DE3922137C2

DE3922137C2 - DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert, und Verfahren zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen mit einer Transformante, die die DNA-Sequenz enthält

Info

Publication number: DE3922137C2
Application number: DE3922137A
Authority: DE
Inventors: Teruhiko Beppu; Sueharu Horinouchi; Osamu Ikehata; Takakazu Endo
Original assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 1988-07-06
Filing date: 1989-07-05
Publication date: 1997-02-27
Anticipated expiration: 2009-07-06
Also published as: FR2633938A1; DE3922137A1; US5130235A; FR2633938B1; JPH02119778A; JP2840253B2

Description

Die Erfindung betrifft eine von Rhodococcus sp. N-774 abge leitete DNA-Sequenz, die ein als Nitrilhydratase wirksames Polypeptid codiert, das Nitrile in ihre entsprechenden Amide umzusetzen vermag. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfah ren zur Herstellung von Amiden aus Nitrilen mit einer Trans formante, die DNA-Sequenzen enthält.

Ein Nitrile hydratisierendes Enzym, das die entsprechenden Amide bildet, ist als Nitrilase oder Nitrilhydratase be kannt. Beispiele von Mikroorganismen, die das Enzym herstel len, sind Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Bacteridium, Micrococcus und Brevibacterium (vgl. US-PS 4,001,081), Corynebacterium und Nocardia (vgl. US-PS 4,248,968), Pseudo monas (vgl. US-PS 4,637,982) und Rhodococcus, Arthrobacter und Microbacterium, vgl. EP-A 0 188 316).

Bei der Hydratisierung von Nitrilen unter Mitwirkung eines Nitrilhydratase-Gens, das durch gentechnologische Clonierung hergestellt wurde, können in einem Mikroorganismus viele Ko pien des Nitrilhydratase-Gens hergestellt werden. Somit sollten die katalytischen Fähigkeiten eines Mikroorganismus gegenüber üblichen Verfahren erheblich gesteigert werden können.

Deshalb wurde erfindungsgemäß eine DNA-Sequenz aus einem Mikroorganismus der Gattung Rhodococcus isoliert, die ein Polypeptid mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert. Außerdem wurde durch Einbau der DNA-Sequenz in einem Vektor ein re kombinantes DNA-Molekül sowie entsprechende transformierte Mikroorganismen hergestellt. Damit wurde eine Transformante mit höherer Nitrilhydratase-Aktivität hergestellt, mit der sich Amide in hohen Ausbeuten herstellen lassen.

Der vorliegenden Erfindung liegt also das technische Problem zugrunde, eine DNA-Sequenz bereitzustellen, die ein Polypep tid mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert. Ferner liegt ihr das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur Herstel lung von Amiden aus Nitrilen bereitzustellen, bei dem Trans formanten verwendet werden, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein Polypeptid mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert.

Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Somit wird erfindungsgemäß eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die ein Polypeptid mit den nachstehend beschriebenen Amino säure-Sequenzen der α- und β-Untereinheit codiert, das Ni trilhydratase-Aktivität aufweist. Ferner wird ein Expres sions-Plasmid bereitgestellt, das diese DNA-Sequenz enthält sowie eine Transformante, die mit dem Expressionsplasmid transformiert ist. Schließlich wird ein Verfahren zur Her stellung von Nitrilhydratase mit der erfindungsgemäßen Transformate bereitgestellt, sowie ein Verfahren zur Her stellung von Amiden aus den entsprechenden Nitrilen durch Einwirkung der Transformante auf die Nitrile.

Die Figuren zeigen:

Fig. 1 (1) Ergebnisse der Aminosäure-Sequenzierung bei der Herstellung von DNA-Sondenmolekülen und die bei der Sondenmolekül-Synthese verwendeten Aminosäure-Se quenzen (unterstrichener Teil).
(2) DNA-Sequenzen der Sondenmoleküle.

Fig. 2 Restriktions-Karte des rekombinanten Plasmids pYUK120

Fig. 3 DNA-Sequenz des von N-774 abgeleiteten DNA-Frag ments, das im rekombinanten Plasmid pYUK121 enthal ten ist und entsprechende Aminosäure-Sequenz.

Fig. 4 Schematische Darstellung der Herstellung des Ex pressionsplasmids pYuK121.

Erfindungsgemäß wird eine DNA-Sequenz bereitgestellt, die ein Polypeptid mit den folgenden Aminosäure-Sequenzen der α- und β-Untereinheit und mit Nitrilhydratase-Aktivität co diert:

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die die α- und β- Untereinheit codierenden DNA-Sequenzen die folgenden:

Ferner wird erfindungsgemäß ein rekombinantes DNA-Molekül bereitgestellt, in das die vorstehend genannte DNA-Sequenz oder die DNA-Sequenzen integriert sind.

Ferner werden erfindungsgemäß Transformanten bereitgestellt, die das erfindungsgemäße rekombinante DNA-Molekül enthalten.

Außerdem wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratase durch Züchtung der erfindungsgemäßen Transformanten bereitgestellt.

Darüber hinaus wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Her stellung von Amiden aus den entsprechenden Nitrilen durch Züchtung einer erfindungsgemäßen Transformante bereitge stellt, bei dem die erhaltene Nitrilhydratase auf die Nitrile zur Herstellung der entsprechenden Amide einwirkt. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wer den aus der gezüchteten Transformante Kulturlösungen, Iso late, behandelte Zellen oder immobilisierte Derivate davon zur Umsetzung der Nitrile zu den entsprechenden Aminen her gestellt.

Erfindungsgemäß werden die folgenden Schritte (1) bis (8) durchgeführt; vgl. auch nachfolgende Beispiele.

(1) Partielle Bestimmung der Aminosäure-Sequenz einer Nitrilhydratase und Herstellung von DNA-Sondenmolekülen

Rhodococcus sp. N-774 wird inkubiert und geerntet. Sodann wird Nitrilhydratase daraus extrahiert und gereinigt. An schließend wird sie durch Hochleistungsflüssigkeitschromato graphie in zwei Untereinheiten zerlegt. Sodann wird ein Teil der Aminosäure-Sequenz jeder Untereinheit bestimmt. Anhand dieser Aminosäure-Sequenz werden DNA-Sequenzen als Sondenmo leküle hergestellt (Fig. 1).

(2) Herstellung von das Nitrilhydratase-Gen enthaltenden DNA-Fragmenten

Chromosomale DNA wird aus Rhodococcus sp. N-774 hergestellt. Die isolierte chromosomale DNA wird mit einem Restriktions enzym gespalten. Sodann werden DNA-Fragmente, die das ge wünschte Gen enthalten, mit den vorstehend gemäß (1) erhal tenen Sondenmolekülen durch Hybridisierung nach Southern nachgewiesen; vgl. Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975), 503.

(3) Insertion chromosomaler DNA-Fragmente in Vektoren

Gemäß (2) hergestellte chromosomale DNA-Fragmente werden in Vektoren eingebaut, um eine Genbank zu erhalten.

(4) Herstellung von Transformanten und Selektion rekombinanter DNA-Moleküle

Mit der gemäß (3) hergestellten Genbank werden Transforman ten hergestellt. Aus diesen wird mit den gemäß (1) herge stellten Sondenmolekülen in einer Kolonie-Hybridisierung das gewünschte rekombinante DNA-Molekül selektiert; vgl. Wallace et al., Nucl. Aci. Res. 9 (1981), 879. Sodann wird die Authentizität des isolierten rekombinanten DNA-Moleküls durch eine weitere Hybridisierung nach Southern bestätigt. Das so erhaltene rekombinante DNA-Molekül wird als Plasmid pYUK120 bezeichnet.

(5) Reinigung des rekombinanten DNA-Moleküls und Erstellung einer Restriktionskarte

Nach dem Reinigen des Plasmids pYUK120 aus (4) wird eine Re striktionskarte hergestellt, um die Lage des darin enthalte nen Gens zu ermitteln; vgl. Fig. 2.

(6) Bestimmung der DNA-Sequenz

Aus einem vom Elterstamm pYUK120 abgeleiteten, chromosomalen DNA-Fragment werden die unnötigen Teile mit einem Restrik tionsenzym entfernt. Sodann wird die gesamte DNA-Sequenz des erhaltenen DNA-Fragments bestimmt; vgl. Fig. 3. Somit wird bestätigt, daß das DNA-Fragment die ausgehend von der Amino säure-Sequenz gemäß (1) erwartete DNA-Sequenz aufweist.

(7) Herstellung eines Expressionsplasmids und einer Transformante

Das gemäß (6) hergestellte DNA-Fragment, das das gewünschte Gen enthält, wird in pUC19 (erhältlich bei Takara Shuzo Co., Ltd.) stromabwärts vom lac-Promotor ligiert. Somit wird das Expressionsplasmid pYUK121 erhalten; vgl. Fig. 4. Dieses Plasmid wird in E. coli 105 (erhältlich bei Amersham Inc.) eingeführt.

(8) Herstellung von Nitrilhydratase mit der Transformante und Umsetzung von Nitrilen in Amide

Die gemäß (7), oben, erhaltene Transformante mit dem Plasmid pYUK121 wird inkubiert. Aus der Kultur wird ein Enzym-Roh präparat gewonnen. Dieses Rohpräparat wird mit einer Nitrile enthaltenden Substratlösung zur Herstellung von Amiden ver mischt.

Rhodococcus sp. N-774 wurde in der 8. Auflage von Bergy′s "Manual of Determinative Bacteriology" (1974) als Mitglied der Gattung Corynebacterium bestimmt. Es ist beim Fermenta tion Research Institute unter der Hinterlegungs-Nummer FERM- P 4446 hinterlegt; vgl. US-PS 4,248,968. Ferner ist Rhodo coccus sp. N-774 und die Transformante E. coli JM105/pYUK121 beim Fermentation Research Institute nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages unter den Hinterlegungs-Nummern FERM BP-1936 bzw. FERM BP-1937 hinterlegt.

Zur Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle nach den vorste hend beschriebenen Schritten ist jeder beliebige Plasmid- Vektor, wie pACYC177 oder pSC101 geeignet. Ferner sind Pha gen-Vektoren, wie λgt11 (erhältlich bei Toyobo Co., Ltd.) oder Charon 4A (erhältlich bei Amersham Inc.). geeignet. Außerdem lassen sich außer dem lax-Promotor auch andere steuerbare Promotoren verwenden. Der Wirtsstamm ist natür lich nicht auf E. coli JM105 beschränkt. Dem Fachmann sind andere erfindungsgemäß verwendbare Wirts-Mikroorganismen be kannt.

Bei der Umsetzung von Nitrilen in Amide lassen sich neben Enzym-Rohpräparaten nicht nur gereinigte Enzyme aus den er findungsgemäßen Transformanten sondern auch Kulturlösungen, Isolate, behandelte Zellen oder immobilisierte Derivate da von verwenden.

Nitrile werden im allgemeinen durch die Formel R-(CN)_n dar gestellt und lassen sich entsprechend des Wertes von n in Mononitrile (n=1) und Polynitrile (n 2) gliedern. Außerdem kann der Rest R in der Formel ein Wasserstoffatom oder einen geradkettigen, verzweigten oder cyclischen gesättigten oder nicht-gesättigten Kohlenwasserstoffrest mit unterschiedli chen Anzahlen von Kohlenstoffatomen, einen Kohlenwasser stoffrest mit einem Substituenten, wie einer Aminogruppe, Hydroxylgruppe, Halogengruppe oder Carboxylgruppe bedeuten, so daß eine große Anzahl von Verbindungen unter die vorste hend genannte allgemeine Formel fällt.

Spezielle Beispiele der genannten Nitrile sind Acetonitril, Propionitril, n-Butylnitril, 1-Butylnitril, n-Valeronitril, Acrylnitril, Methacrylnitril, Benzonitril, Cyanopyridin, Ma lonsäurenitril, Bernsteinsäurenitril, Fumarsäurenitril, Chloracetonitril, β-Hydroxypropionsäurenitril, Aminoaceto nitril oder β-Aminopropionsäurenitril.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Dabei werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

TE: Tris-HCl (10 mMol, pH 7,8),
EDTA (1 mMol, pH 8,0)
TNE: Tris-HCl (50 mMol, pH 8,0),
EDTA (1 mMol, pH 8,0)
NaCl (50 mMol)
STE: Tris-HCl (50 mMol, pH 8,0),
EDTA (5 mMol, pH 8,0)
Saccharose (35 mMol)
2xYT-Medium: 1,6% Trypton, 1,0% Hefeextrakt, 0,5% NaCl.

Beispiel 1 Partielle Bestimmung der Aminosäure-Sequenz einer Nitrilhy dratase und Synthese entsprechender DNA-Sondenmoleküle

Rhodococcus sp. N-774 wird in einem Medium (Glucose 10 g/l; Pepton 5 g/l; Hefeextrakt 3 g/l, Malzextrakt 3 g/l, Eisen(II)-sulfat 0,01 g/l, Wasser 1 l; pH 7,2) 48 Stunden bei 30°C inkubiert, und die Zellen werden geerntet. Sodann werden die Zellen pulverisiert, einer fraktionierten Ammo niumsulfat-Fällung unterzogen und dialysiert. Das Dialysat wird zentrifugiert und der Überstand wird abpipettiert und nacheinander einer DEAE-Cellulofine-Chromatographie, Phenyl- Sepharose-Chromatographie, Sephadex G-150-Chromatographie und einer Octyl-Sepharose-Chromatographie unterzogen, um ak tive Fraktionen zu erhalten. Sodann werden die aktiven Frak tionen dialysiert, um eine Enzym-Lösung zu erhalten. Das En zym wird in die beiden Untereinheiten (α und β) durch Hoch leistungs-Flüssigkeitschromatographie in einer Reversphasen- Säule getrennt (Senshu Pak VP-304-1251, hergestellt von Senshu Scientific Co., Ltd.). Anschließend werden mit einem Aminosäure-Sequenziergerät Applied Bio Systems, Inc.) die Aminosäuresequenzen α₁ und β₁ der N-Termini der Unter einheiten und die Aminosäuresequenzen α₂ und β₂ der N-Ter mini von Peptidfragmenten bestimmt, die durch Lysyl-Endopep tidase-Spaltung erhalten wurden. Sodann werden vier Arten von Sondenmolekülen (α₁, α₂, β₁ und β₂) synthetisiert, die DNA-Sequenzen aufweisen, die anhand der vorstehend genannten Aminosäuresequenz zu erwarten sind. Dazu wird ein automati sches DNA-Synthesegerät verwendet (System 1 plus, Beckmann Instruments, Inc.).

Die Ergebnisse dieser Aminosäure-Sequenzierung, die zur Son denmolekül-Synthese verwendeten Aminosäure-Sequenzen und die DNA-Sequenzen der Sondenmoleküle sind in Fig. 1 darge stellt.

Beispiel 2 Herstellung von das Nitrilhydratase-Gen enthaltenden DNA-Fragmenten

Rhodococcus sp. N-774 wird in 100 ml Medium (hergestellt durch Zugabe von 1% Glycin oder 0,2 µg/ml Ampicillin zu MY- Medium) überimpft und inkubiert. Sodann werden die Zellen geerntet. Sie werden mit TNE gewaschen und in 10 ml TE sus pendiert. Es werden 4 ml 0,25 M EDTA, 10 bis 20 mg Lysozym, 10 bis 20 mg Achromoprotease und 10 ml 10%iges SDS zugege ben. Die Suspension wird 3 Stunden bei 37°C stehengelassen. Sodann werden 15 ml Phenol (60°C) zugegeben. Die erhaltene Lösung wird 15 Minuten bei 60°C stehengelassen und abzentri fugiert. Die obere Phase wird entnommen und mit 0,7 ml 2,5 M Natriumacetat-Lösung und Diäthyläther versetzt. Nach dem Zentrifugieren dieser Lösung wird die obere Phase der erhal tenen Lösung entfernt. Sodann wird die noch vorhandene untere Phase mit 2 Volumina Äthanol versetzt und DNA wird daraus mit einem Glasstab aufgewickelt. Die erhaltene DNA wird nacheinander jeweils 5 Minuten mit 2 : 8, 1 : 9 und 0 : 10 TE: Äthanol-Lösung getränkt und sodann bei 37°C in 2 bis 4 ml TE gelöst. Diese Lösung wird mit 10 µl eines Gemisches der RNAsen A und T₁ bei 37°C versetzt und sodann mit einem glei chen Volumen Phenol. Nach dem Zentrifugieren der erhaltenen Lösung wird die obere Phase gesammelt und mit mindestens einem gleichen Volumen Diäthyläther versetzt. Sodann wird die erhaltene Lösung zentrifugiert, die obere Phase wird entfernt und die verbleibende untere Phase wird über Nacht gegen 2 Liter TE, das ein kleines Volumen Chloroform ent hält, dialysiert. Sodann wird ein zweites Mal 3 bis 4 Stun den dialysiert. Es werden etwa 4 ml eines Präparats roher, chromosomaler DNA erhalten.

15 µl der rohen, chromosomalen DNA-Präparation werden mit 20 Einheiten des Restriktionsenzyms Sph I, 3 µl Sph I-Re striktionspuffer (10-fach konzentriert) und 10 µl TE ver setzt und 1 Stunde bei 37°C gespalten. Das Reaktionsgemisch wird einer Agarose-Gelelektrophorese (3 Stunden, 60 Vol.) unterzogen. Anschließend wird eine Hybridisierung nach Southern mit den gemäß (1), oben, hergestellten DNA-Sonden molekülen durchgeführt. Es wurde gefunden, daß mit den vor stehend genannten, synthetischen Sondenmolekülen stark hy bridisierende DNA-Fragmente eine Größe von etwa 4,4 kb auf weisen.

Es werden weitere 15 µl rohe, chromosomale DNA mit dem Re striktionsenzym Sph I (erhältlich bei Takara Shuzo Co., Ltd.) wie vorstehend beschrieben, gespalten. Die gespaltene DNA wird sodann einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und die 4,4 kb-Bande wird ausgeschnitten. Das Gel wird so dann durch Zugabe eines 3-fachen Volumens einer 8 M NaClO₄- Lösung zersetzt. Die DNA wird an ein GF/C-Filterpapier (her gestellt von Whatman Corp.) mit einem Durchmesser von 6 mm adsorbiert. Auf dieses Filterpapier mit der adsorbierten DNA werden je zehnmal 100 µl TE enthaltend 6 M NaClO₄ und 100 µl 95%iges Äthanol tropfenweise gegeben. Die so behandelten Filter werden 3 Minuten luftgetrocknet und sodann in ein 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt. Sie werden mit 40 µl TE versetzt. Es wird 30 Minuten bei 37°C stehengelassen. Das Röhrchen wird zentrifugiert und sodann werden etwa 40 µl des Überstandes entnommen. In diesem Überstand sind DNA-Frag mente einer Größe von 4,4 kb enthalten, die die gewünschte chromosomale Nitrilhydratase-DNA enthalten.

Beispiel 3 Insertion chromosomaler DNA-Fragmente in Vektoren

10 µl DNA des Plasmids pBR322 (erhältlich bei Takara Shuzo Co., Ltd.) werden mit 20 Einheiten des Restriktionsenzyms Sph I, 3 µl Sph I-Restriktionspuffer (10-fach konzentriert) und 10 µl TE versetzt. Die erhaltene Lösung wird 1 Stunde bei 30°C inkubiert. Sodann wird die Spaltung durch Zugabe von 2 µl 0,25 M EDTA abgebrochen. Sodann werden 7 µl 1 M Tris-HCl (pH 9) und 3 µl BAP (bakterielle, alkalische Phos phatase) zugegeben und die Lösung wird 1 Stunde bei 65°C in kubiert. Sodann wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von TE auf ein Gesamtvolumen von 100 µl gebracht und dreimal mit einem gleichen Volumen Phenol extrahiert. Anschließend wird ein gleiches Volumen Diäthyläther zugegeben, um die untere Phase zu sammeln und sodann 10 µl 3 M Natriumacetat-Lösung und 250 µl Äthanol. Es wird 30 Minuten bei -80°C stehenge lassen, und die Lösung wird zentrifugiert. Das Pellet wird getrocknet und in TE gelöst.

5 µl des vorstehend beschriebenen, mit Sph I gespaltenen und BAP behandelten pBR322 und 40 µl der Lösung des 4,4 kb DNA- Fragments aus (2), oben, werden gemischt. Sodann werden 6 µl Legierungspuffer, 6 µl einer Lösung von 6 mg/ml ATP und 3 µl (1050 Einheiten) T4-DNA-Ligase (erhältlich bei Takara Shuzo Co., Ltd.) zum Gemisch zugegeben, und es wird über Nacht (12 Stunden) bei 4°C inkubiert. Somit werden 60 µl rekombinantes Plasmid, in dem 4,4 kb DNA-Fragmente im Vektor pBR322 inse riert sind, erhalten. Dieses rekombinante Plasmid wird als DNA-Bank oder Genbank betrachtet.

Beispiel 4 Herstellung von Transformanten und Selektion rekombinanter DNA-Moleküle

10 ml 2xYT-Medium werden bei 37°C mit E. coli TG1 (Amersham Corp.) beimpft. Nach 12-stündiger Inkubation wird 1% der Kultur in ein neues 2xYT-Medium überimpft und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und mit 5 ml kalter 50 mMol CaCl₂-Lösung versetzt. Es wird 40 Minuten bei 0°C stehengelassen, und die erhaltene Zell-Suspension wird erneut zentrifugiert. Dann wird das Pellet mit 0,25 ml kalter 50 mMol CaCl₂-Lösung und 60 µl der Lösung des rekombinanten Plasmids gemäß (3) versetzt. Es wird 40 Minuten bei 0°C stehengelassen. Dann wird 2 Minuten bei 42°C ein Hitzeschock durchgeführt und nochmals 5 Minuten bei 0°C stehengelassen. Es werden 10 ml 2xYT-Medium zugege ben, und die erhaltene Lösung wird 90 Minuten bei 37°C inku biert. Sodann werden die Zellen durch Zentrifugation geern tet. Die geernteten Zellen werden homogen in 1 ml 2xYT-Me dium suspendiert, die Suspension wird in 10 µl-Portionen auf Agarplatten (50 µg/ml Ampicillin enthaltendes 2xYT-Medium) ausplattiert und bei 37°C inkubiert. Aus den auf den Platten wachsenden Transformanten werden solche, die ein Nitrilhy dratase-Gen tragen, durch Koloniehybridisierung ausgewählt. Dazu werden die auf den Platten gezüchteten Transformanten auf Nitrocellulosefilter überführt, und die Zellen werden zur Immobilisierung der DNA lysiert. Sodann wird die immobi lisierte DNA mit den synthetischen Sondenmolekülen behandelt und Kolonien, die die gewünschte rekombinante DNA enthalten, werden durch Autoradiographie ausgewählt. Aus den ausgewähl ten Kolonien werden rekombinante Plasmide hergestellt und mit allen vier Formen der synthetischen Sondenmoleküle in einer Hybridisierung nach Southern hybridisiert. Dadurch wird bestätigt, daß die ausgewählten Kolonien Transformanten sind, die das gewünschte Gen tragen.

Beispiel 5 Reinigung von rekombinanten Plasmiden und Erstellung einer Restriktionskarte

Gemäß (4) selektierte Transformanten werden in 100 µl 2xYT- Medium (enthaltend 50 µl/ml Ampicillin) überimpft und über Nacht (12 Stunden) bei 37°C gezüchtet. Die Zellen werden geerntet und mit TNE versetzt. Sodann werden die Zellen nochmals geerntet. Sodann werden sie mit 8 ml STE und 10 mg Lysozym versetzt. Diese Lösung wird 5 Minuten bei 0°C inku biert. Nach der vollständigen Reaktion werden zunächst 4 ml 0,25 M EDTA und sodann 2 ml 10% SDS und 5 ml 5 M NaCl bei Raumtemperatur zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei 0 bis 4°C stehen gelassen. Die erhaltene Lösung wird ultrazentrifugiert. Nach Zugabe eines 1/2 Äquivalentes 30% PEG6000 zum überstand wird die erhaltene Lösung über Nacht (12 Stunden) bei 0 bis 4°C stehengelassen und sodann nochmals zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wird in TNE gelöst, so daß ein Volumen von 7,5 ml erhalten wird. Nach der Zugabe von CsCl wird die erhaltene Lösung zentrifugiert, um Proteine zu entfernen. Sodann wird eine 300 bis 500 mg/ml Äthidiumbromid-Lösung zugegeben. Die erhaltene Lösung wird in ein Zentrifugenröhrchen überführt, das sodann verschweißt und ultrazentrifugiert wird. Anschließend wird cccDNA mit einer peristaltischen Pumpe entnommen und das Äthidiumbromid wird von der cccDNA durch Zugabe von mindestens einem glei chen Volumen Wasser-gesättigtem Isopropylalkohol entfernt. Die so behandelte cccDNA wird gegen TE dialysiert. Es werden etwa 3 ml gereinigtes, rekombinantes Plasmid erhalten. Die ses wird als Plasmid pYUK120 bezeichnet.

Das erhaltene rekombinante Plasmid wird mit den Restrik tionsenzymen EcoR I, Hind III, Kpn I Pst I, Sal I und Sph I (alle erhältlich bei Takara Shuzo Co., Ltd.) und ähnlichen Enzymen zur Erstellung der in Fig. 2 gezeigten Restrik tionskarte gespalten.

Beispiel 6 Bestimmung der DNA-Sequenz

Mit Hilfe der Restriktionskarte aus (5), oben, und einer Hy bridisierung nach Southern, wird die Lage des gewünschten Gens in einem von pYUK120 abgeleiteten DNA-Fragment be stimmt. Sodann werden die unnötigen Teile mit den Restrik tionsenzymen Sph I und Sal I ausgeschnitten. Damit wird das Fragment von 4,4 kb auf 2,07 kb reduziert. Anschließend wird die vollständige DNA-Sequenz des erhaltenen DNA-Fragments nach der Sanger-Methode bestimmt, wobei der Phagenvektor M13 verwendet wird; vgl. Sanger, Science 214 (1981), 1205-1210. Das Ergebnis ist die DNA-Sequenz dieses 2,07 kb von Rhodo coccus sp. N-774 abgeleiteten DNA-Fragments, die in Fig. 3 dargestellt ist.

Es wird ferner bestätigt, daß diese DNA-Sequenz alle anhand der in (1), oben, bestimmten Aminosäure-Sequenz erwarteten DNA-Sequenzen enthält. Damit ist klar, daß dieses DNA-Frag ment sowohl die α- als auch die β-Untereinheit codiert.

Beispiel 7 Herstellung von Expressionsplasmiden und Transformanten

Das 2,07 kb DNA-Fragment aus (6), oben, wird mit dem mit der Restriktionsendonuclease Sph I und Sal I gespaltenen Plasmid pUC19 ligiert. Es werden etwa 3 ml als pYUK121 bezeichnetes Expressionsplasmid erhalten; vgl. Fig. 4.

Mit diesem Plasmid pYUK121 wird gemäß (6) die Transformante JN105/pYUK121 (hinterlegt nach den Vorschriften des Budape ster Vertrages beim Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-1937) hergestellt.

Beispiel 8 Herstellung von Nitrilhydratase mit Transformanten und Umsetzung von Nitrilen in Amide

E. coli JM 105 enthaltend pYUK121 wird über Nacht in 10 ml 2xYT-Medium (enthaltend 50 µg/ml Ampicillin) bei 30°C über Nacht inkubiert. Sodann werden 1%-Portionen dieser Kultur in 100 ml 2xYT-Medium (enthaltend 50 µg/ml Ampicillin), 10 mg/l FeSO₄·7 H₂O und Pyrrochinolinchinon (PQQ) überimpft und 2 Stunden bei 30°C inkubiert. Nach Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 2 mMol wird die erhaltene Kultur wei tere 15 Stunden bei 30°C inkubiert.

Nach dem Ernten der Zellen aus der vorstehend beschriebenen Kultur, werden diese in 3 ml 1/20 M Phosphatpuffer (enthal tend 0,35% Natrium-n-lactat, pH 7,7) suspendiert. Die Sus pension wird beschallt und sodann zentrifugiert. Das Pellet wird in 20 ml des vorstehend genannten Phosphatpuffers, ent haltend 8 M Harnstoff gelöst. Sodann werden 0,585 g Natrium chlorid zugegeben. Die erhaltene Lösung wird auf einen pH- Wert von 10,0 eingestellt. Sodann wird 3 Stunden gegen 3 Li ter 50 mMol Tris-HCl-Puffer (pH 7,7) dialysiert. Das Dialy sat wird weiter über Nacht gegen 3 Liter 1/20 Phosphatpuffer (pH 7,7) dialysiert. Es werden etwa 35 ml des rohen Enzyms erhalten.

2 ml des rohen Enzyms werden mit 2 ml Substratlösung (ent haltend 5% Acrylonitril, 0,35% Natrium-n-lactat, 10 mg/l FeSO₄·7 H₂O, 1 µg/ml PQQ und 50 mMol Phosphatpuffer; pH 7,7) vermischt. Sodann wird 20 Minuten bei 20°C unter Belichtung inkubiert. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 2 ml 1 N HCl abgebrochen. Die Reaktionslösung wird einer Hochleistungs flüssigkeitschromatographie unterzogen. Damit wird das gebildete Acrylamid und das darin enthaltene, nicht umgesetzte Acrylnitril nachgewiesen. Somit wird gezeigt, daß mit dem Rohextrakt des Wirtes E. coli JM105 kein Acrylamid hergestellt wird, während es mit dem Rohextrakt des erfin dungsgemäßen pYUK121 enthaltenden E. coli JM105 hergestellt wird. Die spezifische Aktivität des Acrylamids beträgt 13,2 Einheiten pro Liter Medium. Dabei bedeutet eine Einheit die Menge von pro Minute gebildetem µMol Acrylamid.

Claims

1. DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit den folgenden Amino säure-Sequenzen der α- und β-Untereinheit und mit Nitril hydratase-Aktivität codiert:

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1, wobei die die α- und β- Untereinheit codierenden DNA-Sequenzen die folgenden sind:

3. Rekombinantes DNA-Molekül, das eine in einen Vektor in serierte DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 2 enthält.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, das das re kombinante DNA-Molekül pYUK121 (FERM BP-1937) ist.

5. Transformierter Mikroorganismus, der ein rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3 oder 4 enthält.

6. Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 5, der zur Art Escherichia coli gehört.

7. Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 5 oder 6, der die Transformante E. coli JM105-pYUK121 (FERM BP-1937) ist.

8. Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratase, bei dem man eine Transformante nach einem der Ansprüche 5 bis 7 in ei nem Medium unter geeigneten Bedingungen züchtet und die Ni trilhydratase aus dem Medium gewinnt.

9. Verwendung der Transformante nach einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Herstellung von Amiden, wobei die Transformante zur Bildung von Nitrilhydratase gezüchtet wird und mit der er haltenen Nitrilhydratase Nitrile in die entsprechenden Ami de umgesetzt werden.

10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei man aus der gezüchteten Transformante eine Kulturlösung, Isolate, behandelte Zellen oder immobilisierte Derivate davon zur Umsetzung der Nitri le in die entsprechenden Amide herstellt.