KR100323899B1

KR100323899B1 - 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질 및 이것을 코딩하는 유전자

Info

Publication number: KR100323899B1
Application number: KR19990008896A
Authority: KR
Inventors: 이토키요시; 쯔루오카미유키; 스즈키타다시; 니쿠마루세이야; 나카무라타케시
Original assignee: 사토 아키오; 미쯔이카가쿠 가부시기가이샤
Priority date: 1998-03-16
Filing date: 1999-03-16
Publication date: 2002-02-09
Also published as: CN1250568C; HK1021983A1; DE69935880T2; EP0943686B1; EP0943686A3; AU727092B2; DE69935880D1; AU2039799A; KR19990077942A; ID22189A; CN1235978A; JPH11253168A; ATE360698T1; EP0943686A2; US6730508B1; JP3408737B2

Abstract

본 발명은 슈도노카르디아 써모필라 JCM3095로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 니트릴히드라타제활성화 단백질 및 이것을 코딩하는 유전자서열을 제공한다. 또, 본 발명은 상기 유전자를 함유하는 재조합플라스미드, 상기 유전자와 니트릴히드라타제유전자를 함유하는 재조합플라스미드, 상기 재조합플라스미드에 의한 형질전환을 통해 얻어진 형질전환균주 및 배양액, 상기 형질전환균주를 배양해서 얻어진 균체 또는 해당 균체의 처리생성물을 이용해서 니트릴화합물로부터 대응하는 아미드화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질 및 이것을 코딩하는 유전자{PROTEIN PARTICIPATING IN ACTIVATION OF NITRILE HYDRATASE AND GENE ENCODING THE SAME}

본 발명은 슈도노카르디아 써모필라(Pseudonocardia thermophila) JCM 3095(이하, 간단히 '슈도노카르디아 써모필라'라 칭함)로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질 및 이것을 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 또, 본 발명은 상기 유전자를 함유하는 재조합플라스미드, 상기 유전자와 니트릴히드라타제유전자를 함유하는 재조합 플라스미드, 상기 재조합플라스미드에 의한 형질전환을 통해 얻어진 형질전환균주 및 형질전환균주, 해당 형질변환균주를 배양시켜 얻어진 배양액 또는 그의 처리생성물을 이용해서 니트릴화합물로부터 대응하는 아미드화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근, 각종 화합물의 니트릴기를 수화에 의해 아미드기로 변환하는 니트릴수화활성을 지니는 효소인 니트릴히드라타제 및 이 효소를 생산하는 미생물균주가 다수 개시되어 있다.

니트릴히드라타제를 이용해서 니트릴화합물로부터 아미드화합물을 공업적으로 제조하기 위해서는, 아미드화합물의 제조비를 점유하는 효소의 생산비를 저감시키는 것이 중요하며, 보다 구체적으로는, 미생물의 단위중량에 의거한 효소의 함량을 증가시킬 필요가 있다. 이것과 관련해서, 효소의 유전자를 이용하는 유전공학적인 수법에 의해 해당 효소를 다량으로 발현시키도록, 이 효소의 유전자를 클로닝하는 시도가 검토되고 있다.

본 발명자들은 니트릴히드라타제활성을 지닌 미생물로서 슈도노카르디아 써모필라를 발견하였다(일본국 공개특허 평 8-56684호 공보). 본 발명자들은, 또한 동일 균주로부터 니트릴히드라타제를 단리하여, 이 효소가 α-서브유닛과 β-서브유닛으로 이루어진 것을 확인하였다. 게다가, 본 발명자들은 동일 균주로부터 니트릴히드라타제유전자를 단리하여 그의 아미노산서열 및 유전자서열을 명확히하고, 또,E. coli (Escherichia coli, 이하, '대장균'이라 칭함)속의 유전자를 다량으로 발현시킬 수 있는 재조합플라스미드와, 이 플라스미드의 형질전환을 통해 얻어진 형질전환 대장균 균주를 성공적으로 생산하였다(유럽특허공개공보 제 0,790,310호). 그런데, 슈도노카르디아 써모필라와 관련해서, 이 균주는, 이화학연구소 미생물계통보존시설(일본국 사이타마켕 와코시 히로사와 2-1)에 JCM3095로서 기탁되어, 누구에게든지 청구에 의해 자유로이 분양되고 있다.

본 발명은 대장균내에 있어서 해당 효소를 다량으로 발현시킬 수 있는 재조합플라스미드(pPT-DB1)의 상세한 분석에 의해 명확해진 유럽특허공개공보 제 0,790,310호에 기재된 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질, 이것을 코딩하는 유전자, 이 유전자를 함유하는 재조합플라스미드, 상기 유전자와 니트릴히드라타제유전자를 함유하는 재조합플라스미드, 이 재조합플라스미드에 의한 형질전환을 통해 얻어진 형질전환균주 및 이 형질전환균주, 해당 형질전환균주의 배양을 통해 얻어진 배양액 또는 그의 처리생성물을 이용해서 니트릴화합물로부터 대응하는 아미드화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 일본국 공개특허 평 9-275978호에 기재된 MT-10822균주에 도입된 재조합플라스미드 pPT-DB1에 있어서 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 DNA단편(fragment)의 염기서열을 상세히 분석한 결과, 이하의 5가지 식견을 얻었다. 첫째로, pPT-DB1에 있어서의 DNA단편에 니트릴히트라타제구조유전자(α- 및 β- 서브유닛구조유전자)와는 다른 제 3의 개방형 판독프레임(이하 'ORF3'라 칭함)이 존재하고, 이 ORF3은 대략 15,900의 분자량을 지닌 단백질을 코딩하는 것을 발견하였다. 둘째로, pPT-DB1에 있어서 단지 α-서브유닛의 개방형 판독프레임(이하 'ORF2'라 칭함), β-서브유닛의 개방형 판독프레임(이하 'ORF1'이라 칭함) 및 ORF3만을 클로닝하는 플라스미드 pPT-D1을 생산하여, 이 플라스미드에 의한 형질전환을 통해 얻어진 형질전환 대장균이 니트릴히드라타제활성을 지니는 것을 확인하였다. 셋째로, pPT-DB1로부터 단지 ORF1 및 ORF2만을 지닌 재조합플라스미드 pPT-F1을 구축하고, 이 플라스미드에 의한 형질전환을 통해 얻어진 형질전환 대장균의 니트릴히드라타제활성을 측정한 결과, 이 대장균으로부터는 니트릴히드라타제활성이 검출되지 않은 반면, 해당 균체내에서 α- 및 β-서브유닛에 상당하는 폴리펩티드사슬의 존재가 관측되었다. 넷째로, pPT-DB1로부터 ORF3영역만 클로닝하는 플라스미드 pPT-G1이 생산되었고, 이 플라스미드에 의한 형질전환을 통해 얻어진 형질전환 대장균에서는 니트릴히드라타제활성이 관측되지 않는 것을 확인하였다. 다섯째로, lacZ프로모터, ORF1 및 ORF2를 지닌 영역을 PCR에 의해 증폭하고, 이와 같이 해서 증폭된 DNA단편을 pPT-G1의 ORF3의 3'-말단의 하류에서 재클로닝한 플라스미드 pPT-H1은 pPT-F1로부터 생산되었고, 이 플라스미드에 의한 형질전환을 통해 얻어진 형질전환 대장균의 니트릴히드라타제활성을 측정한 결과, 이 대장균에 있어서는 니트릴히드라타제활성이 검출되었다.

이들 식견으로부터, 본 발명자들은, 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제가 도입된 대장균에 대해서 상기와 동일한 활성을 발휘시키기 위해서, ORF3영역의 존재가 필수불가결하고, 또한, 상기 둘째, 셋째 및 다섯째 식견을 고려해서 ORF3의 번역산물의 존재가 필수불가결하다는 결론에 이르렀다. 더욱이, 상기 효소는 α-서브유닛과 β-서브유닛으로 구성되어 있다는 사실(유럽특허공개공보 제 0,790,310호)과, 3개의 개방형 판독프레임 ORF1∼ORF3를 지닌 최소DNA단편을 대장균내에 도입한 경우에도 재조합 대장균이 니트릴히드라타제활성을 발휘한다는 사실(상기 두번째 식견)로부터, ORF3의 번역산물이 니트릴히드라타제의 활성에 관여하고 있다라고 하는 결론을 얻었다. 즉, ORF3이 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자자리라는 결론에 도달하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은, 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질, 이것을 코딩하는 유전자, 이 유전자를 함유하는 재조합플라스미드, 이 재조합플라스미드에 의한 형질전환을 통해 얻어진 형질전환균주 및 이 형질전환균주, 해당 형질전환균주의 배양을 통해 얻어진 배양액 또는 그의 처리생성물을 이용해서 니트릴화합물로부터 대응하는 아미드화합물을 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

도 1은 플라스미드 pPT-DB1의 제한효소절단점지도

도 2는 플라스미드 pPT-D1의 제한효소절단점지도

도 3은 플라스미드 pPT-E1의 제한효소절단점지도

도 4는 플라스미드 pPT-F1의 제한효소절단점지도

도 5는 플라스미드 pPT-G1의 제한효소절단점지도

도 6은 플라스미드 pPT-H1의 제한효소절단점지도

＜도면의 주요부분에 대한 부호의 간단한 설명＞

bla: β-락타마제를 코딩하는 유전자

ColE1-Ori: ColE1계 복제개시부위

lacZ: pUC18로부터 유래된 락토스오페론의 프로모터 및 오퍼레이터 영역

NHα: 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 α-서브유닛을 코딩하는 유전자

NHβ: 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 β-서브유닛을 코딩하는 유전자

P16: 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자

P16(부분): 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 부분영역

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서 슈도노카르디아 써모필라 JCM3095로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질(이하, 간단히 '니트릴히드라타제활성화 단백질'이라 칭함)이란, 전술한 발명이 이루고자 하는 과제란 및 후술하는 각종 예에 있어서 언급한 바와 같이, 그 발현의 유무가 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 직접 영향을 미치는 단백질이다.

본 발명에 있어서의 니트릴히드라타제활성화 단백질의 대표적인 예로서는, 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 단백질을 들 수 있다. 최근의 분자생물학 및 유전공학의 발전에 의해, 이 니트릴히드라타제활성화 단백질의 분자생물특성 및 아미노산서열을 직접 참조함으로써 슈도노카르디아 써모필라와는 전혀 다른 미생물균주로부터 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴 히드라타제활성화 단백질과 동일한 기능을 지닌 단백질을 비교적 용이하게 얻는 것이 가능해졌다. 이러한 기술 상황에 비추어, 슈도노카르디아 써모필라이외의 미생물균주로부터 유래되었지만, 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질은 본 발명에 포함되는 것으로 한다. 이러한 미생물균주의 바람직한 예로서는, 노카르디아(Nocardia)속, 코리네박테리움(Corynebacterim)속, 바실러스(Bacillus)속, 호열성 바실러스(thermophilicBacillus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 로도크로우스(rhodochrous)종으로 대표되는 로도코커스(Rhodococcus)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 크산토박터(Xanthobacter)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 리조비움(Rhizobium)속, 클레브시엘라(Klebsiella)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 에르위니아(Erwinia)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 시트로박터(Citrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속 또는 슈도노카르디아 써모필라 JCM3095균주이외의 슈도노카르디아(Pseudonocardia)속에 속하는 균주를 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 니트릴히드라타제 활성화 단백질의 대표적인 예로서는, 서열목록의 서열번호 1로 표시된 아미노산서열로 이루어진 단백질을 들 수 있다. 또, 주형과 동일한 염기서열의 유전자를 이용해서 전사 및 번역을 행한 경우에도, 소정기능을 유지하면서 서열목록의 N-말단 근방에 있어서 1개 이상의 아미노산이 결실되거나, N-말단에 1개이상의 아미노산이 새롭게 부가된 부분변이단백질은, 해당 유전자를 도입한 숙주의 종류, 배양에 사용된 영양배지의 성분 혹은 조성, 배양 온도 또는 pH에 따라 숙주내 효소에 의한 번역후의 변형(modification)을 통해 생산될 경우도 있다. 또한, 재조합 DNA기술의 진보에 의해, 해당 단백질의 기능을 실질적으로 변화시키는 일없이, 해당 단백질을 구성하는 1개이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나, 해당 단백질을 구성하는 1개이상의 아미노산을 결실 혹은 절제하거나, 또는 아미노산을 해당 단백질에 삽입하는 것이 가능해졌다. 이러한 기술 상황에 비추어, 본 발명에 관련된 니트릴히드라타제활성화 단백질이란, (1) 서열목록의 서열번호 1로 표시된 아미노산서열을 지닌 단백질뿐만 아니라, 1개이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환, 결실 혹은 절제하거나, 또는 1개이상의 아미노산을 삽입한 아미노산서열을 지니는 부분변이단백질과, (2) 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 부분변이단백질도 포함되는 것으로 한다.

즉, 본 발명에 있어서의 단백질의 대표적인 예는, 서열목록의 서열번호 1로 표시된 144개의 아미노산의 서열로 이루어진 니트릴히드라타제활성화 단백질이다. 또한, 본 발명에 있어서는, 서열목록의 서열번호 1로 표시된 아미노산서열의 일부를 치환, 결실, 절제 또는 삽입에 의해 변형시켜 얻어진 부분변이단백질은, 슈도노카르디아 써모필터라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 한 본 발명에 포함되는 것으로 한다.

본 발명에 있어서의 니트릴히드라타제활성화 단백질의 대표적인 예로서는, 서열목록의 서열번호 1로 표시된 아미노산서열로 이루어진, 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 단백질을 들 수 있다. 최근의 유전공학의 진보에 의해, 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제활성화 단백질의 아미노산서열을 직접 참조함으로써 슈도노카르디아 써모필라와는 상당히 다른 미생물균주로부터 이 단백질과 동일한 기능을 지닌 단백질을 비교적 용이하게 얻는 것이 가능해졌다. 이러한 기술 상황에 비추어, 슈도노카르디아 써모필라이외의 미생물균주로부터 유래된, 서열목록의 서열번호 1로 표시된 아미노산서열을 지닌 단백질, 또는 (1) 1개 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나, 결실 혹은 절제하거나, 또는 1개이상의 아미노산을 삽입한 아미노산서열을 지니고, (2) 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질도, 본 발명에 포함되는 것으로 한다. 이러한 미생물균주의 바람직한 예로서는, 노카르디아속, 코리네박테리아움속, 바실러스속, 고온성 바실러스속, 슈도모나스속, 미크로코커스속, 로도크로우스종으로 대표되는 로도코커스속, 아시네토박터속, 크산토박터속, 스트렙토마이세스속, 리조비움속, 클레브시엘라속, 엔테로박터속, 에르위니아속, 아에로모나스속, 시트로박터속, 아크로모박터속, 아그로박테리움속 또는 슈도노카르디아 써모필라 JCM3095균주이외의 슈도노카르디아속에 속하는 규주를 들 수 있다.

본 발명에 있어서는, 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자의 서열이 포함된다. 본 발명의 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자란, 본 발명의 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자인 한 특히 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서는, 서열목록의 서열번호 1로 표시된 144개의 아미노산의 서열을 코딩하는 염기서열은, 본 발명의 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자의 범위에 포함되는 것으로 한다. 또, 본 발명에 있어서는, 서열목록의 서열번호 1로 표시된 아미노산서열의 일부를 치환, 결실 혹은 절제하거나 또는 아미노산을 삽입해서 얻어진 부분변이단백질이 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여할 경우, 이 부분변이단백질의 아미노산서열을 코딩하는 염기서열도 본 발명의 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자의 범위에 포함되는 것으로 한다.

본 발명의 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자의 대표적인 예로서는, 서열목록의 서열번호 2로 표시된 1328번째 내지 1762번째 염기의 염기서열을 들 수 있다. 또, 제조합 DNA기술의 진보에 의해, 해당 단백질의 아미노산 서열을 실질적으로 변화시키는 일없이 번역시의 주형으로서의 DNA의 염기서열을 비교적 용이하게 다른 염기서열로 치환시킬 수 있다. 또한, 번역시의 주형으로서 DNA의 염기서열을 치환, 결실, 절제 또는 삽입처리함으로써 단백질의 기능을 실질적으로 변화시키는 일없이 단백질을 구성하는 1개이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나, 결실 혹은 절제하거나, 또는 1개이상의 아미노산을 삽입하는 것도 가능해졌다. 이러한 기술적 상황에 비추어, 본 발명의 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자란, 서열목록의 서열번호 2로 표시된 1328번째 내지 1762번째 염기의 염기서열뿐만 아니라, DNA염기서열의 1개이상의 염기를 다른 염기로 치환하거나, 결실 혹은 절제하거나, 또는 1개이상의 염기를 삽입한 부분변이서열도, 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질의 주형으로서 작용하는 한 본 발명에 포함되는 것으로 한다.

즉, 본 발명은, 서열목록의 서열번호 2로 표시된 1328번째 내지 1762번째 염기의 염기서열로 이루어진, 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고 있다. 또, 서열목록의 서열번호 2로 표시된 1328번째 내지 1762번째 염기의 염기서열의 일부를 치환, 결실 혹은 절제함으로써 얻어지거나, 또는 상기 염기서열에 염기를 삽입함으로써 얻어진 염기서열을 지닌 유전자에 있어서는, 이 유전자에 의해 코딩된 단백질이 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 한 본 발명의 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자에 포함되는 것으로 한다.

본 발명에 있어서는, 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 재조합플라스미드를 구축하는 것이 포함된다. 구체적으로는, 이것은, 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자가 해당 유전자의 발현에 필요한 제어영역 및 자율복제에 필요한 영역을 지닌 플라스미드벡터에 삽입된 플라스미드이다.

발현에 필요한 제어영역이란, 프로모터서열(전사를 제어하는 오퍼레이터서열을 포함함), 리보솜결합서열(SD서열) 및 전사종결서열을 말한다. 프로모터서열의 구체예로는, 대장균으로부터 유래된 트립토판오페론의 trp프로모터와 락토스오페론의 lac프로모터, λ상으로부터 유래된 P_L프로모터와 P_R프로모터 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래된 글루콘산합성효소프로모터(gnt), 알칼리프로테아제프로모터(apr), 중성프로테아제프로모터(npr) 그리고 α-아밀라제프로모터(amy)를 들 수 있다. 또한, tac프로모터처럼 독립적으로 변형·설계된 서열도 사용할 수 있다. 리포솜결합서열로서는, 본 발명에 있어서의 슈도노카르디아의 고유서열 또는 대장균 또는 바실러스 서브틸리스로부터 유래된 서열을 들 수 있으며, 대장균 또는 바실러스 서브틸리스 등의 소망의 숙주내에서 기능하는 서열인 한 특히 한정되지 않는다. 예를 들면, 16S 리보솜 RNA의 3'-말단영역에 상보적인 서열로서, 적어도 4개의 염기가 연속된 연속(consensus)서열을, DNA합성을 통해 제조해서 사용해도 된다. 전사종결서열은 반드시 필요한 것은 아니고, ρ-인자비의존성 서열, 예를 들면 리포프로테인터미네이터 또는 trp오페론터미네이터를 사용할 수 있다. 제어영역의 재조합플라스미드에서의 서열의 순서에 관해서는, 5'-말단상류쪽으로부터 프로모터서열, 리보솜결합서열, 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자 및 전사종결서열이 차례로 배열되어 있는 것이 적당하다.

플라스미드벡터의 구체예로서는, 대장균중에서 자율복제가능한 영역을 지닌 pBR322, pUC18, 블루스크립트 II SK(+), pKK223-3 및 pSC101, 그리고, 바실러스 서브틸리스에 있어서 자율복제가능한 영역을 지닌 pUB110, pTZ4, pC194, ρ11, ø1 및 ø105를 들 수 있다. 또, 2종이상의 숙주에 있어서 자율복제가능한 플라스미드벡터의 예로서는 pHV14, TRp7, YEp7 및 pBS7을 들 수 있다.

본 발명에 있어서는, 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자와 니트릴히드라타제유전자의 양 유전자가 동시에 삽입된 재조합플라스미드를 구축하는 것이 포함한다. 즉, 이것은, 이들 양 유전자를 해당 양 유전자의 발현에 필요한 제어영역과 자율복제에 필요한 영역을 포함하는 플라스미드벡터에 삽입함으로써 얻어진 재조합플라스미드이다. 또, 이것은, 임의의 숙주에 도입되어 있을 때, 효소의 생산 및 활성화를 가능하게 하는 재조합플라스미드이다. 구체적으로는, 발현에 필요한 제어영역과 자율복제에 필요한 영역을 포함하는 상기 플라스미드벡터를 선택하면 된다. 또한, 니트릴히드라타제 활성화 단백질을 코딩하는 유전자와, 니트릴히드라타제의 α-서브유닛유전자 및 β-서브유닛유전자는, 이러한 제어영역을 지닌 독립된 시스트론으로서, 또는 공동의 제어영역을 지닌 폴리시스트론으로서 발현되고 있어도 된다.

본 발명의 니트릴히드라타제유전자의 대표적인 예로서는, 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제를 들 수 있다. 구체적으로는, 서열목록의 서열번호 2로 표시된 714번째 내지 1331번째 염기의 염기서열로 표현된 α-서브유닛을 코딩하는 유전자 및 서열목록의 서열번호 2로 표시된 16번째 내지 717번째 염기의 염기서열로 표현된 β-서브유닛을 코딩하는 유전자를 들 수 있다. 즉, 이것은, 기본적으로, α-서브유닛이 618개의 염기의 염기서열로 이루어지고, β-서브유닛이 702개의 염기의 염기서열로 이루어진 니트릴히드라타제이지만, 재조합 DNA기술의 진보에 의해, 해당 효소의 아미노산서열을 실질적으로 변화시키는 일없이 번역시의 주형으로서의 DNA의 염기서열을 다른 염기서열로 비교적 용이하게 치환하거나, 번역시의 주형으로서의 DNA의 염기서열을 치환, 결실 혹은 절제하거나, 또는 해당 염기서열에 염기를 삽입함으로써, 효소의 활성을 실질적으로 변화시키는 일없이 효소를 구성하는 1개이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나, 결실 혹은 절제하거나, 또는 1개이상의 아미노산을 삽입하는 것이 가능해졌다. 이러한 기술 상황에 비추어, 본 발명에 관한 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제유전자에는, 서열목록의 서열번호 2로 표시된 714번째 내지 1331번째 염기의 염기서열로 표현된 α-서브유닛과 서열목록의 서열번호 2로 표시된 16번째 내지 717번째염기의 염기서열로 표현된 β-서브유닛을 지닌 유전자뿐만 아니라, 니트릴히드라타제활성을 지닌 단백질의 주형으로서 작용할 수 있는 한 DNA염기서열의 1개이상의 염기가 다른 염기로 치환되거나, 결실 혹은 절제되거나, 또는 1개이상의 염기가 삽입된 부분변이서열의 유전자도 포함된다.

구체적으로는, 유럽특허공개공보 제 0,790,310호에 기재된 바와 같이, 서열목록의 서열번호 2로 표시되는 729번째 내지 731번째 염기, 768번째 내지 770번째 염기, 825번째 내지 827번째 염기, 942번째 내지 944번째 염기, 981번째 내지 983번째 염기, 1017번째 내지 1019번째 염기, 1029번째 내지 1031번째 염기, 1089번째 내지 1091번째 염기, 1101번째 내지 1103번째 염기, 1137번째 내지 1139번째 염기, 1149번째 내지 1151번째 염기, 1272번째 내지 1274번째 염기, 1293번째 내지 1295번째 염기 및 1320번째 내지 1322번째 염기의 1개이상의 염기서열을 다른 염기서열로 치환함으로써 얻어진 염기서열로 표현되는 α-서브유닛유전자를 구성성분으로서 지니고 있는 니트릴히드라타제유전자를 들 수 있다.

즉, 본 발명에 있어서는, 6번째, 19번째, 38번째, 77번째, 90번째, 102번째, 106번째, 126번째, 130번째, 142번째, 146번째, 187번째, 194번째 및 203번째의 1개이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 얻어진 α-서브유닛을 구성성분으로서 지니고 있는 니트릴히드라타제를 코딩하는 유전자가 포함된다.

마찬가지로, 서열목록의 서열번호 2로 표시된 73번째 내지 75번째 염기, 76번째 내지 78번째 염기, 337번째 내지 339번째 염기, 613번째 내지 615번째 염기 및 649번째 내지 651번째 염기의 1개이상의 염기서열을 다른 염기서열로 치환함으로써 얻어진 염기서열로 표현되는 β-서브유닛유전자를 구성성분으로서 지니고 있는 니트릴히드라타제유전자도 들 수 있다.

즉, 본 발명에 있어서는, β-서브유닛의 20번째, 21번째, 108번째, 200번째 및 212번째 아미노산의 1개이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 얻어진 β-서브유닛을 구성성분으로서 지니고 있는, 니트릴히드라타제를 코딩하는 유전자가 포함된다.

본 발명에 있어서의 니트릴히드라타제 유전자는, 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 유전자로 특히 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 니트릴히드라타제활성화 단백질에 의해 활성화될 수 있는 한 기타 미생물균주로부터 유래된 니트릴히드라타제 유전자도 포함된다. 이러한 미생물균주의 바람직한 예로서는, 노카르디아속, 코리네박테리움속, 바실러스속, 호열성 바실러스속, 슈도모나스속, 미크로코커스속, 로도크로우스종으로 대표되는 로도코커스속, 아시네토박터속, 크산토박터속, 스트렙토마이세스속, 리조비움속, 클레브시엘라속, 엔테로박터속, 에르위니아속, 아에로모나스속, 시트로박터속, 아크로모박터속, 아그로박테리움속 또는 슈도노카르디아 써모필라 JCM3095균주이외의 슈도노카르디아속에 속하는 균주를 들 수 있다.

본 발명에 있어서는, 전술한 재조합플라스미드를 임의의 미생물숙주에 도입함으로써 형질전환체를 얻는 것이 포함한다. 이 때, 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자와 니트릴히드라제의 α-서브유닛유전자 및 β-서브유닛유전자가 동일 플라스미드벡터에 존재하는 재조합플라스미드를 사용해도 되고, 또는, 상기 각각의 유전자가 각각의 독립의 플라스미드벡터에 존재하는 복수의 재조합플라스미드를 동시에 형질도입해도 된다. 또, 여기서 말하는 임의의 숙주의 대표적인 예로서는, 대장균을 들 수 있으나, 대장균으로 특히 한정되지 않고, 바실러스 서브틸리스와 같은 바실러스속이나, 효모, 악티노마이세스와 같은 기타 미생물균주도 포함된다. 예를 들면, MT-10822(이 균주는 1996년 2월 7일자 일본법규정하에 일본국 이바라키켕 쯔쿠바시 히가시 1쪼메 1반 3고에 있는 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 수탁번호 FERM P-15426으로서 수탁된 후, 1997년 1월 10일 부타페스트조약하의 국제기탁소로 이관되어 기탁번호 FERM BP-5785로 기탁되어 있음)가 있다.

또, 외래 유전자의 발현에 필요한 영역을 지닌 플라스미드백터에 본 발명의 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자 및 또는 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제유전자를 삽입함으로써 본 발명의 재조합플라스미드를 구축하는 방법에 관해서는, 'Molecular Cloning 2nd Edition'(T. Maniatis et al.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같이 유전공학분야에서 공지된 일반적인 방법을 참조함으로써 상기 재조합플라스미드를 소망의 숙주로 형질전환시켜도 된다.

본 발명에 있어서는, 니트릴히드라타제활성화 단백질을 코딩하는 유전자와 니트릴히드라타제유전자를 동시에 임의의 숙주에 도입하는 공정과, 얻어진 형질전환체를 통상의 영양배지에서 배양해서 효소를 생산하는 공정과, 이 효소를 생산하는 형질전환균주, 이 형질전환균주의 배양액, 이 형질전환균주의 배양액으로부터 얻어진 형질전환균체 또는 이 형질전환균체의 처리생성물을 제조하는 공정과, 이들중 어느 하나를 수성매체중에서 니트릴화합물과 접촉시키는 공정으로 이루어진, 니트릴화합물로부터 대응하는 아미드화합물을 제조하는 방법이 포함된다. 상기 형질전환균주는, 분자생물학, 생물공학 및 유전공학분야에서 공지된 통상의 방법을 이용해서 제조하면 된다. 예를 들면, LB배지 또는 M9배지 등의 통상의 액체배지 (바람직하게는, 이러한 배지성분에 Fe이온과 Co이온이 0.1㎍/㎖이상의 양으로 존재하는 것이 바람직함)에, 상기 형질전환균주를 접종하여 적절한 배양온도(일반적으로 20℃ 내지 50℃)에서 생육시키는 것이 바람직하다. 또한, 배양액 자체, 배양액으로부터 원심분리를 통해 분리·회수하여 얻어진 형질전환균체 및 이 형질전환균체의 처리생성물도 사용할 수 있다. 여기서 말하는 형질전환균체의 처리생성물이란, 균체의 추출물, 분쇄물, 상기 추출물이나 분쇄물의 니트릴히드라타제활성화 분획을 분리·정제해서 얻어진 생성물, 또는 적절한 담체(carrier)를 이용해서 상기 형질전환균체, 추출물, 분쇄물 혹은 상기 생성물을 고정시켜 얻어진 고정화물을 의미한다. 상기 대응하는 아미드화합물을 제조할 경우의 니트릴화합물은, 본 발명의 니트릴히드라타제가 기질로서 작용할 수 있는 한 특히 한정되지 않지만, 그의 바람직한 대표적인 예로서는, 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, n-부티로니트릴, 이소부티로니트릴, 크로토노니트릴, α-하이드록시이소부티로니트릴, 에틸렌시아노히드린, 푸마로니트릴, 말로노니트릴, 벤조니트릴, 만델로니트릴, 시아노피라진 및 3-시아노피리딘 등의 니트릴화합물을 들 수 있다. 수성매체중의 니트릴화합물의 농도는 특히 한정되지 않는다. 또 반응온도도 특히 한정되지 않지만, 니트릴히드라타제가 활성을 잃게 되지 않는 온도범위가 바람직하며, 보다 바람직하게는 0℃ 내지 50℃이다.

실시예

이하, 본 발명을 다음의 각종 실시예를 참조해서 상세히 설명하나, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 및 비교예에 있어서의 HPLC분석에서는, 칼럼으로서 닛뽄분코사의 파인팍(Finepak) SIL C18-5(250 ×4.6mm(직경))을 사용하고, 용리액으로서는 아세토니트릴 4체적%를 함유하는 10mM인산수용액을 사용하였다. 또, 아크릴아미드, 아크릴로니트릴 및 아크릴산은 210nm의 흡광도에서 검출되었다.

실시예 1

MT-10822균주의 삽입단편의 분석(1)

배플이 끼워맞춤된 3개의 목이 달린 500㎖ 플라스크에 이하의 조성을 지니는 배지 100㎖를 넣고, 121℃에서 20분간 고온고압멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가하고, MT-10822균주(FERM BP-5785) 1루프(loopful)를 접종하고, 37℃, 130rpm에서 16시간 배양하였다. 배양액으로부터 15,000G에서 15분간 원심분리를 통해 균체만을 분리한 후, 이 균체를 생리식염수 50㎖중에 재현탁시킨 후, 재원심분리를 통해 습균체를 얻었다.

배지조성:

효모추출액 5.0g/ℓ

폴리펩톤 10.0g/ℓ

NaCl 5.0g/ℓ

염화코발트 6수화물 10.0mg/ℓ

황산제1철 7수화물 40.0mg/lℓ

pH 7.5

상기 습균체로부터 알칼리SDS추출법에 의해 pPT-DB1(도1)의 플라스미드DNA를 제조하고, ABI사 제품인 오토시퀀서 373A 및 시퀀싱키트를 이용해서 프라이머연신법에 의해 삽입단편의 전체염기서열을 결정하였다. 그 결과, 삽입단편중에 705bp, 621bp 및 435bp의 염기서열을 지닌 개방형 판독프레임(각각 ORF1, ORF2 및 ORF3라 칭함)이 5'-말단쪽으로부터 이 순서로 관찰되었다. 또, 이들 프레임의 전사방향도 완전히 일치하였다. 번역정지코돈을 포함한 ORF1에 있어서의 3'-말단에 가장 가까운 쪽의 4개의 염기가 ORF2에 있어서의 5'-말단에 가장 가까운 쪽의 4개의 염기와 중복되었다. 마찬가지로, 번역정지코돈을 포함한 ORF2에 있어서의 3'-말단에 가장 가까운 쪽의 4개의 염기가 ORF3에 있어서의 5'-말단에 가장 가까운 쪽의 4개의 염기와 중복되었다. 이미 일본국 공개특허 평 9-275978호 공보에 개시되어 있는 바와 같이, ORF1은 니트릴히드라타제의 β-서브유닛유전자이고, ORF2는 니트릴히드라타제의 α-서브유닛유전자이다.

다음에, ORF1에서부터 ORF3까지의 전체영역을 재클로닝하기 위해서, pPT-DB1플라스미드DNA를 주형으로서 이용해서 PCR을 실시하였다.

pPT-DB1플라스미드DNA 1㎍을 주형으로서 이용해서 서열목록의 서열번호 3으로 표시된 프라이머 100pmol, 서열목록의 서열번호 4로 표시된 프라이머 100pmol 및 Taq DNA폴리메라제 5U를 함유한 총량 100㎕인 계내에서, 98℃에서 15초간의 열변성, 55℃에서 30초간의 어닐링 및 72℃에서 120초간의 신장으로 구성된 처리를 25회 반복하였다. PCR반응액 10㎕를 이용한 아가로스전기영동(시그마사 제품인 VII형 저융점아가로스; 아가로스농도 0.8중량%를 이용)을 통해 상기 증폭된 DNA생성물의 분석을 행하였다. 그 결과, 대략 1.8kbp의 증폭된 DNA생성물의 존재가 확인되었다. 이어서, 아가로스겔로부터 대략 1.8kbp의 DNA단편만을 절단하고, 아가로스부분의 대략 0.1g을 미세하게 분쇄하여 TE용액 1㎖중에 현탁시켰다. 이 현탁액을 55℃에서 1시간 유지하여 아가로스를 완전히 융해시켰다. 이 융해물에 대해서 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 실시하였다. 먼저, TE(1mM EDTA·2Na를 함유하는 10mM 트리스염화수소수용액; pH8.0)로 포화된 페놀 1㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 부드럽게 교반하고, 3,000rpm에서 10분간의 원심분리를 통해 수상과 유기상으로 분리하여, 수상만을 회수하였다. 이 절차를 3회 반복하였다. 다음에, 얻어진 수상에 TE-포화페놀액 0.4㎖와 클로로포름 0.4㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 부드럽게 재교반하였다. 이어서, 3,000rpm에서 10분간의 원심분리를 통해 수상과 유기상으로 재분리하여, 수상만을 회수하였다. 이 수상에 클로로포름 0.8㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 부드럽게 재교반하였다. 다음에, 3,000rpm에서 10분간의 원심분리를 통해 수상과 유기상으로 재분리하여, 수상만을 회수하였다. 이 수상에 1.1M NaCl 을 함유한 TE용액 80㎕와 에탄올 1.7㎖를 첨가하고, 이 혼합물을 -80℃에서 30분간 정치한 후, 4℃, 15,000rpm에서 20분간의 원심분리를 통해 DNA단편의 침전을 회수하였다. 이 DNA단편을 공기중에서 건조시킨 후, 최종적으로 TE 10㎕에 용해시켰다. 정제된 대략 1.8kbp의 증폭된 DNA단편을 제한효소(restriction endonuclease) EcoRI 및 SphI에 의해 절단하였다. 이 제한효소처리액에 대해서 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 행하여 DNA단편을 재차 정제하였다. 최종적으로, 이 단편을 TE 10㎕에 용해시켰다. 마찬가지로, pUC18벡터상의 유일한 제한효소부위에 있는 EcoRI 및 SphI에 의해 동 벡터를 절단하고, 아가로스겔전기영동(시그마사 제품인 VII형 저융점아가로스; 아가로스농도 0.7%를 이용)을 행하여, 이 아가로스겔로부터 대략 2.7kbp의 DNA단편만을 절단하고, 절단된 아가로스부분(대략 0.1g)을 미세하게 분쇄하고, TE용액 1㎖에 현탁시켰다. 다음에, 이 현탁액을 55℃에서 1시간 유지하여 아가로스를 완전히 용해시켰다. 이 용해물에 대해서 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 실시하여 DNA단편을 정제하였다. 최종적으로, 이 단편을 TE 10㎕에 용해시키고, 이와 같이 해서 증폭된 DNA생성물을 DNA라이게이션키트(타카라슈조사 제품)를 이용해서 pUC18단편에 연결하여 플라스미드 pPT-D1(도2)을 구축하였다. 또, 구축된 pPT-D1의 EcoRI부위 및 SphI부위사이의 삽입단편의 전체염기서열은 서열목록의 서열번호 2로 표시되어 있다.

토요보사제품인 대장균 HB101의 컴피턴트셀(competent cell)을 이용해서 HB101균주내로 pPT-D1을 도입하여 형질전환균주 No.1을 얻었다. 배플이 끼워맞춤된 3개의 목이 달린 500㎖ 플라스크에 전술한 조성을 지니는 LB액체배지를 넣고, 121℃에서 20분간 고온고압멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가한 후, 상기 얻어진 형질전환균주 No.1을 1루프 접종하고, 37℃, 130rpm에서 대략 20시간 배양하였다. 배양액으로부터 5,000G에서 15분간 원심분리를 통해 균체만을 분리한 후, 이 균체를 생리식염수 50㎖중에 재현탁시키고, 재원심분리를 통해 습균체를 얻었다. 상기 습균체 100mg을 50mM 인산칼륨수용액(pH 7.0) 200㎖에 현탁시키고, 이 현탁액에 아크릴로니트릴 10㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 부드럽게 교반하면서 10℃에서 1시간 반응시켰다. 반응종료후, 이 반응액을 실시예 1에서와 마찬가지로 HPLC를 통해 분석한 바, 이 반응액중에는 아크릴아미드만 존재하고, 아크릴로니트릴과 아크릴산은 관측되지 않았다. 즉, 전화율 및 선택률은 100%였다.

비교예 1

MT-10822균주의 삽입단편의 분석(2)

ORF1영역에서부터 ORF3의 상부절반영역까지를 재클로닝하기 위해서, pPT-DB1플라스미드DNA를 주형으로서 이용해서 PCR을 실시하였다.

실시예 1에서 제조한 pPT-DB1플라스미드DNA 1㎍을 주형으로서 이용해서 서열목록의 서열번호 3으로 표시된 프라이머 100pmol, 서열목록의 서열번호 5로 표시된 프라이머 100pmol 및 Taq DNA폴리메라제 5U를 함유한 총량 100㎕인 계내에서, 98℃에서 15초간의 열변성, 55℃에서 30초간의 어닐링 및 72℃에서 120초간의 신장으로 구성된 처리를 25회 반복하였다. PCR반응액 10㎕를 이용한 아가로스전기영동(시그마사 제품인 VII형 저융점아가로스; 아가로스농도 0.9중량%를 이용)을 통해 증폭된 DNA생성물의 분석을 행하였다. 그 결과, 대략 1.6kbp의 증폭된 DNA생성물의 존재가 확인되었다. 이어서, 아가로스겔로부터 대략 1.6kbp의 DNA단편만을 절단하고, 아가로스부분의 대략 0.1g을 미세하게 분쇄하여 TE용액 1㎖중에 현탁시켰다. 이 현탁액을 55℃에서 1시간 유지하여 아가로스를 완전히 융해시켰다. 이 융해물에 대해서 실시예 1에서와 마찬가지로 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 실시하여 상기 증폭된 DNA단편을 정제하였다. 정제된 대략 1.6kbp의 증폭된 DNA단편을 제한효소 EcoRI 및 SphI에 의해 절단하였다. 이 제한효소처리액에 대해서 실시예 1에서와 마찬가지로 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 행하여 DNA단편을 재차 정제하고, 최종적으로, 이 단편을 TE 10㎕에 용해시켰다. 이와 같이 해서 증폭된 DNA생성물과 실시예 1에서 생성된 대략 2.7kbp의 pUC18 EcoRI-SphI단편을, DNA라이게이션키트(타카라슈조상 제품)를 이용해서 연결하여 플라스미드 pPT-E1(도3)을 구축하였다.

토요보사제품인 대장균 HB101의 컴피턴트셀을 이용해서 HB101균주내로 pPT-E1을 도입하여 형질전환균주 No.2를 얻었다. 배플이 끼워맞춤된 3개의 목이 달린 500㎖ 플라스크에 실시예 1에서와 마찬가지 조성을 지니는 LB액체배지를 넣고, 121℃에서 20분간 고온고압멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가하고, 상기 얻어진 형질전환균주 No.2를 1루프 접종하고, 37℃, 130rpm에서 대략 20시간 배양하였다. 배양액으로부터 5,000G에서 15분간 원심분리를 통해 균체만을 분리한 후, 이 균체를 생리식염수 50㎖중에 재현탁시키고, 재원심분리를 통해 습균체를 얻었다. 상기 습균체 100mg을 50mM 인산칼륨수용액(pH 7.0) 200㎖에 현탁시키고, 이 현탁액에 아크릴로니트릴 10㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 부드럽게 교반하면서 10℃에서 1시간 반응시켰다. 반응종료후, 이 반응액을 실시예 1에서와 마찬가지로 HPLC를 통해 분석한 바, 이 반응액중에는 아크릴아미드는 관측되지 않았고, 미반응아크릴로니트릴만이 관측되었으며, 또한, 아크릴산은 관측되지 않았다. 즉, 전화율 및 선택률은 0%였다.

한편, 배양액으로부터 분리된 균체내에는 슈도노카르디아 써모필라의 α- 및 β-서브유닛에 상당하는 폴리펩티드사슬의 존재가 관측되었다.

비교예 2

MT-10822균주의 삽입단편의 분석(3)

ORF1에서부터 ORF2까지의 전체영역을 재클로닝하기 위해서, pPT-DB1플라스미드DNA를 주형으로서 이용해서 PCR을 실시하였다.

실시예 1에서 제조한 pPT-DB1플라스미드DNA 1㎍을 주형으로서 이용해서 서열목록의 서열번호 3으로 표시된 프라이머 100pmol, 서열목록의 서열번호 6으로 표시된 프라이머 100pmol 및 Taq DNA폴리메라제 5U를 함유한 총량 100㎕인 계내에서, 98℃에서 15초간의 열변성, 55℃에서 30초간의 어닐링 및 72℃에서 120초간의 신장으로 구성된 처리를 25회 반복하였다. PCR반응액 10㎕를 이용한 아가로스전기영동(시그마사 제품인 VII형 저융점아가로스; 아가로스농도 0.9중량%를 이용)을 통해 증폭된 DNA생성물의 분석을 행하였다. 그 결과, 대략 1.3kbp의 증폭된 DNA생성물의 존재가 확인되었다. 이어서, 아가로스겔로부터 대략 1.3kbp의 DNA단편만을 절단하고, 아가로스부분의 대략 0.1g을 미세하게 분쇄하여 TE용액 1㎖중에 현탁시켰다. 이 현탁액을 55℃에서 1시간 유지하여 아가로스를 완전히 융해시켰다. 이 융해물에 대해서 실시예 1에서와 마찬가지로 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 실시하여 상기 증폭된 DNA단편을 정제하였다. 대략 1.3kbp의 증폭된 DNA단편을 제한효소 EcoRI 및 Sph에 의해 절단하였다. 이 제한효소처리액에 대해서 실시예 1에서와 마찬가지로 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 행하여 DNA단편을 재차 정제하고, 최종적으로, 이 단편을 TE 10㎕에 용해시켰다. 이와 같이 해서 증폭된 DNA생성물과 실시예 1에서 생성된 대략 2.7kbp의 pUC18 EcoRI-SphI단편을, DNA라이게이션키트(타카라슈조사 제품)를 이용해서 연결하여 플라스미드 pPT-F1(도4)을 구축하였다.

토요보사제품인 대장균 HB101의 컴피턴트셀을 이용해서 HB101균주내로 pPT-F1을 도입하여 형질전환균주 No.3을 얻었다. 배플이 끼워맞춤된 3개의 목이 달린 500㎖ 플라스크에 실시예 1에서와 마찬가지 조성을 지니는 LB액체배지를 넣고, 121℃에서 20분간 고온고압멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가하고, 상기 얻어진 형질전환균주 No.3을 1루프 접종하고, 37℃, 130rpm에서 대략 20시간 배양하였다. 배양액으로부터 5,000G에서 15분간 원심분리를 통해 균체만을 분리한 후, 이 균체를 생리식염수 50㎖중에 재현탁시키고, 재원심분리를 통해 습균체를 얻었다. 상기 습균체 100mg을 50mM 인산칼륨수용액(pH 7.0) 200㎖에 현탁시키고, 이 현탁액에 아크릴로니트릴 10㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 부드럽게 교반하면서 10℃에서 1시간 반응시켰다. 반응종료후, 이 반응액을 실시예 1에서와 마찬가지로 HPLC를 통해 분석한 바, 이 반응액중에는 아크릴아미드는 관측되지 않았고, 미반응아크릴로니트릴만이 관측되었으며, 또한, 아크릴산은 관측되지 않았다. 즉, 전화율 및 선택률은 0%였다.

한편, 배양액으로부터 분리된 균체내에는 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히트라타제의 α- 및 β-서브유닛에 상당하는 폴리펩티드사슬의 존재가 관측되었다.

비교예 3

MT-10822균주의 삽입단편의 분석(4)

ORF3의 전체영역을 재클로닝하기 위해서, pPT-DB1플라스미드DNA를 주형으로서 이용해서 PCR을 실시하였다.

실시예 1에서 제조한 pPT-DB1플라스미드DNA 1㎍을 주형으로서 이용해서 서열목록의 서열번호 7로 표시된 프라이머 100pmol, 서열목록의 서열번호 4로 표시된 프라이머 100pmol 및 Taq DNA폴리메라제 5U를 함유한 총량 100㎕인 계내에서, 98℃에서 15초간의 열변성, 55℃에서 30초간의 어닐링 및 72℃에서 120초간의 신장으로 구성된 처리를 25회 반복하였다. PCR반응액 10㎕를 이용한 아가로스전기영동(시그마사 제품인 VII형 저융점아가로스; 아가로스농도 1.2중량%를 이용)을 통해 증폭된 DNA생성물의 분석을 행하였다. 그 결과, 대략 450bp의 증폭된 DNA생성물의 존재가 확인되었다. 이어서, 아가로스겔로부터 상기 정제된 대략 450bp의 DNA단편만을 절단하고, 아가로스부분의 대략 0.1g을 미세하게 분쇄하여 TE용액 1㎖중에 현탁시켰다. 이 현탁액을 55℃에서 1시간 유지하여 아가로스를 완전히 융해시켰다. 이 융해물에 대해서 실시예 1에서와 마찬가지로 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 실시하여 상기 증폭된 DNA단편을 정제하였다. 상기 대략 450bp의 증폭된 DNA단편을 제한효소 EcoRI 및 SphI에 의해 절단하였다. 이 제한효소처리액에 대해서 실시예 1에서와 마찬가지로 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 행하여 DNA단편을 재차 정제하고, 최종적으로, 이 단편을 TE 10㎕에 용해시켰다. 이와 같이 해서 증폭된 DNA생성물과 실시예 1에서 생성된 대략 2.7kbp의 pUC18 EcoRI-SphI단편을, DNA라이게이션키트(타카라슈조사 제품)를 이용해서 연결하여 플라스미드 pPT-G1(도5)을 구축하였다.

토요보사 제품인 대장균 HB101의 컴피턴트셀을 이용해서 HB101균주내로 pPT-G1을 형질도입하여 형질전환균주 No.4를 얻었다. 배플이 끼워맞춤된 3개의 목이 달린 500㎖ 플라스크에 실시예 1에서와 마찬가지 조성을 지니는 LB액체배지를 넣고, 121℃에서 20분간 고온고압멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가하고, 상기 얻어진 형질전환균주 No.4를 1루프 접종하고, 37℃, 130rpm에서 대략 20시간 배양하였다. 배양액으로부터 5,000G에서 15분간 원심분리를 통해 균체만을 분리한 후, 이 균체를 생리식염수 50㎖중에 재현탁시키고, 재원심분리를 통해 습균체를 얻었다. 상기 습균체 100mg을 50mM 인산칼륨수용액(pH 7.0) 200㎖에 현탁시키고, 이 현탁액에 아크릴로니트릴 10㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 부드럽게 교반하면서 10℃에서 1시간 반응시켰다. 반응종료후, 이 반응액을 실시예 1에서와 마찬가지로 HPLC를 통해 분석한 바, 이 반응액중에는 아크릴아미드는 관측되지 않았고, 미반응아크릴로니트릴만이 관측되었으며, 또한, 아크릴산은 관측되지 않았다. 즉, 전화율 및 선택률은 0%였다.

실시예 2

MT-10822균주의 삽입단편의 분석(5)

pPT-G1플라스미드의 ORF3영역의 3'-말단쪽에서 비교예 2에서 생성된 pPT-F1에 있어서의 lacZ프로모터, β-서브유닛의 ORF2 및 α-서브유닛의 ORF1을 함유하는 영역을 클로닝하였다.

비교예 1에서 제조한 pPT-F1플라스미드DNA 1㎍을 주형으로서 이용해서 서열목록의 서열번호 8로 표시된 프라이머 100pmol, 서열목록의 서열번호 9로 표시된 프라이머 100pmol 및 Taq DNA폴리메라제 5U를 함유한 총량 100㎕인 계내에서, 98℃에서 15초간의 열변성, 55℃에서 30초간의 어닐링 및 72℃에서 120초간의 신장으로 구성된 처리를 25회 반복하였다. PCR반응액 10㎕를 이용한 아가로스전기영동(시그마사 제품인 VII형 저융점아가로스; 아가로스농도 0.8중량%를 이용)을 통해 증폭된 DNA생성물의 분석을 행하였다. 그 결과, 대략 2.0kbp의 증폭된 DNA생성물의 존재가 확인되었다. 이어서, 아가로스겔로부터 상기 대략 2.0kbp의 DNA단편만을 절단하고, 아가로스부분의 대략 0.1g을 미세하게 분쇄하여 TE용액 1㎖중에 현탁시켰다. 이 현탁액을 55℃에서 1시간 유지하여 아가로스를 완전히 융해시켰다. 이 융해물에 대해서 실시예 1에서와 마찬가지로 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 실시하여 상기 증폭된 DNA단편을 정제하였다. 상기 대략 2.0kbp의 증폭된 DNA단편을 제한효소 SphI 및 HindIII에 의해 절단하였다. 이 제한효소처리액에 대해서 실시예 1에서와 마찬가지로 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 행하여 DNA단편을 재차 정제하고, 최종적으로, 이 단편을 TE 10㎕에 용해시켰다. 마찬가지로, 이 플라스미드를 pPT-G1플라스미드에 있어서의 유일한 제한효소부위인 SphI 및 HindIII에 의해 절단하였다. 아가로스겔전기영동(시그마사 제품인 VII형 저융점아가로스; 아가로스농도 0.7%를 이용)을 행하여, 이 아가로스겔로부터 대략 3.1kbp의 DNA단편만을 절단하고, 절단된 아가로스부분의 대략 0.1g을 미세하게 분쇄하고, TE용액 1㎖에 현탁시켰다. 다음에, 이 현탁액을 55℃에서 1시간 유지하여 아가로스를 완전히 융해시켰다. 이 융해물에 대해서 실시예 1에서와 마찬가지로 페놀과 클로로포름에 의한 추출 및 에탄올침전을 실시하여 DNA단편을 정제하고, 최종적으로, 이 단편을 TE 10㎕에 용해시키고, 이와 같이 해서 증폭된 DNA생성물과 pPT-G1 SphI-HindIII단편을 DNA라이게이션키트(타카라슈조사 제품)를 이용해서 연결해서 플라스미드 pPT-H1(도6)을 구축하였다.

토요보사제품인 대장균 HB101의 성분세포를 이용해서 HB101균주내로 pPT-H1을 도입하여 형질전환균주 No.5를 얻었다. 배플이 끼워맞춤된 3개의 목이 달린 500㎖ 플라스크에 전술한 조성을 지니는 LB액체배지를 넣고, 121℃에서 20분간 고온고압멸균하였다. 이 배지에 최종농도가 100㎍/㎖가 되도록 암피실린을 첨가하고, 상기 얻어진 형질전환균주 No.5를 1루프 접종하고, 37℃, 130rpm에서 대략 20시간 배양하였다. 배양액으로부터 5,000G에서 15분간 원심분리를 통해 균체만을 분리한 후, 이 균체를 생리식염수 50㎖중에 재현탁시키고, 재원심분리를 통해 습균체를 얻었다. 상기 습균체 100mg을 50mM 인산칼륨수용액(pH 7.0) 200㎖에 현탁시키고, 이 현탁액에 아크릴로니트릴 10㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 부드럽게 교반하면서 10℃에서 1시간 반응시켰다. 반응종료후, 이 반응액을 실시예 1에서와 마찬가지로 HPLC를 통해 분석한 바, 이 반응액중에는 아크릴아미드만 존재하고, 아크릴로니트릴과 아크릴산은 관측되지 않았다. 즉, 전화율 및 선택률은 100%였다.

본 발명은 슈도노카르디아 써모필라 JCM3095로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 니트릴히드라타제활성화 단백질 및 이것을 코딩하는 유전자서열을 제공한다. 또, 본 발명은 상기 유전자를 함유하는 재조합플라스미드, 상기 유전자와 니트릴히드라타제유전자를 함유하는 재조합플라스미드, 상기 재조합플라스미드에 의한 형질전환을 통해 얻어진 형질전환균주 및 배양액, 상기 형질전환균주를 배양시켜 얻어진 세포 또는 이 세포의 처리생성물을 이용해서 니트릴화합물로부터 상당하는 아미드화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에 의하면, 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제를 이용해서 니트릴화합물로부터 아미드화합물을 공업적으로 제조할 때, 유전공학적인 수법에 의해 효소를 다량 발현시킬 수 있으므로, 아미드화합물의 제조비용을 점유하는 효소의 제조비를 저감할 수 있다.

Claims

아미노산서열이 서열목록의 서열번호 1로 표시되고, 슈도노카르디아 써모필라 JCM3095로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 것을 특징으로 하는 단백질.
삭제
제 1항에 있어서, 아미노산서열이 서열목록의 서열번호 1로 표시되고, 슈도노카르디아 써모필라 JCM3095로부터 유래된 것을 특징으로 하는 단백질.
제 1항 또는 제 3항 기재의 단백질을 코딩하는 유전자.
제 4항에 있어서, 서열목록의 서열번호 2로 표시된 1328번째 내지 1762번째 염기의 염기서열로 표현되는 것을 특징으로 하는 유전자.
제 5항 기재의 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합플라스미드.
제 6항에 있어서, 니트릴히드라타제유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는재조합플라스미드.
제 7항에 있어서, 니트릴히드라타제 유전자가 슈도노카르디아 써모필라 JCM3095로부터 유래된 것을 특징으로 하는 재조합플라스미드.
제 7항에 있어서, 서열목록의 서열번호 2로 표시된 714번째 내지 1331번째 염기의 염기서열로 표현되는 α-서브유닛을 코딩하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합플라스미드.
제 7항에 있어서, 서열목록의 서열번호 2로 표시된 16번째 내지 717번째 염기의 염기서열로 표현되는 β-서브유닛을 코딩하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합플라스미드.
제 6항 내지 제 10항중 어느 한 항에 기재된 재조합플라스미드를 지닌 형질전환균주.
제 6항 내지 제 10항중 어느 한 항에 기재된 재조합플라스미드를 지닌 형질전환균주를 배양하는 공정과,

상기 형질변환균주, 상기 배양을 통해 얻어진 배양액 및 그의 처리생성물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 부재를 니트릴화합물과 접촉시키는 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 니트릴화합물로부터 대응하는 아미드화합물을 제조하는 방법.

[서열목록]

서열번호: 1

서열의 길이: 144

서열의 형태: 아미노산

토폴로지: 선형

서열의 타입: 단백질

기원:

생물체명: 슈도노카르디아 써모필라

균주명: JCM3095

직접기원:

클론명: pPT-DB1

서열의 특징:

특징을 결정하는 방법: E

기타 정보: 슈도카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질의 아미노산서열을 나타냄.

[서열 1]

서열번호: 2

서열의 길이: 1762

서열의 형태: 핵산

쇄의 수: 2본쇄

토폴로지: 선형

서열의 타입: 게놈DNA

기원:

생물체명: 슈도노카르디아 써모필라

균주명: JCM3095

직접기원:

클론명: pPT-DB1

서열의 특징:

특징을 결정하는 방법: E

기타 정보:

16번째 내지 717번째 염기의 영역이 β-서브유닛영역이다.

714번째 내지 133번째 염기의 영역이 α-서브유닛영역이다.

1328번째 내지 1762번째 염기의 영역이 슈도노카르디아 써모필라로부터 유래된 니트릴히드라타제의 활성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자의 영역이다.

[서열 2]

서열번호: 3

서열의 길이: 29

서열의 형태: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

서열의 타입: 기타 핵산, 합성DNA

[서열 3]

서열번호: 4

서열의 길이: 28

서열의 형태: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

서열의 타입: 기타 핵산, 합성DNA

[서열 4]

서열번호: 5

서열의 길이: 28

서열의 형태: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

서열의 타입: 기타 핵산, 합성DNA

[서열 5]

서열번호: 6

서열의 길이: 28

서열의 형태: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

서열의 타입: 기타 핵산, 합성DNA

[서열 6]

서열번호: 7

서열의 길이: 45

서열의 형태: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

서열의 타입: 기타 핵산, 합성DNA

[서열 7]

서열번호: 8

서열의 길이: 27

서열의 형태: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

서열의 타입: 기타 핵산, 합성DNA

[서열 8]

서열번호: 9

서열의 길이: 28

서열의 형태: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

서열의 타입: 기타 핵산, 합성DNA

[서열 9]