NO328690B1 - Variant mikroorganisme samt fremgangsmate for fremstilling av en karboksylsyre ved bruk av mikroorganismen - Google Patents

Description

TEKNISK FELT

Foreliggende oppfinnelse angående en ny variant stamme av en mikroorganisme som hører til slekten Rhodococcus og en fremgangsmåte for hydrolysering av minst en en cyanogruppe av en aromatisk polynitrilforbindelsen ved anvendelse av den nye variantstammen. Karboksylsyrene, spesielt cyanokarboksylsyrene fremstilt ved foreliggende oppfinnelse er nyttige som startmaterialer for syntese av medikamenter, agrokjemikalier, farvestoffer og andre kjemikalier.

BAKGRUNNSTEKNIKK

Mange studier er blitt gjort på reaksjonen ved hydralysering av en cyanogruppe av en nitrilforbindelse for å oppnå de tilsvarende karboksylsyrene, pga. dette er en enkel og lett fremgangsmåte for fremskaffelse av karboksylsyre.

Men hensyn til bioreaksjon er hydrolysering kun en del av cyanogruppene av en polynitrilforbindelse som har et flertall cyanogrupper i molekylet for å oppnå den tilsvarende cyanokarboksylsyren, spesielt med hensyn til fremgangsmåten for fremskaffelse av aromatiske cyanokarboksylsyrer med selektiv hydrolysering kun av en spesifikk cyanogruppe av en aromatisk polynitrilforbindelse, har mange rapporter blitt publisert på reaksjonen ved anvendelse av spesifisiteten til reaksjonen til mikroorganismen. For eksempel, beskriver U.S. Patent 4.629.700 en fremgangsmåte for fremstilling av cyanobenzosyre fra ftalonitriler ved anvendelse av en Rhodococcus bakterie. Europeisk patent 178.106 beskriver f.eks. også en fremgangsmåte for fremstilling av cyanokarboksylsyrer og cyanokarboksylsyreamider ved selektiv hydrolyse av en cyanogruppe fra en polynitril forbindelse ved anvendelse av 4 genera av grampositive bakterier inkludert genuset Rhodococcus.

Selektive hydrolysereaksjoner av en cyanogruppe i en kjemisk syntese passer spesielt ikke for den praktiske anvendelse, fordi det for å utføre reaksjonen er nødvendig med en komplisert prosedyre, slik som beskyttelse av en spesifikk cyanogruppe.

Bioreaksjoner er generelt ansett å ha høy selektivitet. Imidlertid, når de blir strengt undersøkt, er de i mange tilfeller ledsaget av produksjon av urenheter pga. side reaksjoner. For eksempel, ifølge den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for fremstilling av en cyanobenzosyre fra et ftalonitril ved anvendelse av et Rhodococcus bakterie, er selektiviteten ikke 100%, men reaksjonen blir ledsaget av fra 1,0% til noen få % biprodukter som stammer fra ftalonitril. Fra synspunktet ved omdannelse av et startmateriale, kan dette sies å være en utmerket prosess. Imidlertid, i syntesen av medikamenter eller finkjemikalier, påvirker egenskapene til en liten mengde biprodukter sterkt evnen eller sikkerheten til et stoff som blir syntetisert ved anvendelse av startmaterialet som inneholder biproduktet. Derfor, er den ovenfor beskrevne selektiviteten ikke høy nok for startmaterialet innen dette feltet.

For å øke renheten av produktene, kan en fremgangsmåte for fremskaffelse av et produkt og deretter ytterligere rensing, bli tatt i betraktning. Imidlertid, er f.eks. forskjellige biprodukter fremstilt ved fremgangsmåten ved biologisk å produsere en cyanokarboksylsyre fra et aromatisk polynitril, meget nær hverandres fysikalske egenskaper slik som kokepunkt og hydrofobisitet, og fullstendig separasjon av disse kan derfor ikke bli oppnådd ved vanlig benyttede rensemetoder slik som destillering, ekstraksjon og utsalting.

Som sådan, er ved konvensjonelle fremgangsmåter for fremstilling av karboksylsyre ved en hydrolysereaksjon av en nitrilforbindelse ved anvendelse av mikroorganismer, selektiviteten til selve hydrolysereaksjonen ikke høy nok, og fremstillingen av biprodukter ikke tilstrekkelig redusert.

Bunch et al; Biotransformation of nitriles by Rhodococci; Antonie van Leeuwenhoek, vol. 74, nr-1-3,1998, s. 89-97, ISSN 0003-6012, beskriver to reaksjonsveier for omdanning av nitriler til karboksylsyrer. Nitrilhydratase katalyserer omdanning direkte fra nitril til amid og amidase omdanner amidet videre til karboksylsyre. Nitrilase katalyserer omdanning direkte fra nitril til karboksylsyre uten å gå via amid som mellomprodukt. Da begge reaksjonsveier kan virke samtidig og mellomprodukter i form av amider fra den første reaksjonsveien vil kunne være til stede i sluttproduktet, blir heller ikke her renheten av sluttproduktet god nok.

US 5827699 beskriver en Rhodococcus-stamme med høy nitrilhydrataseaktivitet som effektivt hydrolyserer nitriler, både alifatiske og aromatiske, til amider. Denne stammen har imidlertid ikke noen amidaseaktivitet for omdanning av amid til karboksylsyre.

Kobayashi et al; The catalytic mechanism of amidase also involves nitrile hydrolysis; FEBS letters, vol 439, nr. 3, 1998, s. 325-328, ISSN 0014-5793, beskiver en amidase fra Rhodococcus rhocdochrous J1 som i tillegg til den forventede omdanningen av amid til karboksylsyre også kan omdanne nitril til karboksylsyre. Denne tilleggsaktiviteten er imidlertid my mindre effektiv enn omdanningen av amid til karboksylsyre.

En alternativ fremgangsmåte for fremstilling av karboksylsyre ved hydrolyse av en nitrilforbindelse omfatter en enzymatisk reaksjonsmetode ved anvendelse av nitrilase eller nitrilhydratase og amidase.

Nitrilase er et enzym som katalyserer en reaksjon for omdanning av en nitrilforbindelse til en karboksylsyre og den er et nyttig middel for fremskaffelse av en karboksylsyre som er nyttig som råmateriale for medisinske og agrokjemiske preparater. Eksempler på mikroorganismer som fremstiller enzymet omfatter Fusarium solani{ se Biochem. J 167, 685-692 (1977)), Nocardia sp. (se Int. J. Biochem., 17, 677-683 (1985)), Arthrobacter sp. (se Appl. Environ. Microbiol., 51, 302-306 (1986)), Rhodococcus rhodochrous J1 (se EUR. J. Biochem., 182, 349-356 (1989)), Rhodococcus rhodochrous K- 22 (se J. Bacteriol., 172, 4807-4815 (1990)), Rhodococcus rhodochrous PA- 34 (se Appl. Microbiol. Miotechnol., 37,184-190 (1992)) og Rhodococcus sp. ATCC39484 (se Biotechnol. Appl. Biochem., 15, 283-302 sp. (1992)).

Fra disse mikroorganismene blir nitrilase, nitrilhydratase eller amidase fremstilt. For å anvende disse enzymene i genetisk engineering, har genene til noen av disse enzymene blitt isolert og deres primærstruktur har blitt bestemt. Med hensyn til nitrilasegenet, er gener fra Rhodococcus bakterien beskrevet f.eks. i JP-A-7-99980 (utrykket "JP-A" blir benyttet heri for å angi en ikke-gransket japansk patentsøknad, første publikasjon) og JP-A-9-28382.

I de siste årene har det blitt gjort forsøk på anvende den evnen til omdanning av en nitrilforbindelse som disse mikroorganismene har. Spesielt, for fremstillingen av forbindelsen som har en høy tillagt verdi, er et enzym som har en utmerket sterisk selektivitet eller posisjonsselektivitet nødvendig. F.eks. beskriver JP-A-2-84198 mikroorganismer for anvendelse ved produksjon av en optisk aktiv a-substituert organisk syre, JP-A-4-341185 beskriver mikroorganismer for anvendelse i fremstillingen av en optisk aktiv 2-hydroksykarboksylsyre og EP0433117 beskriver mikroorganismer for anvendelse i fremstillinger av optisk aktiv ketoprofen.

Blant disse mikroorganismene har Rhodococcus sp. ATCC39484 stammen blitt rapportert å ha en kapasitet for å hydrolysere aromatiske polynitrilforbindelser som har et flertall nitrilgrupper, med utmerket posisjonsselektivitet (se US patent 556.625). Forbindelsene som har en nitrilgruppe og en karboksylgruppe i molekylet som blir produsert med dette enzymatiske selektive nitrildegraderingssystemet, er meget effektive som synteseblokker i fremstillingen av medisinske eller agrokjemiske preparater. Imidlertid har nitrilasen i denne mikroorganismen en relativt lav aktivitet overfor aromatiske polynitrilforbindelser og for anvendelse av den egenskapen i industrien er det et essensielt mål å forbedre produktiviteten av enzymet som katalyserer reaksjonen. Imidlertid har nitralasegen for denne mikroorganismen som er uunnværlig i den tiltenkte modifikasjonen ikke blitt fremskaffet.

Nitrilhydratase og amidase er enzymer som katalyserer reaksjonene ved henholdsvis omdanning av en nitrilforbindelse til et amid og et amid til en karboksylsyre. Ved anvendelse av nitrilhydratase og amidase, kan amider og karboksylsyre, som er nyttige som startmaterialer for medisiner, agrokjemikalier osv., bli fremstilt fra nitrilforbindelser. Fremgangsmåter for omdanning av nitrilforbindelser til tilsvarende amider eller karboksylsyrer har blitt utviklet ved anvendelse av biokatalysator og mange mikroorganismer som har slik aktivitet har blitt rapportert (se JP-B-56-17918 (uttrykket "JP-B" som benyttet heri betyr en gransket japansk patentsøknad, andre publikasjon), JP-B-59-037951, JP-B-61-162193, JP-B-61-021519, JP-B-64-086889, JP-B-4-197189, JP-B-2-000470, EPO444640 etc.)

Fra disse mikroorganismene har nitrilhydratase og amidase eller nitralase blitt renset og videre, for anvende disse genene ved genetisk engineering, har gener blitt isolert og deres primærstruktur har blitt bestemt. Med hensyn til nitrilhydratasegenet, er f.eks. genet avledet fra Rhodococcus bakterien beskrevet i US patent 2.840.253 og EP0445646 (JP-A-40211379), gener avledet fra Psudomonas bakterier er beskrevet i JP-A-30251184, gener avledet fra Rhizobium bakterien er beskrevet i JP-A-6-025296 og JP-A-6-303971. Med hensyn til amidasegenet, har f.eks. gener avledet fra Brevicaterium bakterier og gener avledet fra Rhodococcus blitt beskrevet i EP0433117. Videre er gener avledet fra Rhodococcus erythropolis rapportert i Eur. J. Biochem. 217(1), 327-336 (1993) og gener avledet fra Psudomonas bakterien er rapportert i FEBS Lett. 367, 275-279(1995).

Videre er en oppfinnelse som angår et rekombinant plasmid inneholdende både et nitrilhydratasegen og et amidasegen avledet fra Rhodococcus bakterien beskrevet i JP-A-5-068566.

I de senere årene har det blitt gjort forsøk på å anvende kapasiteten til å omdanne en nitrilforbindelse som disse mikroorganismene har. Spesielt, for fremstilling av forbindelser som har en tillagt verdi, er et enzym som har utmerket sterisk selektivitet eller posisjonsselektivitet, krevet. F.eks. beskriver JP-A-2-84198 mikroorganismer for anvendelse ved fremstilling av en optisk aktiv a-substituert organisk syre, JP-A-4-341185 beskriver mikroorganismer for anvendelse i fremstillingen av en optisk aktiv 2-hydroksykarboksylsyre og EP0433117 beskriver mikroorganismer for anvendelse i fremstillingen av optisk aktivt ketoprofen.

Blant disse mikroorganismene har Rhodococcus sp. ATCC39484 stammen blitt rapportert å ha en kapasitet til å hydrolysere aromatiske polynitrilforbindelser som har et flertall nitrilgrupper med utmerket posisjonsselektivitet (se US patent 556.625). Forbindelsen som har en cyanogruppe og en amidgruppe i molekylet, eller de forbindelser som har en cyanogruppe og en karboksylgruppe i molekylet, som blir produsert ved det selektive enzymatiske nitrildegraderingssystemet, er effektive som synteseblokker i fremstilling av medisinske og agrokjemiske preparater.

Imidlertid har nitrilasen i denne mikroorganismen en relativt lag aktivitet på aromatiske polynitrilforbindelser og for anvendelse av denne egenskapen i industrien, er det et essensielt mål å forbedre produktiviteten av enzymet som katalyserer reaksjonen. Imidlertid har relaterte enzymgener fra denne mikroorganismen, som er ufravikelig i de tiltenkte modifikasjonene, enda ikke blitt fremskaffet for verken nitrilhydratase eller amidase.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

I betraktning av de ovenfor beskrevne problemer, er det et mål ifølge foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en fremgangsmåte for fremstilling av karboksylsyre, i hvilken hydrolysereaksjon blir favorisert med et høyere utbytte enn de konvensjonelle prosesser, og reduksjon av mengden av biprodukter, og fremskaffer også en fremgangsmåte for fremstilling av cyanokarboksylsyre, omfattende selektiv hydrolysering av kun en spesifikk cyanogruppe på en polynitrilforbindelse for å fremstille den tilsvarende cyanokarboksylsyren, i hvilken hydrolyserekasjonen blir favorisert med et høyere utbytte enn i konvensjonelle prosesser, og en redusert mengde av biprodukt, og en mutert mikroorganisme som katalyserer de ovenfor beskrevne reaksjoner.

Foreliggende oppfinnere har gjort betydelige undersøkelser for hovedsakelig å redusere biprodukter pga. bireaksjoner ved konvensjonelle hydrolysereaksjoner av en cyanogruppe av en mikroorganisme. Spesielt er biproduktene fremstilt ved forskjellige kjente teknikker fra produksjon av cyanobenzosyrer f ra ftalonitriler nøyaktig analysert, og som et resultat er blitt funnet at biproduktene produsert ved denne reaksjonen hovedsakelig er karbobenzamid og ftalsyremonoamid som ytterligere hydrolysert fra cyanbenzamid. Det er også blitt funnet at når en mikroorganisme som mangler eller har redusert aktivitet for omdanning av nitril til amid blir benyttet i reaksjonen, kan disse biproduktene sterkt bli redusert.

F.eks. fra rapporten til Kobayashi et al. (Nippon Nogeikagaku Kaishi (Japan Societfor Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry), Vol. 71, No. 12

(1997), o.l., er det kjent at to veier finnes for reaksjonen av en mikroorganisme for å hydrolysere en cyanogruppe på en nitrilforbindelse til en karboksylsyre, (1) en en-trinns reaksjonsvei ved en nitralase, og (2) en to-trinns reaksjonsvei ved engangspassasje gjennom en amidform ved to enzymer av nitrilhydratase og amidase.

Foreliggende oppfinnere har spesielt studert reaksjonsveien benyttet i omdanningen fra en polynitrilforbindelse til en cyanokarboksylsyre ved Rhodococcus sp. ATCC39484, som er en kjent nitrilomdanningsbakterie. Denne stammen er bekreftet å forårsake en reaksjon i en cellesuspensjon for deretter å produsere en cyanobenzosyre som et hovedprodukt fra ftalonitril og samtidig produsere cyanobenzamid og ftalsyremonoamid som biprodukter. Dette ble videre studert og som et resultat ble det estimert at de ovenfor beskrevne to typer veier begge kompetitivt virker i hydrolysen av ftalonitril ved denne mikroorganismen. Fra dette har foreliggende oppfinnere kommet til den konklusjon at selv om aktiviteten av amidveien har blitt ansett nyttig for produksjonen av karboksylsyre ved hydrolyse av nitril, ved heller å gjøre aktiviteten manglende eller redusert, kan de aktuelle biproduktene, spesifikt cyanobenzamid og ftalsyremonoamid hydrolysert fra cyanobenzamidet bli fjernet eller redusert samtidig.

Fra en foreldrestamme ATCC39484, ble variantstammegrupper dannet ved anvendelse av NTG (N-metyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin) på vanlig måte. Basert på den antagelse at to-trinnsveien som går igjennom en amidform beskrevet ovenfor, er under en serie kontroller, ble disse variantgruppene utsatt for screening som hadde som mål den manglende evnen til å vokse ved anvendelse av benzamid som den eneste karbon/nitrogenkilden. Som et resultat ble det fremskaffet mange stammer som ikke vokste, og dette pga. den ovenfor beskrevne reaksjonen. Så ble en mikroorganisme som var i stand til ekstremt å redusere produksjonen av cyanobenzamid og ftalsyremonoamid i reaksjon med ftalonitril fremskaffet og betegnet som SD826 stammen. Denne fremskaffelsen har ført til oppnåelsen av foreliggende oppfinnelse.

En utførelsesform av foreliggende oppfinnelse fremskaffer en fremgangsmåte for fremstilling av karboksylsyrer, omfattende omdanning av minst en cyanogruppe av en aromatisk polynitrilforbindelse til en karboksylgruppe ved anvendelse av en mikroorganisme, hvor en variant mikroorganisme av en bakterie som hører til slekten Rhodococcus som mangler eller er redusert i aktiviteten til å omdanne en cyanogruppe til en amidgruppe sammenlignet med en tilsvarende opphavelig stamme, blir benyttet.

En variant mikroorganisme er en variantstamme av en bakterie som hører til genuset Rhodococcus. Videre kan en variantstamme av en Rhodococcus bakterie være en variantstamme av en opphavelig Rhodococcus sp. ATCC39484 stamme. Videre, i en foretrukket utførelsesform, kan variantstammen av en opphavelig stamme Rhodococcus sp. ATCC39484 være Rhodococcus sp. SD826 (FERM BP-7305).

I fremgangsmåten ovenfor kan nitrilforbindelsen er en aromatisk polynitrilforbindelse som har et flertall cyanogrupper i molekylet og karboksylsyren kan være en cyanokarboksylsyre. Foretrukket er den aromatiske polynitrilforbindelsen o-ftalonitril, isoftalonitril eller tereftalonotril og den aromatiske cyanokarboksylsyren er o-cyanobenzosyre , m-cyanobenzosyre eller p-cyanobenzosyre.

En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse fremskaffer en variant mikroorganisme som er Rhodococcus sp. SD826 (FERM BP-7305) stammen som har en aktivitet for omdanning av en cyanogruppe til en karboksylsyre og som mangler eller er redusert i aktivitet av omdanning av en cyanogruppe av en aromatisk polynitrilforbindelse til en amidgruppe, sammenlignet med en tilsvarende opphavelig stamme. Varianten er en variantstamme av en mikroorganisme som hører til genuset Rhodococcus. I en foretrukket utførelsesform er variantorganismen en variantstamme av Rhodococcus sp. ATCC39484.

Rhodococcus sp. SD826 har blitt deponert 12. oktober 1999 ved National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Techology, Ministry of International Trad and Industry (1-3, Higashi 1-chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken, Japan)(Aksesjonsnummer: FERM BP-7305).

En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse fremskaffer en fremgangsmåte for fremstilling av en aromatisk cyanokarboksylsyre ved bruk av en mikroorganisme, omfattende trinnene: • preparering av en variantstamme fremskaffet fra Rhodicoccus sp. ATCC39484, hvori variantstammen har tapt eller er redusert i sin aktivitet for omdanning av en cyanogruppe av en aromatisk polynitrilforbindelse til en amidgruppe sammenlignet med en tilsvarende opphavelig stamme;

og

• omdanning av minst en cyanogruppe av en aromatisk polynitrilforbindelse som har et flertall cyanogrupper til minst en karboksylgruppe for å danne en aromatisk cyanokarboksylsyre ved bruk av variantstammen.

En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse fremskaffer en fremgangsmåte for fremstilling av en aromatisk cyanokarboksylsyre ifølge krav 7, hvor den aromatiske polynytrilforbindelsen er valgt fra gruppen bestående av o-ftalonitril, isoftalonitril og tereftalonitril, og cyanokarboksylsyren er valgt fra gruppen bestående av o-cyanobenzosyre, m-cyanobenzosyre og p-cyanobenzosyre.

Ifølge foreliggende oppfinnelse, kan karboksylsyre med høy renhet enkelt og lett bli fremskaffet fra aromatiske polynitrilforbindelser som startmaterialer ved anvendelse av en ny variantstamme tilhørende slekten Rhodococcus.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 er et skjematisk diagram som viser strukturen av et plasmid fremstilt fra en positiv klon fremskaffet ved kolonihybridisering (eksempel 4). Figur 2 er et skjematisk diagram som illustrerer konstruksjon av et nitralasegen ekspresjonsplasmid. Figur 3 er en kurve som viser en sammenligning av akkumulasjonskurver for p-cyanobenzosyre i omdanningsreaksjon fra tereftaolnitril til p-cyanobenzosyre. Figur 4 er et skjematisk diagram som illustrerer strukturen til et plasmid fremstilt fra en klonet stamme. Figur 5 er et skjematisk diagram som illustrerer konstruksjonen (1) av ekspresjonsplasmid. Figur 6 er et skjematisk diagram som illustrerer konstruksjonen (2) av ekspresjonsplasmid.

FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER AV OPPFINNELSEN

1. Variant mikroorganismer for fremstilling av karboksyl syre r Som den opphavelige stamme benyttet i den foreliggende oppfinnelse ved fremstilling av en variant mikroorganisme som mangler eller har redusert aktivitet for hydrolisering av en cyanogruppe av en aromatisk polynitrilforbindelse til en amidgruppe, behøver man en mikroorganisme som hører til slekten Rhodococcus.

F.eks. blir Rhodococcus sp. ATCC39484 stammen dyrket ved vanlig kjente

fremgangsmåter for dyrking av mikroorganismer og en generelt kjent variant av en induktiv forbindelse eller en ultrafiolett stråle blir fremskaffet for å virke på de oppnådde cellene for å fremstille en variant mikroorganismegruppe. Eksempler på variasjonsinduktive forbindelser omfatter alkylerende midler slik som NTG

(N-metyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin) og EMS (etylmetansulfonat), baseanaloger

slik som 5-bromourasil og interkalasjonsmidler slik som azaserin og akridinorange.

Fra de variante grupper mikroorganismer som blir fremstilt, ble variantstammer med redusert eller manglende aktivitet for fremstilling av en amidforbindelse fra en nitrilforbindelse valgt. Det faktum at variantstammen har redusert eller manglende aktivitet for fremstilling av en amidforbindelse kan bli demonstrert som følger. Kulturceller av variant mikroorganismestammer blir tillatt å virke på en nitrilforbindelse, det fremstilte produktet blir analysert med en fremgangsmåte for analyse slik som HPLC, og tilstanden hvordan den tilsvarende karboksylsyreamidformen blir produsert ledsagende degraderingen av nitrilforbindelsen blir observert.

På dette tidspunkt, for effektivt å konsentrere de ønskede variantstammene fra et stort antall variante grupper mikroorganismer, basert på den antagelsen at to-trinnsveien går gjennom amidformen er utsatt for en serie kontroller, vurderte oppfinnerne anvendelsen av tap eller reduksjon av vekstaktiviteten ved assimilering av en amidforbindelse som kan nære og tillate den opphavelige mikroorganismestammen å vokse, f.eks. benzamid e.l., når ATCC39484 er den opphavelige stammen, som en indeks for fravær eller reduksjon av en serie reduksjonsveier til en karboksylsyre gjennom en amidforbindelse. Forskjellige metoder som benytter denne indeksen, kan en effektiv konsentrasjon av ønskede mikroorganismer som danner en variant mikroorganismegruppe bli realisert.

Uttrykket "tap eller reduksjon av vekstaktivitet ved assimilering av en amidforbindelse" som benyttet i foreliggende oppfinnelse, skal bety at i kulturen som benytter den samme amidforbindelsen som næringskilden, er doblingstiden til mikroorganismen minst 2 ganger lenger enn den til den opphavelige stammen, eller at mikroorganismen ikke i det hele tatt kan vokse. F.eks. blir en variant mikroorganismegruppe spredd på et vanlig næringsagar kulturmedium, f.eks. LB agar kulturmedium og så blir de dannede kulturene individuelt transplantert på et agarkulturmedium som inneholder benzamid som den eneste karbon/nitrogenkilden, og ved visuelt å observere nærværet eller fraværet av vekst, kan variantstammene som er endret med hensyn til aktiviteten for assimilere benzamid bli detektert. Ved anvendelse av det som er kalt penicillin screeningmetoden, kan også en variant mikroorganisme som mangler eller har redusert aktivitet for voksing ved anvendelse av benzamid, bli konsentrert. Mer spesifikt blir et medikament som virker på mikroorganismen i deres fisjons og vekstprosess og som dreper mikroorganismen, f.eks. penicillin tilsatt til kulturmediet som benytter benzamid som den eneste karbon/nitrogenkilden, og en variant mikroorganisme blir inokulert på denne og dyrket, hvor stammene som er i stand til å vokse godt med benzamid blir avlivet og stammene som mangler eller har redusert denne aktiviteten for assimilering av benzamid og således vokser, blir konsentrert. Således blir en konsentrert gruppe av variant mikroorganismer oppnådd.

De dyrkede cellene av hver variant mikroorganisme blir tillatt å virke på en nitrilforbindelse, f.eks. ftalonitril når den opphavelige stammen er ATCC39484, og det oppnådde produktet blir analysert ved en fremgangsmåte for analyse slik som HPLC for å undersøke stammene for reduksjon i akkumuleringen av karboksylsyreamidformen. I gruppen variant mikroorganismer konsentrert på denne måten, blir stammen som er redusert i akkumulering av karboksylsyre amidformen, funnet sammen med stammer som blir øket i akkumuleringen.

Et eksempel av såldes fremskaffet variantstamme er Rhodococcus sp. SD826. Rhodococcus sp. SD826 er en stamme fremstilt av foreliggende oppfinnere fra Rhodococcus sp. ATCC39484 (avdelt fra American Type Culture Collection i USA) som er en kjent mikroorganisme, og denne nye variantstammen har blitt deponert ved National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, som FERM BP-7305.

F.eks. kan variant mikroorganismestammer som har redusert eller manglende evne til å produsere amidforbindelser, bli benyttet ifølge foreliggende oppfinnelse, bli fremskaffet ved å ødelegge eller deletere enzymer og faktorer som regulerer enzymer som deltar i produksjonen av amidforbindelser og regioner av gener som koder for disse ved genetiske engineerings teknikker. Mer spesifikt, blir den realisert som følger. Relaterte gener til enzymer som bidrar til reaksjonen blir isolert og analysert, et genfragment som er inkorporert deri, blir innført, en sekvens som har homologi til basesekvensen blir innført i en mikroorganisme og homologe rekombinasjoner mellom enzymrelaterte gener på kromosomet blir indusert for å forårsake insertsjon eller delesjon av basesekvensen.

Mikroorganismene som blir benyttet ifølge foreliggende oppfinnelse er de mikroorganismene som har redusert eller manglende evne til å produsere en amidforbindelse. Modifikasjonsoperasjonen kan påvirke andre egenskaper til mikroorganismen, spesielt evnen til å produsere karboksylsyre som vil bli ansett å være nær relatert til hverandre. Imidlertid, ifølge målet ved foreliggende oppfinnelse, kan det være tilstrekkelig at produksjonen av amidforbindelser blir relatert redusert sammenlignet med den resulterende karboksylsyre. Selv om det er ønskelig at en slik modifikasjon ikke vil forårsake reduksjon i evnen til en variantstamme å produsere karboksylsyre sammenlignet med den til den opphavelige stammen før modifikasjonen, kan evnen til å produsere karboksylsyrer variere innen områder hvor produksjonen av amidforbindelser er relativt redusert.

Reaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse benytter de således skapte variantmikroorganismene og kan derfor bli utført på samme måte som i konversjonsreaksjonen ved anvendelse av en generell mikroorganisme i en ordinær karboksylsyregenererende reaksjon ved en mikroorganisme som har aktiviteten med å hydrolysere en cyanogruppe. F.eks. blir SD826 stammen dyrket i et næringsmedium på 1% pepton e.l. ved en temperatur fra 20 til 40°C, fortrinnsvis 25 til 30°C i omkring 24 timer. Til den resulterende kulturen blir en nitrilforbindelse tilsatt i en mengde for 1ppm til 50%, fortrinnsvis 10 ppm til 10%, og så blir oppløsningen kontinuerlig omrørt ved den ovenfornevnte temperaturen ifra 1 til 200 timer, og derved blir reaksjonen utført. Hele mengden av den tilsatte nitrilforbindelsen kan ikke bli oppløst. Imidlertid kan et oppløsningsmiddel, en surfaktant e.l. som forbedrer oppløseligheten eller dispersibiliteten i reaksjonsoppløsningen bli tilsatt. I proporsjon med mengden nitrilforbindelse som blir konsumert etter som reaksjonen forløper, kan nitrilforbindelser) bli tilsatt kontinuerlig eller intermitterende. Her er konsentrasjonen av nitrilforbindelsen i reaksjonsoppløsningen ikke begrenset til det ovenfor beskrevne området.

Eksempler på karbonkilder som kan benyttes i kulturmediet for dyrking av mikroorganismer omfatter sakkarider slik som glukose, sukrose, fruktose og melasse, organisk materiale slik som etanol, eddiksyre, sitronsyre, ravsyre, melkesyre, benzosyre og fettsyre, alkaliemetallsalter derav, alifatiske hydrokarboner slik som n-parafin, aromatiske hydrokarboner, og naturlig forekommende organiske materialer slik som pepton, kjøttekstrakt, fiskeekstrakt, soyabønnepulver og kli. Disse blir benyttet individuelt eller i kombinasjon, vanligvis i konsentrasjoner fra 0,01 til 30%, fortrinnsvis i størrelsesorden fra 0,1 til 10%.

Eksempler på nitrogenkilde som kan bli benyttet i kulturmediet for dyrking av mikroorganismer, omfatter uorganiske nitrogenforbindelser slik som ammoniumsulfat, ammoniumfosfat, natriumnitrat og kaliumnitrat, nitrogeninneholdende organiske materialer slik som urea og urinsyre, og naturlig forekommende organiske materialer slik som pepton, kjøttekstrakt, fiskeekstrakt og soyabønnepulver. Disse blir benyttet individuelt eller i kombinasjon, vanligvis i konsentrasjoner fra 0,01 til 30%, fortrinnsvis fra 0,1 til 10%. Disse startmaterialene for reaksjonen av hvilken cyanogruppen blir hydrolysert ved stammen til en karboksylsyre, blir fortrinnsvis tilsatt på forhånd under dyrkingen slik at ammoniumionet isolert ved hydrolysen med forløpet av reaksjonen, kan tjene som nitrogenkilde for mikroorganismene.

Videre, for å forbedre veksten av cellene, kan et fosfat slik som kaliumdihydogenfosfat eller et metallsalt slik som magnesiumsulfat, ferrosulfat, kalsiumacetat, manganklorid, koppersulfat, sinksulfat, koboltsulfat og nikkelsulfat bli tilsatt om ønskelig. Konsentrasjonen ved denne tilsetting varierer avhengig av dyrkingsbetingelsene. Imidlertid, er den vanligvis fra 0,01 til 5% for fosfat, fra 10 ppm til 1% for magnesiumsalt og omkring fra 0,1 til 1000 ppm for andre forbindelser. I tillegg, avhengig av kulturmediet som er valgt, kan en kilde for tilførsel av vitaminer, aminosyrer, nukleinsyre o.l. slik som gjærekstrakt, casaminosyre og gjærnukleinsyrer bli tilsatt i en mengde fra omkring 1 til 100 ppm slik at veksten av celler kan bli forbedret.

For å forbedre reaktiviteten til cellene med en cyanogruppe, blir fortrinnsvis en forbindelse slik som benzonitril tilsatt under dyrkingen i en mengde fra 10 ppm til 1 % som en kilde for indusering av en cyanogruppehydralase. Videre, blir en nitrilforbindelse som kan tjene både som et startmateriale som for reaksjonen og en induksjonskilde, fortrinnsvis tilsatt under dyrkingen.

Ved anvendelse av en hvilken som helst ingrediens, blir pH i kulturmediet fortrinnsvis justert fra 5 til 9, fortrinnsvis fra 6 til 8. Reaksjonen blir også

fortrinnsvis utført etter oppsamling av mikroorganismecellene som på forhånd er dyrket i mediet beskrevet ovenfor fra kulturoppløsningen ved sentrifugering eller filtrering gjennom en membran, og resuspendering av dem i vann inneholdende en nitrilforbindelse som et reaksjons startmateriale, i et fysiologisk saltvann eller i bufferoppløsning som har blitt justert til samme pH som kulturmediet, omfatter fosforsyre, eddiksyre, borsyre, tris(hydroksymetil)aminometan eller et salt derav, pga. at urenhetene i reaksjonsoppløsningen kan blir redusert og produktet etterpå enkelt kan bli oppsamlet. pH kan vanligvis bli opprettholdt under reaksjonen når en bufferoppløsning som har tilstrekkelig høy konsentrasjon blir benyttet. Imidlertid i det tilfellet hvor pH avviker fra det ovenfor beskrevne området ved progresjon av reaksjonen, blir pH fortrinnsvis passende justert ved anvendelse av natriumhydroksid, ammoniakk e.l.

Cyanokarboksylsyren produsert i reaksjonsoppløsningen blir oppsamlet ved vanlig benyttede fremgangsmåter slik som sentrifugering, filtrering gjennom en membran, tørking under redusert trykk, destillasjon, ekstraksjon med oppløsningsmiddel, utsalting, ionebytting og forskjellige typer kromatografi. Oppsamlingsmetoden er valgt ifølge status til cyanokarboksylsyrens reaksjonsoppløsning. Mest enkelt og lett, blir cyanokarboksylsyren utfelt ved justering av reaksjonsoppløsningen til å være sur, og sentrifugering av utfellingen eller filtrering for å gjenvinne cyanokarboksylsyren. Når reaksjonsproduktet blir fremstilt som en vandig oppløsning, blir mikroorganismecellene fortrinnsvis fjernet ved sentrifugering, filtrering gjennom en membran e.l. under betingelse av at produktet er i den oppløste tilstand. I tilfellet når reaksjonsproduktet blir oppnådd som et faststoff og når krystallene er tilstrekkelig store, kan produktet bli oppsamlet ved anvendelse av en sikt dannet av rustfritt stål, nylon e.l. Når krystallene er små og ikke kan bli fraksjonert fra mikroorganismer, blir en fremgangsmåte ved strakt å danne reaksjonsproduktet til en vandig oppløsning ved innstilling av betingelser hvor faststoffet kan oppløses, f.eks. alkaliske betingelser, fjerning av celler ved sentrifugering, filtrering gjennom en membran e.l., gjenvinningsbetingelser, gjenutfelling av faststoffet og oppsamling av reaksjonsproduktet, fortrinnsvis benyttet. Imidlertid, dette er ikke en valgt metode dersom mikroorganismene kan bli fjernet ved midler som er vanlig i teknikken, slik som direkte destillering av reaksjonsoppløsningen.

Avhengig av egenskapene til reaksjonsproduktene, kan produktet akkumulere i reaksjonsoppløsningen for å redusere reaksjonsraten. I dette tilfellet, blir en fremgangsmåte ved tilsetting av vann, fysiologisk saltvann eller en bufferoppløsning til reaksjonsoppløsningen og kontinuerlig uttynning av reaksjonsoppløsningen ifølge konsentrasjoner av produktet, passende benyttet. Reaksjonsraten kan også bli gjenvunnet ved oppsamling av celler ved den tiden og reaksjonsraten har blitt redusert, gjenvinning av supernatanten som produktoppløsning og returnering av oppsamlede celler til oppløsningen ved suspensjonen inneholdende reaksjonsstartmaterialet. Disse fremgangsmåtene kan bli repetert et hvilket som helst antall ganger så lenge mikroorganismene opprettholder aktiviteten for hydrolisering av nitril.

Foreliggende oppfinnelse kan også tilsvarende bli utført selv ved anvendelse av et cellefritt ekstrakt av mikroorganismene anvendt ved foreliggende oppfinnelse, eller ved anvendelse av en ingrediens som katalyserer den ovenfor beskrevne reaksjonen og som blir konsentrert eller ekstrahert fra det cellefrie ekstraktet. Videre, kan foreliggende oppfinnelse bli oppnådd ved immobilisering av en mikroorganisme som kan bli anvendt ved foreliggende oppfinnelse, eller en ekstraktoppløsning eller ekstraherte ingredienser derav til en lite oppløselig støtte og bringe dette immobiliserte materiale i kontakt med en oppløsning av startmaterialet. Eksempler på støtte som kan benyttet for immobilisering omfatter forbindelser som er i stand til å danne et lite vannoppløselig faststoff inneholdende mikroorganismen eller en ekstrahert ingrediens derav, slik som polyamid, polyvinylalkohol, poly-N-vinylformamid, polyallylamin, polyetylenimin, metylcellulose, glukomannan, alginat, carrageenan og en polymer eller tverrbundet produkter derav. Disse produktene kan bli benyttet individuelt eller i kombinasjon. I tillegg kan de oppnådd ved bæring av mikroorganismen eller en ekstraktoppløsning eller ekstraherte ingredienser derav på materialet som på forhånd er dannet som et faststoff, slik som aktivt kull, porøs keramikk, glassfiber, porøs polymerkompakt og nitrocellulosemembran bli benyttet.

Ifølge fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse, er spesifisiteten til substratet benyttet for hydrolysereaksjon av cyanogruppen bred, målet er en aromatisk polynitrilforbindelse. Eksempler på den aromatiske polynitrilforbindelsen omfatter ortoftalonitril, tereftaolnitril og isoftalonitril og substitusjonsprodukter av disse aromatiske polynitrilforbindelsene, slik som klorinert produkt, fluorisert produkt, nitrert produkt og aminert produkt.

Ifølge fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan karboksylsyrer som redusert i mengde men hensyn til biprodukter bli oppnådd, spesifikt slik at de inneholder biprodukter som stammer fra nitrilforbindelsen i startmaterialet i en mengde på 0,5 (mol)% eller mindre i karboksylsyreproduktet. I de siste årene har det vært stor bekymring om effekten av spor av kjemiske stoffer på den humane kropp og derfor er foreliggende oppfinnelse basert på konseptet at en betydelig reduksjon av bieffekter i den kjemiske reaksjonen og høyrene kjemikalier fremstilt ved en slik reaksjon kan danne nye muligheter i industrien.

I fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er produksjonsveien til en karboksylsyre gjennom et amid fundamentalt manglende eller redusert og urenheter i amidform som kan tilskrives delvis hydrolyse av nitril og derivater derav, blir ikke produsert. Karboksylsyrene fremstilt ved foreliggende oppfinnelse passer som startmateriale for en syntese i felt hvor høy renhet er spesielt påkrevet, f.eks. i feltet medikamenter eller finkjemikalier.

2. Nitrilasegen avledet fra Rhodococcus bakterien

Fremgangsmåten for bestemmelse av DNA sekvensen til nitralasegenet til Rhodococcus sp. er beskrevet nedenfor. Det kromosomale DNA, f.eks. fra Rhodococcus sp. ATCC39484 stammen kan bli fremstilt ved anvendelse av fremgangsmåten ifølge Saito et al. (se Biochem. Biophys. Acta. 72, 619 (1963)). Det kromosomale DNA biblioteket for anvendelse i kloning av genet kan bli fremstilt ved anvendelser av f.eks. en plasmidvektor pUC18. Kloningen av nitrilasegenet kan bli utført ved anvendelse av f.eks. en polymerasekjedereaksjon (PCR) iflg. Saiki et al. (se Science 230, 1350 (1985)). På dette tidspunkt blir en universell primer (forover eller revers) benyttet som en primer i PCR og for en annen primer, blir en passende sekvens valgt for en DNA sekvens som koder for en N terminal sekvens for enzymet. Ved kombinasjon av disse primerene, blir en anker PCR utført ved anvendelse av det kromosomale DNA biblioteket som en templat og derved kan kodingen av sekvensfragmentet av det aktuelle enzymet bli oppnådd. Ved anvendelse av den nitrilasekodende sekvensen av partielle DNA fragmenter som probe for screeningen av alle regionene, kan en rekombinant DNA inneholdende et nitrilasegen bli fremskaffet fra det kromosomale DNA biblioteket av Rhodococcus sp. ATCC39484 stammen. DNA sekvensen til det nitrilasekodende sekvensfragmentet kan bli bestemt ved anvendelse av fremgangsmåter slik som dideoksymetoden beskrevet av Sanger et al. (se Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, 5463 (1997)).

For å produsere et nitrilaseenzym ved anvendelse av det således fremstilte strukturelle genet for enzym, blir det strukturelle genet for enzymet ligert med en passende ekspresjonsvektor, f.eks. nedstrøms fra lakpromoteren til pUC18. Ved anvendelse av det således fremstilte plasmidet, blir en vert slik som Escherichia coli JM101 transformert. Ved dyrking av den fremstilte transformanten, blir den aktuelle nitrilasen fremstilt i meget stor mengde i vertcellen. De intakte nitrilasecellene kan bli benyttet for omdanningsreaksjonen, men et cellefritt ekstrakt eller renset enzym fremstilt fra ekstraktet kan også bli benyttet.

For at enzymgene avledet fra forskjellig mikroorganismer skal blir uttrykt i en vertorganisme på en måte slik at det faktisk fungerer i denne, er det velkjent at forskjellige krav må bli tilfredsstilt, f.eks. at genet faktisk blir opprettholdt og del i vertsmikroorganismen, at genet blir transkribert ved hjelp av transkribsjonsfunksjonen til verten, at den transkriberte informasjonen blir translatert til et protein, at polypeptidet produsert ved translasjonen blir foldet til en høyere dimensjonalstruktur slik at den har en funksjon, at et enzym blir utskilt på samme måte som i donormikroorganismen slik at enzymet kan komme i kontakt med et substrat, eller dersom enzymet er et intracellulært enzym, at vertsmikroorganismen har et permeasjons/transportsystem tilsvarende til de i donormikroorganismen. Videre, for at ekspresjonen i noen grad skal være nyttig for industriell anvendelse, må hver av kravene bli tilfredsstilt ved høye nivåer. For å løse disse problemene, blir vanligvis operasjoner slik som analyse og modifikasjon av regulerende regioner, f.eks. promotorer, tilpassing av transkripsjons/ekspresjonssystemet og forskjellige ko-faktorer til kroppen av det ønskede genet ved konstruksjon av en komplisert "shuttel" vektor og returnering av et klonet gen til donormikroorganismen o.l. nødvendig. Disse metodene har de problemene at det er vanskelig å oppnå informasjon om målet for analysen og for å modifisere fremgangsmåten ved modifikasjon for de regulerende mekanismene, og man må derfor stole på en prøve og feilemetode, og at de er begrenset til muligheten til donoren til utførelsen av ekspresjon ved retur av det klonede genet til donoren. Så langt foreliggende oppfinnere kjenner til, selv om det eksisterer noen tilfeller hvor ekspresjon av nitrilase fra en forskjellig mikroorganisme har blitt bekreftet, er det ikke kjent noen tilfeller hvor et nitrilasegen fremstilt som katalyserer selektiv hydrolyse av polynitril og som kan utvise høy aktivitet som langt overgår evnen til donormikroorganismen lett og enkelt ved innlemming av den i et velkjent Escherichia coli vektorsystem for å transformere den. Det er heller ikke kjent noe tilfelle hvor et selektivt og høyt nivå av reaksjonen blir utført hvor dette er rettet mot nitrilforbindelser, spesielt aromatiske polynitrilforbindelser, ved en rekombinant ved anvendelse av et slikt nitrilasegen.

Nitrilforbindelsen benyttet som startmateriale ved foreliggende oppfinnelse er en alifatisk eller aromatisk forbindelse som har en nitrilgruppe eller en alifatisk eller aromatisk polynitrilforbindelse som har et flertall nitrilgrupper. Når det benyttede startmaterialet er ortoftalonitrill, isoftalonitril eller tereftaolnitril, kan den korresponderende o-, m- eller p-cyanobenzosyren foretrukket bli fremskaffet med høy renhet.

I foreliggende oppfinnelse kan omdanningsreaksjon bli utført ved tilsetting av et startmateriale og celler, cellefritt ekstrakt eller enzymer som har omdanningsaktiviteten, til en fortynnet vandig oppløsning, slik som en fosfatbufret oppløsning, med en pH på 5 til 10, fortrinnsvis fra 6 til 8, ved en temperatur fra 15 til 45°C, fortrinnsvis fra 30 til 42°C.

Fremgangsmåten for oppsamling av produktet produsert i reaksjonsoppløsningen er ikke spesielt begrenset, f.eks. blir supernatanten av reaksjonsoppløsningen separert og gjenvunnet og deretter kan produktet bli oppnådd ved anvendelse av fremgangsmåte slik som dannelse av utfelling, ekstrahering, destillering eller en kombinasjon derav, ifølge egenskapene til produktet. Produktet kan også bli fremskaffet med høy renhet ved utførelse av separasjon og rensing ved anvendelse av kolon ne kromatografi e.l.

3. Nitrilhydratasegen og amidasegen avledet fra Rhodococcus bakterien Det kromosomale DNA, f.eks. fra Rhodococcus sp. ATCC39484 stammen kan bli fremstilt ved å benytte fremgangsmåten ifølge Saito et al. (se Biochem. Biophys. Acta. 72, 619 (1963)). Det kromosomale DNA biblioteket for anvendelse ved kloning av genet kan bli fremstilt ved anvendelse av f.eks. en plasmidvektor pUC18. Kloningen av nitrilhydratasegenet og amidasegenet kan bli utført ved kolonihybridisering ved anvendelse av et partsielt fragment fremstilt f.eks. ved en polymerasekjedereaksjon (PCR) metoden ifølge Saiki et al. (se Science 230, 1350 (1985)) som en probe. Her kan en universal primer (forover eller revers) bli benyttet som primer i PCR og for en annen primer, blir en passende sekvens valgt fra DNA sekvensen som koder for et ønsket enzymproteins N terminale sekvens analysert. Ved kombinasjon av disse primerene, blir en anker PCR utført ved anvendelse av det kromosomale DNA biblioteket som en templat og derved kan det kodende sekvensfragmentet til det aktuelle enzymet bli fremskaffet. Ved anvendelse av DNA fragmentet som koder for nitrilhydratasegenet eller DNA fragmentet som koder for amidase som probe for screening av alle genregionene, kan et rekombinant DNA inneholdende et nitrilhydratasegen og/eller amidasegen bli fremskaffet fra det kromosomale DNA biblioteket til Rhodococcus sp. ATCC39484 stammen. DNA sekvensen til sekvensfragmentet som koder for nitrilhydrataset og sekvensfragmentet som koder for amidase, kan bli bestemt ved anvendelse av metoder slik som dideoksymetoden beskrevet av Sanger et al. (se Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, 5463 (1997)).

For å produsere et enzym ved anvendelse av det således oppnådde strukturelle enzymgenet, blir det strukturelle enzymgenet ligert med en passende ekspresjonsvektor, f.eks. nedstrøms for lakpromotoren i pUC18. Ved anvendelse av det således fremskaffede plasmidet, blir en vert slik som Escherichia co//'JM101 transformert. Ved dyrking av de fremskaffede transformantene, blir de ønskede nitrilhydratase og/eller amidase fremstilt i meget stor mengde i vertcellene. Enzymet eller enzymene kan bli benyttet i form av intakte celler for omdanningsreaksjon, men cellefrie ekstrakter eller renset enzym fremstilt fra ekstratet, kan også bli benyttet.

For at enzymgenet avledet fra forskjellige mikroorganismer skal bli uttrykt i en verts mikroorganisme på en måte slik at den faktisk fungerer i denne, er det velkjent at forskjellige krav må bli tilfredsstilt, f.eks. at genet faktisk blir opprettholdt og delt i vertsorganismen, at genet blir transkribert ved transkribsjonsfunksjonen til verten, at den transkriberte informasjonen blir translatert til et protein, at polypeptidet fremstilt ved translasjonen blir foldet til en høyere dimensjonal struktur slik at den har en funksjon, at et enzym blir utskilt på samme måte som i donormikroorganismen slik at enzymet kan komme i kontakt med et substrat, eller dersom enzymet er et intracellulært enzym, at verts mikroorganismen har et permeasjon/transportsystem tilsvarende til det i donormikroorganismen osv. Videre for at ekspresjonen til noen grad skal være nyttig for industriell anvendelse, må hvert av kravene bli tilfredsstilt ved høye nivåer. For å løse disse problemene, er vanligvis operasjoner slik som analyse og modifikasjon av regulerende regioner, f.eks. promotorer, tilpassing av transkripsjon/ekspresjonssystemet og forskjellige cofaktorer til kroppen av målgenet ved konstruksjon av en komplisert "shuttel" vektor og returnering av klonet gen til donormikroorganismen o.l. nødvendig. Disse fremgangsmåtene har de problem at det er vanskelig å oppnå informasjon om målet ved analyse og å modifisere fremgangsmåten ved modifikasjon for regulerende mekanisme, og man må derfor stole på en prøve og feilemetode, og at de er begrenset ved evnen til donoren ved utførelse av ekspresjon ved returnering av det klonede genet til donoren. Så langt foreliggende oppfinnere kjenner til, selv om det finnes noen tilfeller hvor nitrilhydratasegen og amidasegen til forskjellige mikroorganismer har blitt fremstilt og noen tilfeller hvor ekspresjon av slik nitrilhydratase og amidase har blitt bekreftet, er det ikke kjent noe tilfelle hvor et nitrilhydratasegen og amidasegen blir fremstilt som kan katalysere selektiv hydrolyse av polynitril og som kan vise høy aktivitet som sterkt overskrider evnen donormikroorganismen lett og enkelt ved innlemming av dem i et velkjent Escherichia coli vektorsystem for å transformere den. Det er heller ikke kjent noe tilfelle hvor selektiv og høynivåreaksjon blir utført rettet mot nitrilforbindelser, spesielt aromatiske polynitrilforbindelser ved en rekombinant ved anvendelse av et slikt nitrilhydratasegen og amidasegen.

Fremgangsmåte for fremstilling av karboksylsyrer eller

amidomdanningsreaksjon ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli utført ved å tilsette startmaterialet og celler, cellefritt ekstrakt eller enzym som har omdanningsaktivitet for å fortynne en vandig oppløsning slik som en fosfatbufferoppløsning med en pH fra 5 til 10, fortrinnsvis fra 6 til 8, og med en temperatur fra 15 til 45°C, fortrinnsvis fra 30 til 42°C. Det produserte produktet i reaksjonsoppløsningen kan bli fremskaffet ved anvendelse av en dannelse av utfelling eller kolonnekromatografi, avhengig av egenskapene til produktet.

Nitrilet benyttet som startmateriale i foreliggende oppfinnelse er en aromatisk polynitrilforbindelse som har minst en nitrilgruppe i molekylet. Foretrukne eksempler på dette omfatter ortoftalonitrill, isoftalonitril og tereftaolnitril.

Heretter, vil foreliggende oppfinnelse bli beskrevet spesifikt ved eksempler.

Eksempel 1 Fremskaffelse av variant mikroorganisme

Rhodococcus sp. ATCC39484 (anskaffet fra American Type Culture Collection i USA) ble utsådd på et LB agarkulturmedium og dyrket i 24 timer i et bad med konstant temperatur ved 30°C. Fra de genererte koloniene ble en passe mengde celler plukket ut og innokulert i 5 ml LB flytende medium og dyrket under risting i en rister ved 30°C i 6 timer. Cellene ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 10.000 g, vasket 3 ganger med isovolum 50 mM kalium/natriumfosfatbufferoppløsning (pH 7,0) og igjen suspendert i den samme isovolum bufferoppløsning.

Til cellesuspensjonen ble2.000 ppm NTG (N-metyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin) oppløsning tilsatt for å gi en endelig konsentrasjon på 100 ppm. Etter grundig omrøring ble oppløsningen satt i romtemperatur i 30 minutter. Så ble cellene gjenvunnet ved sentrifugering ved 10.000 g, vasket 1 gang med samme bufferoppløsning og igjen suspendert i en liten mengde av samme bufferoppløsning. Deretter ble hele mengden celler innokulert i 5 ml av et uorganisk saltmedium inneholdende 0,1% benzamid. Sammensetningen til det uorganiske saltmediet er vist nedenfor.

Uorganisk saltkulturmedium

Etter omristing av kulturen i 30°C i 15 timer, ble ampicillin tilsatt for å ha en konsentrasjon på 1 mg/l, og det ble dyrket videre under risting ved 30°C i 12 timer. Den fremstilte kulturoppløsningen ble fortynnet 500 ganger og den fortynnede oppløsningen ble utsådd på 300 plater LB fastmedium (hver på en petriskål med diamenter på 90 mm) i en mengde på 0,1 ml pr. plate. Så ble cellene dyrket ved 30°C i 48 timer mens det ble generert kolonier, koloniene ble kopiert til et autoklavert fløyel, hver petriskål som et hele ble transkribert til et uorganisk fast saltmedium (diamenter 90 mm) som hadde den ovenfornevnte sammensetningen og inneholdt 0,1% benzamid og 1,5% agar og cellene ble dyrket ved 30°C i 48 timer.

Kolonidannelsen ble sammenlignet mellom de faste medium som en transkripsjonsorginal og det uorganiske faste saltmediet som et transkripsjonsmål, og omkring 400 stammer som vokste godt i LB og ikke i det uorganiske faste saltmediumet, ble valgt. Disse valgte stammene ble transplantert fra den transkripsjonsorginale LB til et nytt fast LB medium ved hjelp av steriliserte tannpirkere og dyrket ved 30°C i 24 timer. Alle de genererte koloniene ble innokulert i 5 ml i den ovenfor beskrevne uorganiske saltkulturmediumet og 0,1% isoftalonotril ble tilsatt dertil og dette ble reagert i 30°C i 48 timer. Den opphavelige stammen av ATCC39484 ble også dyrket, innokulert og reagert på samme måten. Supernatanten i reaksjonsoppløsningen oppnådd ved hver stamme, ble fortynnet 100 ganger og utsatt for reversfase HPLC (kolonne: Shodex DS-613, elueringsmiddel: 50% acetonitril/5 mM kaliumfosfat bufferoppløsning, pH: 3,0, strømningshastighet: 1 ml/min., deteksjon: UV 210 nm). I en stamme (SD826 stamme) ble det verifisert at en stor mengde 3-cyanobenzosyre ble detektert tilsvarende til den opphavelige stammen ATCC39484 og 3-cyanobenzamid og ftalsyremonoamid, som ble detektert i reaksjonsoppløsningen i den opphavelige stammen, var ekstremt redusert. Den fremstilte stammen ble ansett som en ønskelig stamme som manglet sidereaksjonsveien.

Tabell 1 nedenfor beskriver de mykologiske egenskapene til den nye Rhodococcus bakterien, Rhodococcus sp. SD826 (FERM BP-3705).

Eksempel 2

Rhodococcus sp. SD826 ble utsådd på et LB agarkulturmedium og dyrket ved konstant badtemperatur på 30°C i 24 timer. Fra de genererte koloniene ble en passende mengde celler plukket opp og suspendert i 10 ml av et flytende LB medium plassert i en 500 ml flaske med ledeplater. Flasken ble plassert i en roterende rister med konstant temperatur på 30°C og dyrket ved 120 omdreininger pr. minutt i 24 timer. De fremskaffede mikroorganismecellene ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 10.000 g og suspendert i en 50 mM natrium/kaliumfosfatbufferoppløsning (pH 7) med samme volum som kulturoppløsningen. Til cellesuspensjonen ble isoftalonitril tilsvarende til 5%

(masse/volum) tilsatt og suspensjonen ble plassert i en roterende rister ved konstant temperatur på 30°C og reaksjonen ble utført ved 120 omdreininger pr. minutt i 72 timer.

Den oppnådde reaksjonsoppløsningen ble justert til pH 2 ved anvendelse av 2 mol/l saltsyre, etylacetat med samme volum som reaksjonsoppløsningen ble tilsatt, og den resulterende oppløsning ble omrørt og ekstrahert. Det oppnådde etylacetatlaget ble passende fortynnet og analysert ved reversfase HPLC (kolonne: Shodex DS-613, elueringsmiddel: 50% acetonitril/5 mM kaliumfosfatbufferoppløsning, pH: 3,0, strømningshastighet: 1 ml/min., deteksjon: UV 210 nm). I reaksjonsoppløsningen ble hovedingrediensene med en topp hvis retensjonstid sammenfalt med 3-cyanobenzosyreprøven funnet. Ingrediensen i toppen ble oppsamlet og utsatt for GC-massespekteranalyse. Som et resultat ble hver verifisert å angi et fragmentmønster som antydet den samme strukturen som prøven.

Som et komparativt eksempel, ble reaksjonen, ekstraheringen og analysen utført på samme måte som ovenfor, bortsett fra anvendelse av den opphavelige stammen ATCC39484.

Hovedingrediensen i reaksjonsoppløsningen på den opphavelige stammen ble utsatt for LC-MS analyse og identifisert.

Sammenligningen mellom reaksjonsoppløsningen av den opphavelige stammen og reaksjonsoppløsningen av SD826 med hensyn på konsentrasjon av hver hovedkomponent og estimert omdanningsforhold fra isoftalonitril som var et startmateriale for reaksjonen, og reduksjonsforholdet av biprodukter pga. av anvendelsen av SD826 stammen basert på ATCC39484, vist i tabell 2 nedenfor.

Eksempel 3

Rhodococcus sp. SD826 ble utsådd på et LB agarkulturmedium og dyrket ved konstant badtemperatur på 30°C i 24 timer. Fra de genererte koloniene ble en passende mengde celler plukket opp og suspendert i 10 ml av et flytende LB medium plassert i en 500 ml flaske med ledeplater. Flasken ble plassert i en roterende rister med konstant temperatur på 30°C og dyrket ved 120 omdreininger pr. minutt i 24 timer. De fremskaffede mikroorganismecellene ble gjenvunnet ved sentrifugering ved 10.000 g og suspendert i en 50 mM natrium/kaliumfosfatbufferoppløsning (pH 7) med samme volum som kulturoppløsningen.

Til cellesuspensjonen ble isoftalonitril i e mengde tilsvarende til 1 %

(masse/volum) og 0,1% (masse/volum) benzonitril som et induktivt substrat tilsatt. Så ble suspensjonen plassert i en roterende rister ved konstant temperatur på 30°C og reaksjonen ble utført ved 120 omdreininger pr. minutt i 72 timer. Den resulterende reaksjonsoppløsningen ble justert til pH 2 ved anvendelse av 2 mol/l saltsyre, tilsatt til etylacetat med samme volum som reaksjonsoppløsningen omrørt og ekstrahert. Det oppnådde etylacetatlaget ble passende fortynnet og analysert ved reversfase HPLC (kolonne: Shodex DS-613, elueringsmiddel: 50% acetonitril/5 mM kaliumfosfatbufferoppløsning, pH: 3,0, strømningshastighet: 1 ml/min., deteksjon: UV 240 nm). I reaksjonsoppløsningen ble hovedingrediensene som hadde en topp med en retensjonstid som sammenfalt med 4-cyanobenzosyreprøven funnet. Ingrediensen i toppen ble oppsamlet og utsatt for GC-massespekteranalyse. Som et resultat ble hver bekreftet å samsvare med et fragmentmønster som antyder den samme strukturen som prøven.

Som et komparativt eksempel, ble reaksjonen, ekstraheringen og analysen utført på samme måte som ovenfor, ved anvendelse av en opphavelige stamme ATCC39484. Hovedproduktet i reaksjonsoppløsningen fra den opphavelige stammen under de ovenfor beskrevne HPLC betingelsene ble utsatt for LC-MS analyse og så identifisert og kvantifisert.

Sammenligningen mellom reaksjonsoppløsningen av den opphavelige stammen og reaksjonsoppløsningen av SD826 med hensyn på konsentrasjon av hver hovedkomponent og estimert omdanningsforhold fra isoftalonitril, som var et startmateriale for reaksjonen, og reduksjonsforholdet av biprodukter pga. av anvendelsen av SD826 stammen basert på ATCC39484 er vist i tabell 3 nedenfor.

Eksempel 4 Fremstilling av kromosomalt DNA for fremstilling av nitrilasegen

Rhodococcus sp. ATCC39484 stammen (heretter referert til "R. Sp.") ble dyrket en dag og en natt på en agarplatekulturmedium fremstilt ved tilsetting av 2% agar til et L medium (Polypepton: 1%, NaCI: 0,5%, gjærekstrakt: 0,5%, pH: 7,0) og en knivegg celler derfra ble dyrket ved 30°C i 24 timer i 300 ml av et kulturmedium fremstilt ved tilsetting av 5 g/l glukose og 2 g/l urea til et basekulturmedium (KH2P04: 1,5 g/l, Na2HPO42H20: 0,75 g/l, MgS047H20: 0,2 g/l, CaS042H20: 10 mg/l, FeS047H20: 5 mg/l, gjærekstrakt: 20 mg/l). De inkuberte cellene ble høstet og vasket med 100 ml 5 mM EDTA oppløsning. De resulterende cellene ble suspendert i 30 ml bufferoppløsning (20 mM Trissaltsyrebufferoppløsning (pH 7,1)), 60 mg lysozym ble tilsatt til dette og suspensjonen ble inkubert ved 37°C i 2 timer. Denne suspensjonsoppløsningen ble sentrifugert (5.000 rpm, 7 minutter) for å gjenvinne cellene. De gjenvundne cellene ble resuspendert i 11,34 ml TE buffer, 0,6 ml 10% SDS ble tilsatt, proteinase R (produkt fra Merck) ble tilsatt og blandingen ble ristet forsiktig ved 55°C i 1 time. Denne oppløsningen ble ekstrahert med fenol og utfelt med etanol for fremstille kromosomalt DNA.

Eksempel 5 Konstruksjon av DNA bibliotek

20 jag kromosomalt DNA fremstilt i eksempel 4 ble utsatt for delvis kutting ved anvendelse av et restriksjonsenzym Sau 3Al. Mer spesifikt ble kromosomalt DNA fylt i 5 rør i en mengde på 4 ^g pr. rør og restriksjonsenzymet Sau 3AI (fremstilt av Takara Shuzo Co. Ltd. Fra 4 til 12 U/^l) ble tilsatt til hvert individuelt rør og reagert ved 37°C i et reaksjonsvolum på 100 ul. Hvert 10. sekund ble et rør tatt opp og reaksjonen ble stoppet ved tilsetting av EDTA slik at den endelige konsentrasjonen ble på 20 mM. De således fremstilte partielt oppkuttede fragmentoppløsningene av kromosomalt DNA ble satt på elektroforese på en agarosegel og DNA fragmenter fra 1 til 2 kb ble gjenvunnet ved elektroforeseekstraksjon og utfelling med etanol. De gjenvunnede DNA fragmentene ble oppløst i 30 ^l TE oppløsning. 9 ^l av denne prøven og 1 ^g pUC18 (fremstilt av Takara Shuzo Co. Ltd.) ble utsatt for kutting med BamHI og til en BAP behandling ble ligert ved anvendelse av T4DNA ligase (ligeringskit ver. 2, fremstilt av Takra Shuzo Co. Ltd.) for å gi 20 ul, og deretter ble Escherichia co//'JM101 stammen transformert. For å fremstille et amplifisert bibliotek fra det fremstilte biblioteket, ble Escherichia coli transformantene implantert ved hver 20. koloni, og et L medium inneholdende 50 ppm ampicillin og dyrket en dag og en natt. Fra cellene ble et plasmid ekstrahert med en alkali SDS metode.

Eksempel 6 Anker PCR metode

Før kloningen ble anker PCR utført for å oppnå et partielt enzymgenfragment for anvendelse som en probe. En primer som ble avledet fra enzymsekvensen ble fremstilt ved utvelgelse av en sekvens med en passende Tm fra kjent N-terminalsekvens av dette enzymet. Den er:

5'-gct gcg gtg cag gca-3'

(og den komplementære strand for denne)

Tm: 52°C

PCR ble utført under de følgende reaksjonsbetingelser.

Reaksjonsoppløsningens sammensetning:

Reaksjonsbetingelser:

I den således utførte reaksjonen ble en reaksjonsoppløsning som ble funnet av et fragment spesifikt amplifisert, utsatt for 2% agarosegel elektroforese og regionen inneholdende fragmentet ble skåret ut og renset ved anvendelse av EASYTRAP ver. 2 (produsert av Takara Shuzo Co. Ltd.). DNA sekvensen for hvert oppnådd DNA fragment ble bestemt ved dideoksymetoden. De som hadde en translatert aminosyresekvens homolog til nitralase N-terminalsekvens av R. Sp. ATCC39484 stammen ble søkt. Som et resultat ble omkring 900 bp fragment inneholdende DNA sekvens som koder for 287 aminosyrer for nitrilase funnet i de fremstilte fragmentene.

Eksempel 7 Kolonihybridisering

Ved anvendelse som en probe ble PCR fragmentet fremstilt i eksempel 3 inneholdende en del av nitrilasegenet, ble alle genene klonet ved en kolonihybridiseringsmetode. Oppløsningen av de delvis kuttede fragmentene av kromosomalt DNA degradert ved Sau 3AI ifølge fremgangsmåten i eksempel 6 bli utsatt for en 1 % agarosegel elektroforese og et 4 til 8 kb DNA fragment ble gjenvunnet ved elektroforeseekstraksjon og utfelling av etanol. Dette fragmentet ble tørket og oppløst i 30 ^l TE oppløsning. 9 ^l av denne prøveoppløsningen og pUC18 (fremstilt av Takara Shuzo Co. Ltd., 100 ng) utsatt for kutting med 1 ug BamHI og for en BAP behandling, ble ligert ved anvendelse T4DNA ligase (legeringssett ver. 2, fremstilt av Takara Shuzo Co. Ltd.) og deretter ble Escherichia co//'JM101 stammen transformert. Transformantene ble utsådd på en agarplate kulturmedium fremstilt ved tilsetting av 2% agar til L-medium inneholdende 0,1 mM isopropyl-p-D-tiogalaktopyranosid (IPTG), 0,004% 5-brom-4-klor-3-indolyl-p-D-garaktopyranosid (X-gal) og 50 ppm ampicillin, og ble dyrket ved 37°C en dag og en natt.

De genererte hvite koloniene ble plukket opp på en agarplate kulturmedium fremstilt ved tilsetting av 2% agar til et L-medium inneholdende 50 mM ampicillin og dyrket ved 37°C en hel dag og natt. Etter full vekst ble agarplate kulturmediet plassert ved 4°C i omkring 2 timer for å bli avkjølt. En tørr nylonmembran (Hybond-N<+>, fremstilt av Amersham Pharmacia Biotech) ble markert ved topp, bunn, venstre og høyre og så forsiktig plassert på overflaten til agaren i kontakt med koloniene. Etter membranen var fullstendig fuktet, ble membranen fjernet fra agaroverflaten i en enkelt kontinuerlig bevegelse ved å overføre koloniene på platen til membranen. Når antallet overførte celler ble lite, ble membranen plassert på et agarplate kulturmedium fremstilt ved tilsetting av 2% agar til L-medium inneholdende 50 ppm ampicillin og dyrket ved 37°C en hel dag og natt.

Membranene, på hvilke cellene var overført, ble flotert på 3 ml av en alkalisk oppløsning (0,5 M NaOH) for å oppløse cellene. De ikke-oppløste gjenværende cellene ble vasket ut fra membranen med 5 x SSC i 20 minutter x 2 ganger. Til denne membranen utført ved anvendelse av "Random" primer DNA merking og deteksjonssystem (fremstilt av Amersham Pharmacia Biotech). Detektering ved hybridisering ble utført under standard betingelser ifølge beskrivelsen festet til settet. Som et resultat av hybridiseringen utført på omkring 4.000 kolonier, ble det oppnådd 2 stammer som en positiv klone.

Fra disse positive klonene ble plasmider ekstrahert med en alkalisk-SDS metode. Posisjonen til spaltesetet ved restriksjonsenzym i det partielle fragmentet benyttet som probe, ble sammenlignet med restriksjonskuttingsmønsteretfor hvert plasmid, og derfra ble posisjon og retningen av genene i insertsjonsfragmentet estimert. Som et resultat, ble plasmidene pNL06 og pNL09 fremstilt fra to klonestammer, begge funnet å inneholde totale nitrilasegener (se figur 1). Ved anvendelse av P09 stammeplasmidet (pNL09) som hadde en større lengde på insertsjonsfragmentet, ble DNA sekvensen til insertsjonsfragmentet på omkring 2,6 kb bestemt. En del som var homolog med den partielle fragmentsekvensen benyttet som probe, ble søkt og som resultat ble det funnet at et nitrilasegen av tilstede i den positive retningen med hensyn til lak-promotoren fra en del omkring 300 bp nedstrøms fra insertsjonsfragmentets ende. Den således fundne retningen og posisjonen samsvarte med posisjonen og retningen til genet estimert fra spaltingssetet for restriksjonsenzymet. Aminosyresekvensen translatert fra denne nitrilasegensekvensen var ny og forskjellig fra aminosyresekvensen til en hvilken som helst kjent nitrilase.

Eksempel 8 Måling av nitrialseaktivitet

Nitrilaseaktiviteten ble målt som følger. Cellene ble tilsatt til en reaksjonsoppløsning fremstilt ved suspendering av fra 1 til 10 masse % tereftaolnitril (TPN) som substrat i 10 ml 20 mM fosfatbufferoppløsning (pH 7,0) og reagert ved 30°C under risting, og p-cyanobenzosyre fremstilt i reaksjonsoppløsningen ble kvantifisert ved et HPLC med faste intervaller. Det faste stoff ble fjernet fra reaksjonsoppløsningen ved sentrifugering, og supernatanten ble 100 ganger fortynnet med elueringsmiddel som ble benyttet som HPLC prøven. Apparatet og betingelsene for kvantifisering av p-cyanobenzosyre er vist nedenfor.

Apparat:

Pumpe: DS-2 (Shodex)

Detektor: SPD-6AV UV-VIS spektrofotometer (Shimadzu) Neste introduksjon prøve: Autosampler modell 23 (SIC) med 20 ml prøverør Registrering: Chromatocoder 12 (SIC)

Kolonne: ODSpak F-411 (Shodex), 4,6 x 150 mm, 40°C

Separasjonsbetingelser:

AcCN/H20 = 50:50, 0,1% TFA, 1 ml/min

Aktiviteten blir vist ved massen av p-cyanobenzosyre og cellene i tørr masse på 1 g, ble produsert i 1 I reaksjonsoppløsning i løpet av 1 time (enhet: g/l/t/g tørre celler).

Eksempel 9 Fremstilling av høy ekspresjonsstamme

Den positive klonen P09 stammen fremskaffet i eksempel 4, ble dyrket i et L medium inneholdende 50 ppm ampicillin og som et resultat ble nitrilaseaktiviteten bekreftet uansett fravær eller nærvær av isopropyl-p-D-tioglaktopyranosid (IPTG). Imidlertid, var aktiviteten så lav som noen få tideler av Rhodococcus mikroorganismen som var donor. I P06 stammen ble nitrilaseaktiviteten ikke observert i det hele tatt.

For å øke produksjonen av enzymet, ble to typer fragmenter, et inneholdende kun det strukturelle enzymgenet og en annen inneholdende det strukturelle enzymgenet og regionen på omkring 1,3 kb nedstrøms derfra ble fremstilt ved PCR. Ved anvendelse avdisse, ble plasmidene pUNLEI og pUNLE2 hver ligert umiddelbart etter lak-promotoren i pUC18 fremstilt. Primerene og reaksjonsbetingelsene benyttet for fremstilling av PCR fragmentene er vist nedenfor.

pUNLEI

(forover)

5'-aac atg gtc gaa tac aca aac-3'

(revers)

5'-cc aag ett tea gag ggt ggc tgt-3'

Hindlll sete

pUNLE2

(forover) den samme som pUNLEI

(revers)M13 primer M4

Sammensetning av reaksjonsoppløsningen:

Reaksjonsbetingelser:

De produserte fragmentene ble utsatt for agarosegel elektroforese og gjenvunnet ved ekstrahering. Hvert av fragmentene ble kuttet ved Hindlll og Ncol setet, ligert med EcoRINcol linker og så ligert med pUC18 spaltet ved EcoRI og Hindlll (se figur 2). Med disse plasmidene ble Escherichia coli JM109 stammen transformert. De fremstilte transformantene ble hver dyrket i et L medium inneholdende 50 ppm ampicillin en hel dag og natt, og etter tilsetting av isopropyl-p-D-tiogalactopyranosid (IPTG) til kulturoppløsningen til en konsentrasjon på 0,1 mM, ble den videre dyrket i 2 timer. De fremstilte transformantene ble målt med hensyn til nitrilomdanningsaktivitet ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 5. Som et resultat, ble transformantene fremstilt ved transformering med et hvilket som helst plasmid verifisert å ha en nitrilaseaktivitet så høy som omkring 500 ganger pUNL09 transformanten, omkring 80 ganger Rhodococcus mikroorganismen som var en donor (se tabell 4).

Eksempel 10 Produksjon av p-cyanobenzosyre ved bruk av høyaktivitetsstamme

pUNLEI transformanten fremstilt i eksempel 9 ble dyrket en hel dag og natt på agarkulturmedium preparert ved tilsetting av 2% agar til et L medium inneholdende 50 ppm ampicillin, og de dyrkede cellene ble innokulert med en innokuleringssløfte i 100 ml av et L medium inneholdende 100 ppm ampicillin og dyrket under risting ved 37°C. Kulturoppløsningen ble subkulturert i en 5 I kannefermenter fylt med 2 I medium inneholdende 100 ppm ampicillin og dyrket med lufting og omrøring en hel dag og natt under betingelser på 374°C, 800 rpm agitering og en luftingsrate på 1 l/min. Til cellekulturoppløsningen ved det initielle trinn av den stasjonære fase eller ved det endelige trinn av den logiritmiske vekstfasen, ble isopropyl-p-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) tilsatt for å gi en endelig konsentrasjon på 0,1 mM, og dyrkingen ble fortsatt i ytterligere 4 timer.

Kulturoppløsningen ble sentrifugert og de oppnådde cellene ble igjen suspendert i 1 I 20 mM fosfatbufferoppløsning (pH 7,0). Til dette ble 100 g tereftaolnitril (TPN) tilsatt og reagert ved 35°C under omrøring. En del av reaksjonsoppløsningen ble tatt som prøver av intervaller på 1 time og p-cyanobenzosyren fremstilt i reaksjonsoppløsningen ble kvantifisert ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 5. p-cyanobenzosyre ble hurtig produsert ved transformanten og akkumulert i en andel på 3% i reaksjonsoppløsningen i løpet av omkring 3 timer (se figur 3). Etter fullførelse av reaksjonen ble konsentrert saltsyre tilsatt til reaksjonsoppløsningen for å justere pH til 1 og derved utfelle p-cyanobezosyre. Utfellingen ble filtrert gjennom et filterpapir, vasket med fortynnet saltsyre (0,1 mol/l) og så vakuumtørket. Den således fremskaffede tørre prøven hadde en renhet på 99,9% eller mer. De detekterte urenhetene var startmaterialet tereftaolnitril.

Eksempel 11 Fremstilling av kromosomalt DNA for fremstilling av nitrilhydratasegen og amidasegen

R. sp. ATCC39484 stammen ble dyrket en hel dag og natt i et næringsmedium (L-medium) agarplatekulturmedium, og en full sløyfe av celler av dette ble dyrket ved 30°C i 24 timer i 300 ml av et kulturmedium fremstilt ved tilsetting av 5 g/l glukose og 2 g/l urea til et basekulturmedium (KH2PO4:1,5 g/l, Na2HP042H20: 0,75 g/l, MgS047H20: 0,2 g/l, CaS042H20: 10 mg/l, FeS047H20: 5 mg/l, gjærekstrakt: 20 mg/l). De inkuberte cellene ble høstet og vasket med 100 ml 5 mM EDTA oppløsning. De resulterende cellene ble suspendert i 30 ml av en bufferoppløsning (20 mM Trissaltsyrebufferoppløsning (pH 7,1)), 60 mg lysozym ble tilsatt til dette og suspensjonen ble inkubert ved 37°C i 2 timer. Denne suspensjonsoppløsningen ble sentrifugert (5.000 rpm, 7 minutter) for å gjenvinne cellene. De gjenvunnede cellene blir resuspendert i 11,34 mL TE buffer, 0,6 ml 10% SDS ble tilsatt, proteinase R (produsert av Merck) ble tilsatt til en konsentrasjon på 100 ug/ml og blandingen ble forsiktig ristet ved 55°C i 1 time. Denne oppløsningen ble ekstrahert med fenol og utfelt metanol for å fremstille kromosomalt DNA.

Eksempel 12 Konstruksjon av et DNA bibliotek

De fremstilte 20 ug kromosomalt DNA ble utsatt for partiell kutting ved anvendelse av et restriksjonsenzym Sau 3Al. Mer spesifikt, ble kromosomalt DNA fylt i 5 rør i en mengde på 4ug pr. rør og restriksjonsenzymet Sau 3AI (produsert av Takara Shuzo Co. Ltd. Fra 4 til 12 U/ul) ble tilsatt til hvert individuelle rør og reagert ved 37°C i et reaksjonsvolum på 100 ul. Hvert 10. sekund ble et rør tatt opp og reaksjonen ble stanset ved tilsetting av EDTA for å gi en endelig konsentrasjon på 20 mM. Den således fremstilte delvis kuttede fragmentoppløsning av kromosomalt DNA ble elektroporisert på agarosegel og fra 5 til 10 kb av DNA fragmentet ble gjenvunnet ved elektroforeseekstraksjon og utfelling med etanol. Det gjenvunne DNA fragmentet ble så oppløst i 30 ul TE oppløsning. 9 ul av denne oppløsningen og 1 ug av pUC18 (produsert av Takara Shuzo Co. Ltd.) ble utsatt for kutting med BamHI og BAP behandling, ble ligert ved anvendelse av T4DNA ligase (ligeringssett ver. 2, fremstilt av Takara Shuzo Co. Ltd.) for å gi 20 ul og deretter ble Escherichia coli JM101 stammen transformert. For å fremstille et amplifisert bibliotek fra det fremstilte biblioteket, ble Escherichia coli transformanter transplantert hver 20. koloni på et L medium (pH 7,0) inneholdende 50 ppm ampicillin og dyrket en hel dag og natt. Fra cellene ble et plasmid ekstrahert med en alkali-SDS metode.

Eksempel 13 Rensing av nitrilhydratase og amidase

En primer avledet fra enzymsekvensen nødvendig for å feste PCR, ble fremstilt fra den N-terminale sekvensen av enzympeptidet fremstilt som følger ved selektering av sekvensen slik at primeren hadde en passende TM.

Nitrilhydrataseaktiviteten eller amidaseaktiviteten ble hver kvalitativt bestemt ved å la 1 ml av en reaksjonsblanding inneholdende 10 mM benzonitril eller 10 mM benzamid, 30 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0) og en forhåndsbestemt mengde celleekstrakt for å reagere ved 25°C i 30 minutter, så detektere det produserte benzamid eller benzosyre ved HPLC (HPLC separasjonsbetingelser var de samme som de i eksempel 8 beskrevet ovenfor).

R. sp. ATCC39484 stammen ble innokulert i 600 ml av et medium som induserer nitrildekomponeringsenzymer, omfattende basismediumet i eksempel 1 og 1 g/l benzonitril som induksjonssubstrat, dyrket ved risting ved 30°C. Kulturoppløsningen ble dyrket en hel dag og natt, utsatt for sentrifugering (8.000 rpm, 15 minutter) for å gjenvinne cellene, og 3,2 g våtvekt av de fremskaffede cellene ble vasket med 50 ml av 100 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0 inneholdende 1 mM EDTA og 2 mM DTT), og deretter suspendert i 200 ml av den samme bufferen. Dette ble utsatt for supersonikator for å ødelegge cellene, fulgt av sentrifugering (12.000 rpm, 20 minutter) for å gi 180 ml av en supernatant (rå enzymekstraktoppløsning).

Ammoniumsulfat ble tilsatt til denne cellefrie ekstraktoppløsningen til en 45% mettet konsentrasjon, blandingen ble omrørt ved 4°C i 1 time også ble det genererte presipitatet fjernet ved sentrifugering. Videre, ble ammoniumsulfat tilsatt til den separerte supernatanten til en 60% mettingskonsentrasjon, blandingen ble omrørt ved 4°C i 1 time og deretter ble utfellingen gjenvunnet ved sentrifugering. Den genererte utfellingen ble bekreftet å utvise nitrilhydrataseaktivitet og amidaseaktivitet. De fremskaffede utfellingene ble oppløst i 10 ml 100 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0, inneholdende 1 mM EDTA og 1 mM DTT), og oppløsningen ble dealisert på den samme buffer.

Den dialyserte rå enzymoppløsningen ble fylt i 1 DEAE-Sepharosekolonne (2 cm x 20 cm) ekvilibrert med en 100 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0, inneholdende 1 mM EDTA og 2 mM DTT) og vasket med den ekviliberte bufferen inntil UV absorpsjonen ved 280 nm til eluatet avtok. Deretter ble den ytterligere vasket med den samme bufferen, men tilsatt 0,1 m KCI inntil UV absorpsjonen ved 280 nm av eluatet avtok. Deretter ble nitrilhydratase og amidase eluert med 100 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0, inneholdende 1 mM EDTA og 2 mM DTT) hvor KCI konsentrasjonen ble øket til 0,3 M. Fraksjonene som viste aktivitet ble oppsamlet og enzymproteinet ble konsentrert ved anvendelse av en ultrafiltreringsmembran (kutt ved molekylvekt 30.000).

I fenylsepharose CL-4B kolonne (2 cm x 40 cm) ekvilibrert med en 100 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0, inneholdende 10% mettet konsentrasjon av ammoniumsulfat), og en blanding av en den konsentrerte aktive fraksjonen og 10% mettet konsentrasjon av ammoniumsulfat ble fylt på for å tillate enzymet å bli absorbert på denne. Kolonnen ble så vasket med den ekvilibrerte bufferen inntil UV absorpsjonen ved 280 nm til eluatet avtok. Deretter ble nitrilhydratase og amidase eluert med elueringsbufferen (100 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0)). De aktive fraksjonene ble oppsamlet og enzymproteinet ble konsentrert ved bruk av ultrafiltreringsmembran (kutt ved molekylvekt 30.000).

Den aktive konsentrerte nitrilhydratasefraksjonen ble fylt på en Sefarkryl S-300 Superfine kolonne (2 cm x 60 cm), ekvilibrert med 100 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,0, inneholdende 0,5 M NaCI), og separeringen ble utført ved anvendelse av den samme fraksjonen, med fraksjonering av eluatet i fraksjoner på omkring 0,5 ml. På dette trinn indikerte forskjellige fraksjoner den maksimale nitrilhydratase- og amidaseaktiviteten, slik at den fraksjonering som viste den høyeste enzymaktiviteten og de naboliggende fraksjonene ble gjenvunnet for hvert enzym. Omkring 1,5 ml av hver fraksjon ble konsentrert ved anvendelse av en ultrafiltreringsmembran (kutt ved molekylvekt 30.000).

Eksempel 14 Bestemmelse av terminalpeptidsekvens

Bestemmelse av N-terminalsekvens til de fremskaffede nitrilhydratase og amidase ble forsøkt, men begge enzymene viste lav signalintensitet ved Edman degradering slik at bestemmelsen av sekvensen var uten suksess. Følgelig ble enzymproteinet hydrolysert med cyanogenbromid (BrCN) og de fremstilte peptidene ble separert under de følgende væskekromatografibetingelsene.

Av det flertall av peptider fremskaffet fra de aktive nitrilhydratasefraksjonene, ble de prøvene som viser relativt god separasjon utvalgt og utsatt igjen for N-terminalsekvensanalyse ved Edman degradering. Som et resultat, ble den følgende sekvensen som har stor homologi med eksisterende nitrilhydratasesekvens bekreftet.

Under hensyntagen til denne sekvensen og kodonanvendelsen til Rhodococcus bakterien, bli en primer for nitrilhydrataset fremstilt.

Tilsvarende, av det flertall peptider fremskaffet fra de aktive amidasefraksjonene, ble de fraksjonene som viste relativt god separasjon utvalgt og utsatt igjen for en terminal sekvensanalyse ved Edman degradering. Som et resultat ble den følgende sekvensen med en høy homologi med den eksisterende amidasesekvensen bekreftet.

Under hensyntagen til denne sekvensen og kodonanvendelsen til Rhodococcus bakterien, ble en primer for amidase fremstilt.

Eksempel 15 Anker PCR metoden

PCR metoden blir benyttet under de følgende reaksjonsbetingelsene:

Sammensetning til reaksjonsoppløsningen:

Rekasjonsbetingelser:

I den således utførte reaksjonen ble en reaksjonsoppløsning funnet å ha et fragment som ble spesifikt amplifisert utsatt for 2% agarosegelelektroforese og en region inneholdende fragmentet ble tatt ut og renset ved anvendelse av "EASYTRAP" ver. 2 (fremstilt av Takara Shuzo Co. Ltd.). Hver av de fremstilte DNA fragmentene blir bestemt ved DNA sekvens ved dideoksymetoden for å bekrefte at den translaterte aminosyresekvensen var homolog med de kjente nitrilhydratase og amidase. Som et resultat ble det avslørt at de fremstilte fragmentene 4 og 14 inneholder sekvenser som hadde høy homologi med henholdsvis kjente nitrilhydratase og amidase. Fragment 4 inneholdt omkring 500 bp av en sekvens som var homolog med nitrilhydratase og fragment 14 inneholdt omkring 900 bp sekvens som var homolog med amidase. Begge hadde tilstrekkelig lengde til å tjene som probe for anvendelse i påfølgende kolonihybridisering.

Eksempel 16 Kolonihybridisering

Ved anvendelse som en probe PCR fragmentene som inneholdt en del av nitrilhydratasegenet og PCR fragmentene inneholdende en del av amidasegenet, fremstilt i eksempel 15, ble fulle gener klonet ved en kolonihybridiseringsmetode. Oppløsningen av partielt kuttede fragmenter av kromosomalt DNA degradert ved Sau 3AI ifølge fremgangsmåten i eksempel 1, ble utsatt for 1% agarosegelelektroforese og et 4 til 8 kb DNA fragment ble gjenvunnet ved elektroforeseekstraksjon og utfelling med etanol. Dette fragmentet ble tørket og oppløst i 30 ul TE oppløsning. 9 ul av denne prøveoppløsningen og 1 ul pUC18 (fremstilt av Takara Shuzo Co. Ltd., 100 ng) utsatt for kutting med BamHI og BAP behandling, ble ligert ved anvendelse av T4DNA ligase (ligeringssett ver. 2, produsert av Takara Shyzo Co. Ltd.), og deretter ble Escherichia coli JM101 stammen transformert. Transformantene ble utsådd på et agarplatekulturmedium fremstilt ved tilsetting av 2% agar til et L medium inneholdende 0,1 mM av isopropyl-p-D-tiogalactopyranosid (IPTG), 0,004% 5-brom-4-klor-3-indolyl-p-D-garactopyranosid (X-gal) og 50 ppm av ampicillin, og dyrket ved 37°C en hel dag og natt.

De genererte hvite koloniene ble plukket opp på et agarplatekulturmedium fremstilt ved tilsetting av 2% agar til L medium inneholdende 50 ppm ampicillin og dyrket ved 37°C en hel dag og natt. Etter full dyrking ble agarkulturplatemediumet plassert ved 4°C i omkring 2 timer for avkjøling.

En tørr nylonmembran (Hybond-N<+>, fremstilt av Amersham Pharmacia Biotech) bli merket med en blyant på topp, ned, venstre og høyre, og så forsiktig plassert på overflaten til agaren i kontakt med koloniene. Etter at membranen var fullstendig fuktet ble membranen forsiktig fjernet fra overflaten og i en enkel kontinuerlig bevegelse ble koloniene på agarplaten overført til membranen. Når antallet overførte celler var lite, ble membranen plassert på et agarplatekulturmedium fremstilt ved tilsetting av 2% agar til L medium inneholdende 50 ppm ampicillin dyrket ved 37°C en hel dag og natt.

Membranen, på hvilken det var overført celler, ble flotert på 3 ml av en alkalisk oppløsning (0,5 M NaOH) for å oppløse cellene. De ikke-oppløste gjenværende cellene ble vasket ut fra membranen med 5 x SSC i 20 minutter x 2 ganger. Til denne membranen ble kolonihybridisering utført ved anvendelse av "Random" primer DNA merking og deteksjonssystem (fremstilt av Amersham Pharmacia Biotech). Detekteringen ved hybridiseringen ble utført under standard betingelser ifølge beskrivelsen festet til settet. Som et resultat av hybridiseringen utført på omkring 8.000 kolonier, ble det oppnådd en stamme for hvert gen som en positiv klone.

Fra disse positive klonene ble plasmider ekstrahert ved en alkalie-SDS metode. Posisjonen til spaltingssetet ved restriksjonsenzym i partielle fragmentet benyttet som probe, ble sammenlignet med restriksjonskuttingsmønster for hvert plasmid og fra dette ble posisjonen og retningen av genene i insertsjonsfragmentet estimert. Som et resultat, ble plasmid UNHII fremstilt fra klonet stamme Pil av nitrilhydratase, avslørt å inneholde hele nitrilhydratasegenet (se figur 4), mens plasmidet pUAMD12 fremstilt fra den klonede stammen P12 av amidase, viste kompleks mønster etter restriksjonsenzymbehandling og posisjon i retning til genet kunne ikke bli bestemt. Følgelig, ble pUAMD12 alene videre behandlet med restriksjonsenzym og de fremskaffede fragmentene ble utsatt for Southern hybridisering. Som et resultat, ble det antatt at dette også inneholdt hele den strukturelle genregion (figur 4).

Eksempel 17 Fremstilling av delesjonsmutant og bestemmelse av basesekvens

pUNHII og pUAMD12 er plasmider hver inneholdende ett innsatt fragment på 3 kb til 4 kb, og deres basesekvens var vanskelig å bestemme. Fremstilling av delesjonsmutanter fra hvilke det innsatte fragmentet var deletert fra terminalen ved anvendelse av exonuklease III ble forsøkt. For fremstilling av mutanter, ble

"Deletion Kilo-Sequence Kit" (Takara Shuzo Co. Ltd.) benyttet. Her ble 25 ul (omkring 16 ug for 0,4 mg/ml) av pUNH11 eller pUAMD12 oppløsningen forsiktig kuttet med Sse8387l og Xbal (37°C, 24 timer) renset ved ekstrahering med fenol og utfelt ved tilsetting av 1/10 volum 3M Na acetat og 2,5 volumer etanol. Utfellingene ble sentrifugert og gjenvunnet og en gang vasket med 70% kald etanol. Deretter ble utfellingene tørket under vakuum. De vakuumtørkede utfellingene ble oppløst i 100 ul Exo III buffer. 1 ul Exonuklease III ble tilsatt til DNA oppløsningen og blandingen ble omrørt ved anvendelse av en virvler, og deretter inkubert ved 37°C. Etter 10 sekunder og 30 sekunder ble hver av 50 ul reaksjonsprøvene innsamlet (blandet med 50 ul av en MB nukleasebuffer fremstilt på forhånd for å stoppe reaksjonen).

2 ul MB nuklease ble tilsatt til reaksjonsblandingen og inkubert ved 37°C i 20 minutter. Etter fullførelse av reaksjonen ble reaksjonsblandingen ekstrahert med fenol for rensing og 1/10 volum av en 3M Na acetat og 2,5 volumer etanol ble

tilsatt for å danne utfelling. Utfellingen ble gjenvunnet ved sentrifugering, vasket 1 gang med 70% kald etanol og så tørket under vakuum. De således oppnådde utfellingene ble oppløst i 50 ul Klenow buffer og 1 ul Klenow fragment ble tilsatt til dette, fulgt av inkubering ved 37°C i 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble utsatt for agarosegelelektroforese for å fraksjonere i 3 områder for strenglengde (hver ble kuttet ut fra gelen, ekstrahert og gjenvunnet). 10 ul av de gjenvunnede oppløsningene av de utkuttede fragmentene ble blandet med 100 ul ligeringsbuffer A, 12 ul ligeringsbuffer B ble tilsatt til dette, og blandingen ble omrørt i 16°C i 24 timer ved anvendelse av en virvler for å forårsake selvligering. Det fremskaffede plasmid ble anvendt for å transformere Escherichia coli JM109 stammen.

Fra operasjonen ovenfor kunne 20 eller flere delesjonsmutanter bli fremskaffet for pUNH11. Fra disse, ble 7 mutanter inneholdende insertsjonsfragmenter med passende lengde utvalgt og benyttet for bestemmelse av sekvensen. Imidlertid, for pUAMD12, ble det avslørt at passende delesjonsmutanter ikke kunne bli fremskaffet pga. at de genererte plasmider som var større enn det opprinnelige plasmidet eller plasmider som var mindre enn den anvendte vektoren. Følgelig for pUAMD12 ble sekvensbestemmelse ved en "gene walking" metode, som bestemmer sekvensen mens primeren blir sekvensielt syntetisert, utført.

Bestemmelsen av basesekvensen ble utført ifølge en dideoksymetode ved anvendelse av en DNA sekvens på omkring 2,8 kb, tilsvarende til hele området til det innsatte fragmentet for pUNH11 og en DNA sekvens på omkring 2,8 kb tilsvarende til omkring 2/3 av det innsatte fragmentet for pUAMD12. Porsjoner identiske med partielle fragmentsekvenser benyttet som probe, ble søkt for og som resultat ble det avslørt at omkring 0,2 kb og omkring 1,1 kb nedstrøms fra insertsjonsfragmentene for pUNH11 og pUAMD12 på EcoRI setet var nitrilhydratasegenet tilstede i revers retning i forhold til lak-promotoren, mens amidasegenet var tilstede i en forover retning i forhold til dette. Resultatene fra analysen av basesekvens er vist ved sekvens Id. Nr. 3 og 6. Den retning og posisjon som således er funnet samsvarer med posisjon og retning til genet estimert fra spaltingsmønsteret ved restriksjonsenzym med hensyn til pUNH11, og var i samsvar med posisjonen og retningen for genet estimert fra spaltingsmønsteret ved restriksjonsenzym, resultatet fra Southern hybridisering med hensyn til pUAMD12. Aminosyresekvensen (sekvens Id. Nr. 4, 5 og 7) translatert fra disse gensekvensene er nye og forskjellige fra aminosyresekvensen til en hvilken som helst kjent nitrilhydratase og amidase.

Eksempel 18 Måling av nitrilhydratase og amidaseaktiviteter Nitrilhydrataseaktivitet ble målt som følger. Cellene (omkring 1 g våt masse) ble tilsatt til en reaksjonsoppløsning fremstilt ved suspendering av fra 1 til 10 masse% tereftaolnitril (TPN) som substrat i 10 ml 20 mM fosfatbufferoppløsning (pH 7,0) og reagert ved 30°C under risting, og p-cyanobenzosyreamid fremstilt i reaksjonsoppløsning ble kvantifisert ved HPLC ved faste intervaller. Faststoffet ble fjernet fra reaksjonsoppløsningen ved sentrifugering hos supernatanten 100 ganger fortynnet med elueringsmiddel, ble benyttet som HPLC prøve. Amidaseaktiviteten ble målt ved anvendelse av p-cyanobenzamid eller benzamid som tjener som substrat, mens reaksjonen ble utført under de samme betingelsene som ovenfor, og bestemmelsen av den genererte p-cyanobenzosyre eller benzosyre ble gjort ved HPLC.

Produktene ble bestemt ved anvendelse av apparatene og betingelsene nedenfor:

Apparat:

Separasjonsbetingelser:

AcCN/H20 = 50:50, 0,1% TFA, 1 ml/min

Aktiviteten blir vist ved massen av p-cyanobenzosyreamid, p-cyanobenzosyre eller benzosyre når cellene i tørr masse på 100 g ble produsert i 1 I reaksjonsoppløsning i løpet av 1 time (enhet: g/l/t/g tørre celler).

Eksempel 19 Fremstilling av høyekspresjonsstamme

De positive klonene P11 stamme eller P12 stamme fremstilt i eksempel 16 ble dyrket i et L medium inneholdende 50 ppm ampicillin, og som et resultat, ble nitrilhydrataseaktivitet bekreftet uten hensyn til nærværet eller fraværet av isopropyl-p-D-tiogalactopyranosid (IPTG). Imidlertid, var aktiviteten så lav som noen få tiendeler av Rhodococcus mikroorganismen som var donor. I P12 stammen ble amidaseaktivitet ikke observert i det hele tatt.

For å øke produksjonen av enzymet, ble fragmenter med kun de strukturelle genporsjonen fremstilt ved PCR og ligert umiddelbart etter lakpromotoren til pUC18 for å fremstille plasmid pUNHEI og pUAMDEI. Videre ble plasmid pUNHAMDEI med begge fragmentene på samme plasmid fremstilt.

Primerene og reaksjonsbetingelsene benyttet for fremstilling av PCR fragmenter er vist nedenfor:

pUNLEI

(forover)

5'-aac atg gat ggt atc cac gac-3'

(P initiseringskodon)(Ncol sete)

(revers)

5'-cc aag ett tea tac gat cac ttc-3'

(a stoppkodon)(Hindlll sete)

pUAMDEI

(forover)

5'-acc atg get tcg ttg act cc-3'

(Ncol sete, mutering av en aminosyre 3 Ser->Ala)

(revers)

5'-cc aag ett tea gga egg cac cga-3'

(Hindlll sete)

Sammensetning av reaksjonsoppløsningen:

Reaksjonsbetingelser:

For både nitrilhydratasegenet og amidasegenet, ble de fremstilte fragmentene utsatt for agarosegelelektroforese og gjenvunnet ved ekstrahering. Fragmentene ble hver kuttet ved Ncol og Hindlll setene, ligert med EcolRNcol linkeren, og så ligert med pUC18, spaltet ved EcoRI og Hindlll (se figur 5). Plasmidet på hvilke både nitrilhydratasegenet og amidasegenet var tilstede, ble først kuttet med restriksjonsenzymer Ncol og Hindlll for å spalte nitrilhydratasefragmentet, og fragmentene ble ligert med EcoRINcol linker, Hindlll-Ncol linker i rekkefølge, deretter ligert med amidasefragmentet spaltet med Ncol og Hindlll, og til sist ble det resulterende fragmentet ligert med pUC18, spaltet med EcolR-Hindlll (figur 6).

Med disse plasmidene ble Escherichia coli JM109 stammen transformert. Hver av de fremstilte transformantene ble dyrket i et L medium inneholdende 50 ppm ampicillin i en 24 timers periode, og etter tilsetting av isopropyl-p-D-tiogalaktopyranosid (IPTG) til kulturoppløsningen til en konsentrasjon på 0,1 M ble det videre dyrket i 2 timer. De oppnådde transformantene ble målt på nitrilomdanningsaktivitet ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 8. Som et resultat, ble transformantene fremstilt ved transformering med et hvilket som helst plasmid bekreftet å ha en nitrilaseaktivitet som er høyere enn den til Rhodococcus bakterien, donoren. Kun transformanten transformert med et plasmid inneholdende begge genene, viser en aktivitet som var like høy som donoren. Resultatene er oppsummert i tabell 5 nedenfor.

BESKRIVELSE AV DEPONERING

Den følgende mikroorganismen har blitt deponert ved National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken, Japan)

Den deponerte mikroorganismen har blitt deponert under bestemmelsen ifølge Budapestavtalen om internasjonal anerkjennelse for deponering av mikroorganismer for formål for patentprosedyrer og regler basert på dette.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av karboksylsyre, omfattende omdanning av minst en cyanogruppe av en aromatisk nitrilforbindelse sin har et flertall av cyanogrupper i molekylet til en karboksylgruppe for å fremstille en aromatisk cyanokarboksylsyre ved bruk av en mikroorganisme, karakterisert ved at det blir benyttet en variant mikroorganisme av en bakterie som hører til slekten Rhodococcus, hvor variant mikroorganismen manger eller har redusert aktivitet for omdanning av en cyanogruppe til en amidgruppe, sammenlignet med en tilsvarende utgangsstamme.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av karboksylsyre ifølge krav 1, hvor variantstammen av en Rhodococcus bakterie er en variantstamme av en opphavelig stamme Rhodococcus sp. ATCC39484.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av en karboksylsyre ifølge krav 2, hvor variantstammen av en opphavelig Rhodococcus sp. ATCC39484 er Rhodococcus sp. SD826 (FERM BP-7305).

4. Fremgangsmåte for fremstilling av karboksylsyre ifølge krav 1, hvor den aromatiske polynitrilforbindelsen er valgt blant gruppen omfattende o-ftalonitril, isoftalonitril og tereftaolnitril og den aromatiske cyanokarboksylsyren er tilsvarende o-cyanobenzosyre, m-cyanobenzosyre eller p-cyanobenzosyre.

5. En variant mikroorganisme som er en Rhodococcus sp. SD826 (FERM BP-7305) stamme, karakterisert ved at variant mikroorganismen har aktiviteten for omdanning av en cyanogruppe til en karboksylgruppe, men hvor mikroorganismen mangler eller har redusert aktivitet for omdanning av en cyanogruppe av en aromatisk polynitrilforbindelse til en amidgruppe, sammenlignet med utgangsstammen.

6. Variant mikroorganisme ifølge krav 5, som er en variantstamme av Rhodococcus sp. ATCC39484.

7. En fremgangsmåte for fremstilling av en aromatisk cyanokarboksylsyre ved bruk av en mikroorganisme, karakterisert ved at den omfatter trinnene: Preparering av en variantstamme oppnådd fra Rhodococcus sp. ATCC39484, hvor variantstammen har tapt eller har redusert aktivitet for omdanning av en cyanogruppe av en aromatisk polynitrilforbindelse til an amidgruppe, sammenlignet med en tilsvarende utgangsstamme, og Omdanning av minst en cyanogruppe av en aromatisk polynitrilforbindelse som har et flertall cyanogrupper til minst en karboksylgruppe for å danne en aromatisk cyanokarboksylsyre ved bruk av variantstammen.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av en aromatisk cyanokarboksylsyre ifølge krav 7, karakterisert ved at den aromatiske polynitrilforbinelsen er valgt fra gruppen bestående av o-ftalonitril, isoftalonitril og tereftalonitril, og cyanokarboksylsyren er valgt fra gruppen bestående av o-cyanobenzosyre, m-cyanobenzosyre og p-cyanobenzosyre.