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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein bei der Aktivierung der von Pseudonocardia
thermophila JCM3095 (im Folgenden einfach als" Pseudonocardia thermophila" bezeichnet) stammenden
Nitrilhydratase beteiligtes Protein sowie ein dieses codierendes
Gen. Ferner betrifft die Erfindung ein dieses Gen enthaltendes rekombinantes
Plasmid, ein das Gen und ein Nitrilhydratase-Gen enthaltendes rekombinantes
Plasmid, einen über
eine Transformation mit dem rekombinanten Plasmid erhaltenen transformierten
Stamm sowie ein Verfahren zur Produktion einer entsprechenden Amidverbindung
aus einer Nitrilverbindung unter Einsatz des transformierten Stammes,
einer durch Inkubation des transformierten Stammes erhaltenen Kulturlösung oder behandelter
Produkte desselben.
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In
den letzten Jahren wurden eine Nitrilhydratase, welche ein Enzym
mit einer Nitril-Hydratations-Aktivität zur Überführung einer
Nitrilgruppe aus verschiedenen Verbindungen in eine Amidgruppe mittels
Hydratation ist, und eine große
Anzahl von dieses Enzym produzierenden Mikrobenstämmen beschrieben.
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Zur
industriellen Produktion einer Amidverbindung aus einer Nitrilverbindung
unter Einsatz der Nitrilhydratase ist es wichtig, die überwiegend
auf die Produktionskosten der Amidverbindung zurückzuführenden Produktionskosten für das Enzyms
zu senken. Genauer gesagt muss der auf dem Einheitsgewicht an Mikroben
beruhende Gehalt des Enzyms erhöht
werden. Diesbezüglich
ist ein Ansatz untersucht worden, die Gene dieses Enzyms zu klonieren,
um mit Hilfe des Verfahrens der Genmanipulation unter Einsatz des
Enzymgens das Enzym in großer
Menge zu exprimieren.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckten Pseudonocardia thermophila
als eine Mikrobe mit einer Nitrilhydratase-Aktivität (
JP-A-8-56684 ). Die
Erfinder isolierten ferner die Nitrilhydratase aus demselben Stamm
und stellten fest, dass dieses Enzym aus einer α-Untereinheit und einer β-Untereinheit
zusammengesetzt ist. Sie isolierten ferner das Nitrilhydratase-Gen
aus demselben Stamm, klärten
die Aminosäuresequenz und
die Gensequenz davon auf und produzierten erfolgreich ein rekombinantes
Plasmid, das in der Lage ist, das Gen in E. coli (Escherichia coli)
in großer
Menge zu exprimieren, sowie einen tranformierten E. Coli-Stamm,
welcher durch Transformation mit demselben Plasmid erhalten wurde
(
europäische Offenlegungsschrift 079310 ).
Der Stamm Pseudonocardia thermophila ist nebenbei bemerkt unter
der Nummer JCM3095 bei Rikagaku Kenkyusho, Biseibutsu Keito Hozon
Shisetsu (2-1, Hirosawa, Wako-shi, Saitama-ken) hinterlegt und steht
jedermann auf Anforderung frei zur Verfügung.
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Von der Erfindung zu lösende Aufgaben
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Die
Erfindung soll ein Protein zur Verfügung stellen, das bei der Aktivierung
der Nitrilhydratase eine Rolle spielt, welche von dem in der
europäischen Offenlegungsschrift
0790310 beschriebenen Stamm Pseudonocardia thermophila
stammt, wobei die Nitrilhydratase durch die genaue Untersuchung
eines rekombinanten Plasmids (pPT-DB1) aufgeklärt wurde, das in der Lage ist,
dieses Enzym in E. coli in großer
Menge zu exprimieren. Die Erfindung soll ferner das das aktivierende
Protein codierende Gen, ein das Gen enthaltendes rekombinantes Plasmid,
ein das Gen und ein Nitrilhydratase-Gen enthaltendes rekombinantes
Plasmid, einen über
eine Transformation mit dem rekombinanten Plasmid erhaltenen transformierten
Stamm sowie ein Verfahren zur Produktion einer entsprechenden Amidverbindung
aus einer Nitrilverbindung unter Einsatz des transformierten Stammes,
eine durch Inkubation des transformierten Stammes erhaltene Kulturlösung oder behandelte
Produkte desselben zur Verfügung
stellen.
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Mittel zur Lösung der
Aufgaben
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Die
Erfinder haben genau die Rasensequenz des DNA-Fragments analysiert,
das von Pseudonocardia thermophila in dem rekombinanten Plasmid
pPT-DB1 stammt, welches in den im
JP-A-275978 beschriebenen Stamm MT-10822 eingeführt worden
ist. Als Ergebnis ergaben sich die fünf folgenden Befunde. Erstens ist
gefunden worden, dass das dritte offene Leseraster (im Folgenden
als "ORF3" bezeichnet), das
sich von den Strukturgenen (Gene für die α- und β-Struktur-Untereinheiten) unterscheidet,
in dem DNA-Fragment in pPT-DB1 vorkommt und ORF3 ein Protein mit
dem Molekulargewicht von ungefähr
15.900 codiert. Zweitens haben sie ein pPT-D1-Plasmid hergestellt,
in welchem nur das offene Leseraster der α-Untereinheit, (im Folgenden
als "ORF2" bezeichnet), das
offene Leseraster der β-Untereinheit,
(im Folgenden als "ORF1" bezeichnet) und
das ORF3 in pPT-DB1 geklont sind und sie haben herausgefunden, dass
die über
eine Transformation mit dem Plasmid erhaltenen transformierten E.
coli über
Nitrilhydratase-Aktivität
verfügten.
Drittens haben sie das nur ORF1 und ORF2 enthaltende rekombinante
Plasmid pPT-F1 aus pPT-DB1 konstruiert. Als Ergebnis der Messung
der Nitrilhydratase-Aktivität
von über
eine Transformation mit diesem Plasmid erhaltenen E. coli wurde
bei diesen E. coli keine Nitrilhydratase-Aktivität nachgewiesen. Mittlerweile
wurde in der Zelle das Vorkommen von den α- und β-Untereinheiten entsprechenden
Polypeptidketten beobachtet. Viertens ist das Plasmid pPT-G1 hergestellt
worden, in welchem nur die ORF3-Region geklont ist und es wurde
gefunden, dass keine Nitrilhydratase-Aktivität in den über eine Transformation mit
diesem Plasmid erhaltenen transformierten E. coli beobachtet wurde.
Fünftens
wurde aus pPT-F1 das Plasmid pPT-H1 gewonnen, in welchem die Region mit
dem LacZ-Promotor, ORF1 und ORF2 über eine PCR amplifiziert und
das erhaltene amplifizierte DNA-Fragment downstream vom 3'-Terminus des ORF3
von pPT-G1 erneut kloniert wurde. Die Nitrilhydratase-Aktivität der über eine
Transformation mit diesem Plasmid erhaltenen transformierten E.
coli ist gemessen worden und in diesen E. coli wurde deshalb eine
Nitrilhydratase-Aktivität
nachgewiesen.
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Aus
diesen Befunden haben die Erfinder den Schluss gezogen, dass für E. coli,
in welche aus Pseudonocardia thermophila stammende Nitrilhydratase
eingeführt
worden ist, die Gegenwart der ORF3-Region essentiell ist, um über die
gleich Aktivität
zu verfügen
und dass ferner in Anbetracht des zweiten, dritten und fünften Befunds
das Vorkommen des Translationsprodukts von ORF3 unumgänglich ist.
Ferner ist aus den Fakten, dass das gleiche Enzym sich aus der α- und β-Untereinheit
zusammensetzt (europäische
Offenlegungsschrift 0790310) und dass, selbst wenn das minimale
DNA-Fragment mit den drei offenen Leserastern ORF1 bis ORF3 in E.
coli eingeführt
wird, die rekombinanten E. coli über
Nitrilhydratase-Aktivität
verfügen (zweiter
Befund), geschlossen worden, dass das Translationsprodukt von ORF3
bei der Aktivierung der Nitrilhydratase beteiligt ist. Das heißt, es ist
geschlossen worden, dass ORF3 einen Gen-Locus darstellt, der ein Protein
kodiert, das bei der Aktivierung der von Pseudonocardia thermophila
stammenden Nitrilhydratase beteiligt ist. Danach wurde die Erfindung
vervollständigt.
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Die
Erfindung stellt dementsprechend ein Protein zur Verfügung, das
bei der Aktivierung der von Pseudonocardia thermophila stammenden
Nitrilhydratase beteiligt ist sowie ein Gen, welches dieselbe kodiert.
Ferner stellt die Erfindung ein das Gen enthaltendes rekombinantes
Plasmid, ein das Gen und ein Nitrilhydratase-Gen enthaltendes Plasmid,
einen über
eine Transformation mit dem rekombinanten Plasmid erhaltenen transformierten
Stamm sowie ein Verfahren zur Produktion einer entsprechenden Amidverbindung
aus einer Nitrilverbindung unter Einsatz des transformierten Stammes,
eine durch Inkubation des transformierten Stammes erhaltene Kulturlösung oder
behandelte Produkte desselben zur Verfügung, Bevorzugte Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen
beschrieben.
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1 ist
eine Restriktionskarte für
die Schnittstellen auf dem Plasmid pPT-DB1.
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2 ist
eine Restriktionskarte für
die Schnittstellen auf dem Plasmid pPT-D1.
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3 ist
eine Restriktionskarte für
die Schnittstellen auf dem Plasmid pPT-E1.
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4 ist
eine Restriktionskarte für
die Schnittstellen auf dem Plasmid pPT-F1.
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5 ist
eine Restriktionskarte für
die Schnittstellen auf dem Plasmid pPT-G1.
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6 ist
eine Restriktionskarte für
die Schnittstellen auf dem Plasmid pPT-H1.
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Abkürzungen:
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- bla: Gen, welches die β-Lactamase
kodiert
- ColE1-Ori: Replikations-Initiatonsstelle vom Typ ColE1
- LacZ: Promotor- und Operator-Regionen des von pUC18 stammenden
Lactose-Operons
- NHα:
Gen, welches eine α-Untereinheit
der von Pseudonocardia thermophila stammenden Nitrilhydratase codiert
- NHβ:
Gen, welches eine β-Untereinheit
der von Pseudonocardia thermophila stammenden Nitrilhydratase codiert
- P16: Gen, welches ein Protein codiert, das bei der Aktivierung
der von Pseudonocardia thermophila stammenden Nitrilhydratase beteiligt
ist
- P16 (Teil) Teilregion eines Gens, welches ein Protein codiert,
das bei der Aktivierung der von Pseudonocardia thermophila stammenden
Nitrilhydratase beteiligt ist.
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Die
Erfindung wird im Folgenden genau beschrieben.
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Ein
Protein, das bei der Aktivierung der erfindungsgemäßen von
Pseudonocardia thermophila JCM3095 stammenden Nitrilhydratase (im
Folgenden einfach als "Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein" bezeichnet) beteiligt
ist, ist ein Protein, dessen Expression die Aktivierung der von
Pseudonocardia thermophila stammenden Nitrilhydratase direkt beeinflusst,
wie dies in den weiter unten beschriebenen Abschnitten zur Lösung der
Aufgaben und den Beispielen dargestellt wird.
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Als
typisches Beispiel für
ein erfindungsgemäßes Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
lässt sich
ein von Pseudonocardia thermophila stammendes Protein angeben. Der
Fortschritt in der Molekularbiologie und der Gentechnologie in den
letzten Jahren machte es möglich,
aus einem Bakterienstamm, der sich von Pseudonocardia thermophila
völlig
unterscheidet, ein Protein zu erhalten, das dieselbe Funktion wie
das von Pseudonocardia thermophila stammende Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
aufweist, indem direkt auf die molekularbiologischen Eigenschaften
und die Aminosäuresequenz
dieses Nitrilhydratase-Aktivierungsproteins
Bezug genommen wird. Angesichts eines solchen Standes der Technik
werden Proteine, die von anderen Bakterienstämmen stammen als von Pseudonocardia
thermophila aber bei der Aktivierung der von von Pseudonocardia
thermophila stammenden Nitrilhydratase teilnehmen, von der Erfindung
mit umfasst. Bevorzugte Beispiele für derartige Bakterienstämme sind
Stämme,
die zu den Gattungen Nocardia, Corynebacterium, Bacillus, thermophiler
Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, durch die Art rhodochrous gekennzeichneter
Rhodococcus, Acinetobacter, Xanthobacter, Streptomyces, Rhizobium,
Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Aeromonas, Citrobacter, Achromobacter,
Agrobacterium oder ein anderer Pseudonocadia-Stamm als Pseudonocardia thermophila
JCM3095 gehören.
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Als
typisches Beispiel für
ein erfindungsgemäßes Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
lässt sich
ein aus der in Sequenz-NO.1 des Sequenzprotokolls angegebenen Aminosäuresequenz
zusammengesetztes Protein angeben. Selbst wenn die Transkription
und Translation unter Einsatz eines Gens von derselben Sequenz wie der
Matrizenstrang erfolgt, wird über
eine nach der Translation erfolgende Modifikation mit einem Enzym manchmal
ferner in einem Wirt, je nach dem Typ des Wirts, in den das Gen
eingeführt
wurde, den Verbindungen oder der Zusammensetzung des bei der Inkubation
verwendeten Nährmediums,
der Inkubationstemperatur oder dem pH-Wert ein teilweise unterschiedliches
Protein produziert, in welchem eine oder mehrere Aminosäuren in
Nachbarschaft zum N-terminalen Ende in der Sequenztabelle deletiert
oder eine oder mehrere Aminosäuren
am N-Terminus neu angefügt
werden, obwohl die vorbestimmte Funktion beibehalten wird. Der Fortschritt
der rekombinanten DNA-Technologie hat es noch weiter ermöglicht,
ein oder mehrere der ein Protein darstellenden Aminosäuren durch
andere Aminosäuren
relativ leicht zu ersetzen, ein oder mehrere der ein Protein darstellenden
Aminosäuren
zu deletieren oder auszuschneiden oder eine oder mehrere Aminosäuren in
ein Protein zu insertieren, ohne die Funktion des Proteins wesentlich
zu verändern.
Angesichts eines solchen Standes der Technik umfasst das in der
Erfindung beschriebene Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein nicht nur
ein Protein, das (1) die in der Sequenz NO.1 des Sequenzprotokolls
angegebene Aminosäuresequenz
als solche hat, sondern auch ein teilweise verändertes Protein mit einer Aminosäuresequenz,
in der eine oder mehrere Aminosäuren
durch eine andere Aminosäure
oder andere Aminosäuren
ersetzt oder deletiert oder ausgeschnitten sind, oder eine oder
mehrere Aminosäuren
sind insertiert, sondern auch (2) an der Aktivierung der von Pseudonocardia
thermophila stammenden Nitrilhydratase teilnimmt.
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Das
heißt,
dass ein typisches Beispiel für
ein erfindungsgemäßes Protein
ein Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein ist, das sich aus der in
der Sequenz-NO.1 des Sequenzprotokolls angegebenen Sequenz von 144
Aminosäuren
zusammensetzt. Zusätzlich
umfasst die Erfindung ein teilweise verändertes Protein, das durch
Modifikation eines Teils der in der Sequenz-NO.1 des Sequenzprotokolls
angegebenen Sequenz durch Ersetzen, Deletieren, Ausschneiden oder
einem wie zuvor beschriebenen Insertieren erhalten wurde, solange es
bei der Aktivierung der von Pseudonocardia thermophila stammenden
Nitrilhydratase teilnimmt.
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Bezüglich des
erfindungsgemäßen Nitrilhydratase-Aktivierungsproteins
lässt sich
als typisches Beispiel ein Protein anführen, das von Pseudonocardia
thermophila stammt und aus der in der Sequenz-NO.1 des Sequenzprotokolls
angegebenen Sequenz zusammengesetzt ist. Ferner hat es der Fortschritt
in der Gentechnik in den letzten Jahren ermöglicht, ein Protein mit derselben
Funktion wie dieses Protein aus einem ganz anderen Bakterienstamm
als Pseudonocardia thermophila zu erhalten, indem direkt auf die
Aminosäuresequenz
des aus Pseudonocardia thermophila stammenden Nitrilhydratase-Aktivierungsproteins
Bezug genommen wird. Angesichts eines solchen Standes der Technik
umfasst die Erfindung ein von einem anderen Bakterienstamm als Pseudonocardia
thermophila stammendes Protein mit der in der Sequenz NO.1 des Sequenzprotokolls
angegebenen Aminosäuresequenz
als solche oder ein Protein das (1) eine Aminosäuresequenz aufweist, in der
eine oder mehrere Aminosäuren
durch eine andere Aminosäure
oder andere Aminosäuren
ersetzt oder deletiert oder herausgeschnitten sind, oder eine oder
mehrere Aminosäuren
insertiert sind, und welches an der Aktivierung der von Pseudonocardia
thermophila stammenden Nitrilhydratase teilnimmt. Bevorzugte Beispiele
für einen
derartigen Bakterienstamm sind Stämme, die zu den Gattungen Nocardia,
Corynebacterium, Bacillus, thermophiler Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus,
durch die Art rhodochrous gekennzeichneter Rhodococcus, Acinetobacter,
Xanthobacter, Streptomyces, Rhizobium, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia,
Aeromonas, Citrobacter, Achromobacter, Agrobacterium oder ein anderer
Pseudonocadia-Stamm als Pseudonocardia thermophila JCM3095 gehören.
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Die
Erfindung umfasst die Sequenz des das Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codierenden Gens. Das das erfindungsgemäße Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codierende Gen ist nicht besonders eingeschränkt, solange es ein Gen ist,
welches das erfindungsgemäße Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codiert.
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Erfindungsgemäß ist die
Rasensequenz, welche die in der Sequenz NO.1 des Sequenzprotokolls
angegebene Sequenz von 144 Aminosäuren codiert, in dem Bereich
des Gens enthalten, der das erfindungsgemäße Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codiert. Wenn das teilweise veränderte
Protein, welches durch Ersatz, Deletion oder Ausschneiden eines
Teils der in der Sequenz NO.1 des Sequenzprotokolls angegebenen Aminosäuresequenz
oder durch Insertieren einer (von) Aminmosäure(n) erhalten wird, bei der
Aktivierung der von Pseudonocardia thermophila stammenden Nitrilhydratase
beteilgt ist, ist erfindungsgemäß ferner
die Rasensequenz, welche die Aminosäuresequenz des teilweise veränderten
Proteins codiert, ebenfalls in dem Bereich des Gens enthalten, welcher
das erfindungsgemäße Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codiert.
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In
Bezug auf das Gen, welches das erfindungsgemäße Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codiert, lässt
sich als typisches Beispiel die Rasensequenz der in der Sequenz
NO.2 des Sequenzprotokolls angegebenen Basen 1328 bis 1762 anführen. Ferner
machte es der Fortschritt der rekombinanten DNA-Technologie möglich, die
als Matrize bei der Translation fungierende Rasensequenz der DNA
durch eine andere Rasensequenz zu ersetzen, ohne dass sich die Aminosäuresequenz
des Proteins wesentlich ändert.
Noch weiter war es möglich,
dass ein oder mehrere der ein Protein darstellenden Aminosäuren durch
eine oder mehrere andere Aminosäure(n)
ersetzt, eine oder mehrere deletiert oder ausgeschnitten oder eine
oder mehrere Aminosäuren in
ein Protein insertiert werden, ohne dass die Funktion des Proteins
wesentlich verändert
wird, indem die als Matrize bei der Translation fungierende Rasensequenz
einem Ersetzen, Deletieren, Ausschneiden oder Insertieren unterzogen
wird. Angesichts eines solchen Standes der Technik umfasst das Gen,
welches das erfindungsgemäße Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codiert nicht nur die Rasensequenz der in der Sequenz NO.2 des Sequenzprotokolls
angegebenen Basen 1328 bis 1762 als solche, sondern auch die teilweise
veränderte
Sequenz, in welcher eine oder mehrere Basen der DNA-Basensequenz
durch eine andere Base oder andere Basen ersetzt, deletiert, oder
ausgeschnitten wurden oder in welche eine oder mehrere Basen insertiert sind,
solange es als Matrize für
ein Protein dient, welches bei der Aktivierung der von Pseudonocardia
thermophila stammenden Nitrilhydratase teilnimmt.
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Das
heißt,
die Erfindung umfasst das Gen, welches das Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codiert und aus der Rasensequenz der in Sequenz-NO.2 des Sequenzprotokolls
angegebenen Basen 1328 bis 1762 besteht. Ferner ist das Gen mit
der durch Ersetzen, Deletieren oder Ausschneiden eines Teils der
Rasensequenz der in Sequenz-NO.2 des Sequenzprotokolls angegebenen
Basen 1328 bis 1762 oder durch Insertiern von einer oder mehreren
Basen erhaltenen Rasensequenz in dem Gen enthalten, welches das
erfindungsgemäße Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codiert, solange das von dem Gen codierte Protein bei der Aktivierung
der von Pseudonocardia thermophila stammenden Nitrilhydratase teilnimmt.
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Die
Erfindung umfasst die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids,
in welches das das Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein codierende
Gen isertiert ist. Speziell handelt es sich um ein Plasmid, in welchem das
das Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein codierende Gen in einen
Plasmidvektor mit einer für
die Expression des Gens benötigten
Kontrollregion und einer für
die autonome Replikation benötigten
Region insertiert ist.
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Die
für die
Expression benötigte
Kontrollregion bezieht sich auf eine Promotor-Sequenz (einschließlich einer
Operatorsequenz für
die Kontrolle der Transkription), eine Ribosomen-Bindungs-Sequenz
(SD-Sequenz) und eine Transkriptions-Terminations-Sequenz. Spezielle
Beispiele für
die Promotorsequenz umfassen den von E. coli stammenden trp-Promotor
des Tryptophan-Operons und den von E. coli stammenden lac-Promotor des Lactose-Operons,
den vom λ-Phagen
stammenden PL- und PR-Promotor
sowie den Gluconsäuresynthetase-Promotor
(gnt), den alkalischen Protease-Promotor (apr), den neutralen Protease-Promotor(npr)
und den α-Amylase-Promotor,
die von Bacillus subtilis stammen. Ferner lässt sich auch eine Sequenz
einsetzen, die modifiziert und wie der tac-Promotor unabhängig ausgeführt ist.
Als Ribosomenbindungssequenz lässt
sich die erfindungsgemäße inharente
Sequenz von Pseudonocardia oder die von E. coli oder Bacillus subtilis
stammende Sequenz angeben. Sie ist nicht besonders eingeschränkt, solange
sie eine Sequenz ist, welche in einem gewünschten Wirt wie E. coli oder
Bacillus subtilis funktioniert. Als Komplementärsequenz zu einer 3'-terminalen Region
der 16Sribisomalen RNA kann beispielsweise mittels DNA-Synthese
eine Konsensus-Sequenz hergestellt und eingesetzt werden, die um
mindestens 4 Basen verlängert
ist. Eine Transkriptions-Terminations-Sequenz ist nicht notwendigerweise
erforderlich. Es können
eine nicht vom p-Faktor abhängige
Sequenz, z.B. der Lipoprotein-Terminator oder der trp-Operon-Terminator
eingesetzt werden. Bezüglich
der Reihenfolge der Sequenzen in dem rekombinanten Plasmid der Kontrollregion
ist es ratsam, dass die Promotorsequenz, die Ribosomen-Bindungs-Sequenz,
das das Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein codierende Gen und die
Transkriptions-Terminations-Sequenz in dieser Reihenfolge upstream
vom 5'-Terminus her angeordnet sind.
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Spezielle
Beispiele für
den Plasmid-Vektor sind pBR322, pUC18, Bluescript II SK (+), pKK223-3
und pSC101, welche eine Region aufweisen, die in der Lage ist, in
E. coli autonom zu replizieren, sowie pUB110, pTZ4, pC194, p11, Φ1 und Φ105, welche
eine Region aufweisen, die in der Lage ist, in Bacillus subtilis
autonom zu replizieren. Weitere Beispiele für einen Plasmid-Vektor, der
in der Lage ist, in zwei oder mehr Wirten autonom zu replizieren
sind pHV14, TRp7, YEp7 und pBS7.
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Die
Erfindung umfasst die Konstruktion eines rekombinanten Plasmids,
in welches sowohl das das Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein codierende
Gen als auch das Nitrilhydratase-Gen
insertiert sind. Das heißt, es
handelt sich um ein rekombinantes Plasmid, das erhalten wurde, indem
beide Gene in einen Plasmid-Vektor mit (einer) für die Expression von beiden
Genen erforderlichen Kontrollregion(en) und (einer) für eine autonome
Replikation erforderlichen Region(en) insertiert wurden. Es ist
ein rekombinantes Plasmid, mit welchem sich das Enzym produzieren
und aktivieren lässt,
wenn das Plasmid in irgendeinen Wirt eingeführt worden ist. Der oben beschriebene,
die für
die Expression erforderliche Kontrollregion und die für eine autonome
Replikation erforderliche Region enthaltende Plasmid-Vektor kann
speziell ausgewählt
werden. Das das Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codierende Gen und die Gene für
die α- und β-Untereinheit
der Nitrilhydratase können ferner
als unabhängige
Cistrons mit (einem) derartigen Kontrollabschnitt(en) oder als Polycistron
mit einem gemeinsamen Kontrollabschnitt exprimiert werden.
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Als
typisches Beispiel für
das erfindungsgemäße Nitrilhydratase-Gen
lässt sich
das von Pseudonocardia thermophila stammende Nitrilhydratase-Gen
angeben. Speziell werden das Gen, welches die durch die Rasensequenz
mit den Basen 714 bis 1331 in der Sequenz NO. 2 des Sequenzprotokolls
wiedergegebene α-Untereinheit
codiert und das Gen, welches die durch die Rasensequenz mit den
Basen 16 bis 717 in der Sequenz NO.2 des Sequenzprotokolls wiedergegebene β-Untereinheit
codiert, genannt. Das heißt,
es ist grundsätzlich
die Nitrilhydratase, bei welcher sich die α-Untereinheit aus der Rasensequenz
von 618 Basen und die β-Untereinheit
aus der Rasensequenz von 702 Basen zusammensetzt. Der Fortschritt
in der rekombinanten DNA-Technologie hat es ermöglicht, dass die Rasensequenz
der Matrizen-DNA bei der Translation relativ leicht durch eine andere
Rasensequenz ersetzt wird, ohne dass die Aminosäuresequenz des Enzyms im Wesentlichen
verändert
wird oder dass eine oder mehrere das Enzym aufbauende Aminosäuren durch
andere Aminosäuren
ersetzt, zerstört
oder ausgeschnitten sind oder eine oder mehrere Aminosäuren insertiert
sind, ohne dass die Aktivität
des Enzyms durch Ersetzen, Zerstören
oder Ausschneiden der Rasensequenz der DNA-Matrize bei der Translation oder durch
Insertieren einer Base oder von Basen in die Rasensequenz wesentlich
verändert
wird. Angesichts eines solchen Standes der Technik umfasst das von
Pseudonocardia thermophila stammende Gen, auf das in der Erfindung
Bezug genommen wird, nicht nur das Gen mit der α-Untereinheit, welche durch
die in der Sequenz NO.2 des Sequenzprotokolls wiedergegebene Rasensequenz
mit den Basen 714 bis 1331 wiedergegeben wird, sowie mit der β-Untereinheit,
welche durch die in der Sequenz NO.2 des Sequenzprotokolls wiedergegebene
Rasensequenz mit den Basen 16 bis 717 wiedergegeben wird, sondern
auch das Gen der teilweise veränderten
Sequenz, in welcher eine oder mehrere Basen der DNA-Basensequenz
durch andere Basen ersetzt, zerstört oder ausgeschnitten sind,
oder in welche eine oder mehrere Basen insertiert sind, solange
es als Matrize für
das Protein mit Nitrilhydratase-Aktivität fungieren kann.
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Wie
in der
europäischen Offenlegungsschrift
0790310 beschrieben, lässt
sich speziell ein Nitrilhydratase-Gen angeben, welches als Bestandteil
eine α-Untereinheit
enthält,
die durch die Rasensequenz wiedergegeben wird, welche durch Ersetzen
von einer oder mehreren der in der Sequenz NO.2 des Sequenzprotokolls
wiedergegebenen Rasensequenzen mit den Basen 729 bis 731, 768 bis
770, 825 bis 827, 942 bis 944, 981 bis 983, 1017 bis 1019, 1029
bis 1031, 1089 bis 1091, 1101 bis 1103, 1137 bis 1139, 1149 bis
1151, 1272 bis 1274, 1293 bis 1295 und 1320 bis 1322 mit einer anderen
Rasensequenz oder anderen Rasensequenzen erhalten wird
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Das
heißt,
die Erfindung umfasst das Gen, welches eine Nitrilhydratase codiert,
die als Bestandteil die α-Untereinheit
umfasst, welche erhalten wird, indem eine oder mehrere der Aminosäuren an
Position 6, 19, 38, 77, 90, 102, 106, 126, 130, 142, 146, 187, 194
und 203 durch eine andere Aminosäure
oder andere Aminosäuren
ersetzt wird.
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Auf ähnliche
Weise lässt
sich ein Nitrilhydratase-Gen angeben, welches als Bestandteil die β-Untereinheit
enthält,
die durch die Rasensequenz wiedergegeben wird, welche durch Ersetzen
von einer oder mehreren Rasensequenzen mit den Basen 73 bis 75,
76 bis 78, 337 bis 339, 613 bis 615 und 649 bis 651 in der Sequenz
NO.2 des Sequenzprotokolls mit einer anderen Rasensequenz oder anderen
Rasensequenzen erhalten wird
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Das
heißt,
die Erfindung umfasst das Gen, welches eine Nitrilhydratase codiert,
die als Bestandteil die β-Untereinheit
umfasst, welche erhalten wird, indem eine oder mehrere der Aminosäuren an
Position 20, 21, 108, 200 und 212 der β-Untereinheit durch eine andere
Aminosäure
oder andere Aminosäuren
ersetzt wird.
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Das
erfindungsgemäße Nitrilhydratase-Gen
ist nicht besonders auf das von Pseudonocardia thermophila stammende
Gen beschränkt
und es umfasst auch das von anderen Bakterienstämmen stammende Nitrilhydratase-Gen,
solange diese von dem erfindungsgemäßen Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
aktiviert werden. Bevorzugte Beispiele für derartige Bakterienstämme sind
Stämme,
die zu den Gattungen Nocardia, Corynebacterium, Bacillus, thermophiler
Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, durch die Art rhodochrous gekennzeichneter
Rhodococcus, Acinetobacter, Xanthobacter, Streptomyces, Rhizobium,
Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Aeromonas, Citrobacter, Achromobacter,
Agrobacterium oder ein anderer Pseudonocadia-Stamm als Pseudonocardia
thermophila JCM3095 gehören.
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Die
Erfindung umfasst auch die Beschaffung des Transformanten, indem
das rekombinante Plasmid in einen optionalen Bakterienwirt eingeführt wird.
Dabei kann ein rekombinantes Plasmid, in welchem das das Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codierende Gen und die α-
Untereinheit und die β-Untereinheit
des Nitrilhydratase-Gens im gleichen Plasmidvektor vorkommen, eingesetzt
werden oder es können
mehrere rekombinante Plasmide, in welchen die jeweiligen Gene in
unabhängigen
Plasmidvektoren vorkommen können, gleichzeitig
eingeführt
werden. Ferner lässt
sich E. coli als typisches Beispiel für den hier angesprochenen optionalen
Wirt angeben. Er ist jedoch nicht besonders auf E. coli beschränkt sondern
umfasst auch Stämme, welche
zur Gattung Bacillus, wie z.B. Bacillus subtilis, gehören sowie
andere Mikrobenstämme
wie z.B. Hefe und Actinomyceten. Ein Beispiel ist MT-10822 (dieser
Stamm wurde gemäß dem japanischen
Regelwerk vom 7. Februar 1996 beim National Institute of Bioscience
and Human-Technology of the Agency of Industrial Science and Technology
of the Ministry of International Trade and Industry hinterlegt und
erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-15426 und wurde dann nach
dem Budapest-Abkommen auf die Internationale Hinterlegungstelle übertragen
und erhielt am 10. Januar 1997 von dieser Hinterlegungsstelle die
Nr. FERM BP-5785; die Anschrift der Hinterlegungsstelle lautet:
1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan).
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In
Bezug auf ein Verfahren zur Konstruktion des erfindungsgemäßen rekombinanten
Plasmids durch Insertion des das Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein
codierenden Gens und/oder des von Pseudonocardia thermophila stammenden
Nitrilhydratase-Gens in den Plasmid-Vektor mit der für die Expression
eines Fremdgens erforderlichen Region kann das rekombinante Plasmid
in einen gewünschten
Wirt transferiert werden, indem auf ein allgemeines auf dem Gebiet
der Gentechnik bekanntes Verfahren Bezug genommen wird, wie dies
in "Molecular Cloning
2nd Edition" (T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1998) beschrieben wird.
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Die
Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer entsprechenden
Amidverbindung aus einer Nitrilverbindung, in den Schritten: gleichzeitiges
Einführen
eines ein Nitrilhydratase-Aktivierungsprotein codierenden Gens und
eines Nitrilhydratase-Gens
in irgendeinen Wirt, Inkubieren des erhaltenen Transformanten in
einem allgemeinen Nährmedium,
um das Enzym zu produzieren, Herstellen eines dieses Enzym produzierenden
Transformanten-Stammes, einer Kulturlösung des Transformanten-Stammes, die aus
der Kulturlösung des
Transformantenstammes erhaltenen Transformantenzellen oder ein behandeltes
Produkt der Transformantenzellen, und in Kontakt Bringen eines jeden
derselben mit einer Nitrilverbindung in einem wässrigen Medium. Der Transformanten-Stamm
lässt sich
unter Einsatz eines allgemeinen auf dem Gebiet der Molekularbiologie,
Biotechnik und Gentechnik bekannten Verfahrens gewinnen. Beispielsweise
ist es ratsam, dass der Transformanten-Stamm in ein gewöhnliches
flüssiges
Medium wie z.B. ein LB-Medium oder ein M9-Medium (vorzugsweise liegen
in einem derartigen Medium Eisenionen und Kobaltionen in einer Menge
von 0,1 μg/ml oder
darüber
vor) überimpft
und bei einer geeigneten Inkubationstemperatur (im Allgemeinen zwischen
20°C und
50°C) angezüchtet wird.
Ferner können
auch die Kulturlösung
selbst, die durch Abtrennen und Wiedergewinnung aus der Kulturlösung mittels
Zentrifugation erhaltenen Transformantenzellen und das behandelte
Produkt der Transformantenzellen verwendet werden. Die hier angesprochenen
behandelten Produkte der Transformantenzellen umfassen einen Extrakt
der Zellen, die zermahlenen Zellen, das durch Abtrennen und Reinigen
der aktiven Nitrilhydratase-Fraktion
aus dem Extrakt oder den zermahlenen Zellen erhaltene Produkt oder das
unter Einsatz eines geeigneten Trägers durch Immobilisierung
der Transformantenzellen oder des Extrakts erhaltene immobilisierte
Produkt, die zermahlenen Zellen oder das Produkt. Die Nitrilverbindung,
aus welcher die entsprechende Amidverbindung hergestellt werden
soll, ist nicht besonders eingeschränkt, so lange sie als Substrat
für die
erfindungsgemäße Nitrilhydratase
fungieren kann Bevorzugte typische Beispiele sind Nitrilverbindungen
wie Acetonitril, Propionitril, Acrylonitril, Methacrylonitril, n-Butyronitril,
Isobutyronitril, Crotonitril, α-Hydroxyisobutyronitril,
Ethylencyanhydrin, Fumaronitril, Malononitril, Benzonitril, Mandelonitril, Cyanopyrazin
und 3-Cyanopyridin. Die Konzentration der Nitrilverbindung in dem
wässrigen
Medium ist nicht besonders eingeschränkt. Die Reaktionstemperatur
ist ebenfalls nicht besonders eingeschränkt. Sie liegt vorzugsweise
in einem solchen Temperaturbereich, dass die Nitrilhydratase nicht
inaktiviert wird, mehr bevorzugt zwischen 0°C bis 50°C.
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Beispiele
-
Die
Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele
näher veranschaulicht.
Die Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt.
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In
der HPLC-Analyse in den Beispielen und den Vergleichsbeispielen
wurde als Säule
die von Nippon Bunko gelieferte Finepak SIL C18-5 (250 × 4,6 mm
(Durchmesser)) mit einer wässrigen
4 Vol-% Acetonitril enthaltende wässrige 10 mM Phosphatlösung als
Elutionsmittel verwendet. Ferner wurden Acrylamid, Acrylonitril und
Acrylsäure
durch ihre Extinktion bei 210 nm nachgewiesen.
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Beispiel 1
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Analyse eines Insertionsfragments des
Stammes MT-10822 (1)
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100
ml eines Mediums der folgenden Formulierung wurden in einen mit
einem Drosselventil ausgestatteten 500 ml Dreihalskolben gegeben
und bei 121°C
20 Minuten lang autoklaviert. Zu diesem Medium wurde Ampicillin
so zugegeben, dass die Endkonzentration 100 μg/ml erreichte und ein loopful
des Stammes MT-10822 (FERM BP-5785) wurde hinein überimpft
und bei 37°C
und 130 Upm 16 Stunden lang inkubiert.
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Nur
die Zellen wurden über
eine Zentrifugation bei 15.000 g über einen Zeitraum von 15 Minuten
von der Kulturlösung
abgetrennt. Danach wurden die Zellen in 50 ml einer physiologischen
Kochsalzlösung
resuspendiert und die nassen Zellen sodann durch erneute Zentrifugation
erhalten. Formulierung
des Mediums:
| Hefe-Extrakt | 5,0
g/Liter |
| Polypepton | 10,0
g/Liter |
| NaCl | 5,0
g/Liter |
| CoCl2 × 6
H2O | 10,0
mg/Liter |
| FeCl2 × 7
H2O | 40,0
mg/Liter |
| pH
7,5 | |
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Aus
den nassen Zellen wurde eine Plasmid-DNA von pPT-DB-1 (
1)
mit Hilfe des Alkali-SDS-Extraktionsverfahrens gewonnen. Die ganze
Rasensequenz des Insertionsfragments wurde mit Hilfe des Primer-Extensions-Verfahrens
unter Einsatz eines Sequenzierungs-Kits und einem von ABI gelieferten
Autosequencer 373 A bestimmt. In Folge davon wurden im Insertionsfragment
die (als ORF1, ORF2 bzw. ORF3) bezeichneten) offenen Leseraster
mit Rasensequenzen von 705 bp, 621 bp und 435 bp vom 5'-Ende her in dieser Reihenfolge
beobachtet. Ferner stimmten die Transkriptionsrichtungen dieser
Raster vollständig überein.
Die vier Basen an der dem 3'-Terminus in ORF1
am nächsten
liegenden Seite, welcher das Translations-Terminations-Codon enthält, überlappte
mit den vier Basen an der Seite, welche dem 5'-Terminus in ORF2 am nächsten liegt.
Auch die vier Basen an der dem 3'-Terminus
in ORF2 am nächsten
liegenden Seite, welcher das Translations-Terminations-Codon enthält, überlappten
mit den vier Basen an der dem 5'-Terminus
in ORF3 am nächsten
liegenden Seite. Wie bereits in der
JP-A-9-275978 beschrieben,
ist ORF1 ein Gen für
die β-Untereinheit der
Nitrilhydratase und ORF2 ein Gen für die α-Untereinheit derselben.
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Sodann
wurde zum erneuten Klonen der gesamten Region von ORF1 bis ORF3
unter Einsatz der ppT-DB1-Plasmid-DNA als Matrize eine PCR durchgeführt.
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Ein
Verfahren mit einer thermischen Denaturierung bei 98°C über einen
Zeitraum von 15 Sekunden, einer Hybridisierung bei 55°C über einen
Zeitraum von 30 Sekunden und einer Verlängerungsreaktion bei 72°C über einen
Zeitraum von 120 Sekunden wurde in einem System mit 25 Zyklen wiederholt,
wobei eine Gesamtmenge von 100 μl
eingesetzt worden war, in denen 100 pM des in der Sequenz NO.3 des
Sequenzprotokolls wiedergegebenen Primers, 100 pM des in der Sequenz
NO.4 des Sequenzprotokolls wiedergegebenen Primers und 5 Einheiten
der Taq-Polymerase enthalten waren, wobei 1 μg der pPT-DB1-Plasmid-DNA als Matrize verwendet
wurde. Die Analyse des amplifizierten DNA-Produkts erfolgte über eine Agarose –Elektrophorese (unter
Einsatz einer von Sigma gelieferten niedrig schmelzenden Agarose
vom Typ VII; Agarose-Konzentration 0,8 Gew.-%) unter Einsatz von
10 μl PCR-Reaktionslösung. Danach
wurde die Gegenwart des amplifizierten DNA-Produkts mit ungefähr 1,8 kbp
nachgewiesen. Sodann wurde nur das DNA-Fragment von 1,8 kbp aus dem
Agarose-Gel ausgeschnitten. Ungefähr 0,1 g des Agarose-Anteils
wurden fein zerteilt und in 1 ml einer TE-Lösung suspendiert. Die Suspension
wurde 1 Stunde lang bei 55°C
gehalten, um die Agarose vollständig zu
schmelzen. Diese Schmelze wurde einer Extraktion mit Phenol und
Chloroform unterzogen, dann wurde mit Ethanol gefällt. Zunächst wurde
1 ml einer mit TE (eine 1 mM EDTA × 2 Na enthaltende wässrige 10
mM Trishydrochloridlösung.
pH 8,0) gesättigten
Phenollösung
zugesetzt und die Mischung sanft gerührt. Die wässrige Phase und die organische
Phase wurden mittels Zentrifugation bei 3.000 Upm über einen
Zeitraum von 10 Minuten voneinander getrennt und nur die wässrige Phase
allein gesammelt. Dieses Verfahren wurde 3 Mal wiederholt. Sodann
wurden zu der erhaltenen wässrigen
Phase 0,4 ml der mit TE gesättigten
Phenollösung
und 0,4 ml Chloroform gegeben. Die Mischung wurde wieder sanft gerührt. Danach
wurden erneut die wässrige Phase
und die organische Phase mittels Zentrifugation bei 3.000 Upm über einen
Zeitraum von 10 Minuten voneinander getrennt und nur die wässrige Phase
allein wurde wieder gesammelt. Dieser wässrigen Phase wurden 0,8 ml
Chloroform zugesetzt. Die Mischung wurde sanft gerührt. Dann
wurden die wässrige
Phase und die organische Phase mittels Zentrifugation bei 3.000
Upm über
einen Zeitraum von 10 Minuten wieder voneinander getrennt und nur
die wässrige
Phase allein gesammelt. Zu dieser wässrigen Phase wurden 80 μl einer 1,1
M NaCl und 1,7 ml Ethanol enthaltenden TE-Lösung gegeben. Die Mischung
wurde bei –80°C 30 Minuten
lang stehen gelassen. Danach wurde der Niederschlag des DNA-Fragments
durch Zentrifugation bei 4°C
und 15.000 Upm über
einen Zeitraum von 20 Minuten gewonnen. Das DNA-Fragment wurde mit
Luft getrocknet und dann abschließend in 10 μl TE gelöst. Das amplifizierte DNA-Fragment
von ungefähr
1,8 kbp wurde mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und SphI herausgeschnitten.
Diese mit den Endonucleasen behandelte Lösung wurde der oben beschriebenen
Extraktion mit Phenol und Chloroform sowie der Ethanolfällung unterzogen,
um das DNA-Fragment wieder zu reinigen. Schließlich wurde dieses Fragment
in 10 μl
TE gelöst.
Auch der pUC18-Vektor wurde mit EcoRI und SphI an den einzigen Restriktionsendonucleasestellen im
Vektor geschnitten. Es erfolgte eine Elektrophorese auf einem Agarose-Gel
(unter Einsatz einer von Sigma gelieferten niedrig schmelzenden
Agarose vom Typ VII; Agarose-Konzentration 0,7%) und nur das DNA-Fragment von ungefähr 2,7 kbp
wurde aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten. Der Agarose-Anteil (ungefähr 0,1 g) wurde
fein zerteilt und in 1 ml TE-Lösung
suspendiert. Die Suspension wurde 1 Stunde lang bei 55°C gehalten, um
die Agarose vollständig
zu schmelzen. Diese Schmelze wurde der oben beschriebenen Extraktion
mit Phenol und Chloroform sowie einer Ethanolfällung unterzogen, um das DNA-Fragment
zu reinigen. Schließlich wurde
dieses Fragment in 10 μl
TE gelöst.
Das so erhaltene amplifizierte DNA-Produkt wurde mit dem pUC18-Fragment
unter Einsatz eines DNA-Ligations-Kits (von Takara Shuzo geliefert)
ligiert, um das Plasmid pPT-D1 (2) zu konstruieren.
Ferner wird die gesamte Rasensequenz des Insertionsfragments zwischen der
EcoRI-Stelle und der SphI-Stelle des konstruierten pPT-D1 in der
Sequenz NO.2 des Sequenzprotokolls wiedergegeben.
-
Unter
Einsatz von kompetenten Zellen des von der Toyobo Co., Ltd. gelieferten
E. coli-HB101-Stammes
wurde das pPT-D1 in den HB101-Stamm eingeführt, um den transformierten
Strang Nr.1 zu erhalten. Ein LB-Flüssigmedium mit der oben angegebenen
Formulierung wurde in einen mit einem Drosselventil ausgestatteten
500 ml Dreihalskolben gegeben und bei 121°C 20 Minuten lang autoklaviert.
Zu diesem Medium wurde Ampicillin so zugegeben, dass die Endkonzentration
100 μg/ml
erreichte und ein loopful des erhaltenen transformierten Stammes
Nr.1 wurde hinein überimpft
und bei 37°C
und 130 Upm ungefähr
20 Stunden lang inkubiert. Nur die Zellen wurden von der Kulturlösung durch
Zentrifugation bei 5.000 g über
einen Zeitraum von 15 Minuten abgetrennt. Danach wurden die Zellen
in 50 ml physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert und die nassen
Zellen wurden dann durch erneute Zentrifugation gewonnen. 100 mg
der nassen Zellen wurden in 200 ml einer wässrigen Lösung von 50 mM Kaliumphosphat
(pH 7,0) suspendiert und dieser Suspension 10 ml Acrylnitril zugesetzt.
Die Mischung wurde bei 10°C
1 Stunde lang unter sanftem Rühren
reagieren gelassen. Nach dem Ende der Reaktion wurde die Reaktionslösung wie
in Beispiel 1 mittels HPLC analysiert. Danach kam in der Reaktionslösung nur
Acrylamid vor und Acrylnitril und Acrylsäure wurden darin nicht beobachtet. Das
bedeutet, dass die Umwandlung und Selektivität 100% betrugen.
-
Vergleichsbeispiel 1
-
Analyse eines Insertionsfragments des
Stammes MT-10822 (2)
-
Zum
Reklonieren der Region von ORF1 bis zur oberen Hälfte von ORF3 wurde unter Einsatz
der pPT-DB1-Plasmid-DNA als Matrize eine PCR durchgeführt.
-
Ein
Verfahren mit einer thermischen Denaturierung bei 98°C über einen
Zeitraum von 15 Sekunden, einer Hybridisierung bei 55°C über einen
Zeitraum von 30 Sekunden und einer Verlängerungsreaktion bei 72°C über einen
Zeitraum von 120 Sekunden wurde in einem System mit 25 Zyklen wiederholt,
wobei eine Gesamtmenge von 100 μl
eingesetzt worden war, in denen 100 pM des in der Sequenz NO.3 des
Sequenzprotokolls wiedergegebenen Primers, 100 pM des in der Sequenz
NO.5 des Sequenzprotokolls wiedergegebenen Primers und 5 Einheiten
der Taq-Polymerase enthalten waren, wobei 1 μg der in Beispiel 1 gewonnenen pPT-DB1-Plasmid-DNA
als Matrize verwendet wurde. Die Analyse des amplifizierten DNA-Produkts
erfolgte über
eine Agarose –Elektrophorese
(unter Einsatz einer von Sigma gelieferten niedrig schmelzenden
Agarose vom Typ VII; Agarose-Konzentration
0,9 Gew.-%) unter Einsatz von 10 μl
PCR-Reaktionslösung.
Danach wurde die Gegenwart des amplifizierten DNA-Produkts mit ungefähr 1,6 kbp
nachgewiesen. Sodann wurde nur das DNA-Fragment von ungeführ 1,6 kbp
aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten. Ungefähr 0,1 g des Agarose-Anteils
wurden fein zerteilt und in 1 ml einer TE-Lösung suspendiert. Die Suspension
wurde 1 Stunde lang bei 55°C
gehalten, um die Agarose vollständig
zu schmelzen. Diese Schmelze wurde einer Extraktion mit Phenol und
Chloroform unterzogen, dann wurde wie in Beispiel 1 mit Ethanol
gefällt,
um das amplifizierte DNA-Fragment zu reinigen. Das amplifizierte
gereinigte DNA-Fragment von ungefähr 1,6 kbp wurde mit den Restriktionsendonucleasen
EcoRI und SphI geschnitten. Die mit den Restriktionsendonucleasen
behandelte Lösung
wurde sodann einer Extraktion mit Phenol und Chloroform und wie
in Beispiel 1 einer Ethanolfällung unterzogen,
um das DNA-Fragment erneut zu reinigen und dieses wurde abschließend in
10 μl TE
gelöst.
Das erhaltene amplifizierte DNA-Produkt und das in Beispiel 1 gewonnene
pUC18-EcoRI-SphI-Fragment
von ungefähr
2,7 kbp wurde unter Einsatz eines DNA.Ligations-Kits (von Takara
Shuzo geliefert) ligiert, um das Plasmid pPT-E1 (3)
zu konstruieren.
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Unter
Einsatz von kompetenten Zellen des von der Toyobo Co., Ltd. gelieferten
E. coli-HB101-Stammes
wurde das pPT-E1 in den HB101-Stamm eingeführt, um den transformierten
Strang Nr.2 zu erhalten. Ein LB-Flüssigmedium mit der gleichen
Formulierung wie in Beispiel 1 wurde in einen mit einem Drosselventil
ausgestatteten 500 ml Dreihalskolben gegeben und bei 121°C 20 Minuten
lang autoklaviert. Zu diesem Medium wurde Ampicillin so zugegeben,
dass die Endkonzentration 100 μg/ml
erreichte und ein loopful des erhaltenen transformierten Stammes
Nr.2 wurde hinein überimpft
und bei 37°C
und 130 Upm ungefähr
20 Stunden lang inkubiert. Nur die Zellen wurden von der Kulturlösung durch
Zentrifugation bei 5.000 g über
einen Zeitraum von 15 Minuten abgetrennt. Danach wurden die Zellen
in 50 ml physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert und die
nassen Zellen dann durch erneute Zentrifugation gewonnen. 100 mg
der nassen Zellen wurden in 200 ml einer wässrigen Lösung von 50 mM Kaliumphosphat
(pH 7,0) suspendiert und 10 ml Acrylnitril zu dieser Suspension
gegeben. Die Mischung wurde bei 10°C 1 Stunde lang unter sanftem
Rühren
reagieren gelassen. Nach dem Ende der Reaktion wurde die Reaktionslösung wie
in Beispiel 1 mittels HPLC analysiert. Danach wurde in der Reaktionslösung kein
Acrylamid beobachtet und es wurde nur nicht reagiertes Acrylnitril
bemerkt. Ferner wurde darin keine Acrylsäure beobachtet. Das bedeutet,
dass die Umwandlung und Selektivität 0% betrugen.
-
Inzwischen
wurde in den von der Kulturlösung
abgetrennten Zellen das Vorkommen von Polypeptidketten beobachtet,
welche den α-
und β-Untereinheiten
von Pseudonocardia thermophila entsprechen.
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Vergleichsbeispiel 2
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Analyse eines Insertionsfragments des
Stammes MT-10822 (3)
-
Für das Reklonieren
der gesamten Region von ORF1 bis ORF2 wurde unter Einsatz der pPT-DB1-Plasmid-DNA
als Matrize eine PCR durchgeführt.
-
Ein
Verfahren mit einer thermischen Denaturierung bei 98°C über einen
Zeitraum von 15 Sekunden, einer Hybridisierung bei 55°C über einen
Zeitraum von 30 Sekunden und einer Verlängerungsreaktion bei 72°C über einen
Zeitraum von 120 Sekunden wurde in einem System mit 25 Zyklen wiederholt,
wobei eine Gesamtmenge von 100 μl
eingesetzt worden war, in denen 100 pM des in der Sequenz NO.3 des
Sequenzprotokolls wiedergegebenen Primers, 100 pM des in der Sequenz
NO.6 des Sequenzprotokolls wiedergegebenen Primers und 5 Einheiten
der Taq-Polymerase enthalten waren, wobei 1 μg der in Beispiel 1 gewonnenen pPT-DB1-Plasmid-DNA
als Matrize verwendet wurde. Die Analyse des amplifizierten DNA-Produkts
erfolgte über
eine Agarose –Elektrophorese
(unter Einsatz einer von Sigma gelieferten niedrig schmelzenden
Agarose vorn Typ VII; Agarose-Konzentration
0,9 Gew.-%) unter Einsatz von 10 μl
PCR-Reaktionslösung.
Danach wurde die Gegenwart des amplifizierten DNA-Produkts mit ungefähr 1,3 kbp
nachgewiesen. Sodann wurde nur das DNA-Fragment von ungefähr 1,3 kbp
aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten. Ungefähr 0,1 g des Agarose-Anteils
wurden fein zerteilt und in 1 ml einer TE-Lösung suspendiert. Die Suspension
wurde 1 Stunde lang bei 55°C
gehalten, um die Agarose vollständig
zu schmelzen. Diese Schmelze wurde einer Extraktion mit Phenol und
Chloroform unterzogen, dann wurde wie in Beispiel 1 mit Ethanol
gefällt,
um das amplifizierte DNA-Fragment zu reinigen. Das amplifizierte
gereinigte DNA-Fragment von ungefähr 1,3 kbp wurde mit den Restriktionsendonucleasen
EcoRI und SphI geschnitten. Die mit den Restriktionsendonucleasen
behandelte Lösung
wurde sodann einer Extraktion mit Phenol und Chloroform und wie
in Beispiel 1 einer Ethanolfällung unterzogen,
um das DNA-Fragment erneut zu reinigen und dieses wurde abschließend in
10 μl TE
gelöst.
Das erhaltene amplifizierte DNA-Produkt und das in Beispiel 1 gewonnene
pUC18-EcoRI-SphI-Fragment
von ungefähr
2,7 kbp wurde unter Einsatz eines DNA.Ligations-Kits (von Takara
Shuzo geliefert) ligiert, um das Plasmid pPT-F1 (4)
zu konstruieren.
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Unter
Einsatz von kompetenten Zellen des von der Toyobo Co., Ltd. gelieferten
E. coli-HB101-Stammes
wurde das pPT-F1 in den HB101-Stamm eingeführt, um den transformierten
Strang Nr.3 zu erhalten. Ein LB-Flüssigmedium mit der gleichen
Formulierung wie in Beispiel 1 wurde in einen mit einem Drosselventil
ausgestatteten 500 ml Dreihalskolben gegeben und bei 121°C 20 Minuten
lang autoklaviert. Zu diesem Medium wurde Ampicillin so zugegeben,
dass die Endkonzentration 100 μg/ml
erreichte und ein loopful des erhaltenen transformierten Stammes
Nr.3 wurde hinein überimpft
und bei 37°C
und 130 Upm ungefähr
20 Stunden lang inkubiert. Nur die Zellen wurden von der Kulturlösung durch
Zentrifugation bei 5.000 g über
einen Zeitraum von 15 Minuten abgetrennt. Danach wurden die Zellen
in 50 ml physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert und die
nassen Zellen wurden dann durch erneute Zentrifugation gewonnen.
100 mg der nassen Zellen wurden in 200 ml einer wässrigen
Lösung
von 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,0) suspendiert und 10 ml Acrylnitril
wurden zu dieser Suspension gegeben. Diese Mischung wurde bei 10°C 1 Stunde
lang unter sanftem Rühren
reagieren gelassen. Nach dem Ende der Reaktion wurde die Reaktionslösung wie
in Beispiel 1 mittels HPLC analysiert. Danach wurde in der Reaktionslösung kein
Acrylamid beobachtet und es wurde nur nicht reagiertes Acrylnitril
bemerkt. Ferner wurde darin keine Acrylsäure beobachtet. Das bedeutet,
dass die Umwandlung und Selektivität 0% betrugen.
-
Inzwischen
wurde in den von der Kulturlösung
abgetrennten Zellen das Vorkommen von Polypeptidketten beobachtet,
welche den α-
und β-Untereinheiten
von Pseudonocardia thermophila entsprechen.
-
Vergleichsbeispiel 3
-
Analyse eines Insertionsfragments des
Stammes MT-10822 (4)
-
Für das Reklonieren
der gesamten Region von ORF3 wurde unter Einsatz der pPT-DB1-Plasmid-DNA als Matrize
eine PCR durchgeführt.
-
Ein
Verfahren mit einer thermischen Denaturierung bei 98°C über einen
Zeitraum von 15 Sekunden, einer Hybridisierung bei 55°C über einen
Zeitraum von 30 Sekunden und einer Verlängerungsreaktion bei 72°C über einen
Zeitraum von 120 Sekunden wurde in einem System mit 25 Zyklen wiederholt,
wobei eine Gesamtmenge von 100 μl
eingesetzt worden war, in denen 100 pM des in der Sequenz NO.7 des
Sequenzprotokolls wiedergegebenen Primers, 100 pM des in der Sequenz
NO.4 des Sequenzprotokolls wiedergegebenen Primers und 5 Einheiten
der Taq-Polymerase enthalten waren, wobei 1 μg der in Beispiel 1 gewonnenen pPT-DB1-Plasmid-DNA
als Matrize verwendet wurde. Die Analyse des amplifizierten DNA-Produkts
erfolgte über
eine Agarose –Elektrophorese
(unter Einsatz einer von Sigma gelieferten niedrig schmelzenden
Agarose vom Typ VII; Agarose-Konzentration
1,2 Gew.-%) unter Einsatz von 10 μl
PCR-Reaktionslösung.
Danach wurde die Gegenwart des amplifizierten DNA-Produkts mit ungefähr 450 bp
nachgewiesen. Sodann wurde nur das gereinigte DNA-Fragment von ungefähr 450 bp
aus dem Agarose-Gel
ausgeschnitten. Ungefähr
0,1 g des Agarose-Anteils wurden fein zerteilt und in 1 ml einer
TE-Lösung
suspendiert. Die Suspension wurde 1 Stunde lang bei 55°C gehalten,
um die Agarose vollständig
zu schmelzen. Diese Schmelze wurde einer Extraktion mit Phenol und
Chloroform unterzogen, dann wurde wie in Beispiel 1 mit Ethanol
gefällt,
um das amplifizierte DNA-Fragment zu reinigen. Das amplifizierte
DNA-Fragment von ungefähr
450 bp wurde mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und SphI geschnitten.
Die mit den Restriktionsendonucleasen behandelte Lösung wurde
sodann einer Extraktion mit Phenol und Chloroform und wie in Beispiel
1 einer Ethanolfällung
unterzogen, um das DNA-Fragment
erneut zu reinigen und dieses wurde abschließend in 10 μl TE gelöst. Das erhaltene amplifizierte
DNA-Produkt und das in Beispiel 1 gewonnene pUC 18-EcoRI-SphI-Fragment von
ungefähr
2,7 kbp wurde unter Einsatz eines DNA.Ligations-Kits (von Takara
Shuzo geliefert) ligiert, um das Plasmid pPT-G1 (5)
zu konstruieren.
-
Unter
Einsatz von kompetenten Zellen des von der Toyobo Co., Ltd. gelieferten
E. coli-HB101-Stammes
wurde das pPT-G1 in den HB101-Stamm eingeführt, um den transformierten
Strang Nr.4 zu erhalten. Ein LB-Flüssigmedium mit der gleichen
Formulierung wie in Beispiel 1 wurde in einen mit einem Drosselventil
ausgestatteten 500 ml Dreihalskolben gegeben und bei 121°C 20 Minuten
lang autoklaviert. Zu diesem Medium wurde Ampicillin so zugegeben,
dass die Endkonzentration 100 μg/ml
erreichte und ein loopful des erhaltenen transformierten Stammes
Nr.4 wurde hinein überimpft
und bei 37°C
und 130 Upm ungefähr
20 Stunden lang inkubiert. Nur die Zellen wurden von der Kulturlösung durch
Zentrifugation bei 5.000 g über
einen Zeitraum von 15 Minuten abgetrennt. Danach wurden die Zellen
in 50 ml physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert und die
nassen Zellen dann durch erneute Zentrifugation gewonnen. 100 mg
der nassen Zellen wurden in 200 ml einer wässrigen Lösung von 50 mM Kaliumphosphat
(pH 7,0) suspendiert und 10 ml Acrylnitril zu dieser Suspension
gegeben. Die Mischung wurde bei 10°C 1 Stunde lang unter sanftem
Rühren
reagieren gelassen. Nach dem Ende der Reaktion wurde die Reaktionslösung wie
in Beispiel 1 mittels HPLC analysiert. Danach wurde in der Reaktionslösung kein
Acrylamid beobachtet und es wurde nur nicht reagiertes Acrylnitril
bemerkt. Ferner wurde darin keine Acrylsäure beobachtet. Das bedeutet,
dass die Umwandlung und Selektivität 0% betrugen.
-
Beispiel 2
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Analyse eines Insertionsfragments des
Stammes MT-10822 (5)
-
Eine
Region, welche den lacZ-Promotor, ORF2 der β-Untereinheit und ORF1 der α-Untereinheit in dem
in Vergleichsbeispiel 2 produzierten pPT-F1 enthielt, wurde in die
3'-endständige Seite
der ORF3-Region des pPT-G1-Plasmids kloniert.
-
Ein
Verfahren mit einer thermischen Denaturierung bei 98°C über einen
Zeitraum von 15 Sekunden, einer Hybridisierung bei 55°C über einen
Zeitraum von 30 Sekunden und einer Verlängerungsreaktion bei 72°C über einen
Zeitraum von 120 Sekunden wurde in einem System mit 25 Zyklen wiederholt,
wobei eine Gesamtmenge von 100 μl
eingesetzt worden war, in denen 100 pM des in der Sequenz NO.8 des
Sequenzprotokolls wiedergegebenen Primers, 100 pM des in der Sequenz
NO.9 des Sequenzprotokolls wiedergegebenen Primers und 5 Einheiten
der Taq-Polymerase enthalten waren, wobei 1 μg der in Vergleichsbeispiel
1 gewonnenen pPT-F1-Plasmid-DNA als Matrize verwendet wurde. Die
Analyse des amplifizierten DNA-Produkts erfolgte über eine
Agarose –Elektrophorese
(unter Einsatz einer von Sigma gelieferten niedrig schmelzenden
Agarose vom Typ VII; Agarose-Konzentration 0,8 Gew.-%) unter Einsatz
von 10 μl
PCR-Reaktionslösung.
Danach wurde die Gegenwart des amplifizierten DNA-Produkts mit ungefähr 2,0 kbp
nachgewiesen. Sodann wurde nur das DNA-Fragment von ungefähr 2,0 kbp
aus dem Agarose-Gel ausgeschnitten. Ungefähr 0,1 g des Agarose-Anteils
wurden fein zerteilt und in 1 ml einer TE-Lösung suspendiert. Die Suspension
wurde 1 Stunde lang bei 55°C
gehalten, um die Agarose vollständig
zu schmelzen. Diese Schmelze wurde einer Extraktion mit Phenol und
Chloroform unterzogen, dann wurde wie in Beispiel 1 mit Ethanol
gefällt,
um das amplifizierte DNA-Fragment zu reinigen. Das amplifizierte
DNA-Fragment von
ungefähr
2,0 kbp wurde mit den Restriktionsendonucleasen SphI und HindIII
geschnitten. Die mit den Restriktionsendonucleasen behandelte Lösung wurde
sodann einer Extraktion mit Phenol und Chloroform und wie in Beispiel
1 einer Ethanolfällung
unterzogen, um das DNA-Fragment erneut zu reinigen und dieses wurde
abschließend
in 10 μl
TE gelöst.
Das gleiche Plasmid wurde ebenfalls an den einzigen Restriktionsendonucleasestellen
des pPT-G1-Plasmids mit SphI und HindIII geschnitten. Es erfolgte
eine Elektrophorese auf einem Agarose-Gel (unter Einsatz einer von
Sigma gelieferten niedrig schmelzenden Agarose vom Typ VII; Agarose-Konzentration
0,7%) und nur das DNA-Fragment von ungefähr 3,1 kbp wurde aus dem Agarose-Gel
ausgeschnitten. Ungefähr
0,1 g des Agarose-Anteils wurden fein zerteilt und in 1 ml TE-Lösung suspendiert. Die Suspension
wurde 1 Stunde lang bei 55°C
gehalten, um die Agarose vollständig
zu schmelzen. Diese Schmelze wurde wie in Beispiel 1 beschriebenen
einer Extraktion mit Phenol und Chloroform sowie einer Ethanolfällung unterzogen,
um das DNA-Fragment zu reinigen und abschließend wurde es in 10 μl TE gelöst. Das
so erhaltene amplifizierte DNA-Produkt und das pPT-G1-SphI-HindIII-Fragment
wurden unter Einsatz eines DNA-Ligations-Kits (von Takara Shuzo
geliefert) ligiert, um das Plasmid pPT-H1 (6) zu konstruieren.
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Unter
Einsatz von kompetenten Zellen des von der Toyobo Co., Ltd. gelieferten
E. coli-HB101-Stammes
wurde das pPT-H1 in den HB101-Stamm eingeführt, um den transformierten
Strang Nr. 5 zu erhalten. Ein LB-Flüssigmedium mit der oben angegebenen
Formulierung wurde in einen mit einem Drosselventil ausgestatteten
500 ml Dreihalskolben gegeben und bei 121°C 20 Minuten lang autoklaviert.
Zu diesem Medium wurde Ampicillin so zugegeben, dass die Endkonzentration
100 μg/ml
erreichte und ein loopful des erhaltenen transformierten Stammes
Nr.5 wurde hinein überimpft
und bei 37°C
und 130 Upm ungefähr
20 Stunden lang inkubiert. Nur die Zellen wurden von der Kulturlösung durch
Zentrifugation bei 5.000 g über
einen Zeitraum von 15 abgetrennt. Danach wurden die Zellen in 50
ml physiologischer Kochsalzlösung
resuspendiert und die nassen Zellen dann durch erneute Zentrifugation
gewonnen. 100 mg der nassen Zellen wurden in 200 ml einer wässrigen
Lösung
von 50 mM Kaliumphosphat (pH 7,0) suspendiert und 10 ml Acrylnitril
wurden zu dieser Suspension gegeben. Die Mischung wurde bei 10°C 1 Stunde
lang unter sanftem Rühren
reagieren gelassen. Nach dem Ende der Reaktion wurde die Reaktionslösung wie
in Beispiel 1 mittels HPLC analysiert. Danach kam nur Acrylamid
in der Reaktionslösung
vor und Acrylnitril und Acrylsäure
wurden darin nicht beobachtet. Das bedeutet, dass die Ümwandlung
und Selektivität
100% betrugen.
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Wirkungen der Erfindung
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Die
Erfindung stellt ein Protein zur Aktivierung der Nitrilhydratase
zur Verfügung,
das bei der Aktivierung der von Pseudonocardia thermophila JCM3095
stammenden Nitrilhydratase beteiligt ist, sowie eine dieses Protein
codierende Gensequenz. Ferner stellt die Erfindung ein dieses Gen
enthaltendes rekombinantes Plasmid, ein das Gen und ein Nitrilhydratase-Gen
enthaltendes rekombinantes Plasmid, einen über eine Transformation mit
dem rekombinanten Plasmid erhaltenen transformierten Stamm sowie
ein Verfahren zur Produktion einer entsprechenden Amidverbindung
aus einer Nitrilverbindung unter Einsatz der Kulturlösung, die
durch Inkubation des transformierten Stammes erhaltenen Zellen oder
behandelte Produkte derselben zur Verfügung.
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Darüber hinaus
lässt sich
erfindungsgemäß bei der
industriellen Produktion einer Amidverbindung aus einer Nitrilverbindung
unter Einsatz der von Pseudonocardia thermophila stammenden Nitrilhydratase
das Enzym über
ein gentechnisches Verfahren in großen Mengen produzieren, wodurch
sich die überwiegend
auf die Produktionskosten der Amidverbindung zurückzuführenden Herstellungskosten
für das
Enzym senken lassen. (Sequenzprotokoll)
