JP4923631B2 - 12−アミノドデカン酸の製造方法及びその製造方法に使用する生体触媒 - Google Patents
12−アミノドデカン酸の製造方法及びその製造方法に使用する生体触媒 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4923631B2 JP4923631B2 JP2006057329A JP2006057329A JP4923631B2 JP 4923631 B2 JP4923631 B2 JP 4923631B2 JP 2006057329 A JP2006057329 A JP 2006057329A JP 2006057329 A JP2006057329 A JP 2006057329A JP 4923631 B2 JP4923631 B2 JP 4923631B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- microorganism
- laurolactam
- enzyme
- minutes
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
例えば、細菌に属するものは、アクロモバクター属、アエロバクラター属、アエロモナス属、アグロバクテリウム属、アルカリゲネス属、アルスロバクラター属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクテリウム属、エルウイニア属、エシェリヒア属、クレブシーラ属、スフィンゴモナス属、シュードモナス属、ミクロバクテリウム属、ミクロコッカス属、ブロタミノバクター属、ブロテウス属、クプリアビドス属、スルシナ属、アシドボラックス属、セラチア属又はキサントモナス属であり得、放線菌に属するものは、アクチノミセス属、アクチノプラネス属、ミコバクテリウム属、ロドコッカス属又はストレプトミセス属であり得、真菌に属するものは、アスペルギルス属、パエシロミセス属又はペニシリウム属であり得、酵母に属するものは、キャンディダ属、ハンゼヌラ属、ピヒア属、ロードトルラ属又はトルロプシス属であり得る。
ところ、微生物 U124は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー(MicroSeq Bacterial Full Gene Library)に対する相同性検索の結果、クプリアビドス・ネカター(Cupriavidus necator)に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は97.18%であり、微生物 U224は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー(MicroSeq Bacterial Full Gene Library)に対する相同性検索の結果、ロドコッカス・ワラティスラビエンシス(Rhodococcus wratislaviensis)に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は99.39%であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、ロドコッカス・エスピー(Rhodococcus sp.)NSA6株に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は99.5%であり、微生物 U238は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー(MicroSeq Bacterial Full Gene Library)に対する相同性検索の結果、スフィンゴモナス・カプスァタ(Sphingomonas capsulata)に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は94.20%であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、スフィンゴモナス・サバルクティカ(Sphingomonas subarctica)KFI株(基準株)に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は100%であり、微生物 T7は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー(MicroSeq Bacterial Full Gene Library)に対する相同性検索の結果、クプリアビドス・ネカター(Cupriavidus necator)に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は97.59%であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、クプリアビドス・タイワネンシス(Cupriavidus taiwanensis)LMG 19424(基準株)に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は99.7%であり、微生物 T31は、マイクロセク・バクテリアル・フル・ジーン・ライブラリー(MicroSeq Bacterial Full Gene Library)に対する相同性検索の結果、アシドボラックス・テンペランス(Acidovorax temperans)に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は99.93%であり、更に、国際塩基配列データーベースに対する相同性検索の結果、アシドボラックス・テンペランス(Acidovorax temperans)CCUG 11779(基準株)に対して、最も高い相同性を有し、その相同率は99.7%であった。
本発明の寄託された微生物のDNAは、ハイブリダイゼーション法やPCR法等を用いて取得すればよいが、これらを取得できる方法であれば如何なる方法を用いて取得してもよい。
このようにして得られた本発明遺伝子又は本発明ポリヌクレオチドは、例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載された遺伝子工学的方法に準じてベクターにクローニングすることができる。
微生物 U224のアセトンパウダーを用いるラウロラクタムの加水分解
(1)TGY液体培地の調製
ポリペプトン5g、イースト抽出物5g及び燐酸2水素カリウム(KH2PO4)4.2gを純水980mlに溶解し、水酸化ナトリウム水溶液で、pH7に調製した。なお、平板培地の場合には、寒天17gを加えた。
121℃で20分間、滅菌後、別途滅菌したD−グルコースの10%水溶液20mlを無菌的に加え、TGY液体培地1Lを調製した。
微生物 U224のスラントから白金耳を用い、菌体の一部をかき取り、バッフル付き100mlの三角フラスコ中のTGY液体培地に接種し、30℃、旋回振とう(200rpm)で、72時間培養した。
TGY液体培地200mlを加えた、バッフル付き500mlの坂口フラスコ10本に前培養の培地2mlを接種し、30℃、160rpm(往復振とう)で、60時間培養した。
培養終了後、液体培地を遠心分離(5000rpmで10分)で、集菌し、0.85%食塩水で洗菌した。洗菌後、再び、遠心分離(5000rpmで10分)で、集菌し、湿菌6.2gを得た。
1Lビーカーにアセトン0.5Lを加え、ドライアイス−メタノール浴中で、マグネッチックスターラを用いて、攪拌した。そこに、上記で得られた湿菌を純水25mlに再懸濁したものを少しづずつ加えた。その後、3分間攪拌を続けて、ヌッチェでろ過した。得られた固形物を冷アセトン及び冷エーテルで洗浄した後、デシケーター中で、一晩放置し、減圧で乾燥して、アセトン粉末を得た。粉末を回収して、冷蔵保存した。
2mlチューブに、アセトン粉末1mgをはかり取り、そこに、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)0.8ml及びラウロラクタムのトルエン溶液(1%W/V)0.2mlを加え、ボルッテクスミキサーで混合した。その後、往復振とうして(200rpm)、30℃で、20時間反応させた。
反応終了後、反応混合物を−20℃で凍結させた後、遠心濃縮器を用いて、減圧乾固した。その後,残渣にアセトニトリル1ml及びエステル化剤(ジメチルホルムアミドジメチルアセタール)0.2mlを加え、ボルテックスミキサーで激しく振とうした後、ブロックヒーターを用いて、70℃で、2時間反応させ、アミノドデカン酸メチルに転化させた。
室温まで放冷し、内部標準として、テトラデカン5mgを加えて攪拌し、その溶液1μlを採取して、ガスクロマトグラフィーを用いて、分析し、目的物である12−アミノドデカン酸の収率を決定し、収率41%が得られた。
ガスクロマトグラフィーの測定条件
装置:島津 GC−1700(昇温型)
カラム:DB−1701(30m、0.25mmID)
カラム温度:150℃(5分間)、150℃から280℃に昇温(20℃/分)及び280℃(5分間)
Inj(注入部):270
Det.(検出部):280、FID(検出器)
スプリット比: 1:10
保持時間:12.3分(アミノドデカン酸メチル)、11.3分(ラウロラクタム)、4.8分(テトラデカン:内部標準)
微生物 U124、微生物 T7及び微生物 U238のアセトンパウダーを用いるラウロラクタムの加水分解
微生物 U224の代わりに、それぞれ、微生物 U124(実施例2)、微生物 T7(実施例3)及び微生物 U238(実施例4)を用いて、実施例1と同様な操作を行い、目的物である12−アミノドデカン酸の収率を決定した。
微生物 U224を用いるラウロラクタムの加水分解
上記実施例1(1)〜(3)と同様の操作を行い、得られた湿菌体6.2gを0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)20mlに再懸濁し、休止菌体を得た。
微生物 U224由来のラウロラクタム加水分解酵素
(1)微生物 U224の大量培養
5mLのTGY培地(0.5%ポリペプトン、0.5%イースト抽出物、0.1%燐酸2水素カリウム(KH2PO4)、0.1%D-グルコース、pH 7.0)で、微生物 U224を前培養した(200rpm、30℃で12時間)培養液を500mlのTGY培地に植菌し、バッフル付き2L坂口フラスコ中で、30℃、振とう(96rpm)で、24時間培養した。大型遠心機で集菌し(5000rpmで10分間、4℃)、生理食塩水(0.9% NaCl)で洗浄した後,培地5L分の菌体を、100mLの20mM リン酸緩衝液に懸濁した。
100mLの菌体液をガラスビーズ(0.5〜0.75mm)と共に、30分間超音波処理し、無細胞抽出液とした。無細胞抽出液に、プロタミン硫酸ナトリウムを5%加え、10分間攪伴した後、大型遠心機で分離して(3000rpmで10分間、4℃)、上清を得た。
無細胞抽出液(上清)を氷中にてスターラーで撹拌しながら、30%飽和となるように粉末状硫安を少しずつ加えた。30分間撹拌した後、遠心分離した(8000rpmで10分間、4℃)。上清を氷中で撹拌しながら、60%飽和となるように粉末状硫安を加え、30分間撹拌した後、遠心分離した。同様に、90%飽和となるように粉末状硫安を加え、遠心分離した。各ステップで得られた沈殿(0〜30%画分、30〜60%画分及び60〜90%画分)を5mLの20mM KPB(リン酸緩衝液)に懸濁し、5Lの同緩衝液(x3回)にて、1晩透析を行った。
透析した30〜60%硫安分画画分の酵素の比活性は、0.12U/mgであり、全タンパク質量は、200mgであった。
20mM KPBにより平衡化したDEAE(ジエチルアミノエチル)−トヨパールゲル15mlをカラムに充填し、透析した30〜60%硫安分画画分の酵素をカラムに吸着させた。100mLの20mL KPBでカラムを洗浄した後、20mM KPB 200mL及び500mM NaCl を含む20mM KPB 200mLを用いて、グラジエントによりNaCl濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、15mLずつ試験管にフラクションを採取し、各フラクションのラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。
透析後の酵素の比活性は、0.61U/mgであり、全タンパク質量は、38.1mgであった。
上記(4)における、活性が認められたフラクション39mLに、30%飽和となるように硫安を加え、遠心分離して、上清を得た。硫安30%飽和にした、20mM KPBで平衡化したブチル−トヨパールゲル5mLに酵素液を吸着させた。硫安30%飽和にした、20mM KPBでカラムを洗浄した後、20mM KPB 30mL及び硫安30%飽和にした20mM KPB 30mLを用いて、グラジエントにより硫安濃度を徐々に下げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、3mLずつ試験管にフラクションを採取し、各フラクションのラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。透析した後、酵素液を限外ろ過にて200μLまで濃縮した。
濃縮した酵素(上清)の比活性 1.31U/mgであり、全タンパク質量は、12.8mgであった。
中圧高速液体クロマトグラフィー(FPLC、カラム:20mM KPBで平衡化したモノQ HR5/5カラム)を用いた。サンプルループに酵素液200μLを注入し、20mM KPB及び0.5mM NaClを含む20mM KPBの2つの溶媒を用いて、FPLCのグラジエントシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション(0.5mL)のラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め。1晩透析した。透析した後、酵素液を限外ろ過にて200μLまで濃縮した。
濃縮した酵素(上清)比活性は、4.67U/mgであり、全タンパク質量は、1.8mgであった。
中圧高速液体クロマトグラフィー(FPLC、カラム:150mM NaClを含む20mM KPBで平衡化したセファデックス(Sephadex)200 10/30GLカラム)を用いた。サンプルループに酵素液200μLを注入し、150mM NaClを含む20mM KPBの溶媒を用いて、FPLCのシステムにより、酵素を溶出させた。各フラクション(0.5mL)のラウロラクタム加水分解活性及びタンパク質濃度を測定した。活性が認められたフラクションを集め、1晩透析した。
微生物 T7由来のラウロラクタム加水分解酵素
微生物 U224の代わりに、微生物 T7を用いて、実施例6と同様の操作を行い、最後に、再度、中圧高速液体クロマトグラフィー(カラム:20mM KPBで平衡化したモノQ HR5/5カラム)を用いて、精製して、目的とする加水分解酵素を得た。
微生物 T31の遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素
(1)前培養
実施例18で得られた微生物 T31の遺伝子組込み大腸菌のスラントから白金耳を用い、菌体の一部をかき取り、バッフル付き1L三角フラスコ中のLB培地(Car(カルベニシリン)100μg/mL)100mLに接種し、37℃、旋回振とう(200rpm)で、16時間培養した。
バッフル付き12Lの培養器(ナルゲン製)中、10Lの Terrific Broth(アンピシリン50μg/mL)に前培養の培地100mLを接種し、37℃で、好気培養した。接種6時間後、終濃度1mMとなるようにIPTG(イソプロピルチオガラクトシド)を加え、インキュベーターの温度を30℃に設定して、さらに、12時間培養した。
培養終了後、液体培地を遠心分離(5,000rpmで10分、4℃)により、集菌し、0.85%食塩水で洗菌した。洗菌した後、再び、遠心分離(5,000rpmで10分)により、集菌し、湿菌体95.2gを得た。得られた湿菌体を超音波破砕し、遠心分離をした後、ストレプトマイシンを添加して、核酸成分を除去した。その後、30〜60%硫安分画画分を分取し、透析チューブにて、透析した後、凍結乾燥して、粉末酵素7.7gを得た。
微生物 U224Mの遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素
微生物 T31の遺伝子組込み大腸菌の代わりに、実施例23で得られた、微生物 U224Mの遺伝子組込み大腸菌を用いて、実施例8と同様に、培養及び単離を行い、湿菌体123g及び粉末酵素3.0gを得た。
微生物 T31の遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素を用いるラウロラクタムの加水分解
反応終了後、実施例1に準じて、後処理及びガスクロマトグラフィー分析を行い、トルエンを用いる溶媒系における、酵素濃度(10mg/mL)及びそれを水で10倍希釈させた酵素濃度(1mg/mL)について、それぞれ、目的物である12−アミノドデカン酸の収率62%及び17%を得た。また、DMSOを用いる溶媒系における、酵素濃度(10mg/mL)及びそれを水で10倍希釈させた酵素濃度(1mg/mL)について、それぞれ、目的物である12−アミノドデカン酸の収率67%及び15%を得た。
反応開始後、3時間及び6時間後に、反応混合物の有機相からサンプル0.1mLを分取し、メタノール0.9mLを加えて、実施例1に準じて、ガスクロマトグラフィー分析を行い、それぞれ、原料であるラウロラクタムの転化率46.4%及び74.1%を得た。
反応終了後、反応混合物をろ過し、得られた白色析出物をトルエン及び純水で洗浄・溶解させ、減圧で、溶媒を留去・乾燥させ、白色粉末として、粗12−アミノドデカン酸0.431g得た。
この白色粉末の純度は、ガスクロマトグラフィー分析により、87.4%であった(収率 86%)。
反応終了後、反応混合物の有機相からサンプル0.1mLを分取し、メタノール0.9mLを加えて、実施例1に準じて、ガスクロマトグラフィー分析を行い、原料であるラウロラクタムの転化率99.8%を得た。
又、反応混合物をろ過し、白色析出物をトルエン約5mL及び0.1Mリン酸緩衝液(pH7.0)約1mLで洗浄した。ろ液と洗浄液を合せて、水相を分離させ、反応に1回使用した酵素溶液を得た。
この反応に1回使用した酵素溶液を用いて、上記と同様の加水分解反応、後処理及びガスクロマトグラフィー分析を行い、原料であるラウロラクタムの転化率99.6%を得た。
ついで、同様にして、反応に2回使用した酵素溶液を得て、それを用いて、上記と同様の加水分解反応、後処理及びガスクロマトグラフィー分析を行い、原料であるラウロラクタムの転化率97.4%を得た。
微生物 U224Mの遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素を用いるラウロラクタムの加水分解
(1)実施例8の酵素の代わりに、微生物 U224Mの遺伝子組込み大腸菌株由来のラウロラクタム加水分解酵素(実施例9の酵素)を用いる他、実施例10(1)と同様にして、トルエンを用いる溶媒系における、酵素濃度(10mg/mL)及びそれを水で10倍希釈させた酵素濃度(1mg/mL)について、それぞれ、目的物である12−アミノドデカン酸の収率44%及び1.7%を得た。また、DMSOを用いる溶媒系における、酵素濃度(10mg/mL)及びそれを水で10倍希釈させた酵素濃度(1mg/mL)について、それぞれ、目的物である12−アミノドデカン酸の収率25%及び1.6%を得た。
微生物 T31由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM 109)への形質転換
(1)微生物 T31の染色体DNA及びプラスミドの精製
(i)微生物 T31の染色体DNAの抽出
微生物 T31をTGY培地3mLで、30℃、200rpm(振とう)で、12時間培養した。培養液1mLから菌体を遠心分離して(15,000rpmで5分間、4℃)、集菌した。STE緩衝液(NaCl 0.584g、1Mトリス−HCl(pH8.0)1mL及び0.5MEDTA(pH8.0)200μLを超純水で100mLに定量したもの)1mLで洗浄した後,同緩衝液に懸濁した。68℃で、15分間加熱した後、遠心分離し(15,000rpmで5分間、4℃)、上清を除いて、リゾチーム−RNase液(リゾチーム 5mg、10mg/mLRNase10mLを1液:グルコース0.9g、1Mトリス−HCl(pH8.0)2.5mL、0.5MEDTA(pH8.0)2mLを超純水で、100mLに定量したもの1mLで溶解したもの)300μLに懸濁した。37℃で30分間インキュベートした後、プロテイナーゼK/L 液 (プロテイナーゼK10mg/L液1mL)6μLを加え、穏やかに混合し、37℃で10分間インキュベートした。N−ラウロイルザリコシン3mgを加えて、穏やかに混合した後、37℃で3時間インキュベートし、フェノール−クロロホルム処理を穏やかに2回行った。上清300μLに5MNaCL溶液10μLとエタノール600μLを加えて混合した後、遠心分離した(15,000rpmで10分間、4℃)。70%エタノールで洗浄した後、風乾し、TE緩衝液100μLに溶解し、目的とする染色体DNAを得た。
TGY培地10mLで,30℃、200rpm(振とう)で、24時間培養した、微生物 T31菌体をディスポチューブ内で、遠心分離して(3,000rpmで10分間、4℃)、集菌した。TE緩衝液で洗浄した後、TENS溶液(50mMトリス(pH8.0)、50mMNaCl、10mM EDTA(pH8.0)、20%サッカロース)400μLに懸濁し、リゾチーム10mgを加えて、37℃で30分間インキュベートした。懸濁液に、10%SDA40μLと5N NaOH40μLを加え、10分間、氷冷し、3M 酢酸ナトリウム(pH5.0)600μLを加えて、再び10分間氷冷した。遠心分離した(15,000rpmで10分間、4℃)後、上清を2回フェノール−クロロホルムで処理し、スピッツ管中でエタノール2.7mLを加え、−80℃で30分間インキュベートして、遠心分離した(3,000rpmで10分間、4℃)。70%エタノールで洗浄した後、TE緩衝液20μLに溶解し、目的とするプラスミドを得た。
PCR反応液の組成は,水35μL、10xBlend Taq buffer 5μL、2mM dNTP 5μL、100pmol プライマー1(5'-AGAAGGAGCGCGACAGTGAGCAAGGTGGAC-3':配列番号13)1μL、100 pmolプライマー2(5'-CATCTCCCGCAAGCATCAGGCCGCTGGGATC-3':配列番号14)1μL、Template DNA2μL及びBlend Taq 1μLとした。PCR反応の条件は、(i)98.0℃で5分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)60℃で4分間及び(ii)までを24サイクルとし、(v)4℃で、連続的に続けた。増幅した微生物 T31由来の遺伝子は、アガロースゲル電気泳動により確認した。増幅した遺伝子をVIOGENE(USA)社のGel−M(登録商標)ゲル抽出キットを用いて抽出した。
遺伝子の両方の鎖についてシーケンシングを行うため、プライマー1、プライマー2、プライマー3(5'-GCGGCGGGGTTCGTTTTGCTCGGCAAA-3':配列番号15)及び、プライマー4(5'-CGAGATAAAGGCGGACTGACGCCCTTC-3':配列番号16)を用いてシーケンス反応を行った。反応液組成は、1.6μLの各プライマー、1.6μLの 16s rDNA(PCR産物)、1μLのBigDyeプレミックスソリューション、1.6μLの5xBigDye シーケンシングバッファーと2.8μLの 滅菌水とし、全量10μLとした。PCR反応の条件は、(i)96℃で2分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)60℃で4分間、(v)(ii)〜(iv)を25回及び(vi)72℃で5分間とした。
Ligationの組成は、遺伝子 5μL、pT7 Blue T-Vecter (Novagen)1μL、T4 ligase buffer 1μL、T4 ligase 1μL及び水2mLとし、16℃で一晩反応させた。大腸菌(E.coli JM 109)のコンピテントセル90μLに1μLのpT7 Blue T-Vecterを加え、ヒートショック法で形質転換を行った。80μg/mLのアンピシリンを含むLB培地 (1.0% ポリペプトン、0.5%イースト抽出物及び1.0%NaCl)に生育したコロニーを25株選別し、TLCによる活性とEcoRIとHindIII処理によるインサートの有無の確認を行った。
微生物 T7由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌(E.coli JM 109)への形質転換
微生物 T31の代わりに、微生物 T7を用いて、実施例12と同様な操作を行い、微生物 T7由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌(E.coli JM 109)への形質転換体を得た。
微生物 U124由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌(E.coli JM 109)への形質転換
微生物 T31の代わりに、微生物 U124を用いて、実施例12と同様な操作を行い、微生物 U124由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 のE.coli JM 109への形質転換体を得た。
微生物 U224由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM 109)への形質転換
微生物 T31の代わりに、微生物 U224を用いて、実施例12と同様な操作を行い、微生物 U224由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の(E.coli JM 109)への形質転換体を得た。
微生物 U238由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌(E.coli JM 109)への形質転換
微生物 T31の代わりに、微生物 U238を用いて、実施例12と同様な操作を行い、微生物 U238由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌(E.coli JM 109)への形質転換体を得た。
微生物 U224M由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子 の大腸菌(E.coli JM 109)への形質転換
センスプライマー1(5'-AAAACTAATACACCGGAGATGGGCAATCAG-3':配列番号17)、
センスプライマー2(5'-CGCACGGCAATGACGCGGCAGGTTCCGTGC-3':配列番号18)、
センスプライマー3(5'-CTTCCTCAAGGACTACTCGACGATTTGCGA-3':配列番号19)、
センスプライマー4(5'-TCTCGGGCAGTCTGCAGATGCTGGCCTTCA-3':配列番号20)、
アンチセンスプライマー1(5'-CTGATTGCCCATCTCCGGTGTATTAGTTTT-3':配列番号21)、
アンチセンスプライマー2(5'-GCACGGAACCTGCCGCGTCATTGCCGTGCG-3':配列番号22)、
アンチセンスプライマー3(5'-TCGCAAATCGTCGAGTAGTCCTTGAGGAAG-3':配列番号23)、
アンチセンスプライマー4(5'-TGAAGGCCAGCATCCGCAGACTGCCCGAGA-3':配列番号24)
とした。
微生物 T31由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM109)における発現系構築
実施例12(4)で調製した、微生物 T31由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例12(1)と同様にして得たプラスミドをTemplate DNAとした。
PCR反応液の組成は、水35μL、10x Blend Taq buffer 5μL、2mM dNTP 5μL、100 pmol/μL プライマー5(5'-ACAGCGAAGCTTTAAGGAGGAATAGACAATGAGCAAGGTGGACCTTTGG-3':配列番号26)1 μL、 100 pmol/μL プライマー6 (5'-GGAGGACGTCTAGATCAGGCCGCTGGGATC-3':配列番号27)1μL、Template DNA 100ng及びBlend Taq 5 unitとした。PCR反応の条件は、(i)98.0℃で5分間、(ii)96℃で10秒間、(iii)50℃で5秒間、(iv)60℃で4分間及び(ii)までを24サイクルとし、4℃で連続的に続けた。
PCR反応で得られた、それぞれの菌株由来のPCR産物5μLに、1μL HindIIIと1μL XbaIを加え、37℃で1時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。ライゲーション反応は、5μL DNA、1μL pUC19(増幅遺伝子と同様の制限酵素処理を行ったもの)、2μL T4 DNA ligase bufferと1μL T4 DNA ligaseとし、16℃で1晩インキュベートした。得られたベクター を、ヒートショック法により、大腸菌(E.coli JM109)に導入した。
微生物 T7由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM109)における発現系構築
実施例13で調製した、微生物 T7由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例18と同様の操作を行い、微生物 T7由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM109)における発現系を構築した。
微生物 U124由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM109)における発現系構築
実施例14で調製した、微生物 U124由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例18と同様の操作を行い、微生物 U124由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM109)における発現系を構築した。
微生物 U224由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM109)における発現系構築
実施例15で調製した、微生物 U224由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例18と同様の操作を行い、微生物 U224由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM109)における発現系を構築した。
微生物 U238由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM109)における発現系構築
実施例16で調製した、微生物 U238由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例18と同様の操作を行い、微生物 U238由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM109)における発現系を構築した。
微生物 U224M由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM109)における発現系構築
実施例17で調製した、微生物 U224M由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子組み込み大腸菌から、実施例18と同様の操作を行い、微生物 U224M由来ラウロラクタム加水分解酵素遺伝子の大腸菌(E.coli JM109)における発現系を構築した。
Claims (6)
- ラウロラクタムに、ラウロラクタムを加水分解する活性を有する、ロドコッカス sp.U224(FERM P−20419)、クプリアビドス sp.U124(FERM P−20418)、クプリアビドス sp.T7(FERM P−20416)、スフィンゴモナス sp.U238(FERM P−20420)又はアシドボラックス sp.T31(FERM P−20734)の菌体を接触させて、12−アミノドデカン酸を生成することを特徴とする、12−アミノドデカン酸の製造方法。
- ラウロラクタムに、6−アミノヘキサノアート−サイクリック−ダイマー ヒドロラーゼを接触させて、12−アミノドデカン酸を生成することを特徴とする、12−アミノドデカンの製造方法。
- ラウロラクタムに、配列番号2、4、6、8又は10のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を接触させて、12−アミノドデカン酸を生成することを特徴とする、12−アミノドデカンの製造方法。
- 疎水性溶媒及び水の二層系中で、加水分解反応を行うことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 疎水性溶媒が、芳香族炭化水素類である、請求項4記載の方法。
- 芳香族炭化水素類が、トルエン又はクロルベンゼンである、請求項5記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006057329A JP4923631B2 (ja) | 2005-03-04 | 2006-03-03 | 12−アミノドデカン酸の製造方法及びその製造方法に使用する生体触媒 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005059769 | 2005-03-04 | ||
JP2005059769 | 2005-03-04 | ||
JP2006057329A JP4923631B2 (ja) | 2005-03-04 | 2006-03-03 | 12−アミノドデカン酸の製造方法及びその製造方法に使用する生体触媒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006271378A JP2006271378A (ja) | 2006-10-12 |
JP4923631B2 true JP4923631B2 (ja) | 2012-04-25 |
Family
ID=37206720
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2006057329A Expired - Fee Related JP4923631B2 (ja) | 2005-03-04 | 2006-03-03 | 12−アミノドデカン酸の製造方法及びその製造方法に使用する生体触媒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4923631B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5370983B2 (ja) * | 2008-06-25 | 2013-12-18 | 宇部興産株式会社 | 生体触媒を用いたラクタム加水分解によるω−アミノカルボン酸の製造方法 |
WO2017074063A1 (ko) * | 2015-10-27 | 2017-05-04 | 한국생명공학연구원 | 중쇄 아미노카르복시산의 생산 방법 |
EP3375880B1 (en) | 2015-10-27 | 2019-12-25 | Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology | Method for producing heavy chain aminocarboxylic acid |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11343338A (ja) * | 1998-06-02 | 1999-12-14 | Toray Ind Inc | α,ω−アミノカルボン酸の製造方法及びラクタムの重合方法 |
-
2006
- 2006-03-03 JP JP2006057329A patent/JP4923631B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2006271378A (ja) | 2006-10-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100540991B1 (ko) | 신규한 로도코커스속 세균, 로도코커스속 세균 유래의 니트릴라아제 유전자, 니트릴 하이드라타아제 유전자 및 아미다아제 유전자, 및 이들을 이용한 카르복실산의 제조방법 | |
JP4923631B2 (ja) | 12−アミノドデカン酸の製造方法及びその製造方法に使用する生体触媒 | |
KR100323899B1 (ko) | 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질 및 이것을 코딩하는 유전자 | |
Luo et al. | Gene cloning, overexpression, and characterization of the nitrilase from Rhodococcus rhodochrous tg1-A6 in E. coli | |
CN115261342B (zh) | 一种伯克霍尔德氏菌bjq0011来源酯合成酶jfn94_18195、编码基因及其应用 | |
EP1449923B1 (en) | Novel formate dehydrogenase tolerant to halogen compounds and process for producing the same | |
JP3928676B2 (ja) | 2’−デオキシアデノシン、2’−デオキシグアノシンの製造法 | |
CN105969751B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶基因及其应用 | |
JP4272312B2 (ja) | 新規ニトリラーゼ、および2−ヒドロキシ−4−メチルチオ酪酸の製造方法 | |
CN101942427B (zh) | 一种烷基型硫酸酯酶及其制备方法 | |
EP2128258B1 (en) | Novel amidase, gene for the same, vector, transformant, and method for production of optically active carboxylic acid amide and optically active carboxylic acid by using any one of those items | |
JP3799784B2 (ja) | 2,6−ジアミノプリン−2’−デオキシリボシドおよび2’−デオキシグアノシンの製造法 | |
JP4287144B2 (ja) | 新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法 | |
JP4627039B2 (ja) | アミダーゼ活性を有するポリペプチド及びその遺伝子 | |
KR100680765B1 (ko) | 3'-아미노-2',3'-디데옥시구아노신의 제조 방법 | |
JP3992073B2 (ja) | 2’−デオキシアデノシン、2’−デオキシグアノシンの製造法 | |
JP3557271B2 (ja) | 酵素をコードするdnaとそれを含む組換えdna並びに形質転換体 | |
EP1178114A2 (en) | Heat-stable d-aminoacylase | |
JP3765758B2 (ja) | 新規なd−アミノアシラーゼをコードするdnaおよびそれを用いたd−アミノ酸の製造方法 | |
JP3829950B2 (ja) | 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ | |
WO2008047819A1 (fr) | Nouvelle ester hydrolase, gène codant pour ladite enzyme et utilisation | |
Marais et al. | Chemo-enzymatic synthesis of 2′-O-methoxyethyl ribonucleosides using a phosphodiesterase from Serratia marcescens | |
JP5740955B2 (ja) | ロドコッカス属細菌の形質転換のためのランダム遺伝子導入用ツール | |
JP4066203B2 (ja) | 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ | |
JPS59159778A (ja) | 耐熱性のロイシン脱水素酵素の製造法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081225 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110407 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110705 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110727 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110913 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110929 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120110 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120123 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150217 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4923631 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |