CZ284405B6

CZ284405B6 - Způsob přípravy glutarylacylázy ve velkých množstvích

Info

Publication number: CZ284405B6
Application number: CS92804A
Authority: CZ
Inventors: Klaus-Peter Dr. Koller; Günther Johannes Dr. Riess; Werner Dr. Aretz
Original assignee: Biochemie Gesellschaft M.B.H.
Priority date: 1991-03-18
Filing date: 1992-03-17
Publication date: 1998-11-11
Also published as: CS80492A3; CA2063176A1; ATE145238T1; CN1065292A; CA2063176C; JP3366664B2; SK280242B6; GR3021610T3; DE4136389A1; HK1006853A1; CY2115B1; KR920018222A; KR100211002B1; DK0504798T3; EP0504798A1; JPH05207879A; ES2096671T3; IL101258A0; DE4136389C2; DE59207509D1

Abstract

Glutarylacylázu (GA) kodující gen, obsažený v plasmidu pCM145 (DSM 6409) umožňuje expresi GA v E.coli ve vysokých výtěžcích.ŕ

Description

Plasmid pCM145, genové konstrukce, obsahující GA-gen a způsob přípravy glutarylacylázy

Oblast techniky

Vynález se týká plasmidu pCM145 DSM 6409, genových konstrukcí, obsahujících GA-gen a způsobu přípravy glutarylacylázy (GA) v Escherichia coli genovou technikou.

Dosavadní stav techniky

Při enzymatické přípravě kyseliny 7-aminocefalosporanové z cefalosporinu C se nejprve vytvoří kyselina 7-(4—karboxybutanamido)-cefalosporanová (kyselina glutarylamidocefalosporanová), 15 která se deacyluje pomocí enzymu glutarylacylázy' (popřípadě glutarylamidázy), dále označovaného jako GA, na kyselinu 7-aminocefalosporanovou.

Genovou techniku přípravy GA v Escherichia coli popsali již R. Matsuda a K. I. Komatsu.

J. Bact. 163 (1985) 1222 až 1228. Specifická aktivita však mohla být jen nepatrně zvýšena 20 (z 0,12 jednotek nasazeného kmene na 0,2 jednotek na mg).

Matsuda a kol. použili pro zkoumání mutanta Pseudomonas Sp. GK 16, pro něhož není uvedeno žádné označení o uložení. Autoři vy cházeli z kmene Pseudomonas a. SY-77-1. který je dostupný u Fermentation Research Institute (FRI) pod označením FERM 2410.

Podstata wnálezu

Nyní bylo zjištěno, že z kmene Pseudomonas může být isolován gen, kódující GA a pomocí 30 tohoto genu se může získat enzym v E. coli s nejméně pětkrát vyšší specifickou aktivitou. Tento enzym, isolovaný z kmene Pseudomonas, je srovnatelný s GA z uloženého kmene.

Předmětem předloženého vy nálezu tedy je plasmid pCM145 (DSM 6409) a genové konstrukce, obsahující GA-gen, obsažený v tomto plasmidu pCM145.

Dále je předmětem předloženého vy nálezu způsob přípravy glutarylacylázy v Escherichia coli genovou technikou, jehož podstata spočívá v tom, že se GA-gen, který je obsažen v plasmidu pCM145 (DSM 6409), klonuje bez 5’-regulátorových DNA-sekvencí za E. coli promotor a tento konstrukt se při teplotě v rozmezí 25 až 30 °C přivede k expresi.

Výhodná provedení, jakož i další aspekty vynálezu budou dále v popise blíže objasněny.

Ukázalo se, že klonování genu ve vysoce reprodukovatelném vektoru, jako je pUC 18, vede za běžných podmínek indukce k usmrcení transformovaných buněk. Proto byly pro další zkoumání 45 konstruovány nízko reprodukovatelné vektory, jimiž byla vybavena genová banka genomu kmene. Tyto vektory, plac 10, plac 100 a plac 200, obsahují počátek replikace známého plasmidu pACYC 184/A.C.Y.Chang a S.N.Cohen, J.Bact. 134 /1978/ 1141-1156/a proto jsou k dispozici vaši pěti kopiích na buňku. Tyto vektory dovolují selekci chloramfenikolem atak zabraňují tvorbě β-laktamázy, která by mohla působit na cefalosporin.

K. identifikaci GA-genu byla nejprve založena genová banka, která obsahovala genom totálně štěpený Pstl. Pomocí 2 sond které odpovídají kodonům 30 až 40 a 41 až 51, zveřejněným Matsudou et al., viz výše, byl nalezen klon, který obsahoval 3,7 kb Pstl-inzert. Tento byl po

- 1 CZ 284405 B6 překlonování ve fágu M 13mpl9 sekvencován. Přitom se ukázala více než 98% shoda s publikovanou sekvencí v rozsahu aminokyselin 51 až 209. 3,7 kb Pstl-fragment byl použit jako sonda a radioaktivně označen ke screeningu plasmidové genové banky, která klonováním DNA kmene, částečně štěpené Pstl, byla konstruována v nízkokoreprodukovatelném vektoru plac 100. Restrikční analýzou a srovnáním míst štěpení s publikovanými údaji se ukázalo, že klon pCM 145 obsahuje kompletní gen pro GA, jakož i 5'- a 3’—přiléhající sekvence. Tento klon obsahuje vektor plac 100 s cca 10 kb Pstl-inzertem. Ten produkuje asi 4 U/I GA. Tento klon byl za podmínek Budapešťské smlouvy dne 8. 3. 1991 uložen v Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, pod ukládacím číslem DSM 6409.

Obr. 1 ukazuje restrikční mapu plasmidu pCM 145. V inzertu jsou očíslována místa restrikčního štěpení důležitá pro klonování.

Překlonováním a subklonováním by mohly být výtěžky GA zvýšen ještě na asi 450 U/I.

Překvapivě se přitom ukázalo, že snížení teploty fermentace z 37 °C na 23 °C, výhodně 2530 °C, zvláště 27-28 °C, dovolí výrazné zlepšení výtěžku. Při této teplotě byly fermentace možné delší dobu, zatímco indukce systému E. coli s IPTG při 37 °C byla pro produkční kmen letální.

Indukce nastává přednostně v logaritmické růstové fázi, zejména v pozdní logaritmické fázi. Jako produkční kmeny se přednostně používají kmeny E. coli K12, které obsahují málo nebo žádnou esterázu, čímž je značně usnadněno zpracování.

Produktivita může být ovlivněna produkčním kmenem. Jako vhodné se ukázaly například kmeny E. coli MC 1061 /ATCC 53338/, E. coli W 3110 /ATCC 27325/ nebo E. coli DH1 /ATCC 33849/.

Pro fermentaci mohou být použita známá minerální média a komplexní média s extraktem z kvasnic, peptonem, tryptonem nebo Casamino Acids. Vhodné podmínky může odborník snadno nalézt jednoduchý m předchozím pokusem.

Expresní vektor T 307 dále popsaným překlonováním /v příkladě 4/ doznal již při použití kmene E. coli TG1 /firma Amersham-Buchler, Braunschweig/ za indukčních podmínek výtěžek asi 1000 U/l kultivačního média. Plasmid T 307 má gen β-laktamázy, jehož genový produkt, enzym βlaktamáza. slouží k selekci rekombinantních kmenů. U β-laktamázy se jedná, jako u GA. o sekretovaný, periplasmatický lokalizovaný enzym. Překvapivě se tak ukázalo, že nahrazení části strukturního genu β-laktamázy genem rezistentním vůči chloramfenikolu, vede ke zřetelnému zlepšení výtěžku /srovnej příklad 9, plasmid T 347/. Rezistence vůči chloramfenikolu je zprostředkována enzymem acetvltransferázou. která je na rozdíl od β-laktamázy lokalizována intracelulámě.

Dalšího zlepšení výtěžku se může dosáhnout, když se neodstraní jen část strukturního genu βlaktamázy, ale odstraní se celá oblast strukturního genu, především kódující oblast signálního peptidu odpovědného za sekreci β-laktamázy a použije se právě gen chloramfenikol-acetvltransferázy jako selekční markér/srovnej příklad 10, plasmid T 363/.

Vynález se tedy také týká použití expresních vektorů, které jako selekční gen neobsahují gen pro sekretovaný, periplasmatický lokalizovaný genový’ produkt resp. enzym. Potom se mohou také použít vysoce reprodukovatelné (high copy) vektory, přičemž se volí přednostně vektory bez genu β-laktamázy. Dále bylo nalezeno, že se optimální výtěžky docílí při použití kmene W 3110, popř. MC 1061 E. coli K 12. Tyto plasmidy se v průběhu fermentace neeliminují, nýbrž jsou stabilní.

- 7 CZ 284405 B6

Je však také možné místo intracelulámě účinných selekčních markérů použít periplasmaticky nebo membránově lokalizovaných markérů. Jestliže se to podaří, sníží se exprese signálního markéru během produkční fáze glutarvlamidázy tak, že to nevede k destabilizaci plasmidu. Vhodný je například gen rezistentní vůči tetracyklinu Tu 1721, který· je velmi přesně regulován 5 /Klock G. a spol., J. Bacteriol. 161, 326-332, 1988/ nebo srovnatelně silně reguluje periplasmatický nebo v membráně lokalizovaný markér kódující gen.

Dále budou blíže popsány konstrukce expresních vektorů nezbytné pro dosažení vysokých výtěžků. Použité enzymy byly získány zNew England Biolabs /Schwalbach/, popř. od 10 Gibco/BRL /Eggenstein/ a použity podle návodů výrobce. Ne zcela podrobně popsané práce byly prováděny podle detailních návodů Ausubela a spol., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience. 1987 a doplňků.

Všechny údaje, týkající se velikosti plasmidu /bp/jsou údaje přibližné.

Jedinečnosti vynálezu budou popsány blíže v následujících příkladech. Pokud není uvedeno jinak, jsou uvedená procenta procenta hmotnostní.

Příklady provedení wnálezu

1. Příprava plasmidu plac 10

Z obchodně dostupného plasmidu pBR 325 /SIGMA/ se izoluje 1,1 kb fragment EcoRI-HindlII a liguje se s fragmentem 1.5 kb EcoRI-HindlII z vektoru pACYC 184. Takto získaný minipACYC se parciálně štěpí Haell a liguje se s fragmentem 819 bp Haell z obchodně dostupného vektoru pUC 12, který- obsahuje polylinker a a—komplementaci z lacZ. Vektory-, obsahující inzert v Haell-místě z pACYC184-fragmentu v uspořádání takovém, že polylinker následuje po počátku replikace v posloupnosti míst štěpení EcoRI-HindlII, byly označeny plac 10.

2. Příprava vektorů plac 100 a placZOO

V příkladu 1 popsaný mini-pACYC obsahuje v místě štěpení HindUI 2 sousedící místa štěpení pro Clal. Odstraněním těchto Clal-fragmentů se získá placlOO vektor z placlO vektoru, který-již neobsahuje pro ligování k mini-pACYC používané místo štěpení.

Analogicky příkladu 1 se štěpí placlOO částečně Haell a nahradí se Haell-fragment polylinkerem 40 z pUC12 odpovídajícím fragmentem z pUC18, získá se vektor plac200.

3. Založení genové banky

Všechna DNA kmenů Pseudomonas byla plně rozštěpena Pstl a ligována do placlO štěpeného Pstl. Ligační směsí byla transformována E. coli TG1 /Pharmacia/.

Ke screeningu byly nejprve použity 2 oligonukleotidy, které odpovídají kodonům 30 až 40 a 41 až 50 publikované GA-sekvence. Takto se izoluje klon pWK96, který obsahuje 3,7 kb Pstl50 inzert. Tento hybridizuje s oběma sondami. Překlonováním ve fágu M13mpl9 a sekvenováním se získá více než 98% shoda s publikovanou DNA-sekvencí v oblasti aminokyselin 150-209. Porovnání s publikovanou genovou mapou ukazuje shodu v relevantních místech štěpení.

Inzert byl radioaktivně označen a byl použit jako sonda pro genovou banku, která byla založena z celé DNA částečně štěpené Pstl, přičemž byl nalezen klon pCM 145, který obsahuje cca 10 kb inzert. Restrikční analýza a porovnání s publikovanými místy štěpení ukazují, že byly klonovány kompletní gen i 5’- a 3'- přiléhající sekvence. Klon poskytuje výtěžek 4 U/l GA. Slouží pro následující práce jako výchozí materiál.

4. Překlonování

Plasmid plac 100 je rozštěpen EcoRI a HindlII a inzert s GA-genem překlonován do obchodně dostupného vektoru pUC19 otevřeného stejnými enzymy. Takto získaný klon T 286 poskytuje výtěžek 23,5 U/l GA. Přitom je sekretována část enzymu (ve výchozím kmenu se enzym nachází jen v periplasmě).

K odstranění sekvencí, které možná zabraňují expresi genu v E. coli se - vzhledem k publikované mapě GA-genu - rekonstruuje gen. Přitom je třeba vzít zřetel na číslování restrikčních míst na obrázku 1.

Nejprve se klonuje 0,8 kb velký BamHI-fragment /BamHI/1/- /BamHI/4//, který nese Sallštěpné místo, do obchodně dostupného plasmidu pUC18. Do vzniklého plasmidu, který byl řezán Sáli, se rovněž zavede 0.8 kb velký Sall-fragment /SaII/3/— SaII/6//. Do nového plasmidu, který byl štěpen Pstl. se klonuje 0.9 kb velký Pstl-fragment /PstI/5/-PstI/8/7, přičemž se získá klon pT 93. Dále se klonuje do pUC 18 1,7 kb Sall-fragment /Sal 1/6/—SAII/9// a přezkouší se správná orientace, vznikne plasmid pT 98. Jelikož klonovaný Pstl-fragment /PstI/5/-PstI/8// obsahuje Xhol-štěpné místo, mohl byt společně klonován kompletní gen, ve kterém je navázán EcoRIXhol-fragment z pT 93 s větším. XhoI-EcoRI-fragmentem zpT98, obsahujícím také počátek replikace a gen rezistence. Takto vzniká plasmid pT 103. Jím transformované kultury E. coli produkují až 130 U/l GA. přičemž exprese je řízena 5-koncovou promotorovou aktivitou z psedomonádové DNA.

Z plasmidu pT103 se po štěpení restrikčními enzymy Sstl a HindlII izoluje fragment s GAgenem a klonuje se do vektoru plac200 řezaného stejnými enzymy, takže vznikne expresní vektor pT104, kterým je dosahován GA-výtěžek nad 1000 U/l.

Po překlonování rekonstruovaného genu do míst štěpení EcoRI-HindlII obchodně dostupného expresního vektoru pBtac /výrobce: Boehringer-Mannheim/ se získá plasmid pT 105. Jím transformované E. coli-TG-kmeny produkují po 3 denní fermentaci až 288 U/l GA v třepaných baňkách při teplotě fermentace 37 °C.

Ke klonování GA-genu do vektoru pTrc 99 A /E. Amann a spol., Gene 69 /1988/ 301-315/ je nutný syntetický linker/sekv. id. č.l/:

/Ncol/ /Styl/

CATG CTG AGA GTT CTG CAC CGG GCG GCG TCC GC

GAC TCT CAA GAC GTG GCC CGC CGC AGG CGG AAC

Z plasmidu pCM 145 se po štěpení enzymy Styl a BamHI izoluje 0,57 kb velký BamHI/4/Sty I/2/-fragment/ v publikované DNA-sekvenci se nachází Styl-štěpné místo v oblasti aminokyselin 11 až 13. Tento fragment a uvedený linker se liguje do plasmidu pTrc99A štěpeného Ncol a BamHI, přičemž plasmid T 297 se získá se ztrátou Ncol-štěpného místa.

Dále se izoluje z plasmidu pCM 145 1,5 kb Sall-fragment /SaII/6/-SaII/9// jakož i 0,34 kb BamHI-SalI-fragment a liguje do vektoru pUC 18, který byl otevřen Sáli a BamHI. Vzniklý plasmid T 306 se přezkouší na správnou orientaci SaII/6-9/-fragmentu. Z plasmidu T 306 se

-4 CZ 284405 B6 izolují enzymy BamHI a HindlII 2,1 kb velký fragment /který obsahuje fragment od BamHI/4/ do SaII/9/-místa/. Tylo fragmenty se ligují do vektoru T 297 otevřeného enzymy BamHI a HindlII, přičemž se získá plasmid T 307 /obr. 2/. Jím transformovaná populace E. coli produkuje po 2-denní fermentaci při 28 °C až 260 U/l GA. Změnou fermentačních podmínek /'viz následující příklady/ může tento výtěžek stoupnout nad 780 U/l.

Indukce systému pomocí IPTG při 37 °C je pro transformovaný E. coli kmen letální, což často vede zpět k nasazení high-copy-number-vector T 307. Pracuje se přitom při teplotách pod 30 °C.

5. GA-fermentace s klony E. coli

E. coli klony DH1 T105 a TG1 T307 se nanesou na minerální a komplexní média a produkují již v logaritmické fázi růstu. Maximálního GA-titru se dosáhne ve stacionární fázi. To ukazuje, že GA-produkce je závislá na rychlosti růstu. V obou klonech se enzym vyskytuje z 50-60 % cytoplasmaticky, ze 40-50 % cytoplasmaticky a maximálně z 10 % ve filtrátu kultury.

Pro kompletní uvolnění GA je nutno buňky otevřít pomocí ultrazvuku, French Press nebo Dyno Milí. Periplasmatická GA se může solubilizovat detergenty jako je cetyltrimethylamoniumchlorid nebo toluen. Účinnost zvyšuje přídavek EDTA a lysozymu. Provedené pokusy pro optimalizaci fermentačních parametrů ukazují, že klony rostou v teplotní oblasti 25 °C až 37 °C a mohou produkovat. Při teplotách nad 30 °C se však musí udržovat parciální tlak kyslíku < 5 %. Teplota růstu pod 28 ⁵C vede k GA-produkci, je potřebný nárůst dvojnásobného času >2 h, za těchto podmínek již není tvorba GA závislá na malém pO₂. Zjištěna byla výrazná korelace mezi GA-objemovou produktivitou /U/l kultivačního roztoku/ a koncentrací biomasy /g/i/.

6. GA-produkce v minerálním médiu

Udržování klonu TG1 T307 se provádí při -18 °C v YT-glycerinovém mediu:

glycerin 17 % kvasničný extrakt 0.7 % bactotrypton 0,4 %

NaCl ' 0,4% ampicilin 50 pg'ml

Z této suspenze se připraví agarové plotny stejného média, inkubují se 24 hodin při 28-37 °C a předkultura se inokuluje jednou kolonií.

Médium předkultury: bactotrypton 1 % kvasničný extrakt 0,5 %

NaCl 0,5 % ampicilin 50 μσ/ml pH=7,2

100 ml tohoto živného roztoku se inkubuje v Erlenmeyerových baňkách po naočkování 24 hodin při 28 °C a 220 otáčkách za minutu. Kultura pak vykazuje OD₅78nm 3,0.

Následující hlavní kultura /25 ml živného roztoku /300 ml baňky/ se naočkuje 2 % předkultury a inkubuje 24-72 hodin při 28 °C a 220 otáčkách za minutu:

- 5 CZ 284405 B6

minerální médium:	hmotn.%
NaH,PO₄ Na₂HPO₄ KC1 /NH4ASO4 MgSO₄.7H₂O kyselina citrónová glycerin nebo glukóza Fe₂/SO₄/₃.H₂O roztok stopových prvků	1,110 3,680 0,100 0,325 0,200 0,390 4,000 0,0250 0,1000

pH 6,0-6,5 roztok stopových prvků hmotn.%

H3BO3 /NH4/₆Mo₇O₂₄ ZnSO₄.7H₂O MnSO₄.4 H₂O CuSO₄.5 H₂’o KJ	0,208 0,080 0,160 0,160 0,160 0,048
biomasa po 50 hodinách:	11 g/1
GA po 50 hodinách:	39 L71

7. GA-produkce v komplexním médiu

Analogicky příkladu 6 se provede udržování kmene a vypěstování předkultury a očkuje se do 51 fermentoru s následujícím komplexním médiem /31/:

Komplexní médium:

bactotrypton kvasničný extrakt NaCl

1 % 0,5 % 5 %

pH 7,2

parametry fermentace:	28 °C, 400 ot.min’¹, 0,5 wm
doba fermentace:	24-72 hodin
biomasa po 72 hodinách:	7 g vlhké masy/1
GA po 72 hodinách:	460 U/l kultivačního roztoku, 66 U/g vlhké masy

GA-produkce v zahuštěném komplexním médiu

Analogicky příkladu 7 se klon TG1 T307 nanese do následujícího média:

Komplexní médium:

bactotrypton kvasničný extrakt NaCl

2 % 1,0% 0,5 %

pH 7,2

-6CZ 284405 B6

Fermentační parametry:

Biomasa po 53 h:

GA po 63 h:

°C, 500 ot.min'¹, 0,8 wm g vlhké hmoty/1

780 U/l kultivačního roztoku, 52 U/g vlhké hmoty

Tento příklad ukazuje souvislost mezi vzestupem biomasy a objemové produktivity.

Analogicky příkladu 7 se kultivuje kmen DH1 T104, po 70 hodinách se dosáhne biomasy 11 g vlhké hmoty/1 a objemové aktivity 1040 U/l kultivačního roztoku s 97 U/g vlhké hmoty. To odpovídá specifické asi 1 U/mg proteinu.

Analogicky příkladu 7 se pěstuje kmen DH1 TI04, po 70 hodinách se dosáhne biomasy 11 g vlhké hmoty/1 a objemová aktivita 1040 U/l kultivačního roztoku se 97 U/g vlhké hmoty. Toto odpovídá specifické aktivitě asi 1 U/mg proteinu.

8. Indukovatelnost GA-produkce

Při indukci klonu TG1 T307 v pozdější fázi logaritmického růstu pomocí IPTG /konečná koncentrace 1-5 mM/, se zvýší během 5-10 hodin o 60 %.

9. Plasmid T 347

Izolovaná plasmidová DNA z kmene TG1 /T 307/ se kompletně rozřeže enzymem Dral a větší fragment, který obsahuje počátek replikace jakož i GA-gen pod kontrolou Trc-promotoru, se izoluje elektroelucí z agarozového 0,6% gelu použitého pro dělení fragmentů.

Z vektoru pACYC 184 /Chang a Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141-1156, 1978/ se uvolní štěpením restrikčním enzymem Hae II DNA-fragment velikosti asi 1,3 kb., který obsahuje C AT-gen i regulátorovou oblast pro gen. Tento fragment se také získá po dělení na agarozovém gelu elektroelucí. Enzymem Hae II se vytvoří na koncích fragmentu přesahující 3'-konce, které samy o sobe nejsou vhodné pro ligací s uvedeným Dra I vektorovým fragmentem, který obsahuje tupé konce /blunt ends/. Proto se přesahující konce Hae II-fragmentu odštěpí exonukleázou S1 a fragment se zpracuje DNA-polymerázou I za přítomnosti 4-desoxvnukleotid-trifosfátu.

Takto připravený Hae Il-fragment se pomocí enzymu DNA-ligázy liguje spolu s Dra I-vektorovým fragmentem a transformuje do E.coli MC 1061. Selekce vhodného rekombinovaného E. coli klonu se provádí rezistencí na chloramfenikol a syntézou enzymu GA. Tvorba GA se hodnotí pomocí Schibuja-testů. Rekombinantní klony obsahují plasmid T 347, jehož restrikční mapa je opět uvedena na obr. 3. Pro výši exprese GA není orientace CAT-genu ve vektoru podstatná.

10. Plasmid T 363

Při delší době fermentace E. coli MC 1061 /T 347/ se ukázalo, že počet buněk nesoucích plasmid po indukci GA-exprese pomocí IPTG významně klesá. Na základě toho se předpokládá, že se ještě zbývajícím β-laktamázovým-promotorem vytvoří asi 69 aminokyselin zahrnující zkrácený β-laktamázový základní protein, který obsahuje signální peptid a zbytek β-laktamázy. Protože jeho expresi není možno zabránit klonováním CAT-genu, vede pravděpodobně tato skutečnost k negativnímu selekčnímu tlaku, to znamená ztrátě plasmidu. Pro získání vektoru stabilního po celou dobu fermentace, byl plasmid T 307 dvojnásobně štěpen enzymy Ssp I a Dra I. Oba největší fragmenty, které obsahují jak počátek replikace tak GA-gen sjeho Trc-promotorovou

- 7 CZ 284405 B6 částí, byly po dělení v 0,6 % agarozovém gelu izolovány elektroelucí. Podle příkladu 9 se vyrobí

Hae Π-fragment s CAT-genem a spojí se s oběma uvedenými fragmenty pomocí enzymu DNAligázy. Ligační směs se transformuje do E. coli kmene MC 1061. Rekombinantní klony se selektují na základě jejich schopnosti růst za přítomnosti chloramfenikolu a tvorby enzymu GA.

Optimální výtěžky byly dosaženy s rekombinantními klony E. coli, které nesou plasmid T 363, jehož restrikční mapa je uvedena na obr. 4.

11. Fermentace E. coli kmene W 3110 /T 347/ a W 3110 /T 363/

Podmínky kultivace:

Kultivace byly s výjimkou variabilních parametrů, provedeny za následujících a pro oba klony identických podmínek:

Udržování klonovaného kmene se provádí při -18 °C v YT-glycerinovém médiu:

glycerin 17,0% kvasničný extrakt 0,7 % bactotrypton 0,4 %

NaCl 0.4 % chloramfenikol 25 gg^ml

Z této suspenze se připraví agarové plotny se stejným mediem, inkubují se 24 hodin při 28 °C a předkultura /VK/ se inokuluje jednotlivou kolonií.

VK-medium:	bactopepton	0,1 %
/NL 5295/	kvasničný extrakt	0,5 %
	NaCl	0.5 %
	chloramfenikol	25 pg/ml
	pH - 7.2

100 ml tohoto živného média ve 300 ml Erlenmeyerových baňkách se po naočkování inkubuje 24 hodin při 28 °C a 220 ot.min'¹. Kultura pak vykazuje OD57_{8 nm} 6,0-8,0.

Touto VK se naočkuje 5-10 % /vztaženo na VK s OD₅7_Snm = 3,0 / hlavní kultura /HK/:

HK: NL 5292 + 1 ml desmophenu

20.0 g/l kvasničný extrakt /oxoid/

1,2 g/l NaFLPOj x H?O

8.5 g/l NaiHPOj x 2 H?O l,0g/lKCl

2,0 g/l MgSO₄ x 7 HjO /odděleně autoklávováno/

0.25 g/l kyselina citrónová

5.0 g/l NH4CI

4.0 ml/1 SLA 5029

0.005 g/l thiamin -> sterilní filtrace /5mg/10ml -4 0,5/50 ml N/ pH - 6,5

-8CZ 284405 B6

Podmínky fermentace: teplota: 28 °C objem.: 3,5 1 wm. 0,75 ot.min'':500 /r=7 cm/ pH: 7,0 ± 0,2 /udržováno konstantní pomocí NH4OH/ vsádka:

glycerinový roztok: 525 g glycerinu /99%//! HK-média /bez kvasničného extraktu a NH4CI/ rychlost přidávání živin: 3,4 ml/l*h při kontinuálním přidávání /max. konc. glycerinu vefermentoru: 0,2 %/ popř. jednorázový přídavek počátek přidávání živin: při pO₂ = 40-50 % popř.

OD₅7_8nm = 7-9 po asi 7 h fermentace doba přidávání živin: 40-60 hodin pO₂: udržován konstantní na asi 40 % indukce: po dosažení biomasy 70 až 80 g vlhké hmoty/1 po asi 20 hodinách se provede indukce pomocí IPTG /1 mM konečné koncentrace/. Potom se pokračuje ve výživě glycerinem ještě 4-40 hodin.

sklizeň: 24-48 hodin po indukci.

GA-exprese v E. coli T 347

S klonem T 347 byla vyvinuta vsádková fermentace, která má za cíl vedle zvýšení biomasy 30 doložit indukovatelnost GA.

Za tím účelem byly zkoušeny různé strategie živení pro glycerin a jejich působení na IPTG indukci:

Způsob přidávání glycerinu	vlhká biomasa g/i	U/l	GA-akxivita U/g
bez přikrmování	14	490	35
1 % glycerinu	33	1219	37
1 % glycerinu + lmM IPTG	41	2400	59
kontinuál. glycerin /3.5 %/ -
1 mM IPTG	61	3800*	62

*GA ze 40 % intracelulámé

Uvedená tabulka poskytuje dobrou korelaci přírůstků biomasy a GA-přírůstků a ukazuje zesílení GA-exprese pomocí IPTG. které se reprimuje nejen amoniakem, ale také glycerinem a glukózou v koncentracích vyšších než 0,2 %. Jako dostatečná se ukázala koncentrace induktoru 1 mM IPTG. Optimální okamžik indukce leží na přechodu kultury do stacionární růstové fáze.

Výzkum stability plasmidu tohoto konstruktu ukázal, že k době indukce /asi 40 hodin fermentace/jen ještě 60 % klonů obsahuje plasmid a že po přídavku induktoru se plasmid během 24 hodin ztratí. V kontinuální kultuře je poločas plasmidu <50 hodin.

-9CZ 284405 B6

GA-exprese v E. coli T 363

Klon T 363 obsahuje plasmid, který po 72-hodinové fermentaci je ještě přítomen ve všech buňkách. Toto vede k dosažení významně vyššího GA-titru ve fermentaci. Za výše uvedených optimálních podmínek vsádky se může produkovat až 100 g vlhké hmoty se 7000-1200 U GA/1 KL za asi 70 hodin. Maximálně 40 % této aktivity je lokalizováno cytoplasmaticky.

Pro zjištění, které faktory ovlivňují indukci byly podrobně zkoumány následující parametry:

1/ Teplota fermentace

V oblasti 25-28 °C byly při maximálních specifických aktivitách dosaženy nejvyšší objemové výtěžky. Při 37 °C rostl klon jen ve významně nižších biomasách a exprimoval ještě maximálně 20 U GA/1. Pokles teploty ze 37 na 28 °C v čase indukce také nevedl k expresi GA.

2/ Komplexní zdroje dusíku

Pokud jde o GA-objemovou produktivitu, bylo prokázáno, že kvasničný extrakt od fy Oxoid může být nahrazen extraktem od Bio Springer nebo Marcor. Z jiných komplexních zdrojů dusíku poskytují NZ-aminy A.B.E a L od fy. Sheffield jakož i lactalbumin, soypepton abactopepton ještě 50-70% objemovou aktivitu. Pokud jde o specifickou GA-aktivitu, dosahuje se NZ-aminy, lactalbuminem a bactopeptonem obvykle výrazně vy šších hodnot.

Kvasničný extrakt /15-30 g 1, je v současné době nejlepšim zdrojem dusíku.

3/ Koncentrace induktoru

Pokusy v oblasti 1-10 mM IPTG ukazují, že 1 mM induktoru dosahuje nejlepší GA-exprese, vyšší koncentrace však nejsou škodlivé.

4/ Napájení kyslíkem

V době indukce vytvořil E. coli T 363 asi 80 % své biomasy a spotřeba kyslíku se pohybuje okolo 5 mMol/l*h. Proto se udržuje pO₂ na 40 % sycení. Pro samotnou indukci hraje pO₂ jen menší roli pokud zůstává sycení ještě nad 10 %.

12. Fermentace E. coli K12 /GA/

Kmen: E. coli K12 W3110M: delta M 15 lac Γ pT 363/33

Udržování kmene: uchovávání v ampulích /16,67 % glycerinu v LB médiu dvojnásob. / při -74 °C /hluboké chlazení/ médium LB dvojnásob.: Bacto-Trypton /Difco/ 20 g/1

Bacto-kvasničný extrakt /Difco/ 10 g/1

NaCl 5 g/1

Třepaná kultura: 1000 ml média LB dvojnásob, /ve 2 1 ocelových baňkách/ s 25 mg chloramfenikolu /přidáno přes sterilní filtr po sterilizaci média/ se naočkuje obsahem jedné ampule a kultivuje při 28 °C na třepačce /250 ot.min'¹, amplituda 1,25 cm/ 4-5 h až do OD 1,0.

- 10 CZ 284405 B6

Přípravné stupně: DT-fermentor /200 I pracovní objem/ se naočkuje 1 I třepané kultury /OD 1.0/ 0.5%. Po asi 6 h růstu se dosáhne OD 3-4 pro přeočkování do hlavního stupně.

přípravné médium: kvasničný extrakt /Bio Springer/ 20,00 g/1

Na₂HPO₄ 0,24 g/1

NaH₂PO₄ 1,70 g/1

KC1 0,20 g/1

MgSO₄ x 7 H₂0 0,40 g/1 kyselina citrónová 0,05 g/1 /NH4ASO4 1,00 g/1 thiamin/HCI 1,00 mg/1 stopové prvky-roztok 5029 0,03 ml/l

Desmophen 3600 0,18 ml/l roztok stopových prvků 5029:

COC1₂x6H₂Ó 2,00 g/1

NiCl₂x2H₂Ó 0,08 g/1

CuCÍ₂x2 H,0 0,08 g/1

ZnCl₂ 0,80 g/1

H₃BO₃ 4,00 g/1

Na₂MoO₄x2H₂O 2,40 g/1

FeSO₄x7H₂O 1,60 g/1 pH hodnota nastavena HC1 na 2,5

EDTA 0,40 g/1

Následující podmínky byly udržovány během přípravné fermentace:

teplota: 28 °C, tlak 0,1 MPa, přivzdušňování 7 NM³/h, počet otáček /max=175 ot.min’¹/, pH: 7.2 udržováno plynným NH₃/před naočkováním se pH hodnota média nastaví z asi 3,0 až 3,5 na 7.2/

Hlavní stupeň:

ET-fermentor /2 m' pracovního objemu/ se naočkuje 10% DT-kultivační břečkou. Doba fermentace 60-80 hodin.

Médium hlavního stupně: kvasničný extrakt /Bio Springer/ 20,00 g/1

Na₂HPO₄ ~ 1,20 g/1

NaH₂P0₄ 8,50 g/1

KC1 1.00 g/1

MgSO₄x7 H₂O 2,00 g/1 kyselina citrónová 0,25 g/1 /NH₄/S₂O₄ 5,00 g/1 thiamin/HCI 5,00mg/1 stopové prvky-roztok 5029 0,50ml/l

Desmophen 3600 0,30ml/l

Byly nastaveny následující fermentační podmínky: teplota:28 °C tlak: 0,1 MPa příkon: 2,5 kW/m³ otáčky: 120 ot.min'¹ /při průměru turbomíchadla 600 mm· přivzdušňování: 80 Nnť/h /0,67 wm/ ph-hodnota: 7,2 /regulována podle přídavku glukózy/ indukce: 1 mM IPTG při OD 50

- 11 CZ 284405 B6 přídavek: glukóza /30% roztok/, počátek mezi 6-8 h, množství 0,5 g/1 a h až 2,5 g/1 a h / závislé na průběhu pH/

Na začátku růstové fáze potřebuje kmen nejprve kvasničný extrakt a roste od počátku dávkování glukózy exponenciálně až do OD 50. Přitom se snižuje parciální tlak kyslíku na 30 až 10 %. Pro dostatečné zásobování kmene během exponenciálního růstu kyslíkem /pO?-30 %/, může byl příkon zvýšen zvýšením otáček a/nebo zvýšením přivzdušňování na 3,5 kW/m³ nebo vyšší.

Hodnota pH se v této první fermentační fázi udržuje na 7,2 postupným nebo kontinuálním zvyšováním přidávání glukózy.

Druhá fáze fermentace začíná indukcí tvorby produktu přídavkem 1 mM IPTG /isopropylthiogalaktosid/ ke kultivační břečce /OD 50 asi 20-24 h/.

V dalším průběhu fermentace se produkt /glutaryl-amidáza/ syntetizuje průměrnou rychlostí tvorby 150-200 E/l. Přitom přechází kmen do lineárního růstu. Dávkování glukózy činí asi 0,5 g/1 při konstantním udržování pH /7,2/.

Po 60-80 hodinách může být fermentace při vytvoření biomasy 80-100 g/1 vlhké hmotnosti /suchá hmota 22-25 g/1/ a tvorbě produktu 7000-10000 E/l ukončena.

Sekv. id. č.:l druh sekvence: nukleotid s odpovídajícím proteinem délka sekvence: po 33 bázích druh řetězce: dvojitý řetězec s přesahujícími rozpoznávacími sekvencemi topologie: lineární druh fragmentu: N-terminální fragment /signální sekvence/ původ: syntetická DNA

ATG	CTG	AGA	GTT	CTG	CAC	CGG	GCG	GCG	TCC	GC
	GAC	TCT	CAA	GAC	GTG	GCC	CGC	CGC	AGG	CGG	AAC
Met	Leu	Arg	Val	Leu	His	Arg	Ala	Ala	Ser	Ala	Leu
-29				-25					-20		-18

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Plasmid pCM 145 (DSM 6409).

2. Genové konstrukce, obsahující GA-gen, obsažený v plasmidu pCM145 (DSM 6409) podle nároku 1.

3. Způsob přípravy glutarylacylázy (GA) v Escherichia coli genovou technikou, vyznačující se tím. že se

a) GA-gen, který· je obsažen v plasmidu pCM145 (DSPvl 6409) podle nároku 1, klonuje bez 5'-regulátorových DNA-sekvencí za E. coli promotor

b) tento konstrukt se při teplotě v rozmezí 25 až 30 °C přivede k expresi.

- 12 CZ 284405 B6

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující s e tím, že promotor je indukovatelný. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující s e tím, že indukce se provádí v loga- ritmické fázi růstu. 6. Způsob podle nároku 4, vyznačující s e tím, že indukce se provádí v pozděj- ší logaritmické fázi růstu.

7. Způsob podle nároků 3 až 6, vyznačující se tím, že GA-gen se vyskytuje 10 v nízko reproduko vatě lnem vektoru.

8. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že expresní vektor je vysoce reprodukovatelný vektor.

15 9. Způsob podle nároků 3 až 7, vyznačující se tím, že GA-gen se vyskytuje ve vysoce reprodukovatelném vektoru, přičemž exprese selekčního genu je přísně regulována.