DE69116704T2

DE69116704T2 - Gen, das ein Polypeptid mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert, eine dieses Gen enthaltende Transformante und Verfahren zur Herstellung von Amiden mit dieser Transformante.

Info

Publication number: DE69116704T2
Application number: DE69116704T
Authority: DE
Inventors: Teruhiko Beppu; Sueharu Horinouchi; Toru Nagasawa; Makoto Nishiyama; Hideaki Yamada
Original assignee: Nitto Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1990-02-28
Filing date: 1991-02-27
Publication date: 1996-08-08
Anticipated expiration: 2011-02-28
Also published as: CN1054614A; KR910021479A; RU2082761C1; EP0444639A2; DE69116704D1; EP0444639B1; RU2028380C1; AU636008B2; EP0444639A3; CN1052509C; JPH03251184A; KR950000888B1; JP2907479B2; AU7129591A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das aus Pseudomonas chlororaphis B23 stammt und ein Polypeptid mit Nitrilhydratase-Aktivität zur Hydratisierung von Nitrilen zu Amiden codiert. Die Erfindung betrifft auch eine das Gen enthaltende rekombinante DNA sowie eine mit der rekombinanten DNA transformierte Transformante. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratase unter Verwendung der Transformante und zur Herstellung von Amiden unter Verwendung von Nitrilhydratase.
Nitrilhydratase oder Nitrilase ist bekanntlich ein Enzym, das Nitrile zu Amiden hydratisiert. Nitrilhydratase produzierende Mikroorganismen umfassen Organismen, die zu den Gattungen Bacillus, Bacteridium, Micrococcus und Brevibacterium (vgl. JP-B-62-2 1517/1989, US-P 4,001,081), Corynebacterium und Nocardia (vgl. JP-B-5 6-17918/1989, US-P 4,248,968), Pseudomonas (vgl. JP-B-59-3795 1/1984, US-P 4,637,982), Rhodococcus, Arthrobacter und Microbacterium (vgl. JP-A-61-162193/1986, EP-A 0188316) sowie zu Rhodococcus rhodochrous (vgl. JP-A-2-470/1990, EP-A 0307926) gehören.
Nitrilhydratase ist zur Hydratisierung von Nitrilen zu Amiden verwendet worden. In der vorliegenden Erfindung werden Mikroorganismen nach DNA- Rekombinationstechniken so verändert, daß sie mehrere Kopien einer rekombinanten DNA enthalten, die Nitrilhydratase codiert. Die Rekombinante produziert im Vergleich zu üblichen Verfahren außergewöhnlich große Mengen Nitrilhydratase.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bereits früher ein Gen offenbart, das von Rhodococcus sp. N-774 (FERM BP-1936) stammt und auch ein Polypeptid mit Nitrilhydratase-Aktivität codiert (JP-A-2- 119778/1988).
Im Gegensatz dazu wurde in der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Nitrilhydratase ein Gen verwendet, das von Pseudomonas chlororaphis B23 stammt und im US-P 4,637,982 beschrieben ist. Dazu wurde ein Nitrilhydratase codierendes Gen isoliert, das Gen in einen geeigneten Plasmid-Vektor inseriert und mit dem rekombinanten Plasmid ein geeigneter Wirt transformiert, wobei mit Erfolg eine Nitrilhydratase produzierende Transformante erhalten wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft
(1) ein Gen, das ein Polypeptid codiert, das Nitrilhydratase-Aktivität aufweist und die α-Untereinheit mit der folgenden, im Sequenzprotokoll als SEQ ID: Nr.1 definierten Aminosäuresequenz sowie die β-Untereinheit mit der folgenden, im Sequenzprotokoll als SEQ ID: Nr.2 definierten Aminosäuresequenz umfaßt;
(2) ein in (1) beschriebenes, die α- und β-Untereinheiten codierendes Gen, das die α-Untereinheit codierende Sequenz, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID: Nr.3 definiert ist, und die β-Untereinheit codierende Sequenz, die im Sequenzprotokoll als SEQ ID: Nr.4 definiert ist, umfaßt;
(3) eine rekombinante DNA, die einen Vektor umfaßt, der das in (1) oder (2) beschriebene Gen enthält;
(4) eine Transformante, die mit der in (3) beschriebenen rekombinanten DNA transformiert ist;
(5) ein Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratase, das die Züchtung der in (4) beschriebenen Transformante und die Gewinnung von Nitrilhydratase aus der Kultur umfaßt;
(6) ein Verfahren zur Herstellung von Amiden, das die Hydratisierung von Nitrilen zur Bildung von Amiden unter Verwendung der in (5) beschriebenen Nitrilhydratase umfaßt; und
(7) ein Verfahren zur Herstellung von Amiden, das die Züchtung der in (4) beschriebenen Transformante und die Hydratisierung von Nitrilen zur Bildung von Amiden unter Verwendung der erhaltenen Kultur, von isolierten Bakterienzellen, eines behandelten Materials davon oder eines fixierten Materials davon umfaßt.
Die vorliegende Erfindung wird anschließend genauer beschrieben.

(1) Isolierung und Aufreinigung von Nitrilhydratase und teilweise Aminosäure-Sequenzierung von Nitrilhydratase

Nitrilhydratase wurde aus Pseudomonas chlororaphis B23 isoliert, aufgereinigt und unter Verwendung von HPLC in α- und ß-Untereinheiten aufgetrennt. Die N-terminalen Aminosäuresequenzen der Untereinheiten wurden bestimmt und sind im Sequenzprotokoll als SEQ ID: Nr. 5 bzw. Nr. 6 gezeigt.

(2) Herstellung einer DNA-Sonde für ein Nitrilhydratase-Gen

Aus dem Stamm JM105/pYUK121 (FERM BP-1937) wurde wie in JP-A-2- 119778/1990 beschrieben eine DNA-Sonde hergestellt, da es zwischen der im Japanischen Patentanzeiger beschriebenen Nitrilhydratase-ß-Untereinheit von Rhodococcus sp. N-774 und der β-Untereinheit von Pseudomonas chlororaphis B23 eine erhebliche Aminosäuresequenz-Homologie gibt. Aus einer JM105/pYUK121-Kultur wurde das Plasmid pYUK121 isoliert, das ein aus Rhodococcus sp. N-774 stammendes Nitrilhydratase-Gen enthielt. pYUK121-DNA wurde mit SphI und SalI gespalten. Das SphI-SalI-Fragment enthielt das Nitrilhydratase-Gen von Rhodococcus sp. N-774 (im Sequenzprotokoll als SEQ ID: Nr. 7 gezeigt). Das DNA-Fragment wurde radioaktiv markiert, wobei eine Sonde erhalten wurde.

(3) Nachweis eines DNA-Bereichs, der das Nitrilhydratase-Gen aus dem Chromosom von Pseudomonas chlororaphis B23 enthielt

Aus einer Pseudomonas chlororaphis B23-Kultur wurde chromosomale DNA isoliert. Die chromosomale DNA wurde mit Restriktionsenzymen gespalten und mit der in (2) beschriebenen Sonde nach dem Southern- Hybridisierungsverfahren [Southern, E. M., J. Mol. Biol. 98 (1975), 503] hybridisiert. Dabei wurden zwei DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge nachgewiesen.

(4) Konstruktion rekombinanter Plasmide

Durch Insertion der in (3) isolierten chromosomalen DNA-Fragmente in einen Plasmid-Vektor wurden rekombinante Plasmide konstruiert.

(5) Transformation und Screenen auf Transformanten, die die rekombinanten Plasmide enthalten

Unter Verwendung der in (4) beschriebenen Plasmide wurden Transformanten hergestellt. Rekombinante Plasmide enthaltende Transformanten wurden unter Verwendung der in (2) beschriebenen Sonde entsprechend dem Kolonie-Hybridisierungsverfahren [R. Bruce Wallace et al., Nuc. Aci. Res. 9 (1981), 879] selektiert. Die Gegenwart des Nitrilhydratase-Gens in den rekombinanten Plasmiden wurde außerdem unter Verwendung des Southern-Hybridisierungsverfahrens bestätigt. Die so selektierten Plasmide wurden als pPCN1 und pPCN3 bezeichnet.

(6) Isolierung und Aufreinigung von Plasmid-DNA und Konstruktion von Restriktionskarten

Die DNAs der in (5) beschriebenen Plasmide pPCN1 und pPCN3 wurden isoliert und aufgereinigt. Zur Ermittlung des Bereichs, der das Nitrilhydratase- Gen enthielt, wurden die Restriktionskarten der DNAs konstruiert (Fig. 1).

(7) DNA-Sequenzierung

In pPCN1 und pPCN3 wurde der zusätzliche Bereich der inserierten DNA- Fragmente unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme ausgeschnitten. Die inserierten DNA-Fragmente wurden dann sequenziert. Die Nucleotidsequenz der DNA-Fragmente (vgl. Sequenzprotokoll, als SEQ ID: Nr. 8 definiert) zeigt, daß diese die Sequenz enthalten, die aus der in (1) beschriebenen Aminosäuresequenz abgeleitet wurde.

(8) Insertion der DNA-Fragmente in einen Expressionsvektor und Transformation

Die DNA-Fragmente wurden unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme aus pPCN1 und pPCN3 herausgespalten. Die beiden Fragmente wurden ligiert und in den Expressionsvektor pUC19 inseriert. Das Konstrukt wurde zur Transformation des E. coli-Stamms JM105 (Amersham) verwendet. Die Transformante wurde als JM105/pPCN4 bezeichnet.

(9) Herstellung von Nitrilhydratase unter Verwendung der Transformante und Umwandlung von Nitrilen in Amide

Die in (8) beschriebene Transformante wurde gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden mit Nitrilen, einem Substrat der Nitrilhydratase, gemischt und dadurch wurden Amide erzeugt.
Pseudomonas chlororaphis B23 wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt und erhielt die Eingangsnummer FERM BP-187. Die Transformante JM105/pPCN4 wurde bei der gleichen Einrichtung hinterlegt und erhielt die Eingangsnummer FERM BP-2779.
Für die vorliegende Erfindung kann jeder beliebige Vektor einschließlich eines Plasmid-Vektors (z.B. pAT153, pMP9, pHC624, pKC7, usw.) und eines Phagen-Vektors (z.B. λgt11 (Toyobo), Charon 4A (Amersham), usw.) verwendet werden. Enzyme, die verwendet werden können, umfassen SphI, SalI, SacI, BamHI, EcoRI, PstI und ähnliche Enzyme, die im Handel erhältlich sind (Takara Shuzo). Zur Transformation können verschiedene Wirte verwendet werden, die E. coli JM105 und TG1 umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Zuchtmedien für Transformanten sind Medien, die auf dem Fachgebiet normalerweise verwendet werden.
Die Umwandlung von Nitrilen in Amide wurde unter Verwendung von Nitrilhydratase, Nitrilhydratase-Rohpräparaten, der Kultur der Transformante, von isolierten Bakterienzellen oder behandeltem Material davon und ähnlichen durchgeführt, hergestellt aus der Transformantenkultur.
Geeignete Nitrile umfassen Nitrile mit 2-4 Kohlenstoffatomen, z.B. Acetonitril, Propionitril, Acrylonitril, Methacrylonitril, n-Butyronitril und Isobutyronitril, wobei Acrylonitril bevorzugt ist.
Figur 1 zeigt Restriktionskarten der rekombinanten Plasmide pPCN1, pPCN3 und pPCN4.
Die vorliegende Erfindung offenbart die Aminosäure-und Nucleotidsequenzen der α- und β-Untereinheiten der aus Pseudomonas chlororaphis B23 stammenden Nitrilhydratase. Das Nitrilhydratase codierende Gen wurde in einen Expressionsvektor inseriert und der rekombinante Vektor zur Transformation verwendet. Die Transformante enthält mehrere Gen- Kopien und produziert größere Mengen Nitrilhydratase als üblicherweise verwendete Mikroorganismen.
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel veranschaulicht.
In diesem Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet.
TE: Tris-HCl (10 mM, pH 7,8), EDTA(1 mM, pH 8,0)
TNE: Tris-HCl (50 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM, pH 8,0), NACl (50 mM)
STE: Tris-HCl (50 mM, pH 8,0), EDTA (5 mM, pH 8,0), Saccharose (35 mM)
2 x YT-Medium: 1,6% Trypton, 1,0% Hefe-Extrakt, 0,5% NaCl

Beispiel

(1) Isolierung und Aufreinigung von Nitrilhydratase und Aminosäuresequenzierung eines Teils der Nitrilhydratase

Pseudomonas chlororaphis B23 wurde in einem Medium (10g/l Saccharose, 4 g/l Methacrylamid, 0,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 0,5 g/l MgSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 0,01 g/l FeSO&sub4; x 7 H&sub2;O, pH 7,0) 28 Stunden bei 25ºC gezüchtet. Dann wurden die Bakterienzellen geerntet. 100 g Bakterienzellen wurden aufgeschlossen und mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Die Probe wurde dialysiert und das Dialysat zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und nacheinander einer DEAE-Sephacel-, einer Octyl-Sepharose-CL-4B-, einer Phenyl-Sepharose-CL-4B- sowie einer Sephadex-G-150-Chromatographie unterworfen. Aktive Fraktionen wurden gesammelt und dialysiert. Das Dialysat, das das Enzym enthielt, wurde unter Verwendung einer Umkehrphasen-Säule (Senshu Pak VP-304-1251, Senshu Kagaku) einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatrographie unterworfen. Auf diese Weise wurden zwei Untereinheiten (α und β) gewonnen. Die N-terminalen Aminosäuresequenzen der α- und β- Untereinheiten wurden unter Verwendung einer Aminosäure- Sequenziervorrichtung (Applied Biosystems, Modell 470A) bestimmt. Die N- terminalen Aminosäuresequenzen der α- und β-Untereinheiten sind im Sequenzprotokoll als SEQ ID: Nr. 5 bzw. SEQ ID: Nr. 6 gezeigt.

(2) Herstellung einer DNA-Sonde für das Nitrilhydratase-Gen

Der E. coli-Stamm JM105, der das Plasmid pYUK121 enthielt (FERM BP-1937), wurde in 100 ml 50 µg/ml Ampicillin enthaltendem 2 x YT-Medium über Nacht (12 Stunden) bei 30ºC gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden geerntet und den Zellen wurde TNE zugegeben. Die Zellsuspension wurde dann zentrifugiert. Dem Pellet wurden 8 ml STE und 10 mg Lysozym zugegeben. Das Gemisch wurde fünf Minuten bei 0ºC inkubiert und anschließend wurden 4 ml 0,25 M EDTA zugegeben. Dem Gemisch wurden dann bei Raumtemperatur 2 ml 10%-iges SDS und 5 ml 5 M NaCl zugegeben. Man ließ das erhaltene Gemisch drei Stunden bei 0ºC - 4ºC stehen und danach wurde es einer Ultrazentrifugation unterworfen. Dem Überstand wurde eine halbe Menge an 30%-igem PEG 6000 zugegeben. Man ließ das Gemisch über Nacht (12 Stunden) bei 0ºC - 4ºC stehen und danach wurde es zentrifugiert. Dem Pellet wurde TNE bis zu einem Endvolumen von 7,5 ml zugegeben. Der Suspension wurde dann CsCl zugesetzt. Zur Protein- Entfernung wurde das Gemisch zentrifugiert. Dem Überstand wurde danach Ethidiumbromid bis zu einer Konzentration von 300 - 500 mg/ml zugesetzt. Das Gemisch wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Das Röhrchen wurde durch Hitze verschweißt und dann einer Ultrazentrifugation unterworfen. Unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe wurde cccdna extrahiert. Zur Entfernung von Ethidiumbromid wurde dem Extrakt Isopropylalkoholgesättigtes Wasser in etwas mehr als gleicher Menge zugegeben. Die Probe wurde gegen TE dialysiert. Etwa 3 ml gereinigtes pYUK121 wurden gewonnen.
pYUK121-DNA wurde mit SphI und SalI gespalten, wobei ein 2,07 kb großes DNA-Fragment erhalten wurde, das das aus Rhodococcus sp. N-774 stammende Nitrilhydratase-Gen enthielt. Das Fragment wurde zur Herstellung einer Sonde mit ³²P radioaktiv markiert. Die Nucleotidsequenz der Sonde ist im Sequenzprotokoll als SEQ ID: Nr. 7 gezeigt.

(3) Herstellung eines DNA-Fragments, das ein chromosomales Nitrilhydratase- Gen enthält

Pseudomonas chlororaphis B23 wurde in 100 ml des in (1) beschriebenen Mediums gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden geerntet und mit TNE gewaschen. Das Pellet wurde dann in 10 ml TE suspendiert. Der Suspension wurden 4 ml 0,25 M EDTA, 10 - 20 mg Lysozym, 10 - 20 mg Achromoprotease und 10 ml 10%-iges SDS zugegeben. Das Gemisch wurde drei Stunden bei 37ºC inkubiert. Dem Gemisch wurden 15 ml Phenol zugegeben. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann zentrifugiert. 0,7 ml einer Lösung aus 2,5 M Natriumacetat und Diethylether wurden zu 15 ml der oberen Phase gegeben und das Gemisch wurde zentrifugiert. Die obere Phase wurde verworfen. Der unteren Phase wurden zwei Volumina Ethanol zugegeben und dann wurde DNA mit einem Glasstab abgenommen. Die DNA wurde mit TE:Ethanol im Verhältnis 2:8, 1:9 und 0:10 (Vol./Vol.) jeweils fünf Minuten gewaschen. Die DNA wurde in 2 - 4 ml TE resuspendiert (37ºC). Der Suspension wurden 10 µl eines Gemisches aus RNase A und T&sub1; zugegeben. Dann wurde das Gemisch bei 30ºC inkubiert. Dem Gemisch wurde Phenol in gleicher Menge zugegeben. Danach wurde das Gemisch zentrifugiert. Nach Zentrifugation wurden 2 - 4 ml der oberen Phase abgenommen. Dem abgenommenen Teil wurde Ether in mehr als gleicher Menge zugegeben. Das Gemisch wurde zentrifugiert. Nach Zentrifugation wurde die obere Phase verworfen. Die untere Phase wurde über Nacht gegen 2 l TE-Puffer, der eine kleine Menge Chloroform enthielt, dialysiert und dann 3 - 4 Stunden gegen frischen TE- Puffer dialysiert. Es wurden 4 ml chromosomale Roh-DNA gewonnen. Die chromosomale DNA wurde wie folgt enzymatisch gespalten:
(a) 2 µl SacI + 3 µl Reaktionspuffer (10 x) + 15 µl chromosomale DNA + 10 µl TE- Puffer
(b) 2 µl BamHI + 2 µl SalI + 3 µl Reaktionspuffer (10 x) + 15 µl chromosomale DNA + 8 µl TE-Puffer
Die Gemische wurden eine Stunde bei 37ºC inkubiert und danach drei Stunden einer Elektrophorese auf einem Agarose-Gel bei 60 V unterzogen. Unter Verwendung der in (2) beschriebenen Sonde wurde mit der chromosomalen DNA eine Southern-Hybridisierung durchgeführt. Es zeigte sich, daß Fragmente von etwa 4,6 kb und 4,7 kb stark hybridisierten.
15 µl chromosomale DNA wurden mit SacI sowie BamHI und SalI gespalten und danach wie vorstehend beschrieben, einer Elektrophorese auf einem Agarose-Gel unterzogen. Die DNA-Fragmente von 4,6 kb und 4,7 kb wurden aus dem Gel herausgeschnitten und in drei Volumina 8 M NaC10&sub4; gegeben. Die Lösung wurde auf ein GF/C (Whatman)-Filterpapier (6 mm Durchmesser) aufgetropft. Auf das Filterpapier wurden 10 Tropfen ( 100 µl) TE-Puffer, der 6 M NaC10&sub4; enthielt, und danach 10 Tropfen ( 100 µl) 95%-iges Ethanol gegeben. Das Papier wurde an der Luft getrocknet und in ein 0,5 ml Eppendorf- Röhrchen gegeben. 40 µl TE-Puffer wurden in das Röhrchen gegeben und dann wurde das Röhrchen 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Danach wurde das Röhrchen zentrifugiert. Etwa 40 µl Überstand ,vurden gewonnen, der die 4,6 und 4,7 kb großen DNA-Fragmente enthielt, welche das Nitrilhydratase-Gen der chromosomalen DNA enthielten.

(4) Insertion des chromosomalen DNA-Fragments in einen Vektor

(a) 4,6 kb DNA-Fragment

Zu 10 µl pUC18-DNA wurden 2 µl SacI, 3 µl Reaktionspuffer (10 x) und 10 µl TE-Puffer gegeben. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert. Zur Beendigung der Reaktion wurden dem Gemisch 2 µl 0,25 M EDTA zugegeben. Dann wurden dem Gemisch 7 µl 1 M Tris-HCl (pH 9) und 3 µl BAP (bakterielle alkalische Phosphatase) zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 65ºC inkubiert. Dem Gemisch wurde dann TE-Puffer zugegeben, um das Volumen auf 100 µl zu bringen. Das Gemisch wurde 3 x mit Phenol in gleicher Menge extrahiert. Dem Extrakt wurde die gleiche Menge Ether zugegeben. Die untere Phase wurde abgenommen und dazu wurden 10 µl 3 M Natriumacetat und 250 µl Ethanol gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -80ºC inkubiert, zentrifugiert, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert.
5 µl der so erhaltenen pUC18-DNA und 40 µl des in (3) beschriebenen 4,6 kb großen Fragments wurden gemischt. Dem Gemisch wurden 6 µl Ligierungspuffer, 6 µl ATP (6 mg/ml) und 3 µl T4-DNA-Ligase zugesetzt. Zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids, das das 4,6 kb große DNA-Fragment in der SacI-Restriktionsstelle des pUC18 enthielt, wurde das Gemisch über Nacht (12 Stunden) bei 4ºC inkubiert.

(b) 4,7 kb DNA-Fragment

pUC18-DNA wurde mit BamHI und SalI gespalten. Das 4,7 kb große Fragment wurde in die BamHI-SalI-Restriktionsstelle von pUC18 in gleicher Weise, wie in (4)-(a) beschrieben, inseriert. Es wurde ein rekombinantes Plasmid erhalten, das das 4,7 kb große DNA-Fragment in der BamHI-SalI-Restriktionsstelle von pUC18 enthielt.

(5) Transformation und Screening von Transformanten

10 ml 2 x YT-Medium wurden mit E. coli JM105 (Amersham) beimpft und dann 12 Stunden bei 37ºC bebrütet. Nach Bebrütung wurde die Kultur in frisches 2 x YT-Medium bis zu einer Endkonzentration von 1% gegeben. Das Gemisch wurde zwei Stunden bei 37ºC bebrütet. Die Kultur wurde zentrifugiert und das Pellet in 5 ml einer kalten 50 mM CaCL2-Lösung suspendiert. Die Suspension wurde 40 Minuten bei 0ºC gehalten und danach zentrifugiert. Das Pellet wurde auf zwei Röhrchen verteilt. Pro Röhrchen wurden 0,25 ml kalte 50 mM CaCL&sub2;-Lösung sowie jeweils 60 µl der in (4) (a) und (b) hergestellten rekombinanten Plasmide zugegeben. Die Gemische wurden 40 Minuten auf Eis inkubiert, zwei Minuten bei 42ºC einem Hitzeschock unterworfen, fünf Minuten auf Eis gegeben und dann in jeweils 10 ml 2 x YT-Medium gegeben. Die Gemische wurden 90 Minuten bei 37ºC unter Schütteln inkubiert und dann zentrifugiert. Die Pellets wurden in 1 ml 2 x YT-Medium suspendiert. Jeweils 10 µl der Suspensionen wurden auf 2 x YT-Agar-Platten, die 50 µg/ml Ampicillin enthielten, ausplattiert. Die Platten wurden bei 37ºC bebrütet. Die auf den Platten gewachsenen Kolonien wurden mit Hilfe des Koloniehybridisierungs- Verfahrens selektiert: Die Kolonien wurden auf Nitrocellulose-Filter übertragen und lysiert. Die an die Filter fixierte DNA wurde wie in (2) beschrieben mit der Sonde hybridisiert. Die Filter wurden einer Autoradiographie unterzogen und rekombinante Kolonien wurden selektiert. Außerdem wurde in den Transformanten die Gegenwart des Nitrilhydratase- Gens nach dem Southern-Hybridisierungsverfahren bestätigt.

(6) Isolierung und Aufreinigung rekombinanter Plasmide und Konstruktion von Restriktionskarten der inserierten DNA-Fragmente

Transformanten, die wie in (5) beschrieben selektiert worden waren, wurden in 100 ml 2 x YT-Medium, das 50 µg/ml Ampicillin enthielt, über Nacht (12 Stunden) bei 37ºC gezüchtet. Die Bakterienzellen wurden geerntet und den Zellen wurde TNE-Puffer zugegeben. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugation gewonnen. Den Zellen wurden 8 ml STE-Puffer und 10 mg Lysozym zugegeben. Das Gemisch wurde fünf Minuten bei 0ºC inkubiert. Dann wurden dem Gemisch 4 ml 0,25 M EDTA, 2 ml 10%-iges SDS (bei Raumtemperatur) und 5 ml 5 M NaCl zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 0ºC - 4ºC inkubiert und dann einer Ultrazentrifugation unterworfen. Dem Überstand wurde 30%-iges PEG 6000 in halber Menge zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht (12 Stunden) bei 0ºC - 4ºC inkubiert und erneut zentrifugiert. Dem Pellet wurde TNE-Puffer zugegeben, um das Volumen auf 7,5 ml zu bringen. Dem Gemisch wurde CsCl zugesetzt. Zur Proteinentfernung wurde das Gemisch zentrifugiert. Danach wurde dem Überstand 300 - 500 mg/ml Ethidiumbromid zugegeben und das Gemisch in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Das Röhrchen wurde mittels Hitze verschweißt und einer Ultrazentrifugation unterworfen. Unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe wurde cccDNA abgenommen. Zur Entfernung von Ethidiumbromid wurde der cccDNA mit Isopropylalkohol gesättigtes Wasser in etwas mehr als gleicher Menge zugegeben. Die DNA-Probe wurde danach gegen TE-Puffer dialysiert, wobei etwa 3 ml rekombinante DNA erhalten wurden. Das rekombinante Plasmid, das das 4,6 kb DNA-Fragment enthielt, wurde als pPCN1 bezeichnet (das rekombinante Plasmid, das das 4,7 kb DNA-Fragment enthielt wurde als pPCN3 bezeichnet).
Die Plasmid-DNAs wurden mit EcoRI, BamHI, PstI, SacI und SalI gespalten. Die Restriktionskarten der Plasmide wurden konstruiert und sind in Figur 1 gezeigt.

(7) DNA-Sequenzierung

Die Position des Nitrilhydratase-Gens in den DNA-Fragmenten von pPCN1 und pPCN3 wurde nach den konstruierten Restriktionskarten und dem Southern-Hybridisierungsverfahren ermittelt. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde das 2,456 kb große BamHI-HincII-DNA-Fragment mit Hilfe des Sanger-Verfahrens [Sanger, F., Science 214 (1981), 1205-1210] unter Verwendung des Phagen-Vektors M13 sequenziert. Das 2,456 kb-DNA-Fragment von Pseudomonas chlororaphis B23 ist im Sequenzprotokoll als SEQ ID: Nr. 8 gezeigt.
In der vorstehend bestimmten Sequenz wurde die gesamte Nucleotidsequenz gefunden, die in (1) aus der Aminosäuresequenz abgeleitet worden war. Die Sequenzanalyse zeigte auch, daß das DNA-Fragment die Sequenz enthielt, die die α- und β-Untereinheiten codiert.

(8) Insertion des BamHI-HincII-DNA-Fragments in einen Expressionsvektor und Transformation

Das 2,2 kb große SphI-BamHI-Fragment von pPCN1 und das 4,7 kb große BamHI-SalI-Fragment von pPCN3 wurden herausgespalten und beide Fragmente wurden ligiert (Figur 1). Das ligierte Fragment wurde in die SphI- SalI-Restriktionsstelle des Expressionsvektors pUC19 inseriert. Das Konstrukt wurde als pPCN4 bezeichnet.
E. coli JM105 wurde mit pPCN4 in ähnlicher Weise wie in (5) beschrieben transformiert. Die Transformante wurde als JM105/pPCN4 (FERM BP-2779) bezeichnet.

(9) Herstellung von Nitrilhydratase unter Verwendung der Transformante und Umwandlung von Nitrilen zu Amiden unter Verwendung von Nitrilhydratase

10 ml 2 x YT-Medium, das 50 µg/ml Ampicillin enthielt, wurde mit JM105/pPCN4 beimpft und über Nacht (12 Stunden) bei 26,5ºC bebrütet. 100 µl der erhaltenen Kultur wurden 10 ml 2 x YT-Medium (50 µg/ml Ampicillin, 50 mg/l FeSO&sub4; x 7 H&sub2;O, 10 mg/l MgSO&sub4; N 7 H&sub2;O, 1 mg/l Pyrrolochinolinchinon) zugegeben. Das Gemisch wurde fünf Stunden bei 26,5ºC bebrütet. Dem Gemisch wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt. Das Gemisch wurde 10 Stunden bei 26,5ºC bebrütet. Nach Zellernte wurden die Zellen in 5 ml 1/20 M Phosphatpuffer (pH 7,7) suspendiert. 0,1 ml der Suspension wurden 10 µl einer Substratlösung (1 M Acylonitril) zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 20ºC inkubiert. Als Kontrolle wurde ein Gemisch verwendet, das mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren von E. coli JM105 erhalten worden war. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung von HPLC sowohl auf die Gegenwart von Acrylamid (dem Produkt der Enzymreaktion) als auch auf die Gegenwart von Acrylonitril hin getestet. Im Reaktionsgemisch von JM105/pPCN4 wurde Acrylamid festgestellt, aber kein Acrylonitril, während im Reaktionsgemisch von JM105 Acrylonitril gefunden wurde, aber kein Acrylamid.
(1) INFORMATION ZU SEQ ID: Nr. 1
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 200 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRANGE: -
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(vi) URSPRUNG
(A) ORGANISMUS: Pseudomonas chlororaphis
(B) STAMM: B23 (FERM BP-187)
(ix) EIGENSCHAFTEN
(A) WEITERE INFORMATIONEN
α-Untereinheit
(xi) SEQUENZBEZEICHNUNG: SEQ ID: Nr. 1
(2) INFORMATION ZU SEQ ID: Nr. 2
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 220 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: -
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(vi) URSPRUNG
(A) ORGANISMUS: Pseudomonas chlororaphis
(B) STAMM: B23 (FERM BP-187)
(ix) EIGENSCHAFTEN
(A) WEITERE INFORMATIONEN
β-Untereinheit
(xi) SEQUENZBEZEICHNUNG: SEQ ID: Nr. 2
(3) INFORMATION ZU SEQ ID: Nr. 3
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 600 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Genomische DNA
(vi) URSPRUNG
(A) ORGANISMUS: Pseudomonas chlororaphis
(B) STAMM: B23 (FERM BP-187)
(ix) EIGENSCHAFTEN
(A) WEITERE INFORMATIONEN
α-Untereinheit
(xi) SEQUENZBEZEICHNUNG: SEQ ID: Nr. 3
(4) INFORMATION ZU SEQ ID: Nr. 4
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 660 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Genomische DNA
(vi) URSPRUNG
(A) ORGANISMUS: Pseudomonas chlororaphis
(B) STAMM: B23 (FERM BP-187)
(ix) EIGENSCHAFTEN
(A) WEITERE INFORMATIONEN
β-Untereinheit
(xi) SEQUENZBEZEICHNUNG: SEQ ID: Nr. 4
(5) INFORMATION ZU SEQ ID: Nr. 5
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 25 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: -
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(vi) URSPRUNG
(A) ORGANISMUS: Pseudomonas chlororaphis
(B) STAMM: B23 (FERM BP-187)
(ix) EIGENSCHAFTEN
(A) WEITERE INFORMATIONEN
α-Untereinheit: α&sub1;
(xi) SEQUENZBEZEICHNUNG: SEQ ID: Nr. 5
(6) INFORMATION ZU SEQ ID: Nr. 6
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 23 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: -
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(vi) URSPRUNG
(A) ORGANISMUS: Pseudomonas chlororaphis
(B) STAMM: B23 (FERM BP-187)
(ix) EIGENSCHAFTEN
(A) WEITERE INFORMATIONEN
β-Untereinheit: β&sub1;
(xi) SEQUENZBEZEICHNUNG: SEQ ID: Nr. 6
(7) INFORMATION ZU SEQ ID: Nr. 7
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 2070 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Genomische DNA
(vi) URSPRUNG
(A) ORGANISMUS: Rhodococcus
(B) STAMM: sp. N-774 (FERM BP-1936)
(ix) EIGENSCHAFTEN
von Nucleotid-Nr. 675 bis 1295: α-Untereinheit
von Nucleotid-Nr. 1325 bis 1969: β-Untereinheit
(xi) SEQUENZBEZEICHNUNG: SEQ ID: Nr. 7 β-Untereinheit
(8) INFORMATION ZU SEQ ID: Nr. 8
(i) SEQUENZMERKMALE:
(A) LÄNGE: 2456 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) ANZAHL DER STRÄNGE: Einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: Linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Genomische DNA
(vi) URSPRUNG
(A) ORGANISMUS: Pseudomonas chlororaphis
(B) STAMM: B23 (FERM BP-187)
(ix) EIGENSCHAFTEN
von Nucleotid-Nr. 1021 bis 1620: α-Untereinheit
von Nucleotid-Nr. 1666 bis 2325: β-Untereinheit
(xi) SEQUENZBEZEICHNUNG: SEQ ID: Nr. 8 α-Untereinheit β-Untereinheit

Claims

1. Gen, das ein Polypeptid mit Nitrilhydrataseaktivität Codiert, wobei das Polypeptid die α-Untereinheit mit der Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie in dem Sequenzprotokolll durch SEQ ID: No. 1 definiert ist, und die β- Untereinheit mit der Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID: No. 2 definiert ist.

2. Gen nach Anspruch 1, das α- und β-Untereinheiten codiert, umfassend die die α-Untereinheit codierende Sequenz, wie sie in dem Sequenzprotokoll durch SEQ ID: No. 3 definiert ist, und die die β-Untereinheit codierende Sequenz, wie sie in dem Sequenzprotokoll durch SEQ ID: No. 4 definiert ist.

3. Rekombinante DNA, umfassend das Gen nach Anspruch 1 oder 2.

4. Transformante, transformiert mit der rekombinanten DNA nach Anspruch 3.

5. Transformante nach Anspruch 4, die JM105/pPCN4 (FERM BP- 2779) ist.

6. Verfahren zur Herstellung von Nitrilhydratase, umfassend das Züchten der Transformante nach Anspruch 4 oder 5 und die Gewinnung von Nitrilhydratase aus der Kultur.

7. Verfahren zur Herstellung von Amiden, umfassend die Hydratisierung von Nitrilen unter Verwendung einer aus der Kultur der Transformante nach Anspruch 4 oder 5 erhaltenen Nitrilhydratase.

8. Verfahren zur Herstellung von Amiden, umfassend das Züchten der Transformante nach Anspruch 4 oder 5 und das Hydratisieren von Nitrilen zu Amiden unter Verwendung der erhaltenen Kultur, isolierter bakterieller Zellen, behandelten Materials davon, oder eines fixierten Materials davon.