的部分序列，基于已公开的GA基因图重新构建该基因。图1中标出了此构建中所涉及之对应限制性酶切位点的编号。

首先将大小为0.8Kb且包含SalⅠ酶切位点的BamHⅠ片段（BamHⅠ（1）-BamHⅠ（4））克隆到市售质粒pUC18中。用SalⅠ切割所得质粒并插入一个大小为0.8Kb的SalⅠ片段（SalⅠ（3）-SalⅠ（6））。用PstⅠ切割该新质粒并在其中克隆一个大小为0.9Kb的PstⅠ片段（PstⅠ（5）-PstⅠ（8）），得到克隆pT93。此外，将1.7Kb SalⅠ片段（SalⅠ（6）-SalⅠ（9））克隆到PUC18中并检查其是否以正确方向插入;结果得到质粒pT98。因为克隆的pstⅠ片段（PstⅠ（5）-PstⅠ（8））含有XhoⅠ酶切位点，故有可能通过将pT93的EcoRⅠ-XhoⅠ片段与得自pT98并且也含有复制原点和抗性基因的较大XhoⅠ-EcoRⅠ片段连接在一起，来克隆完整的基因。如此即得到质粒pT103。用其转化的大肠杆菌培养物产生浓度高达130单位/升的GA，其表达显然是受来自假单孢菌DNA的5′启动子活性控制的。

用限制性酶SstⅠ和HindⅢ消化质粒pT103后，从中分离携带GA基因的片段，然后克隆到用同种酶切割的载体plac200中，得到表达载体pT104，使用该载体质粒可使GA产率达到1000单位/升。

将重新构建的基因再克隆到市售表达载体pBtac（由Boehringer-Mannheim公司生产）的EcoRⅠ-HindⅢ酶切位点中，得到质粒pT105。以其转化大肠杆菌TG1菌株，在摇瓶中于37℃发酵温度下发酵3天后，GA产率达到288单位/升。

在载体pTrc99A（E.Amann et al.，Gene 69（1988）301-315）中克隆GA基因所需的合成接头（SEQ ID NO：1）是：

(NcoI) (StyI)

C ATG CTG AGA GTT CTG CAC CGG GCG GCG TCC GC

GAC TCT CAA GAC GTG GCC CGC CGC AGG CGG AAC

用限制性酶StyⅠ和BamHⅠ消化质粒pCM145后从中分离长度为0.57Kb的BamHⅠ（4）-StyⅠ（2）片段（在已公开的DNA序列中，StyⅠ酶切位点位于氨基酸11至13区域内）。将该片段和上述接头连接到已用NcoⅠ和BamHⅠ切割过的质粒pTrc99A中，得到丢失了NcoⅠ酶切位点的质粒T297。

另外，从质粒pCM145中分离1.5Kb SalⅠ片段（SalⅠ（6）-SalⅠ（9））和0.34Kb Bam HⅠ-SalⅠ片段并克隆到已用SalⅠ和Bam HⅠ切开的载体pUC18中。如此即得到经检查有正确SalⅠ（6-9）片段之插入方向的质粒T306。用限制性酶Bam HⅠ和HindⅢ切割质粒T306，从中分离-2.1Kb片段（其含有Bam HⅠ（4）至SalⅠ（9）位点的片段）。将该片段连接到已用Bam HⅠ和HindⅢ切开的载体T297中，得到质粒T307（图2）。以其转化大肠杆菌，于28℃下发酵2天后GA产率达到260单位/升。在改良的发酵条件下（详见下述实施例），这一产率可提高到780单位/升以上。

在37℃下用IPTG诱导该系统可导致被转化的大肠杆菌菌株死亡，这显然是由于使用了高拷贝数载体T307。因此要在低于30℃的温度下进行发酵。

实施例5：用大肠杆菌克隆进行GA发酵

可在无机盐和复合培养基上培养大肠杆菌克隆DH1 T105和TG1 T307，并使之在对数生长期产生GA。在静止期达到最大GA滴度。这表明GA产生依赖于生长速率。使用两克隆所产生的酶有50-60%在胞浆中，40-50%在周质中，最多有10%是在培养物滤液中。

为了完全释放GA，必须用超声波、French压碎机或Dyno研磨器破碎细胞。可使用十六烷基三甲基氯化铵或甲苯等去污剂溶解周质GA。加入EDTA和溶菌酶以提高效率。对最适发酵参数的初步研究表明，这些克隆可在25℃-37℃的温度范围内生长并产生GA。但在30℃以上的温度时，须使氧分压保持在5%以下。在GA产生所需的28℃生长温度下发酵时，可使细胞倍增时间增加到2小时以上;在这些条件下，GA生产不再依赖于低氧分压（pO₂）。已发现基于体积的GA生产率（单位/升培养物）和生物量浓度（克/升）之间存在着特殊的相互关系。

实施例6：在无机盐培养基中产生GA

克隆TG1 T307在YT一甘油培养基中于-18℃下保存：

甘油 17.0%

酵母浸膏 0.7%

细菌胰酶解胨 0.4%

NaCl 0.4%

氨苄青霉素 50μg/ml

由此悬浮液制备含同样培养基的琼脂平皿并于28-37℃下保温24小时，经接种单个菌落后进行预培养。

pC培养基：细菌胰酶解胨 1%

酵母浸膏 0.5%

NaCl 0.5%

氨苄青霉素 50μg/ml

（pH7.2）

将100ml该营养液加于300ml培养瓶内，接菌后于28℃和以220rpm旋转保温24小时。保温后培养物的OD₅₇₈nm为3.0。

用2%预培养物接种下列主培养物（25ml营养液/300ml培养瓶）并以220rpm在28℃下保温24-74小时：

无机盐培养基：（重量%）

NaH₂PO₄1.110

Na₂HPO₄3.680

KCl 0.100

（NH₄）₂SO₄0.325

MgSO₄·7H₂O 0.200

柠檬酸 0.390

甘油或葡萄糖 4.000

Fe₂（SO₄）·3H₂O 0.0250

微量元素溶液 0.1000

pH 6.0-6.5

微量元素溶液（重量%）

H₃BO₃0.208

（NH₄）₆MO₇O₂₄0.080

ZnSO₄·7H₂O 0.160

MnSO₄·4H₂O 0.160

CuSO₄·5H₂O 0.160

KI 0.048

50小时后，生物量浓度为11克/升;GA产率为39单位/升。

实施例7：在复合培养基中生产GA

菌株维持和预培养同实验例6，但其中用5升发酵罐接种下列复合培养基（3升）：

复合培养基：细菌胰酶解胨 1%

酵母浸膏 0.5%

NaCl 0.5%（pH7.2）

发酵参数：28℃，400rpm;0.5vvm

发酵时间：24-72小时

72小时后生物量：湿重7克/升

72小时后GA：460单位/升培养液;

66单位/克湿重

在补充含量的复合培养基中生产GA

按实施例7所述的相似方法，在下列培养基中培养克隆TG1 T307：

复合培养基：细菌胰酶解胨 2%

酵母浸膏 1.0%

NaCl 0.5%

pH 7.2

发酵参数：28℃，500rpm;0.8vvm

53小时后生物量：温重15克/升

63小时后GA：780单位/升培养液

52单位/克湿重

本实施例显示了生物量增加与以体积为基础之生产率增加之间的关系。

按实施例7所述的相似方法培养菌株DH1 T104，70小时后生物量浓度为11克湿重/升培养液，GA活性（以体积为基础）为1040单位/升培养液（97单位/克湿重）。此与大约1单位/毫克蛋白质的比活性相当。

实施例8：GA生产的可诱导性

在对数生长后期，用IPTG（终浓度为1-5mM）诱导克隆TG1 T307，在5-10小时内产率增加60%。

实施例9：质粒T347

用DraⅠ酶完全消化从菌株TG1（T307）中分离的质粒DNA，从用于分离各片段的0.6%琼脂糖凝胶中电洗脱分离含复制原点和处于Trc启动子控制下之GA基因的较大片段。

用限制性酶HaeⅡ消化载体pACYC184（Chang and Cohen，J.Bacteriol.134，1141-1156，1978），从中释放含有CAT基因和其调节区的约1.3Kb的DNA片段。在琼脂糖凝胶中分离后，经电洗脱得到该片段。用限制性酶HaeⅡ切割，在该片段的两端产生不适于与带有平头的上述DraⅠ载体片段连接的3′突出未端。因此须用核酸外切酶S1切掉HaeⅡ片段的突出末端，然后在4种三磷酸脱氧核苷酸存在下用DNA聚合酶Ⅰ处理之。

借助DNA聚合酶将以这种方法制得的HaeⅡ片段与DraⅠ载体片段连接在一起，并转化到大肠杆菌MC 1061中。根据氯霉素抗性和GA酶的合成选择适当的大肠杆菌重组体克隆。用Schibuja检测法检测GA的产生量。重组体克隆含有质粒T347，其限制性酶切图如图3所示。CAT基因在载体中的定位对GA的表达水平并不严格。

实施例10：质粒T363

业已发现，当延长大肠杆菌MC1061（T347）的发酵时间时，在用IPTG诱导GA表达后携带质粒之细胞的数目有不同程度的降低。推测这种不稳定性的原因可能是由于剪短了包括大约69个氨基酸并含有信号肽的β-内酰胺酶蛋白质，而且通过β-内酰胺酶启动子产生的β-内酰胺酶之残基仍然存在。因为不能通过在CAT基因克隆来阻止其表达，这样就可能导致阴性选择压力，即质粒丢失。为了得到在整个发酵期间能稳定保存的质粒，用限制性酶SspⅠ和DraⅠ双重消化质粒T307。在0.6%琼脂糖凝胶中电泳分离后，以电洗脱法得到两最大的片段，其一方面含有复制原点，另一方面又含有连同其Trc启动子部分的GA基因。按实施例9中所述方法制备含有CAT基因的HaeⅡ片段并借助DNA连接酶将其与上述两片段组装在一起。将此连接混合物转化到大肠杆菌菌株MC 1061中。基于其在氯霉素存在下生长及产生GA酶的能力选择重组体克隆。

用携带质粒T363的重组体大肠杆菌克隆达到了最佳产率。质粒T363的限制性酶切图示于图4中。

实施例11：大肠杆菌菌株W3110（T347）和W3110（T363）的发酵

培养条件：

除可变参数外，所有培养物均在下述条件下培养，这些条件对于两克隆都相同：

克隆在XT-甘油培养基中于-18℃下维持：

甘油 17.0%

酵母浸膏 0.7%

细菌胰酶解胨 0.4%

NaCl 0.4%

氯霉素 25μg/ml

由此悬浮液制成含同样培养基的琼脂平皿并于28℃保温24小时，用单一菌落接种预培养物（pC）。

pC培养基：细菌胰酶解胨 0.1%

（NL5295）酵母浸膏 0.5%

NaCl 0.5%

氯霉素 25μg/ml

pH 7.2

在300ml培养瓶内加入100ml该营养液，接种后以220rpm于28℃下保温24小时。保温后培养物的OD₅₇₈nm为6.0-8.0。

用5-10%该预培养物（基于PC OD₅₇₈nm＝3.0）接种下述主培养物（MC）：

MC培养基：NL5292+1ml Desmophen

20.0g/L酵母浸膏（Oxoid）

1.2g/L NaH₂PO₄·H₂O

8.5g/L Na₂HPO₄·2H₂O

1.0g/L KCl

2.0g/L MgSO₄·7H₂O（单独高

压灭菌）

0.25g/L 柠檬酸

5.0g/L NH₄Cl

4.0ml/L SLA 5029

0.005g/L硫胺素→过滤除菌

（5mg/10ml→0.5/50ml N1）

pH＝6.5

发酵条件：温度：28℃

体积：3.5L

vvm：0.75

rpm：500（r＝7cm）

pH：7.0±0.2（用25%NH₄OH维持恒定）

分批进料：甘油溶液：525克甘油（99%）/升MC

培养基（无酵母浸膏和NH₄Cl）

进料速率：3.4ml/升·小时，连续加入（发酵罐中最大甘油浓度：0.2%）或分次加入

给料开始：在pO₂＝40-50%，或发酵约7小时后，OD₅₇₈nm＝7-9时

进料持续时间：40-60小时

pO₂：稳定在大约40%

诱导：发酵约20小时后且生物量浓度达到70-80克湿重/升后用IPTG（终浓度1mM）诱导。

甘油进料应在此后持续4-40小时。

收获：诱导后24-48小时收获。

在大肠杆菌T347中表达GA

在使用克隆T347时进行分批进料发酵，目的不仅是为了增加生物量，而且旨在证明GA的可诱导性。为此，研究了甘油进料的各种方式及其对IPTG诱导作用的影响：

上表说明生物量的增加与GA增加之间密切相关，而且显示IPTG提高GA表达水平不受铵的限制，但受浓度在0.2%以上之甘油和葡萄糖的阻遇。已证明IPTG作为诱导剂浓度在1mM足以发挥作用。最适诱导的时间是当培养物进入生长静止期时。

对该构建体之质粒稳定性的研究表明，在诱导时（发酵约40小时）只有60%的克隆含有质粒，并且在加入诱导剂后24小时内丢失质粒。在连续培养中检测质粒半寿期大于50小时。

在大肠杆菌T363中表达GA

在发酵72小时后，克隆T363具有仍存在于所有细胞内的质粒。使用该克隆可在发酵后达到明显更高的GA浓度。在上述最适分批进料条件下，在大约20小时内每升培养液可达到100克生物量（湿重）和7，000-12，000单位GA。此GA活性最多有40%是在胞浆中。

为了阐明影响诱导作用的各因素，详细研究了下列参数：

1）发酵温度

在25-28℃的温度范围内，基于体积的产率达到最高，同时达到最大比活性。在37℃条件下，克隆生长明显减缓而减少了生物量，且表达最大只有20单位GA/升。诱导时将温度由37℃改为28℃也不会导致GA表达。

2）复合氮源

就保证基于体积的GA生产率来说，有可能用Bio Bprnger或Marcor提供的酵因浸膏代替得自Oxoid的。使用其他复合氮源，如Sheffield提供的NZ胺A、B、E和L，以及乳清蛋白、大豆蛋白胨、Bacto胨，仍可提供50-70%基于体积的活性。就GA比活性来说，使用NZ胺、乳清蛋白和Bacto胨通常可达到更高值。

迄今酵母浸膏（15-30g/L）是最好的复合氮源。

3）诱导剂浓度

用1-10mM IPTG所作的研究表明，1mM诱导剂即是以引起最好的GA表达，但更高浓度时未见有不利影响。

4）氧供应

在诱导时，大肠杆菌T363产生了大约占其80%的生物量需氧量约为50mmol/升。小时。为此须使pO₂保持在40%饱和度。pO₂对诱导本身中只起小部分作用，只要能保持在10%饱合度以上即可。

实施例12：大肠杆菌K12（GA）的发酵

菌株：大肠杆菌KR W3110M₈δM15Lac I^qpT363/33。

菌株维持：于-74℃（深冻）下在安瓶（16.67甘油原料加在2×LB培养基中）储存。

2×LB培养基：Bacto胰酶群胨（Difco）20g/L

Bacto酵母浸膏（Difco）10g/L

NaCl 5g/L

振荡培养：用安瓶内容物接种1000ml含有25mg氯霉素（培养基灭菌后通过除菌滤器加入）的2×LB培养基（在2升钢瓶中）于28℃下在振荡器（250rpm，动幅1.25cm）上保温4-5小时，直到OD值为1.0。

预发酵阶段：用1升振荡培养物（OD 1.0）接种DT发酵罐（有效容积200升）。生长约6小时后，OD值达到3-4即转移到主发酵阶段。

预发酵培养基：

酵母浸膏（Bio Springer） 20.00g/L

Na₂HPO₄0.24g/L

NaH₂PO₄1.70g/L

KCl 0.20g/L

MgSO₄·7H₂O 0.40g/L

柠檬酸 0.05g/L

（NH₄）₂SO₄1.00g/L

硫胺素/HCl 1.00mg/L

微量元素溶液5029 0.03ml/L

Desmophen 3600 0.18ml/L

微量元素溶液5029：

CoCl₂·6H₂O 2.00g/L

NiCl₂·2H₂O 0.08g/L

CuCl₂·2H₂O 0.08g/L

ZnCl₂0.80g/L

H₃BO₃4.00g/L

Na₂MoO₄·2H₂O 2.40g/L

FeSO₄·7H₂O 1.60g/L

用HCl将pH调至2.5

EDTA 0.40g/L

在预发酵阶段保持下列条件

温度：28℃;压力：1.0巴;空气输入量：7m³CSTP/小时;转速：最大175rpm;pH：用NH₂气维持在7.2（接种前，培养基的pH从大约3.0-3.5提高到7.2）。

主发酵阶段：用DT培养液接种ET发酵罐（有效容量2m³（10%）。发酵时间为60-80小时。

主发酵培养基：

酵母浸膏（Bio Springer） 20.00g/L

Na₂HPO₄1.20g/L

NaH₂PO₄8.50g/L

KCl 1.00g/L

MgSO₄·7H₂O 2.00g/L

柠檬酸 0.25g/L

（NH₄）₂SO₄5.00g/L

硫胺素/HCl 5.00mg/L

微量元素溶液5029 0.50ml/L

Desmophen 3600 0.30ml/L

发酵条件如下：

温度：28℃;压力：1.0巴;功率输入：2.5KW/m³;转速：120rpm（涡轮搅拌器直径600mm）;空气输入量：80m³（STP）/小时（0.67vvm）

pH：7.2（由继后加入的葡萄糖控制）

诱导：用1mM IPTG，在OD为50时加入

继后加入：葡萄糖（30%溶液）;6-8小时后加入;加入量：0.5克/升。小时至2.5克/升。小时（根据pH改变而定）。

在生长初期，菌株先利用酵母浸膏，当开始供入葡萄糖时，继续呈指数生长，直到OD值为50。同时，氧分压降到30-10%。为了在指数生长期提供足够的氧，可通过增加转速和/或增加空气输入量使功率输入提高到3.5KW/m³或更高。

在此第一发酵期内，经逐步或连续定量供入葡萄糖使pH保持在7.2。

第二发酵期开始后，向培养液（OD＝50，约20-24小时）内加入1mM IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）诱导产物生成。

在继后发酵过程中，以150-200单位/升。小时的平均速率合成产物（戊二酰酰胺酶）。此期间菌株改为线性生长。然后限定的葡萄糖加入量减少到大约0.5克/升·小时，以维持pH恒定（7.2）。

持续60-80小时后，当生物量已达到80-100克/升（湿重）（干重22-25克/升），且产物生成量达到7000-10，000单位/升时即可停止发酵。

SEQ ID NO：1

序列类型：伴有相应蛋白质的核苷酸

序列长度：各33个碱基

链型：带截短之识别序列的双链

拓朴结构：线性

片段类型：N-末端片段（信号序列）

来源：合成DNA

C ATG CTG AGA GTT CTG CAC CGG GCG GCG TCC GC

GAC TCT CAA GAC GTG GCC CGC CGC AGG CGG AAC

Met Leu Arg Val Leu His Arg Ala Ala Ser Ala Leu

-29 -25 -20 -18

Claims

1、在大肠杆菌中制备戊二酰酰基转移酶(GA)的遗传工程方法，其包括引起包含在质粒PCM145(DSM6409)中之GA基因的表达。

2、根据权利要求1中所述的方法，其中GA基因是在大肠杆菌启动子控制下表达的。

3、根据权利要求2中所述的方法，其中启动子是可诱导的。

4、根据权利要求3中所述的方法，其中诱导发生在对数生长期。

5、根据权利要求4中所述的方法，其中诱导发生在对数生长后期。

6、根据权利要求1至5之一或多项中所述的方法，其中GA基因存在于低拷贝数载体中。

7、根据权利要求1至5之一或多项中所述的方法，其中GA基因存在于表达载体中，所说的表达载体不含作为选择基因的表达定位于周质中之分泌型酶的基因。

8、根据权利要求7中所述的方法，其中表达载体是高拷贝数载体。

9、根据权利要求1至5之一或多项中所述的方法，其中GA基因存在于高拷贝数载体中，且其中选择基因的表达是受到严格控制的。

10、根据权利要求1至9之一或多项中所述的方法，其中表达在大约25至30℃的发酵温度下进行。

11、质粒pCM145（DSM6409）。

12、包含在质粒pCM145（DSM6409）中的GA基因。

13、含有权利要求12中所述基因的基因构建体。