KR100540991B1 - 신규한 로도코커스속 세균, 로도코커스속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자, 니트릴 하이드라타아제 유전자 및 아미다아제 유전자, 및 이들을 이용한 카르복실산의 제조방법 - Google Patents

신규한 로도코커스속 세균, 로도코커스속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자, 니트릴 하이드라타아제 유전자 및 아미다아제 유전자, 및 이들을 이용한 카르복실산의 제조방법 Download PDF

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Abstract

신규한 로도코커스 및 로도코커스 세균을 이용하여 니트릴 화합물의 시아노기를 가수분해함으로써 카르복실산을 생산하는 방법. 방향족 폴리니트릴 화합물의 시아노기에 대해 탁월한 위치-선택성을 보이는 로도코커스-유래의 니트릴라아제 유전자, 니트릴하이드라타아제 유전자, 및 아미다아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 이용하여 카르복실산류(특히, 시아노카르복실산류)를 생산하는 방법; 이들 형질전환체, 플라스미드, 유전자 및 상기 형질전환체를 이용한 효소의 생산 방법; 및 이렇게 얻어진 효소. 이렇게 얻어진 카르복실산류(특히, 시아노카르복실산류)는 약물, 살충제, 염색약 및 기타 화학 제품의 합성에서 출발물질로서 유용하다.

Description

신규한 로도코커스속 세균, 로도코커스속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자, 니트릴 하이드라타아제 유전자 및 아미다아제 유전자, 및 이들을 이용한 카르복실산의 제조방법{Novel rhodococcus, rhodococcus-origin nitrilase gene, nitrilehydratase gene and amidase gene and process for producing carboxylic acids by using the same}
관련출원과의 관계
이 출원은, 미국 특허법 제111조(b)의 규정에 따라 2000년 2월 22일에 제출된 미국 가출원 제60/183754호 및 2000년 2월 22일에 제출된 미국 가출원 제60/183821호의 출원일의 이익을 미국특허법 제 119조(e)(i)에 의해 주장하는 미국특허법 제 111조(a)의 규정에 기초한 출원이다.
기술분야
본 발명은, 신규한 로도코커스(Rhodococcus) 속 세균 및 그 세균을 이용하여 니트릴 화합물의 시아노기를 가수분해하여 대응하는 카르복실산류를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 방향족 폴리니트릴 화합물의 시아노기에 대하여 특히 우수한 위치선택성을 보이며, 로도코커스속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자, 니트릴하이드라타아제 유전자 및 아미다아제 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 형질전화체를 이용하는 카르복실산류, 특히 시아노카르복실산류의 제조 방법, 그 형질전환체, 상기 플라스미드, 상기 유전자, 상기 형질전환체를 이용한 효소의 제조방법, 및 이로써 얻어지는 효소에 관한 것이다. 본 발명에 의해 얻어지는 카르복실산류, 특히 시아노카르복실산류는, 의약, 농약, 염료, 기타 화학 제품의 합성 원료로서 유용하다.
니트릴화합물의 시아노기를 가수분해하여 대응하는 카르복실산류를 얻는 반응은, 간편하게 카르복실산류를 얻는 방법으로 여러 가지가 검토되어 있다.
1 분자 중에 복수의 시아노기를 포함하는 폴리니트릴 화합물의 일부 시아노기만을 생물적으로 가수분해하고, 대응하는 시아노카르복실산을 얻는 반응, 특히, 방향족 폴리니트릴 화합물의 특정 시아노기만을 선택적으로 가수분해하는 것에 의해 방향족 시아노카르복실산류를 얻는 방법에 대하여, 미생물의 반응 특이성을 활용한 반응이 다수 보고되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 4,629,700호에서는 로도코커스속의 세균을 이용한, 프탈로니트릴류로부터 시아노안식향산류의 제조방법이 개시되어 있다. 또한, 예를 들면 유럽 특허 제 178,106호에서는, 로도코커스 속을 포함하는 네 가지 속의 그람 양성 세균을 이용한, 폴리니트릴 화합물로부터의 선택적 시아노기 가수분해에 의한 시아노 카르복실산류, 및 시아노카르복실산 아미드류의 제조방법이 개시되어 있다.
이와 같은 선택적 시아노기 가수분해반응을, 화학합성적으로 실시하기 위하여는, 특정의 시아노기의 보호 등 복잡한 과정이 필요하므로 실용적이지 못하다.
일반적으로 선택성이 높다고 하는 생물 반응도, 상세히 검증하면, 엄밀하게 는 부반응에 의한 불순물을 동반하고 있는 경우가 많다. 가령 상기의 로도코커스속 세균을 이용한 프탈로니트릴로부터 시아노 안식향산의 제조방법에 있어서는, 선택율이 100%는 아니고, 어느것이든, 1.0%로부터 수%의 프탈로니트릴 유래의 부산물을 동반하고 있다. 이들은 원료로부터의 전환율로서는 우수한 방법이라고 할 수 있지만, 특히 의약합성등, 정밀유기합성의 출발원료로서 보았을 경우에는, 미세한 부산물의 거동이, 결과적으로 그것을 원료로 하여 합성된 물질의 성능이나 안전성에 크게 영향을 주는 경우가 적지 않은 것을 고려한다면, 충분하다고는 말할 수 없다.
제품의 순도를 높이기 위한 방법으로는, 산물을 취득후, 다시 정제를 더 행하는 방법을 들 수 있다. 그러나, 가령 방향족 폴리니트릴로부터 생물적으로 시아노 카르복실산을 생성하는 과정에서 생산되는 여러 가지의 부산물은, 서로 비점, 소수도 등의 물성치가 서로 매우 유사하여서, 통상 이용되는 증류 및 추출, 염석의 정제방법으로는 완전하게 분리되기 어렵다.
이와 같이, 종래의 니트릴 화합물의 미생물을 이용한 가수분해 반응에 의해 카르복실산류를 제조하는 방법에 있어서, 가수분해반응 그 자체의 선택율은 충분하지 않고, 부산물의 생성량이 충분히 감소되어 있다고는 말할 수 없다.
또한, 니트릴 화합물의 가수분해에 의해 카르복실산류를 제조하는 다른 방법으로서, 니트릴라아제, 또는 니트릴하이드라타아제와 아미다아제를 이용하는 효소적 반응법이 있다.
니트릴라아제는 니트릴 화합물을 카르복실산으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소로서, 니트릴 화합물로부터 의농약원료 등에 유용한 카르복실산을 얻는 수단으로서 유용하다. 당해 효소를 생산하는 미생물로는, 가령, 후사리움 솔라니(Fusarium solani)(Biochem. J. 167, 685-692(1977)), N-오카르디아 종(N-ocardia sp.)(Int. J. Biochem. 17, 677-683(1985)), 아르트로박터 종(Arthrobacter sp.)(Appl. Environ. Microbiol. 51, 302-306(1986)), 로도코커스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J1(Eur. J. Biochem. 182, 349-356(1989)), 로도코커스 로도크로우스 K-22(J. Bacteriol. 172, 4807-4815(1990)), 로도코커스 로도크로우스 PA-34(Appl, Microbiol. Biotechnol. 37, 184-190(1992)), 로도코커스 종 ATCC 39484(Biotechnol. Appl. Biochem. 15, 283-302(1992)) 등을 들 수 있다.
또한, 이들 미생물로부터는 니트릴라아제 혹은 니트릴하이드라타아제, 아미다아제를 정제할 수 있고, 더욱이 이들 효소의 유전자공학적 이용을 도모하기 위하여, 그 유전자가 단리되어 일차구조가 결정되어 있는 것도 있다. 니트릴라아제 유전자에 대하여는, 예를 들면, 로도코커스 속 세균 유래의 유전자가 특개평7-99980호 공보 혹은 특개평9-28382호 공보에 개시되어 있다.
근래, 이와 같은 미생물이 가지고 있는 니트릴 화합물의 변환능을 응용하려는 시도가 행해지고 있다. 특히 부가가치가 높은 화합물의 제조에 이용하기 위하여, 입체선택성이나 위치선택성이 우수한 효소가 요망되고 있다. 예를 들면, 특개평2-84198호공보에는 광학 활성을 갖는 α-치환 유기산의 제조에 이용되는 미생물에 대하여, 특개평4-341185호 공보에는 광학활성을 갖는 2-히드록시카르복실산의 제조에 이용되는 미생물에 대하여, EP0433117호에는 광학활성을 갖는 케토프로펜(ketoprofen)의 제조에 이용되는 미생물에 대하여 각각 개시되어 있다.
이와 같은 미생물 중에, 로도코커스 종 ATCC 39484 균주는 복수의 시아노기를 갖는 방향족 폴리니트릴 화합물에 대하여, 우수한 위치선택적 가수분해능을 갖는다는 것이 보고되어 있다(US556625). 이러한 선택적인 니트릴 분해효소계에 의해 생성되는 시아노기와 카르복실기를 분자 내에 갖는 화합물은 의농약제조의 합성재료로서 아주 유효하다. 그러나, 이 균이 갖는 니트릴라아제의 방향족 폴리니트릴 화합물에 대한 활성은 비교적 낮아서, 이 특성을 공업적으로 이용하기 위하여는, 반응을 촉매하는 효소의 생산성 향상이 필수이다. 그러나, 이들의 개변에 필요불가결한 이 균의 니트릴라아제 유전자는 밝혀져 있지 않다.
니트릴하이드라타아제 및 아미다아제는 각각 니트릴 화합물을 아미드로, 아미드를 카르복실산으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소이다. 니트릴하이드라타아제 및 아미다아제를 이용하는 것에 의해 니트릴 화합물로부터, 의농약원료 등에 유용한 아미드 또는 카르복실산을 얻을 수 있다. 니트릴 화합물을 각각 상당하는 아미드 또는 카르복실산으로 변환하는 방법이 생체촉매의 이용에 따라 개발되어, 이와 같은 촉매능을 갖는 미생물이 많이 보고되어 있다.(특공소56-17918호 공보, 특공소59-37951호 공보, 특공소61-162193호 공보, 특공소61-21519호 공보, 특공소 64-86889호 공보, 특공평4-197189호 공보, 특개평 2-470 공보, EP0444640 등)
또한 이들 미생물로부터는 니트릴하이드라타아제나 아미다아제 혹은 니트릴라아제가 정제되고, 더 나아가 이들 효소의 유전자공학적 이용을 도모하기 위하여, 이 유전자가 단리되어 일차구조가 결정되어 있다. 니트릴라타아제 유전자에 대하여는, 예를 들면, 로도코커스 속 세균 유래의 유전자가 미국특허 제2840253호나 EP 0445646(특개평4-211379호 공보)에 있어서, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균 유래의 유전자가 특개평3-251184호 공보에 있어서, 리조비움(Rhizobium) 속 세균 유래의 유전자가 특개평6-25296호 공보나 특개평6-303971호 공보에 있어서, 또한 아미다아제 유전자에 대하여는, 예를 들면 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 세균과 로도코커스 속 세균 유래의 유전자가 EP 0433117에 개시되어 있다. 또한 로도코커스 에리쓰로폴리스(R.erythropolis) 유래의 유전자가 Eur.J.Biochem. 217(1), 327-336(1993)에 있어서, 슈도모나스 속 세균 유래의 유전자가 FEBS Lett. 367, 275-279(1995)에 있어서 보고되어 있다. 또한 로도코커스 속 세균의 니트릴하이드라타아제 유전자 및 아미다아제 양 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드에 관한 발명이 특개평5-68566호 공보에 개시되어 있다.
근래, 이와 같은 미생물이 갖는 니트릴 화합물의 변환능을 응용하고자 하는 시도가 되고 있다. 특히 부가가치가 높은 화합물의 제조에 이용하기 위하여, 입체선택성이나 위치선택성이 우수한 효소가 요구되고 있다. 예를 들면, 특개평2-84198호 공보에는 광학활성을 갖는 α-치환유기산의 제조에 이용되는 미생물에 관하여, 특개평4-341185호 공보에는 광학활성을 갖는 2-히드록시카르복실산의 제조에 이용되는 미생물에 관하여, EP 0433117에는 광학활성인 케토프로펜의 제조에 이용되는 미생물에 관하여 각각 개시되어 있다.
이와 같은 미생물 중, 로도코커스 종 ATCC39484 균주는 복수의 시아노기를 갖는 방향족 폴리니트릴 화합물에 대하여, 우수한 위치선택적 가수분해능을 갖는 것이 보고되어 있다(US 556625). 이러한 선택적인 니트릴 분해효소계에 의해 생성되는 시아노기와 아미드기, 시아노기와 카르복실기를 분자내에 갖는 화합물은 의농약제조의 합성재료로서 아주 유효하지만, 본균이 갖는 니트릴 변환활성은 공업적으로 이용하기 위하여는 낮아서, 반응을 촉매하는 효소의 생산성을 향상시키는 것이 요구되고 있다. 그러나, 이러한 개량에 필요불가결한 본균의 관련효소유전자는 니트릴하이드라타아제, 아미다아제 어느 것에 대하여도 밝혀지지 않았다.
본 발명은, 상기와 같은 배경으로부터, 니트릴화합물의 시아노기를 미생물을 이용하여 가수분해하여 대응하는 카르복실산류를 제조하는 방법에 있어서, 종래보다도 높은 수율의 가수분해 반응으로 부산물의 양을 감소시킨 카르복실산류의 제조방법을 제공하고, 더 나아가 폴리니트릴 화합물의 특정의 시아노기만을 선택적으로 가수분해하여 대응하는 시아노카르복실산류를 제조하는 방법에 있어서, 종래보다도 높은 수율의 가수분해반응으로 부산물의 양을 감소시킨 시아노카르복실산류의 제조방법, 및 상기 반응을 촉매하는 변이 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은, 로도코커스 속 세균 유래의 신규한 니트릴라아제 유전자, 니트릴하이드라타아제 유전자 및 아미다아제 유전자를 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 또 다른 목적은, 유전자 공학적 방법을 이용하여 이들 유전자를 조합한 플라스미드로 형질전환한 형질전환체를 이용하여, 효율적으로 카르복실산류를 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 더 나아가, 본 발명의 또다른 목적은 상기 형질 전환체, 상기 플라스미드, 상기 유전자, 상기 형질전환체를 이용한 효소의 제조방법, 및 그로써 얻어지는 효소를 제공하는 것이다.
발명자들은, 종래의 미생물에 의한 시아노기의 가수분해반응의 부반응에 의한 부산물의 본질적인 감소를 목적으로 예의 검토를 반복하였다. 특히, 프탈로니트릴류(phthalonitriles)로부터, 시아노안식향산류를 생성하는 공지의 다양한 방법에 있어서 생기는 부산물을 상세히 해석한 결과, 이 반응에 의한 주요한 부산물은 시아노벤즈아미드 및 시아노벤즈아미드로부터 다시 가수분해된 프탈산모노아미드인 것을 발견하였다. 더 나아가, 니트릴을 아미드로 변환시키는 능력을 결여 또는 저하시킨 미생물을 동반응에 이용함으로써, 이들 부산물을 대폭적으로 감소시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
예를 들면, 고바야시 등의 보고(일본농예화학회지 Vol.71, No.12, 1997)등에 의하면, 미생물이 니트릴 화합물을 카르복실산까지 가수분해하는 경로로서는, (1)니트릴라아제에 의한 일단계의 반응 경로, (2)니트릴하이드라타아제와 아미다아제의 두가지 효소에 의해, 일단 아미드 형태를 경유하는 이단계의 반응경로의 2 종류가 존재하는 것으로 알려져 있다.
발명자들은, 공지의 니트릴 변환세균인 로도코커스 종 ATCC39484 균주를 이용하여, 본균주가 폴리니트릴 화합물을 시아노카르복실산으로 변환하는 반응 경로에 관한 상세한 검토를 행하였다. 본균주는 균체현탁반응에 의해, 프탈로니트릴로부터 생산물로서 시아노안식향산을 생성하지만, 동시에 부산물로서 시아노벤즈아미드, 및 프탈산모노아미드를 생성하는 것을 확인하였다. 더욱더 검토한 결과, 본 미 생물의 프탈로니트릴 가수분해에는 상기한 2 종류의 경로 양쪽이 길항적으로 작용하고 있다는 것이 추측되었다. 그리고, 통상, 니트릴의 가수분해에 의한 카르복실산 생성에 유용하다고 생각되어져 온 아미드 경로의 활성을 오히려 결손 또는 저하시킴으로써, 문제의 부산물인 시아노벤즈아미드, 및 시아노벤즈아미드로부터 다시 가수분해된 프탈산모노아미드를 동시에 제거 또는 감소시킬 수 있다는 생각에 이르게 되었다.
ATCC 39484 균주를 모주로서, NTG(N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘)을 이용하여 상법에 따라 변이주 그룹을 제조하였다. 전술한, 아미드 형태를 경유하는 이단계 경로가, 일련의 제어를 받고 있다는 가정에 기초하여, 벤즈아미드를 단일의 탄소/질소원으로 했을 때 생육하지 않는 것을 타겟으로, 이들 변이주 그룹으로부터 예의 스크리닝을 행하였다. 다수의 비생육 균주를 취득하여 실제로 상기 반응을 거친 결과, 프탈로니트릴과의 반응에 있어서 시아노벤즈아미드, 및 프탈산모노아미드 생성이 현저하게 감소된 신규한 세균, SD826 균주를 취득한 것으로 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 한 태양은, 니트릴 화합물의 적어도 하나의 시아노기를 , 미생물을 이용하여 카르복실기로 변환하여 카르복실산류를 제조하는 방법에 있어서, 시아노기를 아미드기로 변환하는 능력을 결핍 또는 감소시킨 변이 미생물을 이용하여 니트릴 화합물을 카르복실산류로 변환하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 카르복실산류의 제조방법을 제공한다.
상기 변이 미생물은, 로도코커스 속 세균의 변이주인 것이 바람직하다. 더 나아가, 상기 로도코커스 속 세균의 변이주는, 로도코커스 종 ATCC 39484를 모주로 하는 변이주인 것이 바람직하다. 또한, 바람직한 실시태양에 있어서, 로도코커스 종 ATCC 39484를 모주로 하는 변이주는, 로도코커스 종 SD826(FERM BP-7305)인 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서, 니트릴 화합물은, 분자 내에 복수의 시아노기를 갖는 폴리니트릴 화합물인 것이 바람직하고, 또한 카르복실산류는, 시아노카르복실산류인 것이 바람직하다. 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 폴리니트릴 화합물은 방향족 폴리니트릴 화합물이고, 시아노카르복실산류는 방향족 시아노카르복실산류이다. 또한 바람직하게는, 방향족 폴리니트릴 화합물은, 오르토프탈로니트릴, 이소프탈로니트릴 또는 테레프탈로니트릴이고, 방향족 시아노카르복실산류는, 오르토시아노안식향산, 메타시아노안식향산 또는 파라시아노안식향산이다.
본 발명의 또다른 태양은, 시아노기를 카르복실기로 변환하는 능력을 가지며, 또한 시아노기를 아미드기로 변환하는 능력을 결핍 또는 감소시킨 변이 미생물을 제공한다. 상기 변이 미생물은, 로도코커스 속 세균의 변이주인 것이 바람직하다. 더 나아가 바람직한 실시태양에 있어서, 상기 변이 미생물은, 로도코커스 종 ATCC 39484의 변이주이다.
본 발명의 또다른 태양은, 로도코커스 종 SD 826(FERM BP-7305) 균주를 제공한다. 이러한 로도코커스 종 SD 826은, 1999년 10월 12일에 통산성공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본국 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1-3)에 기탁되어 있다.(수탁번호 : FERM BP-7305).
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 2로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 이용하여, 니트릴 화합물의 시아노기를 카르복실기로 변환하는 것을 포함하는 카르복실산류의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 1로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 이용하여, 니트릴 화합물의 시아노기를 카르복실기로 변환하는 것을 포함하는 카르복실산류의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은 상기한 형질전환체를 이용하여 폴리니트릴 화합물의 적어도 하나를 카르복실기로 변환하는 것을 포함하는 시아노카르복실산류의 제조방법을 제공한다.
이들 제조방법에 있어서, 폴리니트릴 화합물은, 방향족 폴리니트릴 화합물이 바람직하다. 바람직하게는, 방향족 폴리니트릴 화합물은, 오르토 프탈로니트릴, 이소프탈로니트릴 또는 테레프탈로니트릴이고, 시아노카르복실산류는, 오르토, 메타 또는 파라시아노 안식향산인 것이 바람직하다.
본 발명의 또다른 태양은, 상술한 제조방법에 있어서 이용되는, 배열표의 배열번호 2로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상술한 제조 방법에 있어서 이용되는, 배열표의 배열번호 1로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상술한 형질전환체의 제조에 이용되는, 배열표의 배열번호 2로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상술한 형질전환체의 제조에 이용되는, 배열표의 배열번호 1로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 2로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 1로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자를 제공한다.
상기 로도코커스 속 세균은, 로도코커스 종 ATCC39484 균주인 것이 바람직하다.
본 발명의 또다른 태양은, 상술한 형질전환체를 배양하고, 배양물로부터 니트릴라아제를 채취하는 것을 포함하는 니트릴라아제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 방법으로 제조된 니트랄라아제를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 4 및 5로서 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 이용하여, 니트릴 화합물의 시아노기를 아미드기로 변환하는 것을 포함하는 아미드류의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열 번호 3으로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질 전환된 형질전환체를 이용하여, 니트릴 화합물의 시아노기를 아미드기로 변환하는 것을 포함하는 아미드류의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 7로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 이용하여, 아미드류의 아미드기를 카르복실기로 변환하는 것을 포함하는 카르복실산류의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 6으로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 이용하여, 아미드류의 아미드기를 카르복실기로 변환하는 것을 포함하는 카르복실산류의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 4 및 5로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자, 및 배열표의 배열번호 7로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자 둘다를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 이용하여, 니트릴 화합물의 시아노기를 카르복실기로 변 환하는 것을 포함하는 카르복실산류의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표에 배열번호 3을 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자, 및 배열표의 배열번호 6으로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자 둘다를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 이용하여, 니트릴 화합물의 시아노기를 카르복실기로 변환하는 것을 포함하는 카르복실산류의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 니트릴류가 오르토프탈로니트릴, 이소프탈로니트릴, 또는 테레프탈로니트릴이고, 아미드류가 오르토시아노벤즈아미드, 메타시아노벤즈아미드, 파라시아노벤즈아미드인 청구항 26 또는 27에 기재된 아미드류의 제조방법을 제공한다.
상술한 제조방법에 있어서, 아미드류는 오르토시아노벤즈아미드, 메타시아노벤즈아미드, 파라시아노벤즈아미드인 것이 바람직하고, 카르복실산류는 오르토, 메타 또는 파라 시아노안식향산인 것이 바람직하다. 니트릴류는 오르토프탈로 니트릴, 이소프탈로니트릴 또는 테레프탈로니트릴인 것이 바람직하고, 카르복실산류는 오르토, 메타, 또는 파라시아노안식향산인 것이 바람직하다.
본 발명의 또다른 태양은, 상술한 방법에 이용되는, 배열표의 배열번호 4 및/또는 5로 나타내는 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상술한 방법에 이용되는, 배열표의 배열번호 3으로 나타내는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상술한 방법에 이용되는, 배열표의 배열번호 7로 나타내는 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상술한 방법에 이용되는, 배열표의 배열번호 6으로 나타내는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상술한 방법에 이용되는, 배열표의 배열번호 4 및 5로 나타내는 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자, 및 배열표의 배열번호 7로 나타내는 아미노산 배열표를 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자 둘다를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상술한 방법에 이용되는, 배열표의 배열번호 3으로 나타내는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자, 및 배열표의 배열번호 6으로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자 둘다를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 형질 전환체를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 형질전환체 제조용 배열표의 배열번호 4 및/또는 5로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 형질전환체 제조에 이용되는, 배열표의 배열번호 3으로 나타내는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 형질전환체의 제조에 이용되는, 배열표의 배열번호 7로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 형질전환체의 제조에 이용되는, 배열표의 배열번호 6로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 형질전환체의 제조에 이용되는, 배열표의 배열번호 4 및/또는 5로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자, 및 배열표의 배열번호 7로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자 둘다를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 형질전환체의 제조에 이용되는, 배열표의 배열번호 3으로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자, 및 배열표의 배열번호 6으로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세 균 유래의 아미다아제 유전자 둘다를 포함하는 플라스미드를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 4 및 5로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 3으로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자를 제공한다.
상기 로도코커스 속 세균은, 로도코커스 종 ATCC39484 균주가 바람직하다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 7로 나타낸 아미노산 배열을 코딩하는 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 배열표의 배열번호 6으로 나타낸 DNA 배열로 된 로도코커스 속 세균 유래의 아미다아제 유전자를 제공한다.
상기 로도코커스 속 세균은, 로도코커스 종 ATCC 39484 균주가 바람직하다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 형질전환체를 배양하고, 배양물로부터 니트릴하이드라타아제를 채취하는 것을 포함하는 니트릴하이드라나타아제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 형질전환체를 배양하고, 배양물로부터 니트릴하이드라타아제를 채취하는 것을 포함하는 니트릴하이드라타아제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 형질전환체를 배양하고, 배양물로부터 아미 다아제를 채취하는 것을 포함하는 아미다아제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 형질전환체를 배양하고, 배양물로부터 니트릴하이드라타아제 및/또는 아미다아제를 채취하는 것을 포함하는 니트릴하이드라타아제 및/또는 아미다아제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 제조방법으로 제조된 니트릴하이드라타아제를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 제조방법으로 제조된 아미다아제를 제공한다.
본 발명의 또다른 태양은, 상기 제조방법으로 제조된 니트릴하이드라타아제 및/또는 아미다아제를 제공한다.
본 발명에 의하면, 신규한 로도코커스 속 변이주를 이용하여, 니트릴 화합물을 원료로 하여, 간편하고 효율적으로 고순도의 카르복실산류를 얻을 수 있다. 또한, 폴리니트릴 화합물, 특히 방향족 폴리니트릴화합물을 원료로 하여, 간편하고 효율적으로 고순도의 시아노카르복실산류를 얻을 수 있다.
더 나아가, 본 발명은, 복수의 시아노기를 갖는 방향족 폴리니트릴 화합물에 대하여, 우수한 위치선택적 가수분해능을 갖는, 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자, 니트릴하이드라타아제 유전자 및 아미다아제 유전자를 제공하는 것이다. 로도코커스 속 세균 유래의 이들 유전자의 DNA 배열은, 니트릴하이드라타아제, 아미다아제의 유전공학적 방법을 이용한 효율적 생산 및 단백질공학적 방법을 이용한 효소의 개량 등에 불가결한 것으로서, 이와 같이 하여 얻은 효소는 유용한 화합물의 공업적 생산에의 응용을 기대할 수 있다.
도 1은, 콜로니 하이브리다이제이션(실시예 4)로 얻은 포지티브 클론으로부터 제조한 플라스미드의 제조를 나타낸 개략도이다.
도 2는, 니트릴라아제 유전자 발현 플라스미드의 구축을 설명하는 개략도이다.
도 3은, 테레프탈로니트릴->파라시아노안식향산 변환반응에 있어서 파라시아노 안식향산의 축적 커브의 비교를 나타낸 그래프이다.
도 4는, 클로닝된 균주로부터 제조한 플라스미드의 구조를 나타낸 개략도이다.
도 5는, 발현 플라스미드의 구축(1)을 나타낸 개략도이다.
도 6은, 발현 플라스미드의 구축(2)을 나타낸 개략도이다.
발명의 실시를 위한 최적의 형태
1. 카르복실산류 제조용 변이미생물
본 발명에 이용되는, 시아노기를 가수분해하여 아미드기로 변환하는 능력을 결핍 또는 감소시킨 변이 미생물을 생산하기 위한 모주로서는, 일반적으로 알려진, 니트릴 화합물의 시아노기를 가수분해하는 능력을 갖는 여러 종류의 미생물, 특히, 니트릴라아제 활성을 가지며, 더 나아가 니트릴 화합물의 수화반응에 의한 카르복실산 생성 반응에 있어서 부산물이 아미드 형태인 것과 같은 미생물을 이용할 수 있다. 니트릴 가수분해능을 갖는 것으로 알려진 미생물의 예로는, 로도코커스, 로 도토룰라(Rhodorotulla), 푸사리움(Fusarium), 슈도모나스(Pseudomonas), 아시네토박터(Acinetobacter), 바실러스(Bacillus), 브레비박테리움(Brevibacterium), 클렙시엘라(Klebsiella), 마이크로코커스(Micrococcus), 버크홀데리아(Burkholderia), 코리네박테리움(Corynebacterium), 노카르디아(Norccardia), 에어로모나스 (Aeromonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 아크로모박터(Achromobacter), 아스퍼질러스(Aspergillus), 리조비움 등의 각 속에 속하는 미생물이 있다.
예를 들어, 로도코커스 종 ATCC 39484 균주를, 통상 알려진 미생물 배양방법에 의해 배양하고, 얻어진 균체에 NTG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘), EMS(에틸메탄술폰산) 등의 알킬화제, 5-브로모우라실 등의 염기 유사체, 아자세린 및 아크리딘 오렌지 등의 층간삽입제(intercalation agents) 등 일반적으로 알려진 변이 유도 화합물, 또는 자외선을 작용시켜 변이미생물 그룹을 제조한다.
이러한 변이미생물 그룹으로부터, 니트릴 화합물로부터 아미드 화합물을 생성하는 능력이 저하 혹은 결핍된 변이주를 선발한다. 변이주가, 아미드 화합물을 생성하는 능력을 저하 혹은 결핍하고 있다는 것은, 변이 미생물 균주의 배양 균체를 니트릴 화합물에 작용시켜, 얻어진 생성물을, HPLC 등의 분석 방법에 의해 해석하고, 니트릴 화합물의 분해에 따른 대응하는 카르복실산 아미드 형태의 생성 상황을 관찰하는 것으로 알 수 있다.
이 때, 발명자들은, 팽대한 변이미생물 그룹으로부터, 목적하는 변이주를 효과적으로 농축하기 위하여, 아미드 형태를 경유하는 이단계 경로가 일련의 제어를 받고 있다는 가정에 기초하여, 모주 미생물의 영양원으로서 이 미생물을 생육할 수 있도록 하는 아미드 화합물, 가령, ATCC 39484를 모주로 한 경우에는 벤즈아미드 등을 자화하여 생육하는 능력의 결핍 혹은 저하를 이용하여, 아미드를 거쳐서 카르복실산에 이르는 일련의 반응 경로의 결손 또는 저하의 지표로 하는 것을 고안하였다. 이러한 지표에 기초하여, 여러 가지 방법으로써, 목적하는 변이 미생물을 변이 미생물 그룹으로부터 효율적으로 농축하는 것이 가능하게 되었다.
또한, 본 발명에 있어서, 「아미드화합물을 자화하여 생육하는 능력의 결핍 혹은 저하」라고 하는 것은, 동일한 아미드 화합물을 영양원으로 한 배양에 있어서 미생물의 배가시간이, 모주와 비교하여 거의 2배 이상으로 연장되거나, 혹은 전혀 생육할 수 없게 된 것을 의미한다. 가령, 변이 미생물 그룹을 통상의 영양 한천배지, 예를 들면, LB 한천 배지 등에 도말하고, 생성된 콜로니를 개별적으로, 벤즈아미드를 유일한 탄소/질소원으로 함유한 한천배지에 이식하고, 거기서의 생육의 유무를 눈으로 관찰하는 것으로, 벤즈아미드 자화능이 변화한 변이주를 탐지하는 것이 가능하다. 또한, 소위 페니실린스크리닝 법을 적용하여, 벤즈아미드에 의한 생육능이 결핍 또는 저하된 변이 미생물을 농축하는 것이 가능하다. 즉, 벤즈아미드를 유일한 탄소/질소원으로 한 배지에, 미생물이 분열, 증식하는 과정에 작용하여 미생물을 사멸시키는 약제, 예를 들면, 페니실린을 첨가하고, 여기에 변이 미생물 그룹을 접종하여 배양하는 것으로, 벤즈아미드로써 잘 자랄 수 있는 균주가 사멸하고, 벤즈아미드를 자화하여 생육하는 능력이 결핍 혹은 저하된 균주가 농축된다. 이와 같이 하여 농축된 일군의 변이 미생물에 대하여, 각각, 배양 균체를 니트릴 화합물, 예를 들면 ATCC 39484를 모주로 한 경우에는 프탈로니트릴에 작용시켜, 얻 어진 미생물을 HPLC 등의 분석 방법에 의해 해석하고, 카르복실산 아미드 형태의 축적이 감소된 균주를 탐색한다. 이와 같이 하여 농축된 일군의 변이 미생물 중에는, 카르복실산 아미드 형태의 축적이 증대된 균주와 함께, 축적이 감소된 균주가 발견된다.
이와 같이 하여 창출된 변이주의 일예로서, 로도코커스 종 SD826 균주를 들 수 있다.
로도코커스 종 SD826 균주는 공지 미생물인 로도코커스 종 ATCC 39484(미국 아메리칸 타입 걸쳐 컬렉션으로부터 분양)로부터 발명자들에 의해 창출된 균주로서, 이 균주는, 공업기술원 생명공학 연구소에 기탁번호 FERM BP-7305로서 기탁되어 있다.
또한, 예를 들면, 본 발명에 적용되는, 아미드 화합물을 생성하는 능력을 저하 혹은 결여시킨 변이 미생물 균주는, 유전자 공학적 방법을 이용하여, 아미드 화합물의 생성에 관여하는 효소 또는 효소의 제어 인자, 및 이들을 코딩하는 유전자 영역을 파괴 혹은 결실시키는 것에 의해 취득하여도 좋다. 구체적으로는, 당해 반응에 기여하는 효소의 관련유전자를 단리, 해석하고, 그 염기 배열에 상동성을 갖는 배열을 조합한 유전자 단편을 미생물에 도입하고, 염색체 상의 효소 관련 유전자와의 사이에서 상동 재조합을 유도하고, 염기 배열의 삽입이나 결실을 일으키는 것에 의해 달성된다.
본 발명에 적용되는 미생물은, 아미드 화합물을 생성하는 능력이 저하 혹은 결여된 미생물이다. 이와 같은 저하 혹은 결여를 초래하는 미생물의 개변 조작이, 미생물의 기타 특성, 특히 서로 관련이 깊다고 생각되어지는, 카르복실산의 생성능력에 영향을 미치는 경우가 있다. 단, 본 발명의 해결해야하는 과제에 따르면, 아미드 화합물의 생성이, 얻어지는 카르복실산에 대해 상대적으로 감소되어 있다면 좋고, 이와 같은 개변에 의해 카르복실산의 생성능력이 적어도 개변 전의 모주에 비해 저하되지 않는 것은 바람직하지만, 아미드 화합물의 생성이 상대적으로 감소되는 범위에서, 카르복실산의 생성능력은 변화하여도 좋다.
본 발명의 반응은, 상기와 같이 창출된 변이 미생물을 이용하여, 통상의 시아노기 가수분해 활성을 갖는 미생물에 의한 카르복실산 생성 반응과 같은 방식의, 일반적인 미생물을 이용한 변환 반응으로서 실시할 수 있다. 가령, SD 826 균주를 1% 펩톤 등의 영양 배지에서, 20℃ 내지 40℃, 바람직하게는 25℃ 내지 35℃의 온도에서, 24시간 정도 배양하고, 얻어진 배양액에, 니트릴 화합물을 1ppm-50%, 바람직하게는 10ppm-10% 첨가하고, 계속해서 같은 온도에서 1시간 -200시간 정도 교반을 계속함으로써 수행한다. 더 나아가, 첨가되는 니트릴 화합물은 반드시 전량이 용해되어 있지 않아도 좋지만, 반응 액 중에서의 용해성이나 분산성을 개선하기 위한 용매, 계면활성제 등을 첨가하는 것도 가능하다. 또한, 반응의 진행에 의한 니트릴 화합물의 소비에 따라서, 연속적 혹은 간헐적으로 니트릴 화합물을 첨가하여도 좋고, 이러한 경우의 니트릴 화합물의 반응액 중 농도는 상기의 범위에 제한되지는 않는다.
미생물을 배양하기 위한 배지 탄소원으로서는, 글루코스, 수크로스, 프럭토스, 폐당밀 등의 당류, 에탄올, 초산, 구연산, 숙신산, 젖산, 안식향산, 지방산 등 의 유기물 또는 이들의 알칼리 금속염, n-파라핀 등의 지방족 탄화수소류, 방향족 탄화수소류, 또한 예를 들어 펩톤, 육류 엑기스, 생선 엑기스, 대두분, 밀기울 등의 천연유기물을 단독으로, 혹은 이들의 조합에 의해, 통상 0.01% 내지 30%, 바람직하게는 0.1% 내지 10% 정도의 농도로 사용할 수 있다.
미생물을 배양하기 위한 배지 질소원으로서는, 가령 황산암모늄, 인산암모늄, 질산나트륨, 질산칼륨 등의 무기질소 화합물, 또한 요소, 요산 등의 함질소 유기물, 펩톤, 육류 엑기스, 생선 엑기스, 대두분, 등의 천연유기물을 단독으로, 혹은 이들의 조합에 의해 통상 0.01% 내지 30%, 바람직하게는 0.1% 내지 10% 정도의 농도로 이용하는 것이 가능하다. 또한 이들 균주에 의해 시아노기가 가수분해되어 카르복실산으로 되는 것과 같은 반응의 원료는, 배양중에 미리 첨가해 놓음으로써, 반응의 진행과 함께 가수분해에 의해 유리되는 암모늄 이온이 미생물의 질소원이 될 수 있도록 하므로 유용하다.
더욱 필요에 따라서는, 인산 2수소칼륨 등의 인산, 황산마그네슘, 황산제1철, 초산칼륨, 염화망간, 황산동, 황산아연, 황산 코발트, 황산니켈 등의 금속염이 균의 생육 개선을 위해 첨가된다. 첨가 농도는 배양 조건에 따라 다르지만, 통상, 인산염에 관하여는 0.01%-5%, 마그네슘염에 있어서는 10ppm-1%, 기타의 화합물에서는 0.1ppm-1000ppm 정도이다. 또한 선택한 배지에 따라서, 비타민류, 아미노산류, 핵산 등의 공급원으로서 예를 들면 효모 엑기스, 카자민산, 효모핵산을 1ppm-100ppm 정도 첨가하는 것에 의해, 균의 생육을 개선할 수 있다.
또한, 균의 시아노기에 대한 반응성을 향상시키기 위하여, 시아노기 가수분 해 효소의 유도원으로서 배양 중에 니트릴 화합물, 예를 들면 벤조니트릴 등을 10ppm-1% 첨가하는 것은 유용하다. 더 나아가, 유도원에 더하여, 반응원료가 되는 니트릴 화합물을 배양개시 시점부터 첨가해 두는 것도 유용하다.
어느 성분을 이용하는 경우건, 배지의 pH는 5-9, 바람직하게는 6-8로 조정하는 것이 바람직하다. 또한 이상과 같은 배지로 미리 배양된 미생물 균체를, 원심분리, 막 여과 등의 방법에 의해 배양액으로부터 분취하고, 반응원료인 니트릴 화합물을 포함하는 물, 생리식염수, 또는 배양의 pH와 동일하게 조정한 인산, 초산, 붕산, 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄 등과 이들의 염으로부터 이루어진 완충액 등으로 다시 현탁하여, 반응시키는 것은, 반응액 중의 협잡물을 감소시키고, 나중에 생성물의 분취를 간편하게 하기 위하여 유용하다. 반응중의 pH는, 충분한 농도의 완충액을 이용하는 경우에 있어서는 통상 유지될 수 있지만, 반응의 진행에 따라 상기 pH를 면탈하는 경우에는, 수산화 나트륨, 암모니아 등을 이용하여 적절히 조정하는 것이 바람직하다.
반응액 중에 생성된 시아노카르복실산은, 그 반응액 중에서의 성상에 따라, 원심 분리, 막여과, 감압건조, 증류, 용매추출, 염석, 이온교환, 각종 크로마토그래피 등 통상 이용되는 방법으로 분취할 수 있다. 가장 간편하게는, 반응액을 산성으로 조정하는 것에 의해 시아노 카르복실산을 석출시키고, 침전을 원심분리 또는 여과하는 것에 의해 회수할 수 있다. 또한 반응 생성물을 수용액으로서 얻을 수 있는 경우는, 생성물이 용해된 조건하에서, 원심분리, 막여과 등의 방법에 따라, 미생물 균체를 제거해 두는 것이 바람직하다. 또한 반응 생성물이 고형물로서 얻어지는 경우에는, 결정이 충분히 큰 경우에는 스텐레스, 나이론 등의 메쉬를 이용하여 생성물을 분취할 수 있다. 결정이 미생물과의 분별이 곤란한 정도로 미세한 경우는, 그들이 용해되도록 하는 조건, 예를 들면, 알칼리 조건 하 등에 의해 한번 수용액으로서, 원심분리, 막여과 등의 방법에 따라 균체를 제거하고, 그리고 난 후에 조건을 회복하고, 재침전시켜 분취하는 방법이 바람직하다. 단, 반응액의 직접 증류 등, 통상의 공정에 의해 미생물을 제거할 수 있는 경우에 있어서는 이것에 한정되지 않는다.
반응 생성물의 성질에 따라서는, 반응액 중에 생성물이 축적됨으로써, 반응 속도가 저하하는 경우가 있다.
이와 같은 경우는, 생성물의 농도에 따라서 반응액 중에, 물, 생리식염수, 반응완충액을 추가하여 연속적으로 희석해가는 방법이 바람직하다. 또한 반응 속도가 저하한 시점에서 균을 분취하고, 상징액을 생산물 용액으로서 회수하고, 분취한 균은 다시 반응원료를 포함하는 용액 혹은 현탁액으로 되돌림으로써 반응속도를 회복할 수 있다.
이들 방법은, 미생물의 니트릴 가수분해 활성이 유지되는 범위에서, 몇 번이고 반복할 수 있다.
본 발명은 더 나아가, 본 발명에 적용되는 미생물의 무세포추추출액, 더 나아가 무세포추출액으로부터 상기 반응을 촉매하는 성분을 농축, 추출한 것 등을 이용하여서도 동일하게 실시할 수 있다. 더 나아가서는, 본 반응에 적용가능한 미생물 혹은 그 추출액, 추출성분을, 난용성의 담체에 고정화하고, 이 고정화물을 원료 용액에 촉매시킴으로써도 달성된다. 이와 같은 고정화 담체로서는, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐알콜, 폴리-N-비닐포름아미드, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌이민, 메틸 셀룰로스, 글로코만난, 알긴산염, 카라기난, 및 이들의 폴리머 또는 가교반응 생성물 등, 미생물 혹은 그 추출성분을 포함한 수난용성의 고형분을 형성하도록 하는 화합물을 단독, 혹은 혼합하여 이용할 수 있다. 또한 활성탄, 다공질 세라믹, 유리섬유, 다공질 폴리머 성형체, 니트로셀룰로스막 등, 미리 고형물로 형성된 물체상에 미생물 혹은 그 추출액, 추출성분을 보유시킨 것을 이용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의한 시아노기의 가수분해 반응의 기질 특이성은 넓으며, 통상 알려진 여러 가지의 니트릴 화합물, 예를 들면 지방족 니트릴, 방향족 니트릴, 복소환식 니트릴 등을 대상으로 하여, 높은 선택율로써 대응하는 카르복실산을 얻을 수 있다.
지방족 니트릴로서는, 예를 들면, 아세토니트릴, 프로피오니트릴, n-부티로니트릴, 이소부티로니트릴, n-발레로니트릴, 이소발레로니트릴, 카프로니트릴, 말로노니트릴, 글로코노니트릴, 아디포니트릴, 숙시노니트릴, 아크릴로니트릴 및 메타크릴로니트릴 등을 들 수 있다.
또한 방향족 니트릴로서는, 벤조니트릴, 테레프탈로니트릴, 오르토프탈로니트릴, 톨루니트릴, 이소프탈로니트릴, 및 이들 방향족 니트릴 화합물의 치환체, 예를 들면, 염소화물, 불소화물, 니트로화물, 아미노화물, 등을 들 수 있다.
또한 복소환식 니트릴로서는, 메타시아노피리딘, 파라시아노피리딘, 시아노인돌산 등을 들 수 있다.
또한 본 발명에 의하면, 상기 중 특히 1분자중에 복수의 시아노기를 갖는 폴리니트릴화합물을 대상으로 하여, 높은 선택율로써 대응하는 시아노카르복실산을 얻을 수 있다. 이와 같은 폴리니트릴 화합물로서는, 예를 들면, 지방족 니트릴로서는 말로노니트릴, 숙시노니트릴, 아디포니트릴 및 글루코니트릴 등, 또한 방향족 니트릴로서는 오르토프탈로니트릴, 테레프탈로니트릴, 이소프탈로니트릴, 및 이들 방향족 니트릴 화합물의 치환체, 예를 들면, 염소화물, 불소화물, 니트로화물, 아미노화물 등을 들 수 있다.
본 발명의 부산물의 양을 감소시킨 카르복실산류의 제조방법에 의하면, 구체적으로는, 생성물인 카르복실산류 중, 원료 니트릴 화합물에서 유래하는 부산물의 전량을 0.5(몰)% 이하로 할 수 있다. 미량의 화학물질이 인체에 미치는 영향에 대해 관심이 높은 근래에는, 화학반응에 있어서 본질적인 부반응의 감소와, 그러한 반응에 의해 얻어지는 고순도의 화학제품이 산업상 새로운 가능성을 창조할 수 있다는 것을 기본 생각으로 한 것이다.
본 발명의 이러한 방법은, 기본적으로 아미드를 경유하는 카르복실산의 생성 경로를 결손 혹은 감소시키는 것으로부터, 니트릴의 부분 가수분해에 의한 아미드 형태 불순물, 더 나아가 그 유도체를 실질적으로 생성하지 않는다. 본 발명에 의해 얻어지는 카르복실산류는 특히 고순도가 요구되는 분야, 예를 들면 의약합성이나 정밀 화학 분야의 합성원료 등의 제조방법으로서 바람직하다.
2. 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자
로도코커스 종의 니트릴라아제 유전자의 DNA 배열의 결정 방법에 대하여, 이 하에서 설명한다. 예를 들어, 로도코커스 종 ATCC 39484 균주 염색체 DNA는, 예를 들면 사이토(Saito) 등의 방법(Biochem, Biophys. Acta. 72, 619(1963))을 응용하여 제조할 수 있다. 유전자의 클로닝에 이용하는 염색체 DNA 라이브러리는, 예를 들면 pUC18 등의 플라스미드 벡터를 이용하여 제조할 수 있다. 니트릴라아제 유전자의 클로닝은, 예를 들면 사이키(Saiki) 등의 중합효소 연쇄반응(PCR)법(Science 230, 1350(1985))을 이용하여 행할 수 있다. 이 때, 사용하는 PCR용 프라이머의 한 쪽은 유니버설 프라이머(포워드 또는 리버스)로 하고, 다른쪽은 효소 N 말단배열을 코딩하는 DNA 배열로부터 적당한 배열을 선발한다. 이들 프라이머를 조합시켜서, 염색체 DNA 라이브러리를 주형으로 하여 앵커(anchor) PCR법으로 얻은 니트릴라아제 코드 배열 DNA 부분단편을 전 유전자영역 스크리닝용 프로브로서 사용함으로써, 로도코커스 종 ATCC39484 균주의 염색체 DNA 라이브러리로부터, 니트릴라아제 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 얻을 수 있다. 니트릴라아제 코드 배열 단편의 DNA 배열은, 생거(Sanger) 등에 의한 디데옥시(dideoxy)법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463(1997)) 등 공지의 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
얻어진 효소 구조 유전자를 이용하여 니트릴라아제 효소를 생산하기 위하여는, 효소 구조 유전자를 적당한 발현 벡터, 예를 들면 pUC18의 lac 프로모터의 하류로 접속함으로써 제조할 수 있다. 이와 같이 하여 제조한 플라스미드를 이용하여, 가령 대장균 JM101 균주(Escherichia coli JM101) 등의 숙주를 형질전환한다. 이러한 형질전환체를 배양함으로써, 상기 니트릴라아제가 숙주 세포 내에 현저한 양으로 생산된다. 이러한 니트릴라아제 효소는 균체 그대로 변환 반응에 사용할 수도 있지만, 균체를 파쇄하여 무세포추출액으로서 혹은 정제효소로서 사용하는 것도 가능하다.
이종 미생물 유래의 효소 유전자가, 숙주 미생물에 있어서 실제로 기능을 하는 형태로 발현하기 위하여는, 실제로 숙주 미생물 내에서 그 유전자가 유지, 분열되는 것, 숙주의 전사 기능에 의해 전사되는 것, 전사된 정보가 단백질로 번역되는 것, 번역으로 생성된 폴리펩티드가 기능을 가질 수 있는 고차원 구조로 폴딩(folding)되는 것, 더 나아가서는, 그러한 효소가 기질에 접촉할 수 있도록 공여 미생물과 같은 방법으로 효소가 분비되는 것, 혹은 균체 내 효소라면 숙주 미생물이 공여 미생물과 같은 기질 투과/운반계를 갖는 것, 등 여러 가지 요건이 만족될 필요가 있다는 것은 주지의 사실이다. 더 나아가, 그 발현이 산업상 유용한 정도이기 위하여는, 이들 요건이 각각 모두 높은 수준으로 만족되어야 할 필요가 있다. 이러한 과제의 해결을 위하여, 통상은, 프로모터 등 조절 영역의 해석 및 개변, 또는 복잡한 운반 벡터계를 구축하고, 클로닝된 유전자를 공여 미생물로 되돌림으로써 전사/발현계나 여러 가지의 보조인자를 목적 유전자 본체에 적합하게 하는 등의 조작이 필요하게 된다. 이들의 방법은, 개변해야 하는 조절기구의 해석 대상이나 개변 방법에 관한 정보를 얻는 것이 곤란하여 시행착오에 의존해야한다는 것, 또한 공여균으로 되돌려 발현시키는 것에 있어서는, 결국 공여균의 능력에 제한을 받는 등의 문제가 있다. 본 발명자들이 알고 있는 바에 의하면, 이종 미생물의 니트릴라아제의 발현이 확인된 사례는 존재하지만, 본 발명과 같이, 통상 알려진 대장균 숙주/벡터계로 합체되어 형질전환되는 것에 의해, 간편하게, 공여 미생 물의 능력을 훨씬 초과하는 높은 활성을 발현하는 것이 가능한, 폴리니트릴의 선택적 가수분해를 촉매하는 니트릴라아제의 유전자를 얻은 사례, 또한 이와 같은 니트릴라아제 유전자를 이용한 재조합체에 의한 니트릴 화합물, 특히 방향족 폴리니트릴 화합물을 대상으로 하는 선택적이며 레벨이 높은 반응의 사례는 알려져 있지 않다.
본 발명의 원료로서 이용되는 니트릴 화합물은, 시아노기를 1개 포함하는 지방족 또는 방향족의 화합물, 혹은 복수의 시아노기를 포함하는 지방족 또는 방향족의 폴리니트릴 화합물이다. 오르토프탈로니트릴, 이소프탈로니트릴 또는 테레프탈로니트릴을 원료로서 이용하면 대응하는 고순도의 오르토-, 메타-, 또는 파라-시아노안식향산을 바람직하게 얻을 수 있다.
본 발명의 변환반응은, 가령 인산 완충액과 같은 희석 수용액에, 원료가 되는 물질과 변환활성을 갖는 균체, 무세포추출액, 혹은 효소를 가하고, pH 5-10, 바람직하게는 6-8, 온도 15-45℃, 바람직하게는 30-42℃에서 수행할 수 있다.
반응액 중에 생성된 생산물의 취득방법은 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 반응액의 상징액을 분취회수한 후, 생산물의 특성에 따라서 침전형성, 추출 또는 증류 등의 방법을 이용하여 혹은 이 방법들을 조합하여 취득할 수 있다. 또한 칼럼 크로마토그래피 등을 이용하여 분리 정제하는 것에 의해 고순도의 생성물을 얻을 수 있다.
3. 로도코커스 속 세균 유래의 니트릴하이드라타아제 유전자 및 아미다아제 유전자
로도코커스 종 ATCC39484 균주 염색체 DNA는, 예를 들어 사이토 등의 방법(Biochem. Biophys. Acta. 72, 619(1963))을 응용하여 제조할 수 있다. 유전자의 클로닝에 이용되는 염색체 DNA 라이브러리는, 예를 들면 pUC18 등의 플라스미드 벡터를 이용하여 제조할 수 있다. 니트릴하이드라타아제 유전자와 아미다아제 유전자의 클로닝은, 예를 들면 사이키 등의 중합효소 연쇄반응(PCR)법(Science 230, 1350(1985))을 이용하여 얻어지는 부분단편을 프로브로 한 콜로니 하이브리다이제이션에 의해 행할 수 있다. 이 때, 사용하는 PCR용 프라이머의 한 쪽은 유니버설 프라이머(포워드 또는 리버스)로 하고, 다른쪽은 효소 단백질의 N 말단배열을 해석하여, 이것을 코딩하는 배열로부터 적당한 배열을 선발한다. 이들 프라이머를 조합하여, 염색체 DNA 라이브러리를 주형으로 하여 앵커(anchor) PCR을 행함으로써, 목적 효소의 코드 배열 단편을 얻을 수 있다. 이 앵커 PCR법으로 얻은 니트릴하이드라타아제 코드 배열 혹은 아미다아제 코드 배열 DNA 단편을 전 유전자영역 스크리닝용 프로브로서 사용함으로써, 로도코커스 종 ATCC39484 균주의 염색체 DNA 라이브러리로부터, 니트릴하이드라타아제 유전자 및/또는 아미다아제 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 얻을 수 있다. 니트릴하이드라타아제 코드 배열 단편 및 아미다아제 코드 배열 단편의 DNA 배열은, 생거(Sanger) 등에 의한 디데옥시(dideoxy)법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463(1997)) 등 공지의 방법을 이용하여 결정할 수 있다.
얻어진 효소 구조 유전자를 이용하여 효소를 생산하기 위하여는, 효소 구조 유전자를 적당한 발현 벡터, 예를 들면 pUC18의 lac 프로모터의 하류로 접속함으로 써 제조할 수 있다. 이와 같이 하여 제조한 플라스미드를 이용하여, 가령 대장균 JM101 균주(Escherichia coli JM101) 등의 숙주를 형질전환한다. 이러한 형질전환체를 배양함으로써, 상기 니트릴하이드라타아제 및/또는 아미다아제가 숙주 세포 내에 현저한 양으로 생산된다. 이러한 효소는 균체 그대로 변환 반응에 사용할 수도 있지만, 균체를 파쇄하여 무세포추출액으로서 혹은 정제효소로서 사용하는 것도 가능하다.
이종 미생물 유래의 효소 유전자가, 숙주 미생물에 있어서 실제로 기능을 하는 형태로 발현하기 위하여는, 실제로 숙주 미생물 내에서 그 유전자가 유지, 분열되는 것, 숙주의 전사 기능에 의해 전사되는 것, 전사된 정보가 단백질로 번역되는 것, 번역으로 생성된 폴리펩티드가 기능을 가질 수 있는 고차원 구조로 폴딩(folding)되는 것, 더 나아가서는, 그러한 효소가 기질에 접촉할 수 있도록 공여 미생물과 같은 방법으로 효소가 분비되는 것, 혹은 균체 내 효소라면 숙주 미생물이 공여 미생물과 같은 기질 투과/운반계를 갖는 것, 등 여러 가지 요건이 만족될 필요가 있다는 것은 주지의 사실이다. 더 나아가, 그 발현이 산업상 유용한 정도이기 위하여는, 이들 요건이 각각 모두 높은 수준으로 만족되어야 할 필요가 있다. 이러한 관제의 해결을 위하여, 통상은, 프로모터 등 조적 영역의 해석 및 개변, 또는 복잡한 운반 멕저계를 구축하고, 글로닝된 유전자를 공여 미생물로 되돌림으로써 전사/발현계나 여러 가지의 보조인자를 목적 유전자 본체에 적합하게 하는 등의 조작이 필요하게 된다. 이들의 방법은, 개변해야 하는 조절기구의 해석 대상이나 개변 방법에 관한 정보를 얻는 것이 곤란하여 시행착오에 의존해야하는 것, 또한 공여균으로 되돌려 발현시키는 것에 있어서는, 결국 공여균의 능력에 제한을 받는 등의 문제가 있다. 본 발명자들이 알고 있는 바에 의하면, 이종 미생물의 니트릴하이드라타아제 및 아미다아제의 유전자를 얻은 사례, 또는 이와 같은 니트릴하이드라타아제 및 아미다아제의 발현이 확인된 사례는 존재하지만, 본 발명과 같이, 통상 알려진 대장균 숙주/벡터계로 합체되어 형질전환되는 것에 의해, 간편하게, 공여 미생물의 능력을 훨씬 초과하는 높은 활성을 발현하는 것이 가능한, 폴리니트릴의 선택적 가수분해를 촉매하는 니트릴하이드라타아제 및 아미다아제의 유전자를 얻은 사례, 또한 이와 같은 니트릴하이드라타아제 및 아미다아제 유전자를 이용한 재조합체에 의한 니트릴 화합물, 특히 방향족 폴리니트릴 화합물을 대상으로 하는 선택적이며 레벨이 높은 반응의 사례는 알려져 있지 않다.
본 발명의 카르복실산류 또는 아미드류의 제조방법은, 예를 들면 원료로 되는 화합물과, 변환 활성을 갖는 균체, 무세포추출액, 혹은 효소를, 인산 완충액과 같은 묽은 수용액에 가하고, 반응액 pH 5-10, 바람직하게는 6-8로 유지하고, 반응 온도를 15-45℃, 바람직하게는 30-42℃로 유지함으로써 수행할 수 있다. 반응액 중에 생성된 생산물은, 반응액의 상징액을 분리 회수한 후, 생산물의 특성에 따라서 침전형성이나 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 얻을 수 있다.
본 발명의 카르복실산류 또는 아미드류의 제조방법의 원료로 이용되는 니트릴류는, 1분자 중에 적어도 1개의 시아노기를 갖는 지방족 및 방향족의 화합물이다. 오르토프탈로니트릴, 이소프탈로니트릴 및 테레프탈로니트릴 등의 방향족 폴리니트릴 화합물이 바람직하게 예시된다.
본 발명의 카르복실산류의 제조방법의 원료로 이용될 수 있는 아미드류는, 아미드기를 갖는 지방족 및 방향족의 화합물이다. 오르토시아노벤즈아미드, 메타시아노벤즈아미드 또는 파라시아노벤즈아미드 등의 시아노기를 갖는 방향족 아미드 화합물이 바람직하게 예시된다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
변이미생물의 취득
로도코커스 종 ATCC 39484 균주(미국 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 입수)를 LB 한천 배지에 획선하고, 30℃ 항온조에서 24시간 배양하였다. 생성된 콜로니로부터 1 백금이의 세포를 떠서, LB 액체 배지 5ml에 접종, 30℃의 진탕배양기에서 6시간 진탕배양하였다. 균체를 10,000g의 원심분리에 의해 회수하고, 같은 부피의 50mM 인산 칼륨/나트륨 완충액(pH7.0)으로 3회 세정한 후, 같은 부피의 같은 완충액에서 재차 현탁하였다.
균 현탁액에, 2000ppm NTG(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘) 용액을 최종 농도 100ppm으로 되도록 첨가하여 잘 교반한 후, 실온에서 30분간 방치하였다. 균체를 10,000g의 원심분리에 의해 회수하고, 동 완충액으로 1회 세정한 후, 균체를 소량의 동 완충액에 재차 현탁하고, 전량을 0.1%의 벤즈아미드를 포함하는 무기염 액체 배지 5ml에 접종하였다. 무기염배지의 조성은 이하와 같이 나타내었다.
(무기염 배지)
KH2PO4 1.5g/L
Na2HPO4 1.5g/L
MgSO4·7H2O 0.2g/L
CaSO4·2H2O 10mg/L
FeSO4·7H2O 5mg/L
효모 엑기스 20mg/L
30℃, 1.5시간의 진탕 배양 후, 1mg/L가 되도록 암피실린을 첨가하고, 다시 30℃, 12 시간 진탕배양하였다. 얻어진 배양액을 500배로 희석하고, 희석액을 LB 고체배지(직경 90mm 페트리 접시 상에서)에 각 0.1ml 씩, 300 플레이트에 도포하였다. 30℃, 48 시간 배양하고, 콜로니가 생긴 단계에서, 고압 멸균한 벨벳에 콜로니를 찍어내고, 각 플레이트 마다 0.1% 벤즈아미드, 1.5% 한천을 포함하는 상기 조성의 무기염 고체배지(직경 90mm)에 전사하고, 30℃, 48시간 배양하였다.
전사원인 LB 고체 배지와 전사 타겟인 무기염 고체배지에서의 콜로니 형성을 비교하여, LB에서 양호하게 생육하고, 무기염 고체배지에서 생육하지 않는 약 400 균주를 선발하였다. 이들 선발 균주를, 전사원인 LB로부터 멸균한 이쑤시개로써 새로운 LB 고체 배지에 이식하고 30℃, 24시간 배양하였다. 생성된 전부의 콜로니에 대하여 각각 상기의 무기염 배지 5mL로 접종하고, 더 나아가 이소프탈로니트릴 0.1%를 첨가하여 30℃, 48시간 반응시켰다. 동시에 모주인 ATCC39484에 대하여도 동일하게 배양, 접종하여 반응을 행하였다. 각각의 균주에 대하여 얻어진 반응액의 상징액을 100배로 희석하고, 역상 HPLC(칼럼:Shodex DS-613, 용리액:50% 아세트니트릴/5mM 인산칼륨 완충액 pH 3.0, 유속:1mL/min, 검출:UV210nm)를 행하였다. 하나의 균주(SD826 균주)에서, 모주 ATCC39484와 유사하게, 현저한 양의 메타시아노안식향산을 검출함과 동시에, 모주의 반응액에서 검출된 메타시아노벤즈아미드 및 프탈산모노아미드가 현저하게 감소되어 있는 것을 확인하였다. 목적하는 부반응 경로가 결손된 균주가 얻어졌다고 생각되었다.
다음 표 1에, 본 발명에 관한 신규한 로도코커스 속 세균, 로도코커스 족 SD826균주(FERM BP-7305)의 균학적 성질을 기재하였다.
항목 성상
형태 다형성 간균
그램 염색성 +
포자 -
운동성 -
산소에 대한 태도 호기성
옥시다아제 -
카탈라아제 +
항산성 -
집락의 색조 오렌지 색
Rod-coccus 사이클 +
아데닌의 분해 +
티로신의 분해 +
요소의 분해 _
자화성 이노시톨 -
말토스 -
만니톨 +
람노스 -
소르비톨 +
p-크레졸 -
m-히드록시안식향산 +
피멜산 +
아디프산 나트륨 +
안식향산 나트륨 +
구연산 나트륨 +
젖산 나트륨 +
테스토스테론 -
L-티로신 +
락토스 -
만노스 +
2,3-부탄디올 +
글루코스 +
0.02% 나트륨 아지드의 존재하에서의 생육 -
10℃에서의 생육 -
40℃에서의 생육 +
45℃에서의 생육 -
실시예 2
로도코커스 종 SD826을 LB 한천 배지에 획선하고, 30℃의 항온조에서 24시간 배양하였다. 형성된 콜로니로부터, 1백금이를 취하여, 500mL 부피의 배플 플라스크 내의 LB 액체배지 100mL에 현탁하였다. 플라스크를 30℃의 항온 회전진탕배양기에 설치하고, 매분 120회전, 24시간 배양하였다. 얻어진 미생물 균체를 10,000g 의 원심분리에 의해 회수하고, 배양액과 같은 부피의 50mM 인산나트륨/칼륨 완충액(pH=7)에 현탁하였다. 균 현탁액에 이소프탈로니트릴을 5%(질량/체적) 상당 첨가하고, 30℃의 항온회전진탕배양기에 설치하고 매분 120회전, 72시간 반응시켰다.
얻어진 반응액을, 2mol/l 염산을 이용하여 pH 2로 하고, 반응액과 같은 부피의 초산에틸을 첨가하여 교반, 추출을 행하였다. 얻어진 초산 에틸층을 적당하게 희석하고, 역상 HPLC(칼럼:Shodex DS-613, 용리액:50% 아세트니트릴/5mM 인산칼륨 완충액 pH 3.0, 유속:1mL/min, 검출:UV210nm)에 의해 분석하였다. 반응액 중에 주성분으로서 메타시아노안식향산 샘플과 머무름 시간이 일치하는 피크를 검출하였다. 피크 성분을 분취하여, GC-질량스펙트럼 분석을 시행하고, 각각의 샘플과 동일한 구조를 시사하는 단편 패턴을 그리는 것을 확인하였다.
비교예로서, 상기와 같은 방법에 의해, 모주 ATCC39484 균주를 이용하여 반응, 추출, 분석을 행하였다. 모주 반응액 중의 상기 HPLC 조건 하에서의 주요한 생성물을 LC-MS 분석을 행하여 동정하였다.
모주 및 SD826의 반응액 중의 주요한 각성분의 농도와, 반응원료인 이소프탈로니트릴로부터의 추정변환율의 비교, 및 ATCC 39484를 기준으로 한, SD826 균주의 사용에 의한 부산물의 감소율을 표 2에 나타내었다.
균주명 메타시아노안식향산 메타시아노벤즈아미드 이소프탈산 모노아미드
농도(%) 변환율(몰%) 농도(%) 변환율(몰%) 농도(%) 변환율(몰%)
ATCC39484 5.638 98.22 0.023 0.40 0.087 1.34
SD826 5.721 99.67 0.003 0.06 0.016 0.24
부산물의 감소율/성분별(%) 85 82
부산물의 감소율/총계(%) 83
실시예 3
로도코커스 종 SD826을 LB 한천 배지에 획선하고, 30℃의 항온조에서 24시간 배양하였다. 형성된 콜로니로부터, 1백금이를 취하여, 500mL 용량의 배플 플라스크 내의 LB 액체배지 100mL에 현탁하였다. 플라스크를 30℃의 항온 회전진탕배양기에 설치하고, 매분 120회전, 24시간 배양하였다. 얻어진 미생물 균체를 10,000g의 원심분리에 의해 회수하고, 배양액과 같은 부피의 50mM 인산나트륨/칼륨 완충액(pH=7)에 현탁하였다. 균 현탁액에 이소프탈로니트릴을 5%(질량/체적) 상당 첨가하고, 30℃의 항온회전진탕배양기에 설치하고 매분 120회전, 72시간 반응시켰다.
균 현탁액에 테레프탈로니트릴을 1%(질량/체적) 상당, 및 유도기질로서 벤조니트릴을 0.1%(질량/체적) 첨가하고, 30℃의 항온 회전진탕배양기에 설치하여, 매분 120회전, 72시간 반응시켜다. 얻어진 반응액을, 2mol/l 염산을 이용하여 pH 2로 하고, 반응액과 같은 부피의 초산에틸을 첨가하여 교반, 추출을 행하였다. 얻어진 초산 에틸층을 적당하게 희석하고, 역상 HPLC(칼럼:Shodex DS-613, 용리액:50% 아세토니트릴/5mM 인산칼륨 완충액 pH 3.0, 유속:1mL/min, 검출:UV210nm)에 의해 분석하였다. 반응액 중에서 주성분으로서 파라시아노안식향 산 샘플과 머무름 시간이 일치하는 피크를 검출하였다. 피크 성분을 분취하여, GC-질량스펙트럼 분석을 시행하고, 각각의 샘플과 동일한 구조를 시사하는 단편 패턴을 그리는 것을 확인하였다.
비교예로서, 상기와 같은 방법에 의해, 모주 ATCC39484 균주를 이용하여 반응, 추출, 분석을 행하였다. 모주 반응액 중의 상기 HPLC 조건 하에서의 주요한 생성물을 LC-MS 분석을 행하여 동정, 정량하였다.
모주 및 SD826의 반응액 중의 주요한 각 성분의 농도와, 반응원료인 이소프탈로니트릴로부터의 추정변환율의 비교, 및 ATCC 39484를 기준으로 한, SD826 균주의 사용에 의한 부산물의 감소율을 표 3에 나타내었다.
균주명 파라시아노안식향산 파라시아노벤즈아미드 테레프탈산 모노아미드
농도(%) 변환율(몰%) 농도(%) 변환율(몰%) 농도(%) 변환율(몰%)
ATCC39484 1.129 98.31 0.006 0.53 0.012 0.97
SD826 1.145 99.68 n.d. - 0.002 0.26
부산물의 감소율/성분별(%) 100 83
부산물의 감소율/총계(%) 89
n.d. : 검출되지 않음.
실시예 4
니트릴라아제 유전자 제조용 염색체 DNA의 제조
L 브로스(폴리펩톤 1%, NaCl 0.5%, 효모 엑기스 0.5%, pH 7.0)에 2%의 한천을 가하여 평판화한 한천평판배지에서 하루밤낮 배양한 로도코커스 종(이하 R.sp 라고 함) ATCC39484 균주 1백금이를 기본 배지(KH2PO4 1.5g/l, Na2HPO4 ·2H2O 0.75g/l, MgSO4·7H2O 0.2g/l, CaSO4·2H2O 10mg/l, FeSO4 ·7H2O 5mg/l, 효모 엑기스 20mg/l)에 글루코스 5g/l, 요소 2g/l을 첨가한 배지 300mL에서 30℃, 24시간 배양하였다. 배양후의 균체를 집균하고, 5mM의 EDTA 용액 100ml으로 균체를 세정하였다. 이 균체를 30ml의 완충액(20mM 트리스 염산 완충액(pH7.1))에 현탁하고, 60mg의 리소자임을을 가하여 37℃에서 2 시간 인큐베이팅하였다. 이 현탁액을 원심분리(5000rpm, 7분간)하여 균체를 회수하고, 11.34ml의 TE 버퍼에 재현탁하고, 10% SDS 0.6ml를 가하고, 다시 100㎍/ml의 농도가 되도록 프로테이나아제 K(머크사제)를 가하고, 1시간동안 55℃에서 부드럽게 진탕하였다. 이 용액을 페놀로 추출하고, 에탄올로 침전시킴으로써 염색체 DNA를 제조하였다.
실시예 5
염색체 라이브러리의 제조
실시예 4에서 얻어진 염색체 DNA 20㎍에 대하여 제한효소 Sau3AI를 이용하여 부분소화를 행하였다. 즉, 염색체 DNA를 4㎍씩 5개의 튜브에 넣고, 100㎕의 반응 부피 내에서, 제한 효소 Sau3AI(다카라 슈조사제, 4-12U/㎕)을 첨가하여 37℃에서 반응시키고, 10초마다 튜브 중 하나를 취하여, 최종 농도 20mM이 되도록 EDTA를 가하여 반응을 정지시켰다. 이와 같이 하여 제조된 염색체 DNA의 부분 소화 단편 용액을 아가로스겔 전기영동을 행하여, 1-2kb의 DNA 단편을 영동추출 및 에탄올 침전으로써 회수하고, 30㎕의 TE 용액에 용해시켰다. 이 시료 9㎕와 1㎍의 BamHI을 소화시킨 후 BAP 처리한 pUC18(다카라 슈조사제)을 T4DNA 리가아제(다카라 슈조사제, 라이게이션 키트 ver.2)를 이용하여 라이게이션한 후, 대장균 JM101 균주를 형질전환하였다. 이 라이브러리의 증폭 라이브러리를 제조하기 위하여, 대장균 형질전환체를 20콜로니 씩 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스로 이식하고, 하루 밤낮을 배양한 균체로부터 알칼리-SDS법에 의해 플라스미드를 추출하였다.
실시예 6
앵커-PCR법
클로닝에 앞서, 프로브로 사용하는 효소유전자 부분단편을 얻기 위해, 앵커-PCR을 행하였다. 효소배열에서 유래하는 한쪽 프라이머는, 공지의 본 효소 N-말단 배열로부터 적당한 Tm을 갖도록 배열을 선택하여 제조하였다. 즉, 5'-gct gcg gtg cag gca-3'( 및 그 상보적 사슬), Tm = 52℃
PCR법은 이하의 반응 조건에서 행하였다.
반응액 조성:
R.sp.ATCC39484 염색체 DNA 라이브러리 1㎍
유니버설 프라이머 100pmol
효소 N-말단 프라이머 100pmol
dNTP 용액 각 1mM
10x 반응 버퍼 10㎕
ExTaq DNA 폴리머라아제(다카라 슈조사제) 2.5U
계 50㎕
반응 조건 :
열변성 94℃, 45초
아닐링 37-55℃, 60초
신장 72℃, 60-90초
사이클 수 24회
이와 같이 하여 행한 반응에서, 특이적으로 증폭되는 단편이 보여진 반응액을 2% 아가로스 겔 전기영동을 행하여, 단편을 포함하는 부분의 겔을 잘라내고, ESAYTRAP ver.2(다카라 슈조사제)을 이용하여 정제하였다. 이들 DNA 단편에 대하여, 디데옥시법에 따라 DNA 배열을 결정하고, 번역된 아미노산 배열이 R.sp. ATCC39484 균주의 니트릴라아제 N-말단 배열과 일치하는 것을 탐색하였다. 그 결과, 얻어진 단편 중에서, 니트릴라아제 287 아미노산을 코딩하는 DNA 배열을 포함하는 약 900bp의 단편이 발견되었다.
실시예 7
콜로니 하이브리다이제이션
실시예 6에서 얻어진 니트릴라아제 유전자의 일부를 포함하는 PCR 단편을 프로브로 하여, 콜로니 하이브리다이제이션법에 의해 전체 유전자의 클로닝을 행하였다. 실시예 2의 방법에 따라서 Sau3AI로 분해한 염색체 DNA의 부분 소화단편 용액을 1%의 아가로스 겔 전기 영동을 행하여, 4-8kb의 DNA 단편을 영동 추출 및 에탄올 침전에 의해 회수하고, 건조 후 30㎕의 TE 용액에 용해시켰다. 이 시료 용액 9㎕와, 1㎕의 BamHI을 소화시킨 후 BAP 처리한 pUC18(다카라 슈조사 제, 100ng)를 T4DNA 리가아제(다카라 슈조사제, 라이게이션 키트 ver.2)를 이용하여 라이게이션 한 후, 대장균 JM101균주를 형질전환하고, 이소프로필-B-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 0.1mM, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노사이드(X-gal) 0.004%, 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스에 2%의 한천을 가하여 평판화한 한천 평판배지에 도포하여 37℃에서 하루 밤낮을 배양하였다.
생성된 백색 콜로니를, 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스에 2%의 한천을 가하여 평판화한 한천평판 배지에 조균(釣菌)하고, 37℃에서 하루 밤낮을 배양하였다. 충분히 생육한 후, 한천 평판 배지를 약 2 시간 동안 4℃에 두어 냉각하였다. 건조한 나일론 막(Amersham Pharmacia Biotech 사제, Hybond-N+)에 상하 좌우의 표시를 연필로 한 후 냉각한 평판배지 위에 조심스레 놓고, 막 전체가 젖는 것을 기다려 조심스럽게 그리고 한번에 벗겨내어, 평판 위의 콜로니를 막으로 옮겼다. 옮긴 균체가 적을 경우에는, 막을 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스에 2% 한천을 가하여 평판화한 한천평판배지에 놓고, 37℃에서 하루 밤낮 배양하였다.
균체를 옮긴 막을 3ml의 알칼리 용액(NaOH 0.5M) 위에 띄우고, 균체를 용해하였다. 용해한 균체의 잔사를 5×SSC로 20분간×2회 세정하여 떨어뜨렸다. 이 막에 대하여, Random prime DNA labelling and detecteion system(Amersham Pharmacia Biotech 사제)를 이용하여 콜로니 하이브리다이제이션을 행하였다. 하이브리다이제이션 검출의 순서는, 동 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라서 표준적인 조건에서 행하였다. 약 4000 콜로니에 대하여 행한 하이브리다이제이션의 결과, 2 균주의 포지티브 클론이 얻어졌다.
이들의 포지티브 클론으로부터 알칼리-SDS법에 의해 플라스미드를 추출하고, 프로브용 부분단편 중에 있는 제한 효소 절단 사이트의 위치와, 플라스미드의 제한효소 분해 패턴을 비교하여, 삽입단편 중의 유전자의 위치와 방향을 추정하였다. 그 결과, 2개의 클론 균주로부터 제조한 플라스미드 pNL06 및 pNL09 두개가 전체의 니트릴라아제 유전자를 포함하고 있는 것을 알았다(도 1). 거기서부터 삽입 단편 길이의 길이 P09 균주의 플라스미드(pNL 09)를 이용하여, 디데옥시법에 의해 삽입 단편 약 2.6kb의 DNA 배열을 결정하였다(배열번호:1). 프로브로서 이용한 부분 단편 배열과 일치하는 부분을 탐색한 결과, 삽입 단편 끝으로부터 약 300bp 하류로부터 lac 프로모터에 대하여 정방향으로 니트릴라아제 유전자가 존재하고 있다는 것을 알았다.
이 방향과 위치는, 제한 효소의 절단 사이트로부터 추정한 유전자의 위치와 방향에 일치하고 있다. 이 니트릴라아제 유전자 배열로부터 번역된 아미노산 배열(배열번호 2)는, 이미 알려진 어떠한 니트릴라아제의 아미노산 배열과도 다른 신규한 것이었다.
실시예 8
니트릴라아제 활성의 측정
니트릴라아제 활성은 20mM 인산 완충액(pH7.0) 10ml에 테레프탈로니트릴(TPN)을 기질로 하여 1-10질량%를 현탁한 반응액에, 균체(습체질량으로 1g 전후)를 가하여 30℃에서 흔들면서 반응을 행하여, 일정시간마다 반응액 중에 생성된 파라시아노안식향산을 HPLC로 정량함으로써 측정하였다. 통상, 반응액으로부터 고형물을 원심분리하여 제거한 후, 상징액을 용리액으로 100배 희석한 것을 HPLC 샘플로 사용하였다. 파라시아노 안식향산의 정량은, 이하의 장치, 조건에서 행하였다.
장치 :
펌프 : DS-2(Shodex)
검출기 ; SPD-6AV UV-VIS
샘플의 도입 ; 20㎕ 샘플 튜브를 갖는 Autosampler Model23(SIC)
기록 ; Chromatocoder 12(SIC)
칼럼 ; ODSpak F-411(Shodex), 4.6×150mm, 40℃
분리조건 ; AcCN/H20 = 50:50, 0.1% TFA, 1ml/min
활성은 건조질량 1g의 균체가 1시간에 1l의 반응액 중에 생성하는 파라시아노안식향산의 질량(g/l/hr/g 건조균체)으로 나타내는 것으로 하였다.
실시예 9
고발현주의 생산
실시예 4에서 얻은 포지티브 클론 P09 균주를 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스에서 배양하면, 이소프로필-B-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 존재의 여하에 관계없이 약한 니트릴라아제 활성을 확인할 수 있다. 그러나 이러한 활성은 공여체인 로도코커스 속 세균의 수십분의 일이라고 하는 낮은 것이었다. 다른 쪽의 P06 균주에는 니트릴라아제 활성은 전혀 확인되지 않았다.
그래서 효소 생산량을 증가시키기 위해, 효소 구조 유전자부분만, 그리고 효소 구조 유전자와 그 하류 영역 약 1.3kb를 포함하는 2종의 단편을 PCR로 제조하고, pUC18의 lac 프로모터 바로 다음에 연결된 플라스미드 pUNLE1 및 UNLE2를 제조하였다. PCR 단편 제조에 이용한 프라이머 및 반응 조건은 이하와 같다.
pUNLE1
(포워드)
5'-aac atg gtc gaa tac aca aac-3'
(리버스)
5'-cc aag ctt tca gag ggt ggc tgt-3'
HindIII 사이트
pUNLE2
(포워드)
pUNLE1과 동일
(리버스)
M13 프라이머 M4
반응액 조성 :
플라스미드 DNA 0.8-1㎍
프라이머 각 100pmol
dNTP 용액 각 1mM
10×반응 버퍼 10㎕
ExTaqDNA 폴리머라아제(다카라 슈조 사 제) 2.5U
계 50㎕
반응 조건 :
열변성 94℃, 60초
아닐링 55℃, 60초
신장 72℃, 120초
사이클 수 24회
생성한 단편을 아가로스 겔 전기영동하여, 추출, 회수하였다. 단편을 제한효소 NcoI와 HindIII으로 절단하고, EcoRINcoI 링커로 라이게이션한 후, EcoRI, HindIII 커트한 pUC18과 라이게이션 하였다.(도 2)
이들 플라스미드로 대장균 JM109 균주를 형질전환하고, 얻어진 형질전환체를 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스로 하루 밤낮을 배양한 후, 이소프로필-B-D-티오갈락토-피라노사이드(IPTG)를 0.1mM이 되도록 배양액에 가하여 다시 2 시간 배양하였다. 얻어진 형질전환체의 니트릴 변환 활성을 실시예 5에 나타낸 방법에 의해 측정한 결과, 어느 플라스미드로 형질전환한 형질전환체에서도, pUNL09 형질전환체의 약 500배, 및 공여체인 로도코커스 속 세균의 약 80배의 니트릴라아제 활성이 확인되었다(표 4).
균주 비유도시의 활성 유도시의 활성
R.sp.ATCC39484 - 0.14
pUNL09형질전환체 0.029 0.022
pUNLE1형질전환체 0.51 11.1
pUNLE2형질전환체 0.46 10.6
활성단위 : g/ℓ/hr/g 건조균체
실시예 10
고활성 균주를 이용한 파라시아노 안식향산의 제조
실시예 9에서 얻은 pUNLE1 형질전환체를, 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스에 2%의 한천을 가하여 평판화한 한천 평판 배지에서 하루 밤낮을 배양한 균체 1백금이를, 암피실린 100ppm을 포함하는 L-브로스 100ml에 식균하고, 37℃에서 진탕 배양하였다. 이 배양액을 다시 암피실린 100ppm을 포함하는 L 브로스 21을 넣은 5L 자르(jar) 발효조에 식균(subculture)하고, 37℃, 800rpm, 통기 1ml/min에서 하루 밤낮을 통기 교반 배양하였다. 정상기 초기 혹은 대수증식기 종기의 균체 배양액에, 최종 농도 0.1mM이 되도록 이소프로필-B-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)을 첨가하고, 다시 4 시간 배양을 계속하였다.
배양액을 원심분리하여 얻은 균체를 20mM 인산 완충액(pH 7.0) 1l에 재현탁하고, 100g의 테레프탈로니트릴(TPN)을 가하고, 35℃에서 교반하면서 반응을 행하였다. 반응액의 일부를 1시간마다 취하여, 실시예 5의 방법에 따라 반응액 중에 생긴 파라시아노안식향산을 정량하였다. 파라시아노안식향산은 형질전환체에 의해 빨리 생성되어, 약 3시간 내에 반응액 중에 3% 축적하였다(도 3). 반응 종료 후, 반응액에 진한 염산을 첨가하여 pH를 1로 하고, 파라시아노안식향산을 침전시켰다. 이것을 여과지로 여과하고, 묽은 염산(0.1몰/l)로 세정한 후, 진공 건조하였다. 이 건조 샘플의 순도는 99.9% 이상이었다. 불순물로 검출된 것은 원료 테레프탈로니트릴이었다.
실시예 11
니트릴하이드라타아제 유전자 및 아미다아제 유전자 제조용 염색체 DNA의 제조
영양(L 브로스) 한천 평판배지에서 하루 밤낮을 배양한 R.sp.ATCC39484 균주 1 백금이를 기본 배지(KH2PO4 1.5g/l, Na2HPO4·2H2O 0.75g/l, MgSO4·7H2O 0.2g/l, CaSO4·2H2O 10mg/l, FeSO4·7H2O 5mg/l, 효모 엑기스 20mg/l)에 글루코스 5g/l, 요소 2g/l을 첨가한 배지 300mL에서 30℃, 하루동안 배양하였다. 배양후의 균체를 집균하고, 5mM의 EDTA 용액 100ml로 균체를 세정하였다. 이 균체를 30ml의 완충액(20mM 트리스/염산 완충액(pH7.1))에 현탁하고, 60mg의 리소자임을을 가하여 37℃에서 2 시간 인큐베이팅하였다. 이 현탁액을 원심분리(5000rpm, 7분간)하여 균체를 회수하고, 11.34ml의 TE 버퍼에 재현탁하고, 10% SDS 0.6ml를 가하고, 다시 100㎍/ml의 농도가 되도록 프로테이나아제 K(머크사제)를 가하고, 1시간동안 55℃에서 부드럽게 진탕하였다. 이 용액을 페놀로 추출하고, 에탄올로 침전시킴으로써 염색체 DNA를 제조하였다.
실시예 12
염색체 라이브러리의 제조
얻어진 염색체 DNA 20㎍에 대하여 제한효소 Sau3AI를 이용하여 부분소화를 행하였다. 즉, 염색체 DNA를 4㎍씩 5개의 튜브에 취하고, 100㎕의 반응 부피 내에서, 제한 효소 Sau3AI(다카라 슈조사제, 4-12U/㎕)을 첨가하여 37℃에서 반응시키 고, 10초마다 튜브 중 하나를 취하여, 최종 농도 20mM이 되도록 EDTA를 가하여 반응을 정지시켰다. 이와 같이 하여 제조된 염색체 DNA의 부분 소화 단편 용액을 아가로스겔 전기영동을 행하여, 5-10kb의 DNA 단편을 침전추출 및 에탄올 침전으로써 회수하고, 30㎕의 TE 용액에 용해시켰다. 이 시료 9㎕와 1㎍의 BamHI을 소화 후 BAP 처리한 pUC18(다카라 슈조사제)을 T4DNA 리가아제(다카라 슈조사제, 라이게이션 키트 ver.2)를 이용하여 20㎕의 양으로 라이게이션한 후, 대장균 JM101 균주를 형질전환하였다. 이 라이브러리의 증폭 라이브러리를 제조하기 위하여, 대장균 형질전환체를 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스(pH 7)로 식균하고, 하루 밤낮을 배양한 균체로부터 알칼리-SDS법에 의해 플라스미드를 추출하였다.
실시예 13
니트릴하이드라타아제 및 아미다아제의 제조
앵커 PCR에 필요한 효소 배열에서 유래하는 한 쪽 프라이머는, 이하와 같이 하여 제조한 효소 펩티드의 N 말단 배열로부터, 적당한 Tm을 갖도록 배열을 선발하여 제조하였다.
니트릴하이드라타아제 활성 또는 아미다아제 활성은, 각각 벤조니트릴 10mM 또는 벤즈아미드 10mM, 인산 칼륨 버퍼(pH 7.0) 30mM, 및 소정량의 균체 추출액을 포함하는 반응 혼합액 1ml에 대하여, 25℃에서 30분간 반응을 행한 후, 생성된 벤즈아미드 혹은 안식향산을 HPLC에 의해 검출함으로써 정성적으로 행하였다(HPLC 분리 조건은 후술하는 실시예 8과 같다).
R.sp.ATCC39484 균주를 실시예 1의 기본 배지에 유도기질로서 1g/l의 벤조니 트릴을 첨가한 니트릴 분해효소군 유도배지 600ml에 식균하고, 30℃에서 진탕 배양하였다.
하루 밤낮을 배양한 배양액을 원심분리(8000rpm, 15분간)를 행하여 균체를 회수하고, 얻어진 균체의 미건조 질량 3.2g을 100mM 인산 칼륨 버퍼(pH 7.0, 1mM의 EDTA 및 2mM의 DDT를 포함한다) 50ml로 세정한 후, 같은 버퍼 200ml로 현탁하였다. 이것을 초음파 파쇄기에 넣고 균체를 파쇄한 후, 원심분리(12,000 rpm, 20분간)하여 상징액(조(粗)효소추출액) 180ml를 얻었다.
이 무세포 추출액에 45% 포화 농도가 되도록 황산 암모늄을 첨가하고, 4℃에서 1 시간 교반한 후, 생성된 침전을 원심분리에 의해 제거하였다. 분리한 상징액에 다시 황산암모늄을 60% 포화농도가 되도록 첨가하고, 4℃에서 1 시간 교반한 후, 원심분리에 의해 침전을 회수하였다. 생성된 침전에는 니트릴하이드라타아제 활성 및 아미다아제 활성이 확인되었다. 얻어진 침전을 100mM 인산 칼륨 버퍼(pH 7.0, 1mM의 EDTA 및 2mM의 DDT를 포함한다) 10ml에 용해하고, 같은 버퍼에 대하여 투석을 행하였다.
100mM 인산 칼륨 버퍼(pH 7.0, 1mM의 EDTA 및 2mM의 DDT를 포함한다)로 평형화한 DEAE-Sephacel 칼럼(2cm X 20cm)에, 투석한 조효소용액을 넣고, 평형화 버퍼로 용출액의 UV 280nm가 저하할 때까지 세정하고, 다시 0.2M로 KCl 농도를 높인 버퍼로 동일하게 용출액의 UV 280nm가 저하할 때까지 세정하였다. 그 후, 0.3M로 KCl 농도를 높인 100mM 인산 칼륨 버퍼(pH 7.0, 1mM의 EDTA 및 2mM의 DDT를 포함한다)로 니트릴하이드라타아제와 아미다아제를 용출하였다. 활성을 보이는 분획을 수집하고, 한외여과막(분자량 30,000 cut)을 이용하여 효소 단백질을 농축하였다.
100mM 인산 칼륨 버퍼(pH 7.0, 10% 포화농도의 황산암모늄을 포함한다)로 평형화한 Phenyl Sepharose CL-4B칼럼(2cm X 40cm)에, 농축된 활성 분획에 10% 포화 농도의 황산 암모늄을 첨가한 것을 놓고, 효소를 흡착시켰다. 평형화 버퍼로 용출액의 UV 280nm가 감소할 때까지 세정하였다. 그 후, 용출 버퍼(100mM 인산 칼륨 버퍼(pH 7.0))로 니트릴하이드라타아제 및 아미다아제를 용출하였다. 활성 분획을 수집하고, 한외여과막(분자량 30,000 cut)을 이용하여 효소 단백질을 농축하였다.
이 농축된 니트릴하이드라타아제 활성 분획을 100mM 인산칼륨 버퍼(pH 7.0, 0.5M의 NaCl를 포함한다)로 평형화한 Sephacryl S-300 초미세 칼럼(2cm X 60cm)에 놓고, 같은 버퍼를 이용하여 분획을 행하고, 용출액을 약 0.5ml씩 분획하였다. 이 단계에서, 니트릴하이드라타아제와 아미다아제 활성이 가장 높은 분획을 알기 위하여, 각각 가장 높은 활성 및 그 전후의 분획을 각각 회수하였다. 각각 약 1.5ml의 분획을 한외여과막(분자량 30,000 cut)을 이용하여 농축하였다.
실시예 14
펩티드 말단 배열의 결정
얻어진 니트릴하이드라타아제 및 아미다아제의 N 말단 배열의 결정을 시험하였지만, 어느 효소에 대하여도 에드만(Edman) 분해에 있어서의 시그날 강도가 낮았고, 배열결정이 불가능하였다. 그래서 효소 단백질을 브롬화시안(BrCN)법에 의해 가수분해하고, 생성된 펩티드를 이하의 액체 크로마토그래피 조건에서 분리하였다.
본체 ; LC 9A(시마츠 세이사쿠쇼)
칼럼 ; Asahipak ODP 50 6D(Shodex)
칼럼 온도 ; 25℃
용리액 ; 아세토니트릴 0-80%(직선 농도 구배, 60분간)
0.1% 트리플루오로아세트산
유속 0.5ml/분
검출 ; SPD-6AV UV VIS Spectro Photometer(시마츠 세이사쿠쇼)
215nm
니트릴하이드라타아제 활성 분획으로부터 얻어진 복수의 펩티드 중, 비교적 분리가 양호한 샘플을 선발하고, 다시 에드만 분해에 의해 N 말단 배열 분석을 행한 결과, 기존의 니트릴하이드라타아제의 배열과 상동성이 높은 하기 배열이 확인되었다.
Glu(E)·Tyr(Y)·Arg(R)·Ser(S)·Arg(R)·Val(V)·Val(V)
이 배열과 로도코커스 속 세균의 코돈 용도를 고려하여, 니트릴하이드라타아제용 프라이머를 제조하였다.
5'-GAG TAC CGG TCC CGA-3'( 및 그의 상보 사슬)
동일하게, 아미다아제 활성 분획으로부터 얻어진 복수의 펩티드 중, 비교적 분리가 양호한 샘플을 선발하여, 에드만 분해에 의해 N 말단 배열 분석을 행한 결과, 기존의 아미다아제의 배열과 상동성이 높은 하기의 배열이 확인되었다.
Ala(A)·Val(V)·Gly(G)·Gly(G)·Asp(D)·Gln(Q)·Gly(G)
이 배열과 로도코커스 속 세균의 코돈 용도를 고려하여, 아미다아제용 플라 스미드를 세작하였다.
5'-GCA GTC GGC GGC GAC-3'( 및 그의 상보 사슬)
실시예 15
앵커 PCR
PCR 법은 이하의 반응조건에서 수행하였다.
반응액 조성:
R.sp.ATCC39484 염색체 DNA 라이브러리 1㎍
유니버설 프라이머 100pmol
효소 펩티드 말단 프라이머 100pmol
dNTP 용액 각 1mM
10x 반응 버퍼 10㎕
ExTaq DNA 중합효소(다카라 슈조사제) 2.5Unit
계 50㎕
반응 조건 :
열변성 94℃, 45초
아닐링 37-60℃, 60초
신장 72℃, 60-90초
사이클 수 24회
이와 같이 하여 행한 반응 중, 특이적으로 증폭되는 단편이 나타난 반응액을 2% 아가로스 겔 전기영동을 행하여, 그 단편을 포함하는 부분의 겔을 잘라내고, ESAYTRAP ver.2(다카라 슈조사제)을 이용하여 정제하였다. 이 DNA 단편에 대하여, 디데옥시법에 따라 DNA 배열을 결정하고, 번역된 아미노산 배열이 공지의 니트릴하이드라타아제 또는 아미다아제와 상동성이 있는 것을 확인하였다. 그 결과, 얻어진 단편 4, 14 중에, 각각 공지의 니트릴하이드라타아제, 아미다아제와 상동성이 높은 배열이 포함되어 있는 것을 알 수 있었다. 단편 4에는 약 500bp의 니트릴하이드라타아제 상동배열이, 단편 14에는 약 900bpdml 아미다아제 상동배열이 포함되어 있고, 모두 하기하는 콜로니하이브리다이제이션에 이용되는 프로브로서 충분한 길이였다.
실시예 16
콜로니 하이브리다이제이션
실시예 15에서 얻어진 니트릴하이드라타아제 유전자의 일부, 및 아미다아제 유전자의 일부를 포함하는 PCR 단편을 프로브로 하여, 콜로니 하이브리다이제이션법에 의해 전체 유전자의 클로닝을 행하였다. 실시예 2의 방법에 따라서 Sau3AI로 분해한 염색체 DNA의 부분 소화단편 용액을 1%의 아가로스 겔 전기 영동을 행하여, 4-8kb의 DNA 단편을 영동 추출 및 에탄올 침전에 의해 회수하고, 건조 후 30㎕의 TE 용액에 용해시켰다. 이 시료 용액 9㎕와, 1㎕의 BamHI을 소화 후, BAP 처리한 pUC18(다카라 슈조사 제, 100ng)를 T4DNA 리가아제(다카라 슈조사제, 라이게이션 키트 ver.2)를 이용하여 라이게이션한 후, 대장균 JM101균주를 형질전환하고, 이소프로필-B-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 0.1mM, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일-β-D-갈락토피라노사이드(X-gal) 0.004%, 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스에 2%의 한천을 가하여 평판화한 한천 평판배지에 도포하여 37℃에서 하루 밤낮을 배양하였다.
생성된 백색 콜로니를, 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스에 2%의 한천을 가하여 평판화한 한천평판 배지에 조균(釣菌)하고, 37℃에서 하루 밤낮을 배양하였다. 충분히 생육한 후, 한천 평판 배지를 약 2 시간 동안 4℃에 두어 냉각하였다.
건조한 나일론 막(Amersham Pharmacia Biotech 사제, Hybond-N+)에 상하 좌우의 표시를 연필로 한 후 냉각한 평판배지 위에 조심스레 놓고, 막 전체가 젖는 것을 기다려 조심스럽게 그리고 한번에 벗겨내어, 평판 위의 콜로니를 막으로 옮겼다. 옮긴 균체가 적을 경우에는, 막을 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스에 2% 한천을 가하여 평판화한 한천평판배지에 놓고, 37℃에서 하루 밤낮 배양하였다.
균체를 옮긴 막을 3ml의 알칼리 용액(NaOH 0.5M) 위에 띄우고, 균체를 용해하였다. 용해한 균체의 잔사를 5×SSC로 20분간×2회 세정하여 떨어뜨렸다. 이 막에 대하여, Random prime DNA labelling and detecteion system(Amersham Pharmacia Biotech 사제)를 이용하여 콜로니 하이브리다이제이션을 행하였다. 하이브리다이제이션 검출의 순서는, 동 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라서 표준적인 조건에서 행하였다. 약 8000 콜로니에 대하여 행한 하이브리다이제이션의 결과, 각 유전자에 대하여 각 1균주의 포지티브 클론이 얻어졌다.
이들의 포지티브 클론으로부터 알칼리-SDS법에 의해 플라스미드를 추출하고, 프로브용 부분단편 중에 있는 제한 효소 절단 사이트의 위치와, 플라스미드의 제한 효소 분해 패턴을 비교하여, 삽입단편 중의 유전자의 위치와 방향을 추정하였다. 그 결과, 니트릴하이드라타아제의 클론 균주 P11로부터 제조한 플라스미드 pUNH11는 전체 니트릴하이드라타아제 유전자를 포함하고 있는 것을 알 수 있었지만(도 4), 아미다아제의 클론 균주 P12로부터 제조한 플라스미드 pUAMD12는 제한효소 처리 패턴이 복잡하여, 유전자의 위치와 방향을 추정하는 것이 불가능하였다. 따라서 pUAMD12에 관해서만 더 제한 효소 처리를 한 단편에 대해 서던(Southern) 하이브리다이제이션을 행하고, 이것이 전체 구조 유전자 영역을 포함하고 있다는 것을 추정하였다.(도 4)
실시예 17
결실 변이주의 제조와 염기배열의 결정
pUNH11 및 pUAMD12는 각각 3kb-4kb의 삽입 단편을 포함하는 플라스미드이고, 그 자체는 염기배열의 결정이 곤란하였다. 그래서, 엑소뉴클레아제 III을 이용하여 말단으로부터 삽입단편을 결실시킨 결실 변이체(deletion mutant)의 제조를 시도하였다. 변이체의 제조에는 킬로-시퀀스 용 결실 키트(다카라 슈조사제)를 이용하였다. 즉, pUNH11 또는 pUAMD 12 용액 25㎕(0.4mg/ml로서 약 16㎍)을 Sse8387I, XbaI로 완전분해(37℃, 24시간)하고, 페놀 추출로 정제한 후, 1/10 용량의 3M 초산나트륨과 2.5 용량의 에탄올을 가하여 침전시켰다. 원심분리로서 침전을 회수하고, 70%의 차가운 에탄올로 일회 세정한 후, 진공 건조 침전을 100㎕의 Exo III 버퍼에 용해하였다. DNA 용액에 1㎕의 엑소뉴클레아제 III을 가하고, 소용돌이로 교반한 후, 37℃에서 인큐베이팅하고, 10초 및 30초 후에 각 50㎕를 샘플링하였다.( 반응을 정지시키기 위해, 미리 준비한 MB 뉴클레아제 버퍼 각 50㎕와 혼합)
이 반응액에 MB 뉴클레아제 2㎕를 첨가하고, 37℃에서 20분간 인큐베이팅하였다. 반응종료후, 페놀 추출하여 정제하고, 1/10용량의 3M 초산나트륨과 2.5 용량의 에탄올을 가하여 침전시켰다. 원심분리하여 회수하고, 70%의 차가운 에탄올로 일회 세정한 후, 진공 건조시킨 침전을 50㎕의 klenow 버퍼에 용해하고, klenow 단편 1㎕를 가하여 37℃에서 15분간 인큐베이팅하였다. 이 반응액을 아가로스 겔 전기영동을 하여, 3개의 사슬 길이 범위로 분획하였다(겔로부터 각각 잘라내어, 추출 회수).
잘라낸 단편의 회수액 10㎕를 100㎕의 라이게이션 용액 A와 혼합하고, 라이게이션 용액 B 12㎕를 가하고, 소용돌이로 교반한 후 16℃에서 24시간 반응시켜서, 셀프 라이게이션하였다. 이 플라스미드로 대장균 JM109 균주를 형질전환하였다.
이러한 조작에 따라, pUNH11에 대하여는 20종 이상의 결실 변이체를 취득할 수 있고, 이 중에서 적당한 길이의 삽입 단편을 포함하는 변이체 7종을 선택하여, 배열 결정에 이용하는 것으로 하였다. 그러나, pUAMD12에 관하여는, 원래의 플라스미드보다 큰 플라스미드나 이용한 벡터보다 작은 플라스미드가 생성되는 등, 적당한 결실체를 취득할 수 없다는 것이 밝혀졌다. 따라서, pUAMD12에 관하여는 차례대로 프라이머를 합성하면서 배열을 결정하는 유전자 워킹(gene walking)법에 따라 배열결정을 행하는 것으로 하였다.
염기 배열의 결정은 디데옥시법에 의해, pUNH11은 삽입 단편의 전영역에 상당하는 약 2.8kb의 DNA 배열, pUAMD 12는 삽입단편의 약 2/3에 상당하는 약 2.8kb 의 DNA 배열을 결정하였다. 프로브로 이용한 부분단편 배열과 일치하는 부분을 탐색한 결과, pUNH11, pUAMD12 각각의 삽입단편의 EcoRI 사이트 측으로부터 약 0.2kb, 1.1kb 하류로부터 니트릴하이드라타아제 유전자는 lac 프로모터에 대하여 역순으로, 아미다아제 유전자는 정방향으로 존재하고 있다는 것을 알았다. 각각의 염기배열의 해석결과를 배열번호 3 및 6에 나타내었다. 이러한 방향과 위치는, pUNH11에 관하여는 제한효소의 절단단편생성 패턴으로부터 추정한 유전자의 위치와 방향에, pUAMD12에 관하여는 제한효소의 절단 패턴과 서던 하이브리다이제이션의 결과로부터 추정된 것과 일치하고 있었다. 이들의 유전자 배열로부터 번역된 아미노산 배열(배열번호 4,5 및 7)은, 이미 알려진 어떠한 니트릴하이드라타아제, 아미다아제의 아미노산 배열과도 다른 신규한 것이었다.
실시예 18
니트릴하이드라타아제 및 아미다아제 활성의 측정
니트릴하이드라타아제 활성은 20mM 인산 완충액(pH 7.0) 10ml에 테레프탈로니트릴(TPN)을 기질로 하여 1-10 질량%를 현탁한 반응액에, 균체(미건조 질량으로 1g 전후)를 가하여 30℃에서 진탕하면서 반응을 행하고, 일정 시간마다 반응액 중에 생성된 파라시아노안식향산 아미드를 HPLC로 정량함으로써 측정하였다. 통상, 반응액으로부터 고형물을 원심분리하여 제거한 후, 상징액을 용리액으로 100배 희석한 것을 HPLC 샘플로 이용하였다. 아미다아제 활성은 기질로서 파라시아노벤즈아미드 또는 벤즈아미드를 이용하여, 같은 조건에서 반응시키고, 생성된 파라시아노안식향산 또는 안식향산을 HPLC로 정량함으로써 측정하였다.
각 생성물의 정량은, 이하의 장치, 조건에서 행하였다.
장치 : 펌프 ; DS-2(Shodex)
검출기 ; SPD-6AV UV VIS Spectrophotometer(Shimadzu)
샘플 도입 ; 20㎕ 샘플 튜브를 갖는 Autosampler Model23(SIC)
기록 ; Chromatocoder 12(SIC)
칼럼 ; ODSpak F-411 (Shodex), 4.6×150mm, 40℃
분해조건 ; AcCN/H2O = 50:50, 0.1% TFA, 1ml/min
활성은 갖는 건조 질량 1g의 균체가 1시간에 1ℓ의 반응액 중에 생성되는 파라시아노안식향산 아미드, 파라시아노안식향산 또는 안식향산의 g 질량(g/ℓ/hr/g 건조 균체)로 표시하는 것으로 하였다.
실시예 19
고발현 균주의 제조
실시예 16으로 나타낸 포지티브 클론 P11또는 P12 균주를 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스에서 배양했더니, 이소프로필-B-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 존재의 여하에 관계없이, 약한 니트릴 하이드라타아제 활성이 확인되었다. 그러나 이러한 활성은 공여체인 로도코커스 속 세균의 수십분의 일이라고 하는 낮은 것이었다. 다른 쪽의 P12 균주에서는 아미다아제 활성은 전혀 확인되지 않았다.
따라서, 효소 생산량을 증가시키기 위하여, 각각의 효소 구조 유전자 부분만의 단편을 PCR로 제조하고, pUC 18의 lac 프로모터 바로 다음에 이어진 플라스미드 pUNHE1 및 pUAMDE1을 제조하였다. 더 나아가, 이러한 양 단편을 같은 플라스미드 상에 올린 플라스미드 pUNHAMDE1을 제조하였다.
PCR 단편 제조에 이용된 프라이머 및 반응 조건은 이하와 같았다.
pUNHE1
(포워드)
5'-acc atg gat ggt atc cac gac-3'
(β서브유닛 개시 코돈)(NcoI 사이트)
(리버스)
5'-cc aag ctt tca tac gat cac ttc-3'
(α서브유닛 종지 코돈)(HindIII 사이트)
pUAMDE1
(포워드)
5'-acc atg gct tcg ttg act cc-3'
(NcoI 사이트, 아미노산 3번째 Ser->Ala로 변이)
(리버스)
5'-cc aag ctt tca gga cgg cac cga-3'
(HindIII 사이트)
반응액 조성 :
플라스미드 DNA 0.8-1㎍
프라이머 각 100pmol
dNTP 용액 각 1mM
10×반응 버퍼 10㎕
ExTaqDNA 중합효소(다카라 슈조사제) 2.5U
계 50㎕
반응 조건 :
열변성 94℃, 60초
아닐링 55℃, 60초
신장 72℃, 120초
사이클 수 24회
니트릴하이드라타아제 유전자, 아미다아제 유전자 모두, 생성된 단편을 아가로스 겔 전기영동하고, 추출, 회수한 후, 단편을 제한효소 NcoI와 HindIII으로 절단하고, EcoRINcoI 링커로 라이게이션 한 후, EcoRI-HindIII 절단한 pUC18과 라이게이션하였다.(도 5)
니트릴하이드라타아제 유전자와 아미다아제 유전자를 동일한 플라스미드 상에 올린 플라스미드는, 우선 니트릴하이드라타아제 단편을 제한효소 NcoI와 HindIII으로 절단하고, EcoRINcoI 링커, HindIII-NcoI 링커의 순으로 라이게이션 한 후, NcoI와 HindIII으로 절단한 아미다아제 단편과 라이게이션 하고, 최후로 EcoRI-HindIII 컷트한 pUC18과 이 단편을 라이게이션하였다.(도 6)
이들 플라스미드로 대장균 JM109 균주를 형질전환하고, 얻어진 형질전환체를 암피실린 50ppm을 포함하는 L 브로스로 하루 밤낮을 배양한 후, 이소프로필-B-D-피오갈락토피라노사이드(IPTG)를 0.1mM이 되도록 배양액에 가하고 다시 2 시간 배양 하였다. 얻어진 형질전환체의 니트릴 변환활성을 실시예 8에 나타낸 방법에 의해 측정한 결과, 어떠한 플라스미드로 형질전환한 형질전환체도 공여체인 로도코커스 속 세균보다 높은 활성이 확인되었다. 양 유전자를 모두 함유시킨 플라스미드로 형질전환한 것만은, 공여체와 동등한 활성을 보였다. 결과를 하기하는 표 5에 요약하였다.
균주 비유도시의 활성 유도시의 활성
R.sp.ATCC39484 - 0.171)
pUNH11형질전환체 0.009 0.007
pUAMD12형질전환체 n.d. n.d.
pUNHE1형질전환체 0.35 0.41
pUAMDE1형질전환체 0.11 0.27
pUNHAMDE1형질전환체 0.112) 0.132)
활성단위 : g/ℓ/hr/g 건조균체
1) 공여체의 활성은 아미드의 생성속도만(산의 생성속도는 니트릴라아제의 영향 때문에 정확히 측정 불가) 측정.
2) pUNHAMDE1은 니트릴->산생성 속도를 측정.
기탁의 개시
이하의 미생물은 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(일본국 이바리끼현, 츠쿠바시, 히가시 1쵸메, 1-3)에 기탁되었다:
미생물 수탁번호 기탁일
로도코커스 sp. Sd826 FERM BP-7305 1999년 10월 12일
이 기탁 미생물은 특허절차상의 미생물의 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페 스트 조약의 규정 및 그것에 기초한 규칙에 기초하여 행해졌다.
SEQUENCE LISTING <110> SHOWA DENKO K.K. <120> A Novel Rhodococcus Bacteria, Nitrilase Gene, Nitrile Hydratase Gene and Amidase Gene from Rhodococcus Bacteria, and Process for Producing Carboxylic Acids by the Same. <130> PC-8404 <150> JP 11-303212 <151> 1999-10-26 <160> 7 <210> 1 <211> 1531 <212> DNA <213> Rhodococcus sp. <220> <221> CDS <222> (324)..(1421) <400> 1 agcttgacca tgattacgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcgaaccag caacggggac 60 gcacagtcga cgtagacctc gacctatccg ccgttccgca gaaggacacc gaccaccacc 120 acttcaacat ccttcaacgt gcccggccag tccttcgacg aatcgaaacg gcgaagagcc 180 gcctcggacc ccccggccga accgctcgat gaactcccct acacgggtgg cgcagaatgc 240 caggacccgt gtcattccac gtcaattcac gcgccttttc acctcgtact gtcctgccaa 300 acacaagcaa cggaggtacg gac atg gtc gaa tac aca aac aca ttc aaa gtt 353 Met Val Glu Tyr Thr Asn Thr Phe Lys Val 1 5 10 gct gcg gtg cag gca cag cct gtg tgg ttc gac gcg gcc aaa acg gtc 401 Ala Ala Val Gln Ala Gln Pro Val Trp Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val 15 20 25 gac aag acc gtg tcc atc atc gcg gaa gca gcc cgg aac ggg tgc gag 449 Asp Lys Thr Val Ser Ile Ile Ala Glu Ala Ala Arg Asn Gly Cys Glu 30 35 40 ctc gtt gcg ttt ccc gag gta ttc atc ccg ggg tac ccg tac cac atc 497 Leu Val Ala Phe Pro Glu Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr His Ile 45 50 55 tgg gtc gac agc ccg ctc gcc gga atg gcg aag ttc gcc gtg cgc tac 545 Trp Val Asp Ser Pro Leu Ala Gly Met Ala Lys Phe Ala Val Arg Tyr 60 65 70 cac gag aat tcc ctg acg atg gac agc ccg cac gta cag cgg ttg ctc 593 His Glu Asn Ser Leu Thr Met Asp Ser Pro His Val Gln Arg Leu Leu 75 80 85 90 gat gcc gcc cgc gac cac aac atc gcc gta gtg gtg gga atc agc gag 641 Asp Ala Ala Arg Asp His Asn Ile Ala Val Val Val Gly Ile Ser Glu 95 100 105 cgg gat ggc ggc agc ttg tac atg acc cag ctc atc atc gac gcc gat 689 Arg Asp Gly Gly Ser Leu Tyr Met Thr Gln Leu Ile Ile Asp Ala Asp 110 115 120 ggg caa ctg gtc gcc cga cgc cgc aag ctc aag ccc acc cac gtc gag 737 Gly Gln Leu Val Ala Arg Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu 125 130 135 cgt tcg gta tac gga gaa gga aac ggc tcg gat atc tcc gtg tac gac 785 Arg Ser Val Tyr Gly Glu Gly Asn Gly Ser Asp Ile Ser Val Tyr Asp 140 145 150 atg cct ttc gca cgg ctt ggc gcg ctc aac tgc tgg gag cat ttc cag 833 Met Pro Phe Ala Arg Leu Gly Ala Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln 155 160 165 170 acg ctc acc aag tac gca atg tac tcg atg cac gag cag gtg cac gtc 881 Thr Leu Thr Lys Tyr Ala Met Tyr Ser Met His Glu Gln Val His Val 175 180 185 gcg agc tgg cct ggc atg tcg ctg tac cag ccg gag gtc ccc gca ttc 929 Ala Ser Trp Pro Gly Met Ser Leu Tyr Gln Pro Glu Val Pro Ala Phe 190 195 200 ggt gtc gat gcc cag ctc acg gcc acg cgt atg tac gca ctc gag gga 977 Gly Val Asp Ala Gln Leu Thr Ala Thr Arg Met Tyr Ala Leu Glu Gly 205 210 215 caa acc ttc gtg gtc tgc acc acc cag gtg gtc aca ccg gag gcc cac 1025 Gln Thr Phe Val Val Cys Thr Thr Gln Val Val Thr Pro Glu Ala His 220 225 230 gag ttc ttc tgc gag aac gag gaa cag cga atg ttg atc ggc cga ggc 1073 Glu Phe Phe Cys Glu Asn Glu Glu Gln Arg Met Leu Ile Gly Arg Gly 235 240 245 250 gga ggt ttc gcg cgc atc atc ggg ccc gac ggc cgc gat ctc gca act 1121 Gly Gly Phe Ala Arg Ile Ile Gly Pro Asp Gly Arg Asp Leu Ala Thr 255 260 265 cct ctc gcc gaa gat gag gag ggg atc ctc tac gcc gac atc gat ctg 1169 Pro Leu Ala Glu Asp Glu Glu Gly Ile Leu Tyr Ala Asp Ile Asp Leu 270 275 280 tct gcg atc acc ttg gcg aag cag gcc gct gac ccc gtg ggc cac tac 1217 Ser Ala Ile Thr Leu Ala Lys Gln Ala Ala Asp Pro Val Gly His Tyr 285 290 295 tca cgg ccg gat gtg ctg tcg ctg aac ttc aac cag cgc cgc acc acg 1265 Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser Leu Asn Phe Asn Gln Arg Arg Thr Thr 300 305 310 ccc gtc aac acc cca ctt tcc acc atc cat gcc acg cac acg ttc gtg 1313 Pro Val Asn Thr Pro Leu Ser Thr Ile His Ala Thr His Thr Phe Val 315 320 325 330 ccg cag ttc ggg gca ctc gac ggc gtc cgt gag ctc aac gga gcg gac 1361 Pro Gln Phe Gly Ala Leu Asp Gly Val Arg Glu Leu Asn Gly Ala Asp 335 340 345 gaa cag cgc gca ttg ccc tcc aca cat tcc gac gag acg gac cgg gcg 1409 Glu Gln Arg Ala Leu Pro Ser Thr His Ser Asp Glu Thr Asp Arg Ala 350 355 360 aca gcc acc ctc tgactcgggc gcacccgtgg cgcctccgaa gcgccacggg 1461 Thr Ala Thr Leu 365 tgtgtgaagg ggcgagacag gggaatcgga ggatccccgg gtaccgagct cgaattcgta 1521 atcatggtca 1531 <210> 2 <211> 366 <212> PRT <213> Rhodococcus sp. <400> 2 Met Val Glu Tyr Thr Asn Thr Phe Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Gln 1 5 10 15 Pro Val Trp Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Asp Lys Thr Val Ser Ile 20 25 30 Ile Ala Glu Ala Ala Arg Asn Gly Cys Glu Leu Val Ala Phe Pro Glu 35 40 45 Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr His Ile Trp Val Asp Ser Pro Leu 50 55 60 Ala Gly Met Ala Lys Phe Ala Val Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Thr 65 70 75 80 Met Asp Ser Pro His Val Gln Arg Leu Leu Asp Ala Ala Arg Asp His 85 90 95 Asn Ile Ala Val Val Val Gly Ile Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu 100 105 110 Tyr Met Thr Gln Leu Ile Ile Asp Ala Asp Gly Gln Leu Val Ala Arg 115 120 125 Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Ser Val Tyr Gly Glu 130 135 140 Gly Asn Gly Ser Asp Ile Ser Val Tyr Asp Met Pro Phe Ala Arg Leu 145 150 155 160 Gly Ala Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Ala 165 170 175 Met Tyr Ser Met His Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Gly Met 180 185 190 Ser Leu Tyr Gln Pro Glu Val Pro Ala Phe Gly Val Asp Ala Gln Leu 195 200 205 Thr Ala Thr Arg Met Tyr Ala Leu Glu Gly Gln Thr Phe Val Val Cys 210 215 220 Thr Thr Gln Val Val Thr Pro Glu Ala His Glu Phe Phe Cys Glu Asn 225 230 235 240 Glu Glu Gln Arg Met Leu Ile Gly Arg Gly Gly Gly Phe Ala Arg Ile 245 250 255 Ile Gly Pro Asp Gly Arg Asp Leu Ala Thr Pro Leu Ala Glu Asp Glu 260 265 270 Glu Gly Ile Leu Tyr Ala Asp Ile Asp Leu Ser Ala Ile Thr Leu Ala 275 280 285 Lys Gln Ala Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu 290 295 300 Ser Leu Asn Phe Asn Gln Arg Arg Thr Thr Pro Val Asn Thr Pro Leu 305 310 315 320 Ser Thr Ile His Ala Thr His Thr Phe Val Pro Gln Phe Gly Ala Leu 325 330 335 Asp Gly Val Arg Glu Leu Asn Gly Ala Asp Glu Gln Arg Ala Leu Pro 340 345 350 Ser Thr His Ser Asp Glu Thr Asp Arg Ala Thr Ala Thr Leu 355 360 365 <210> 3 <211> 2822 <212> DNA <213> Rhodococcus sp. <220> <221> CDS <222> (1379)..(2068) <223> nitrile hydratase beta subunit <220> <221> CDS <222> (2082)..(2693) <223> nitrile hydratase alpha subunit <400> 3 ctagaggatc tcggtcatcg cgataccatc gttgcggacg atgatgtcca atacgtacca 60 ctggtccgcg gtcaacttct cttgatcgac cacgttatgg attctacgac tcagggaccg 120 gctcacggct tccagggcgc ctccgaccaa aggtgatcga acgacatttc cggattcagc 180 caccgcttcc gactcgatca ttcctgtccc tccccgtcca cgcgcagttg atcttacctc 240 ctcatcaaga ggatatccac tgaacgaatt atttcaagtg gaagtacttg gagtcgatcc 300 tacacgtgag tggacgatgc ctgggcgcta gtcggatgtg caacccaccc accccctcct 360 cccgcctacg ccgaagaccg gaaccggcgt cgtccctgcc tgccgtctct ggcaactgtt 420 gtgaacgccc gagcggccct cacggctctt cagttggcgc ggatcgccat ggcggacgtc 480 gcccacggcg ggacctacgc atcttcggcc ggaaggcagc cgcggtcacg aacacctagc 540 ggcagtcgag cacctgagac gaaggccgcc ggcgtcctgt cccggaaatc cgcagcccag 600 ccgtgacagc caacagtcgt ggcggttccc tcccctccta gggtctttga ctcggcgcca 660 acgcctgcga gggcgctcgt cgcggaccac ttgtcgaggt cggtgccgca cgtcaccgag 720 cgcacccttc ttcgtgctct gcgcatcggc ccggaccgcg accgcggcaa cactacgacg 780 tctgacaatg ctgatcccct gccgccgccg ttggacgacc acagttgcta cgagcatgcg 840 gagccaacca taggcatcat gcgatcgccg gagtcttcat cctattttgg gatgcgcagg 900 attaacacat ctacacattg acatccgttc cgatgtgaag taaaaattgt cacgtagggc 960 ggcaggcgaa gtctgcagct cgaacatcga agggtgggag ccgagagatc ggagacgcag 1020 acacccggag ggaacttagc ctcccggacc gatgcgtgtc ctggcaacgc ctcaagattc 1080 agcgcaagcg attcaatctt gttacttcca gaaccgaatc acgtccccgt agtgtgcggg 1140 gagagcgccc gaacgcaggg atggtatcca tgcgcccctt ctcttttcga acgagaaccg 1200 gccggtacag tcaatccgga cacattgtga cgccgttcaa cgattgttgt gctgtgaagg 1260 attcactcaa gccaactgat atcgccattc cgttgccgga acatttgacg ccttctccct 1320 acgagtagaa gccagctgga ccctctttga gcccagctcc gatgaaagga atgaggaa 1378 atg gat ggt atc cac gac aca ggc ggc atg acc gga tac gga ccg gtc 1426 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 ccc tat cag aag gac gag ccc ttc ttc cac tac gag tgg gag ggt cga 1474 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 acc ctg tcg att ctg acc tgg atg cat ctc aag ggc atg tcg tgg tgg 1522 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp 35 40 45 gac aag tcg cgg ttc ttc cgg gag tcg atg ggg aac gaa aac tac gtc 1570 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 aac gag att cgc aac tcg tac tac acc cac tgg ctg agt gcg gcg gaa 1618 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 cgt atc ctc gtc gcc gac aag atc atc acc gaa gaa gag cga aag cac 1666 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 cgc gtg cag gag atc ctc gag ggt cgg tac acg gac agg aac ccg tcg 1714 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser 100 105 110 cgg aag ttc gat ccg gcc gag atc gag aag gcg atc gag agg ctt cac 1762 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 gag ccc cac tcc cta gtg ctt cca gga gcg gag ccg agt ttc tcc ctc 1810 Glu Pro His Ser Leu Val Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 ggt gac aag gtc aaa gtg aag aac atg aac ccg ctg gga cac aca cgg 1858 Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 tgc ccg aag tat gtg cgg aac aga atc ggg gaa atc gtc acc tcc cac 1906 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Arg Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His 165 170 175 ggg tgc cag atc tat ccc gag agc agc tcc gcc ggc ctc ggc gac gat 1954 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 ccc cgc ccg ctc tac acg gtc gcg ttt tcc gcc cag gaa ctg tgg ggc 2002 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 gac gac gga aac ggg aaa gac gta gtg tgc gtc gat ctc tgg gaa ccg 2050 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 tac ctg atc tct gcg tga aaggaatacg ata gtg agc gag cac gtc aat 2099 Tyr Leu Ile Ser Ala Val Ser Glu His Val Asn 225 230 5 aag tac acg gag tac gag gca cgt acc aag gca atc gaa acc ttg ctg 2147 Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys Ala Ile Glu Thr Leu Leu 10 15 20 tac gag cga ggg ctc atc acg ccc gcc gcg gtc gac cga gtc gtt tcg 2195 Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala Val Asp Arg Val Val Ser 25 30 35 tac tac gag aac gag atc ggc ccg atg ggc ggt gcc aag gtc gtg gcc 2243 Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly Gly Ala Lys Val Val Ala 40 45 50 aag tcc tgg gtg gac cct gag tac cgc aag tgg ctc gaa gaa gac gcg 2291 Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys Trp Leu Glu Glu Asp Ala 55 60 65 70 acg gcc gcg atg gcg tca ttg ggc tat gcc ggc gag cag gca cac cag 2339 Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala Gly Glu Gln Ala His Gln 75 80 85 atc tcg gcc gtc ttc aac gac tcc caa aca cat cac gta gtg gtg tgc 2387 Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr His His Val Val Val Cys 90 95 100 act ctg tgt tcg tgc tat ccg tgg ccg gtg ctt ggc ctc ccg ccc gcc 2435 Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly Leu Pro Pro Ala 105 110 115 tgg tac aag agc atg gag tac cgg tcc cga gtg gta gca gac cct cgt 2483 Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg Val Val Ala Asp Pro Arg 120 125 130 gga gta ctc aag cgc gat ttc ggg ttc gac atc ccc gat gag gtg gag 2531 Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp Ile Pro Asp Glu Val Glu 135 140 145 150 gtc agg gtt tgg gac agc agc tcc gaa atc cgc tac atc gtc atc ccg 2579 Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile Arg Tyr Ile Val Ile Pro 155 160 165 gaa cgg ccg gcc ggc acc gac ggt tgg tcc gag gac gag ctg gcg aag 2627 Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Asp Glu Leu Ala Lys 170 175 180 ctg gtg agt cgg gac tcg atg atc ggt gtc agt aat gcg ctc aca ccg 2675 Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val Ser Asn Ala Leu Thr Pro 185 190 195 cag gaa gtg atc gta tga gtgaagacac actcactgat cggctcccgg 2723 Gln Glu Val Ile Val 200 cgactgggac cgccgcaccg ccccgcgaca atggcgagct tgtattcacc gagccttggg 2783 aagcaacggc attcggggtc gccatcgcgc tttcggatc 2822 <210> 4 <211> 229 <212> PRT <213> Rhodococcus sp. <400> 4 Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg 20 25 30 Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp 35 40 45 Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val 50 55 60 Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu 65 70 75 80 Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His 85 90 95 Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser 100 105 110 Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His 115 120 125 Glu Pro His Ser Leu Val Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu 130 135 140 Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg 145 150 155 160 Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Arg Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His 165 170 175 Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp 180 185 190 Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly 195 200 205 Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro 210 215 220 Tyr Leu Ile Ser Ala 225 <210> 5 <211> 203 <212> PRT <213> Rhodococcus sp. <400> 5 Val Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr 1 5 10 15 Lys Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala 20 25 30 Ala Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met 35 40 45 Gly Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg 50 55 60 Lys Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr 65 70 75 Ala Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln 80 85 90 95 Thr His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro 100 105 110 Val Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser 115 120 125 Arg Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe 130 135 140 Asp Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu 145 150 155 Ile Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp 160 165 170 175 Ser Glu Asp Glu Leu Ala Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly 180 185 190 Val Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val 195 200 <210> 6 <211> 2822 <212> DNA <213> Rhodococcus sp. <220> <221> CDS <222> (1094)..(2491) <223> amidase <400> 6 tgattacgaa ttcgagctcg gtacccgggg atcacttcgg ccagagggtg acggcgaaat 60 cgggcctcga tctccgcgtc cacggcgttg atacgtgtgt cgaggtcgat caccgcctgc 120 gccaattcgg cgaccagttc ggcagcgaca tcttcccccg gcaaccgcac ggtctgcgcc 180 ttcgcggcgg tgactgcggc ccgggcgatc gattcggcgt ggcgcacccc ggccccggtg 240 agcattgcgg ccagtcgggc cgccccgacg cggcggatcg ctttcggtcg ctggtagcgg 300 gccagcagca ccacccagcc ccggtccgag gagatctgcg cgacgcgttc gagtccgggg 360 cagatcgcga cgagttgctg acgcagccgg ttgatggtcc gggtacggtc ggcgaccaga 420 tcggtgcggt ggccggtgag catctgcagc tcacggatca actcgtcgtc gggacgcaga 480 acgggcaggt ccgaccgcat ccgggactga tcggcgatca cccgggcgtc gcgggcgtcg 540 gtcttggctt cgccgncgcg gtagaccgac gatgcctgcc acaccgaacg tncggacagg 600 tagcgcaccg gtttcccggc gtcggccagc acagtcagca acaaggtgac gtaggcggtg 660 gtcagatcca ccgtccacga caccgtctcg gtgagtgcgt cgatctcggt gatcaccgca 720 cggatcgttg cttcgtcgtt gtcacatcgc cgcgacagca ccaccgtccc ggaggtgtcg 780 agtacgcata tccagtggtg ttctttgccg acgtcgactc ctgcccacag ttgcgaaccg 840 gtcatcggat ttcctcgttt tcgcttgtgt tccggcctgg ccccgatgga cgcctncgcc 900 ggcatttcct taaacaagcg atcatgcgca gatctcaatc agcggtccag aggtgtccag 960 acaggtcggg tggccagtcc tttcaagccc cactcgagag tgggcaaacc ttatgcagcc 1020 tcgccggcct gcccgggtta cagctcaacg taactctcac gaagtaactg cacctacgaa 1080 cttaaggaac ctc atg tct tcg ttg act ccc ccc aat tcc aac caa atg 1129 Met Ser Ser Leu Thr Pro Pro Asn Ser Asn Gln Met 1 5 10 tcg gcc ctg aac aac cac ttc cga ttc gga ctg acg acg ccg gaa ctc 1177 Ser Ala Leu Asn Asn His Phe Arg Phe Gly Leu Thr Thr Pro Glu Leu 15 20 25 gaa gag ttc gca ccg gcc ctc gaa gcg acg ctc gcg tcc tcc gaa acc 1225 Glu Glu Phe Ala Pro Ala Leu Glu Ala Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr 30 35 40 gtc gaa cgc ctc tac gag cgc acc gcg ccc gag ccg cct cag cgg tca 1273 Val Glu Arg Leu Tyr Glu Arg Thr Ala Pro Glu Pro Pro Gln Arg Ser 45 50 55 60 tgg acc tca ccc acg gcg gac gag aac ccg ctg agc gcc tgg tac gtc 1321 Trp Thr Ser Pro Thr Ala Asp Glu Asn Pro Leu Ser Ala Trp Tyr Val 65 70 75 acc acc tcg atc agc gaa acc gac gaa ggc ccc ctc gcc ggg cga acg 1369 Thr Thr Ser Ile Ser Glu Thr Asp Glu Gly Pro Leu Ala Gly Arg Thr 80 85 90 gtc gcc gtg aaa gac aac gtc gca gtc gcc ggc gtg ccg atg atg aac 1417 Val Ala Val Lys Asp Asn Val Ala Val Ala Gly Val Pro Met Met Asn 95 100 105 ggc tcc cga acc gtc gag ggc ttc acc ccc cgc tac gac gcc acc gtc 1465 Gly Ser Arg Thr Val Glu Gly Phe Thr Pro Arg Tyr Asp Ala Thr Val 110 115 120 gta cgc cga ctg ctc gac gcc ggc gca acc atc acc ggc aaa gcg gtg 1513 Val Arg Arg Leu Leu Asp Ala Gly Ala Thr Ile Thr Gly Lys Ala Val 125 130 135 140 tgc gaa gat ctc tgc ttc tcc ggc gcc agc ttc act tcc cac ccc cag 1561 Cys Glu Asp Leu Cys Phe Ser Gly Ala Ser Phe Thr Ser His Pro Gln 145 150 155 ccg gtc cgc aac ccc tgg gac gaa agc cgc atc acc ggc ggc tcg tcc 1609 Pro Val Arg Asn Pro Trp Asp Glu Ser Arg Ile Thr Gly Gly Ser Ser 160 165 170 agc ggc agc ggc gcc ctg gtc gcc agc ggc cag gtg gat atg gca gtc 1657 Ser Gly Ser Gly Ala Leu Val Ala Ser Gly Gln Val Asp Met Ala Val 175 180 185 ggc ggc gac cag ggc ggt tcg atc cgc atc ccc gcc gcg ttc tgc ggc 1705 Gly Gly Asp Gln Gly Gly Ser Ile Arg Ile Pro Ala Ala Phe Cys Gly 190 195 200 atc gtc gga cac aaa ccc acc cac gga ctg gtc ccc tat acg gga gca 1753 Ile Val Gly His Lys Pro Thr His Gly Leu Val Pro Tyr Thr Gly Ala 205 210 215 220 ttt ccc atc gaa cga acc atc gac cac ctc ggt ccg atg acg cgc acg 1801 Phe Pro Ile Glu Arg Thr Ile Asp His Leu Gly Pro Met Thr Arg Thr 225 230 235 gtc agc gac gcc gcc gca atg ctc acc gtc ctc gcc ggc acc gac ggc 1849 Val Ser Asp Ala Ala Ala Met Leu Thr Val Leu Ala Gly Thr Asp Gly 240 245 250 ctc gat ccc cga cag acc cac cgg atc gaa ccg gtg gac tac ctc gcg 1897 Leu Asp Pro Arg Gln Thr His Arg Ile Glu Pro Val Asp Tyr Leu Ala 255 260 265 gcg ctg gcc gaa ccc gca tcg ggt ctg cgc gtg ggt gtg gtc acc gaa 1945 Ala Leu Ala Glu Pro Ala Ser Gly Leu Arg Val Gly Val Val Thr Glu 270 275 280 ggc ttc gac acc cct gtc tcc gac gct gcc gtc gac aat gcc gtg cgc 1993 Gly Phe Asp Thr Pro Val Ser Asp Ala Ala Val Asp Asn Ala Val Arg 285 290 295 300 acc gcc atc ggc gta ctg cgc tcg gcc gga ctt acc gtc gaa gag gtc 2041 Thr Ala Ile Gly Val Leu Arg Ser Ala Gly Leu Thr Val Glu Glu Val 305 310 315 tcg atc ccc tgg cac ctc gat gcg atg gcc gtc tgg aac gtg atc gac 2089 Ser Ile Pro Trp His Leu Asp Ala Met Ala Val Trp Asn Val Ile Asp 320 325 330 cgg gcc gac gac gaa ttc gaa gcc ttc ctg ctg cag gtg ctc gac gag 2137 Arg Ala Asp Asp Glu Phe Glu Ala Phe Leu Leu Gln Val Leu Asp Glu 335 340 345 aac gcc gtc acc atc ccc gaa ctc gga cag gtg cgg gcg cag acg ccg 2185 Asn Ala Val Thr Ile Pro Glu Leu Gly Gln Val Arg Ala Gln Thr Pro 350 355 360 cgc tcg tgg tgc tca cct cga acc gca ccc gcg agg tgc acg acg ccc 2233 Arg Ser Trp Cys Ser Pro Arg Thr Ala Pro Ala Arg Cys Thr Thr Pro 365 370 375 380 tca aac gcc gct gcc tgt acc act ggc tcg aac acc ccg acc tcg cgc 2281 Ser Asn Ala Ala Ala Cys Thr Thr Gly Ser Asn Thr Pro Thr Ser Arg 385 390 395 ggg aag tgg aga tcc tgc gcc gcc gca tcc cgg gca tcg acg aac acc 2329 Gly Lys Trp Arg Ser Cys Ala Ala Ala Ser Arg Ala Ser Thr Asn Thr 400 405 410 tcg cgg cgc agg tcg ccc acg ccg tgc agg cca tgc gcg gga tgg acc 2377 Ser Arg Arg Arg Ser Pro Thr Pro Cys Arg Pro Cys Ala Gly Trp Thr 415 420 425 tgc tca aac cac ccg ggg tcg cgg agt cgc tgg act ggg cac gag cgc 2425 Cys Ser Asn His Pro Gly Ser Arg Ser Arg Trp Thr Gly His Glu Arg 430 435 440 tgc ggg aac tcg acc gcg acg tgc tcg acg cga cga ccg cgg ccg cga 2473 Cys Gly Asn Ser Thr Ala Thr Cys Ser Thr Arg Arg Pro Arg Pro Arg 445 450 455 460 ccc tcg gtg ccg tcc tga agtaccggga ggacctcgac cgagtggtcc 2521 Pro Ser Val Pro Ser 465 gcaccgggct cgaccggctc ctgacggggt gacagcggcg atgacgacga ccaccgacgc 2581 cgggggttcc ctcgtcggac tcaccggctt cacccgcgcc ctcgccgcgg ccggcctgtc 2641 cgtcgcctcg gacgccaccg tggcctacct gcgcgccctg cgcgagatcg acctcggcga 2701 ccgccgtcag gtgtactggg ccgggcgcgc caccctgtgc cacgaccccg acgacatccc 2761 ccgctacgac ctcgcgttcg agagctggtt cggcggaacg gcacccgacg tgacgtcgcc 2821 g 2822 <210> 7 <211> 465 <212> PRT <213> Rhodococcus sp. <400> 7 Met Ser Ser Leu Thr Pro Pro Asn Ser Asn Gln Met Ser Ala Leu Asn 1 5 10 15 Asn His Phe Arg Phe Gly Leu Thr Thr Pro Glu Leu Glu Glu Phe Ala 20 25 30 Pro Ala Leu Glu Ala Thr Leu Ala Ser Ser Glu Thr Val Glu Arg Leu 35 40 45 Tyr Glu Arg Thr Ala Pro Glu Pro Pro Gln Arg Ser Trp Thr Ser Pro 50 55 60 Thr Ala Asp Glu Asn Pro Leu Ser Ala Trp Tyr Val Thr Thr Ser Ile 65 70 75 80 Ser Glu Thr Asp Glu Gly Pro Leu Ala Gly Arg Thr Val Ala Val Lys 85 90 95 Asp Asn Val Ala Val Ala Gly Val Pro Met Met Asn Gly Ser Arg Thr 100 105 110 Val Glu Gly Phe Thr Pro Arg Tyr Asp Ala Thr Val Val Arg Arg Leu 115 120 125 Leu Asp Ala Gly Ala Thr Ile Thr Gly Lys Ala Val Cys Glu Asp Leu 130 135 140 Cys Phe Ser Gly Ala Ser Phe Thr Ser His Pro Gln Pro Val Arg Asn 145 150 155 160 Pro Trp Asp Glu Ser Arg Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ser Gly Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Val Ala Ser Gly Gln Val Asp Met Ala Val Gly Gly Asp Gln 180 185 190 Gly Gly Ser Ile Arg Ile Pro Ala Ala Phe Cys Gly Ile Val Gly His 195 200 205 Lys Pro Thr His Gly Leu Val Pro Tyr Thr Gly Ala Phe Pro Ile Glu 210 215 220 Arg Thr Ile Asp His Leu Gly Pro Met Thr Arg Thr Val Ser Asp Ala 225 230 235 240 Ala Ala Met Leu Thr Val Leu Ala Gly Thr Asp Gly Leu Asp Pro Arg 245 250 255 Gln Thr His Arg Ile Glu Pro Val Asp Tyr Leu Ala Ala Leu Ala Glu 260 265 270 Pro Ala Ser Gly Leu Arg Val Gly Val Val Thr Glu Gly Phe Asp Thr 275 280 285 Pro Val Ser Asp Ala Ala Val Asp Asn Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly 290 295 300 Val Leu Arg Ser Ala Gly Leu Thr Val Glu Glu Val Ser Ile Pro Trp 305 310 315 320 His Leu Asp Ala Met Ala Val Trp Asn Val Ile Asp Arg Ala Asp Asp 325 330 335 Glu Phe Glu Ala Phe Leu Leu Gln Val Leu Asp Glu Asn Ala Val Thr 340 345 350 Ile Pro Glu Leu Gly Gln Val Arg Ala Gln Thr Pro Arg Ser Trp Cys 355 360 365 Ser Pro Arg Thr Ala Pro Ala Arg Cys Thr Thr Pro Ser Asn Ala Ala 370 375 380 Ala Cys Thr Thr Gly Ser Asn Thr Pro Thr Ser Arg Gly Lys Trp Arg 385 390 395 400 Ser Cys Ala Ala Ala Ser Arg Ala Ser Thr Asn Thr Ser Arg Arg Arg 405 410 415 Ser Pro Thr Pro Cys Arg Pro Cys Ala Gly Trp Thr Cys Ser Asn His 420 425 430 Pro Gly Ser Arg Ser Arg Trp Thr Gly His Glu Arg Cys Gly Asn Ser 435 440 445 Thr Ala Thr Cys Ser Thr Arg Arg Pro Arg Pro Arg Pro Ser Val Pro 450 455 460 Ser 465

Claims (61)

  1. 니트릴 화합물의 적어도 하나의 시아노기를, 미생물을 이용하여 카르복실기로 변환하여 카르복실산류를 제조하는 방법에 있어서, 시아노기를 아미드기로 변환하는 능력을 결핍 또는 감소시킨 로도코커스 속 세균의 변이주를 이용하여 니트릴 화합물을 카르복실산류로 변환하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 카르복실산류의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 로도코커스 속 세균의 변이주는, 로도코커스(Rhodococcus) 종 ATCC 39484를 모주로 하는 변이주인 것을 특징으로 하는 카르복실산류의 제조방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 로도코커스 종 ATCC 39484를 모주로 하는 변이주는, 로도코커스 종 SD826(FERM BP-7305)인 것을 특징으로 하는 카르복실산류의 제조방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 니트릴 화합물은, 분자 내에 복수의 시아노기를 갖는 폴리니트릴 화합물이고, 카르복실산류는, 시아노카르복실산류인 것을 특징으로 하는 카르복실산류의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 폴리니트릴 화합물은 방향족 폴리니트릴 화합물이고, 시아노카르복실산류는 방향족 시아노카르복실산류인 것을 특징으로 하는 카르복실산류의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 방향족 폴리니트릴 화합물은, 오르토프탈로니트릴, 이소프탈로니트릴 또는 테레프탈로니트릴이고, 방향족 시아노카르복실산류는, 오르토시아노안식향산, 메타시아노안식향산 또는 파라시아노안식향산인 것을 특징으로 하는 카르복실산류의 제조방법.
  8. 시아노기를 카르복실기로 변환하는 능력을 가지며, 동시에 시아노기를 아미드기로 변환하는 능력을 결핍 또는 감소시킨 로도코커스 속 세균의 변이주.
  9. 삭제
  10. 제 8 항에 있어서, 로도코커스 종 ATCC 39484의 변이주인 것을 특징으로 하는 로도코커스 속 세균의 변이주.
  11. 로도코커스 종 SD 826(FERM BP-7305) 균주.
  12. 삭제
  13. 삭제
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  59. 복수의 아미노기를 갖는 폴리니트릴 화합물의 적어도 하나의 시아노기를 미생물을 이용하여 적어도 하나의 카르복실기로 변환시켜 시아노 카르복실산류를 제조하는 방법에 있어서, 시아노기를 아미드기로 변환시키는 능력을 결핍 또는 감소시킨, 로도코코스 종(Rhodococcus sp.) ATCC39484를 모주로 하는 변이주를 이용하여 상기 니트릴 화합물을 상기 카르복실산류로 변환시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 시아노카르복실산류의 제조방법.
  60. 복수의 아미노기를 갖는 방향족 폴리니트릴 화합물의 적어도 하나의 시아노기를 미생물을 이용하여 적어도 하나의 카르복실기로 변환시켜 방향족 시아노 카르복실산류를 제조하는 방법에 있어서, 시아노기를 아미드기로 변환시키는 능력을 결핍 또는 감소시킨, 로도코코스 종(Rhodococcus sp.) ATCC39484를 모주로 하는 변이주를 이용하여 니트릴 화합물을 카르복실산류로 변환시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물을 이용한 방향족 시아노카르복실산류의 제조방법.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 방향족 폴리니트릴 화합물은 오르토프탈로니트릴, 이소프탈로니트릴 또는 테레프탈로니트릴이고, 방향족 시아노카르복실산류는 오르토시아노안식향산, 메타시아노안식향산 또는 파라시아노안식향산인 것을 특징으로 하는 방향족 카르복실산류의 제조방법.
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