CN1054614A - 编码具有腈水化酶活性的多肽的基因、含该基因的转化株和用该转化株生产酰胺的方法 - Google Patents

编码具有腈水化酶活性的多肽的基因、含该基因的转化株和用该转化株生产酰胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及由Pscudomonas chlororaphis B23 菌株产生的基因，该基因编码具有能将腈水化为酰胺 的腈水化酶活性的多肽。本发明还涉及含有该基因 的重组DNA并用其转化的转化株。本发明进一步 涉及用该转化株生产腈水化酶和用该酶生产酰胺的 方法。

Description

本发明涉及由Pseudomonas  chlororaphis  B23产生的并编码具有将腈水化为酰胺的腈水化酶活性的多肽的基因。本发明还涉及含该基因的重组DNA和用该重组DNA转化的转化株。本发明进一步涉及用该转化株生产腈水化酶和用该腈水化酶生产酰胺的方法。
公众已知腈水化酶是一种将腈水化为酰胺的酶。产生腈水化酶的微生物包括属于芽孢杆菌属（Bacillus）、杆菌属（Bacteridium）、微球菌属（Micrococcus）和短杆菌属（Brevibacterium）（参阅JP-B-62-21517.1989，USP  No.4001081）、棒状杆菌属（Corynebacterium）和诺卡氏菌属（Nocardia）（参阅JP-B-56-17918/1989，USP  No.4248968）、假单胞菌属（Pseudomonas）（参阅JP-B-59-37951/1984，USP  No.4637982）、红球菌属（Rhodococcus）、节细菌属（Arthrobacter）和微杆菌属（Microbacterium）、（参阅JP-A-61-162193/1986，EP-A-0188316）和玫瑰色红球菌（Rhodococcus  rhodochrous）（参阅JP-A-2-470/1990，EP-A-0307926）。
腈水化酶已经用于将腈水化为酰胺。在本发明中，根据重组DNA技术，采用遗传工程方法使微生物含有编码腈水化酶的更多拷贝重组DNA。与常规技术相比，重组体产生显著高水平的腈水化酶。
本发明人先前公开了由Rhodococcus  sp.N-774（FERM-BP-1936）产生的基因，该基因编码具有腈水化酶活性的多肽（JP-A-2-119778/1988）。
可是本发明人又将在USP  No.4637982中所述的由Pseudomonas  chlororaphis  B23产生的基因用于产生腈水化酶。我们分离到编码腈水化酶的基因，并将该基因插入到适当的质粒载体中，再用该重组质粒转化适当的寄主，从而成功地获得产生腈水化酶的转化株。
本发明涉及如下几个方面：
（1）编码具有腈水化酶活性并含有下列氨基酸顺序的α-亚单位的多肽的基因：
5  10  15
MetSerThrSerIleSerThrThrAlaThrProSerThrProGly
20  25  30
GluArgAlaTrpAlaLeuPheGlnValLeuLysSerLysGluLeu
35  40  45
IleProGluGlyTyrValGluGlnLeuThrGlnLeuMetAlaHis
50  55  60
AspTrpSerProGluAsnGlyAlaArgValValAlaLysAlaTrp
65  70  75
ValAspProGlnPheArgAlaLeuLeuLeuLysAspGlyThrAla
80  85  90
AlaCysAlaGlnPheGlyTyrThrGlyProGlnGlyGluTyrIle
95  100  105
ValAlaLeuGluAspThrProGlyValLysAsnValIleValCys
110  115  120
SerLeuCysSerCysThrAsnTrpProValLeuGlyLeuProPro
125  130  135
GluTrpTyrLysGlyPheGluPheArgAlaArgLeuValArgGlu
140  145  150
GlyArgThrValLeuArgGluLeuGlyThrGluLeuProSerAsp
155  160  165
ThrValIleLysValTrpAspThrSerAlaGluSerArgTyrLeu
170  175  180
ValLeuProGlnArgProGluGlySerGluHisMetSerGluGlu
185  190  195
GlnLeuGlnGlnLeuValThrLysAspValLeuIleGlyValAla
200
LeuProArgValGly
和下列氨基酸顺序的β-亚单位：
5  10  15
MetAspGlyPheHisAspLeuGlyGlyPheGlnGlyPheGlyLys
20  25  30
ValProHisThrIleAsnSerLeuSerTyrLysGlnValPheLys
35  40  45
GlnAspTrpGluHisLeuAlaTyrSerLeuMetPheValGlyVal
50  55  60
AspGlnLeuLysLysPheSerValAspGluValArgHisAlaVal
65  70  75
GluArgLeuAspValArgGlnHisValGlyThrGlnTyrTyrGlu
80  85  90
ArgTyrIleIleAlaThrAlaThrLeuLeuValGluThrGlyVal
95  100  105
IleThrGlnAlaGluLeuAspGlnAlaLeuGlySerHisPheLys
110  115  120
LeuAlaAsnProAlaHisAlaThrGlyArgProAlaIleThrGly
125  130  135
ArgProProPheGluValGlyAspArgValValValArgAspGlu
140  145  150
TyrValAlaGlyHisIleArgMetProAlaTyrValArgGlyLys
155  160  165
GluGlyValValLeuHisArgThrSerGluGlnTrpProPhePro
170  175  180
AspAlaIleGlyHisGlyAspLeuSerAlaAlaHisGlnProThr
185  190  195
TyrHisValGluPheArgValLysAspLeuTrpGlyAspAlaAla
200  205  210
AspAspGlyTyrValValValAspLeuPheGluSerTyrLeuAsp
215  220
LysAlaProGlyAlaGlnAlaValAsnAla
（2）如（1）中所述的编码α-和β-亚单位的基因，其含有下列α-亚单位-编码顺序：
15  30  45
ATGAGTACATCTATTTCCACGACTGCGACACCTTCGACACCCGGC
60  75  90
GAGAGGGCATGGGCCTTGTTTCAAGTGCTCAAGAGCAAGGAACTC
105  120  135
ATCCCAGAGGGCTATGTCGAGCAGCTCACTCAATTGATGGCCCAT
150  165  180
GACTGGAGCCCGGAGAACGGCGCTCGCGTGGTCGCCAAGGCATGG
195  210  225
GTCGATCCGCAGTTCCGGGCGCTGCTGCTCAAGGACGGAACAGCC
240  255  270
GCTTGCGCGCAGTTCGGCTACACCGGCCCACAAGGCGAATACATC
285  300  315
GTCGCCCTGGAAGATACACCGGGGGTGAAGAACGTCATCGTCTGC
330  345  360
AGCCTGTGCTCCTGCACCAACTGGCCGGTCCTCGGCCTGCCGCCC
375  390  405
GAGTGGTACAAGGGCTTTGAGTTTCGTGCGCGCCTGGTCCGGGAG
420  435  450
GGGCGCACCGTACTGCGCGAGCTGGGGACGGAGTTGCCGAGCGAC
465  480  495
ACGGTCATCAAAGTCTGGGATACCAGCGCCGAAAGCCGTTACCTG
510  525  540
GTGTTGCCGCAAAGGCCTGAAGGCTCTGAGCACATGAGTGAAGAA
555  570  585
CAGCTTCAACAGCTGGTGACCAAAGACGTGCTGATTGGCGTCGCC
600
CTGCCACGCGTTGGC
和下列β-亚单位编码顺序：
15  30  45
ATGGATGGCTTTCACGATCTCGGCGGTTTCCAAGGCTTTGGCAAA
65  75  90
GTGCCGCACACCATCAACAGCCTCAGCTACAAACAGGTTTTCAAG
105  120  135
CAGGACTGGGAACACCTGGCCTATAGCTTGATGTTTGTCGGCGTT
150  165  180
GACCAATTGAAAAAGTTCAGCGTGGACGAAGTGCGTCATGCCGTC
195  210  225
GAACGCCTGGACGTTCGCCAGCATGTCGGCACCCAGTACTACGAA
240  255  270
CGCTACATCATCGCGACCGCCACGCTGCTGGTGGAAACGGGCGTT
285  300  315
ATCACCCAGGCGGAGCTCGATCAGGCATTGGGTTCCCACTTCAAG
330  345  360
CTGGCGAACCCCGCCCATGCGACAGGTCGCCCGGCGATCACCGGC
375  390  405
AGGCCGCCCTTCGAAGTGGGCGATCGGGTTGTGGTTCGAGACGAA
420  435  450
TATGTGGCGGGGCATATCCGCATGCCGGCCTACGTGCGCGGTAAG
465  480  495
GAAGGCGTGGTCCTGCACCGCACCTCAGAGCAGTGGCCCTTCCCC
510  525  540
GACGCCATTGGCCACGGCGACTTGAGCGCAGCCCATCAGCCTACC
555  570  585
TACCACGTCGAGTTTCGCGTGAAAGATCTATGGGGTGACGCGGCA
600  615  630
GATGACGGTTACGTCGTGGTCGATCTTTTCGAAAGCTACTTGGAT
645  660
AAGGCCCCCGGTGCCCAAGCGGTGAACGCA
（3）含有载体的重组DNA，该载体含有（1）或（2）所述基因：
（4）用（3）所述重组DNA转化的转化株;
（5）生产腈水化酶的方法，该方法包括培养（4）所述转化株，并由其培养物回收腈水化酶;
（6）生产酰胺的方法，该方法包括用（5）所述腈水化酶将腈水化形成酰胺;
（7）生产酰胺的方法，该方法包括培养（4）所述转化株并用生成的培养物将腈水化成酰胺，所述培养物系经过分离的细菌细胞、其经过处理的或固定的材料。
本发明详述如下：
（1）腈水化酶的分离和纯化及其部分氨基酸顺序的编排
由Pseudomonas  chlororaphis  B23分离并纯化的腈水化酶，用HPLC将其分离为α和β亚单位。测定该两种亚单位的部分氨基酸顺序（图1）。
（2）制备用于腈水化酶基因的DNA探针
由于日本专利公报中所述的Rhodococcus  sp.N-774的腈水化酶β亚单位与Pseudomomas  chlororaphis  B23之间的腈水化酶β亚单位在氨基酸顺序上具有高度的同源性，因此由JP-A-2-119778/1990中所述的JM105/pYUK121菌株（FERM  BP-1937）制备DNA探针。由JM105/pYUK121培养物制备含有由Rhodococcus  sp.N-774产生的腈水化酶基因的质粒pYUK121  DNA，并用SphI和Sal  I消化pYUK  121  DNA。Sph  I-Sal  I片段含有Rhodococcus  sp.N-774的腈水化酶基因（图2）。用放射性同位素标记DNA片段，得到探针。
（3）检测含由Pseudomonas  chlororaphis  B23的染色体产生的腈水化酶基因的DNA片段
由Pseudomonas  chlororaphis  B23的培养物制备染色体DNA后，用限制酶对其进行消化，并按Southern杂交方法（Southern，E.M.，J.Mol.Biol，98，503，1975）将其与（2）所述探针杂交。筛选出不同长度的两个DNA片段。
（4）重组质粒的构建
重组质粒的构建是将（3）所制备的染色体DNA片段插入质粒载体。
（5）含有重组质粒的转化株的转化和筛选。
用（4）所述的重组质粒制备转化株。按菌落杂交方法（R.Bruce  Wallace  et.al.，Nuc.Aci.Res.9，879，1981），用（2）所述探针选择含重组质粒的转化株，并再用Southern杂交方法确认重组质粒中是否存在腈水化酶基因。由此选出的质粒命名为pPCN1和pPCN3。
（6）质粒DNA的分离和纯化以及限制性图的构建
分离和纯化（5）所述的pPCN1和pPCN3的质粒DNA，构建DNA的限制性图（图3），以测定含腈水化酶的区域。
（7）DNA顺序的编排
用适当的限制酶切除插入在pPCN1和pPCN3中的DNA片段的多余片段，然后将插入的DNA片段用于顺序编排。DNA片段的核苷酸顺序（图4）显示其含有由（1）所述氨基酸顺序推导得到的顺序。
（8）DNA片段插入表达载体和转化
用适当的限制酶从pPCN1和pPCN3上切下DNA片段。将这两个片段连接后插入到表达载体pUC19。将该构建用于转化大肠杆菌JM105（Amersham），所得转化株命名为JM105/pPCN4。
（9）用转化株生产腈水化酶并将腈转化为酰胺
培养（8）所述的转化株，将细菌细胞与作为腈水化酶底物的腈混合，生产酰胺。
Pseudomonas  chlororaphis  B23保藏在日本工业科学技术厅发酵研究所（FERM），保藏号为FERM  BP-187。转化株JM105/pPCN4也保藏在该所，保藏号为FERM  BP-2779。
任何载体都可用于本发明，包括质粒载体（例如pAT153，pMP9，pHC624，pKC7等）和噬菌体载体（例如λgtll（Toyobo），Charon  4A（Amersham）等）。可用的酶包括SphI，SalI，SacI，BamHI，EcoRI，PstI等，它们均可通过商业途径得到（Takara  Shuao）。各种宿主都可用于转化，包括但不限于大肠杆菌JM105和TG1。用于转化株的培养基系本领域常用的培养基。
将腈转化酰胺可用腈水化酶，粗制腈水化酶和转化株、分离的细菌细胞或其经处理过的材料的培养物等，它们均由转化株的培养物制备。
适用于本发明的腈包括具有2-4个碳原子的腈，例如乙腈、丙腈、丙烯腈、甲基丙烯腈，正丁腈和异丁腈，尤以丙烯腈为佳。
附图说明如下：
图1  表示由Pseudomonas  chlororaphis  B23产生的腈水化酶α和β亚单位的N端氨基酸顺序;
图2  表示用作DNA探针的Rhodococcus  sp.N-774的腈水化酶基因的DNA顺序;
图3  表示重组质粒pPCN1，pPCN3和pPCN4的部分限制性图;
图4  表示DNA插入在由Pseudomonas  chlororaphis  B23产生的pPCN3中的核苷酸顺序和推导得到的氨基酸顺序。
本发明已经公开了由Pseudomonas  chlororaphis  B23产生的腈水化酶α和β亚单位的氨基酸顺序和核苷酸顺序，插入表达载体的编码腈水化酶的基因，用于转化的重组载体。与常规用的微生物相比，转化株含有更多的基因拷贝数和产生更大量的腈水化酶。
本发明将通过以下实施例予以详细说明，但决不是以此来限制本发明。
在实施例中使用了以下省略符号：
TE：Tris-HCl（10  mM，pH7.8），EDTA（1mM，pH8.0）
TNE：Tris-HCl（50  mM，pH8.0），EDTA（1  mM，pH8.0），NaCl（50  mM）
STE：Tris-HCl（50  mM，pH8.0），EDTA（5  mM，pH8.0），蔗糖（35  mM）
2×YT培养基：1.6%胰蛋白胨，1.0%酵母膏，0.5%NaCl。
实施例
（1）腈水化酶的分离和纯化及其部分氨基酸顺序的编排
在25℃下，将Pseudomonas chlororaphis B23在培养基中培养28小时。培养基含有蔗糖10g/l，甲丙烯酰胺4g/l，KH2PO40.5g/l，K2HPO40.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，FeSO4·7H2O 0.01g/l（pH 7.0）。收集细菌细胞，取其100g用硫酸铵破碎和分级分离。将样品进行透析，并离心透析物。取其上清液装载在DEAE-Sephacel色谱、Octyl-Sepharose CL-4B色谱、Phenyl-Sapharose CL-4B色谱和Sephadex G-150色谱上。收集和透析活性部分，将含有酶的透析物用反向柱装载在HPLC（Senshu Pak VP-304-1251，Senshu Kagaku），得到两个亚单位（α和β）。用氨基酸顺序仪（Applied Biosystems model 470A）测定α和β亚单位的N端氨基酸顺序。α和β亚单位的N端氨基酸顺序示于图1。
（2）用于腈水化酶基因的DNA探针的制备
在30℃下将含pYUK121的大肠杆菌JM105（FERM  BP-1937）培养在100ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中过夜（12小时）。收集细菌细胞，加入TNE，离心该细胞悬浮液。将8ml  STE和10mg溶菌酶加到细胞碎片沉淀物中，该混合物在0℃下温育5分钟后加入4ml  0.25M  EDTA，然后再在室温下加入2ml的10%  SDS和5ml的5M  NaCl。生成的混合物在0-4℃下静置3小时后进行超速离心。以1/2体积的30%PEG6000加到上清液中，混合物在0-4℃下静置过夜（12小时）后离心。然后将TNE加入细胞碎片沉淀物中，使体积变为7.5ml，再将CsCl加到悬浮液中。混合物经离心去除蛋白质。将300-500mg/ml溴乙锭加到上清液中，并将混合物转移到离心管中，离心管经热封闭后进行超速离心，并用蠕动泵抽提cccDNA。将略多于等量的水饱和异丙醇加到提取液中，去除溴乙锭。样品经TE透析，得到约3ml纯化的pYUK121。
pYUK121 DNA用SphI和SalI消化，形成含由Rhodococcus sp.N-774产生的腈水化酶基因的2.07 kb DNA片段。该片段用32P进行放射性同位素标记，产生探针。探针的核苷酸顺序示于图2。
（3）含染色体腈水化酶基因的DNA片段的制备
将Pseudomonas chlororaphis B23培养在100ml（1）所述的培养基中，收集细菌细胞，细胞碎片经TNE洗涤后悬浮于10ml TE中，加4ml 0.25 M EDTA，10-20mg溶菌酶，10-20mg非染色体蛋白酶（achromoprotease）和10ml 10% SDS。悬浮液在37℃下温育3小时，再加15ml苯酚。该混合物在室温下温育15分钟后离心。向15ml的上层加0.7ml的2.5M乙酸钠和乙醚，然后再离心。滗去上层，向底层加二倍体积的乙醇，用玻璃棒取出DNA。该DNA依次用2∶8、1∶9和0∶10（V/V）的TE∶乙醇各冲洗5分钟，然后再将DNA悬浮在2-4ml的TE（37℃）中。将10μl RNA酶A和T1的混合物加到悬浮液中，在37℃下温育，加入等量苯酚，离心。向2-4ml的上层加多于等量的乙醚，离心。离心后，滗去上层，底层用21含少量氯仿的TE透析过夜后，再用新鲜的TE透析3-4小时。得到4ml粘制染色体DNA，然后按如下所述对染色体DNA进行酶消化：
（a）2μl  SacI+3μl反应缓冲液（10X）+15μl染色体DNA+10μl  TE，
（b）2μl  BamHI+2μl  SalI+3μl反应缓冲液（10X）+15μl染色体DNA+10μl  TE。
该混合物在37℃下温育1小时后，在60V的琼脂糖上电泳3小时，用（2）所述探针进行染色体DNA的Southern杂交，得到约4.6kb和4.7kb片段，显示杂交情况极其良好。
15ml的染色体DNA按如上所述用SacI、BamHI和SalI消化，在琼脂糖上进行电泳。从凝胶上切下4.6kb和4.7kb DNA片段后置于3倍体积的8M NaClO4中。将溶液点在GF/C（Whatman）滤纸（直径6mm）上，再在滤纸上先后滴加10滴（
Figure 911013296_IMG1
100ml）含6M NaClO4的TE和10滴（
Figure 911013296_IMG2
10ml）95%乙醇。滤纸经空气干燥后置于0.5ml Eppendorf管中，加40μl TE，37℃下温育30分钟，离心。得到约40μl上清液，其中4.6kb和4.7kb DNA片段含有染色体DNA的腈水化酶基因。
（4）将染色体DNA片段插入载体
（a）4.6kb  DNA片段
将2μl  SacI、3μl反应缓冲液（10X）和10μl  TE加到10μl的pUC18  DNA中，在37℃下温育1小时，加2μl的0.25M  EDTA，终止反应。然后再加7μl  1M  Tris-HCl（pH9）和3μl  BAP（细菌碱性磷酸酶），在65℃温育1小时，将TE加到该混合物中，使总体积达到高至100μl，再用等量苯酚提取3次，在提取液中加等量的醚。取出底层，将10μl  3M乙酸钠和250μl乙醇加到该底层中，在-80℃下温育30分钟，离心，干燥。再悬浮在TE中。
将由此得到的5μl  pUC18  DNA与（3）所述40μl的4.6  kb  DNA片段混合后，加入6μl连接缓冲液、6μl  ATP（6mg/ml）和3μl  T4  DNA连接酶。该混合物在4℃温育过夜（12小时），产生的重组质粒含有在pUC18的SacI位点上的4.6  kb  DNA片段。
（b）4.7  kb  DNA片段
pUC18  DNA用BamHI和SalI消化，按类似（4）-（a）所述方法将4.7  kb  DNA片段插入pUC18的BamHI-SalI位点上。得到的重组质粒含有pUC18的BamHI-SalI位点上的4.7  kb  DNA片段。
（5）转化株的转化和筛选
将大肠杆菌JM105（Amersham）接种到10ml的2×YT培养基后，在37℃下温育12小时。温育后，将生成的培养物加到浓度为1%的新鲜的2×YT培养基中，该混合物在37℃下温育2小时后离心，将碎片沉淀物悬浮在5ml冷却的50mM CaCl2中。悬浮液在0℃下放置40分钟后离心，再将0.25ml冷却的50mM CaCl2和60μl的按（4）-（a）和（4）-（b）制备的重组质粒加到分离管中的碎片沉淀物。该混合物在0℃下温育40分钟，在42℃下热休克2分钟，置于0℃下5分钟，然后将其加到10ml的2×YT培养基中，在37℃摇动培育90分钟，离心。将碎片沉淀物悬浮在1ml 2×YT培养基中，取10μl悬浮液置于含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT琼脂板上，在37℃下温育。用菌落杂交方法挑选生长在琼脂板上的菌落，将菌落转移到硝基纤维滤膜上进行消化。将DNA固定在滤膜上并与（2）所述探针杂交，滤膜经放射自显影后，选出重组菌落，再按Southern杂交方法确认转化株中是否存在腈水化酶基因。
（6）重组质粒的分离和纯化以及插入DNA片段限制性图的构建
在37℃下将按（5）选择的转化株在100ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中培养过夜（12小时），收集细菌细胞，并将TNE加到细胞中。再离心收集细胞，并将8ml  STE和10mg溶菌酶加到细胞中。该混合物在0℃下温育5分钟后，加入4ml的0.25M  EDTA、2ml的10%SDS（室温）和5ml的5M  NaCl，在0-4℃下温育3小时后进行超速离心。将1/2体积的30%PEG  6000加到上清液中，在0-4℃下温育过夜（12小时），再进行离心。将TNE加到碎片沉淀物中，使体积达高至7.5ml。将CsCl加到悬浮液中，离心到除去蛋白质。然后将300-500mg/ml溴化锭加到上清液中，并将混合物转移到离心管中，离心管经热密封后进行超速离心。用蠕动泵移取cccDNA，加入略多于等量的水饱和异丙醇，以除去溴化锭。DNA样品经TE透析，生成约3ml的重组DNA。由此得到的重组质粒，含有4.6kb  DNA片段，命名为pPCN1（重组质粒含有4.7kb  DNA片段，命名为pPCN3）。
上述质粒DNA用EcoRI、BamHI，PstI，SacI和SalI消化。构建的限制性图示于图3。
（7）DNA顺序的编排
根据构建的限制性图和Southern杂交方法，测定腈水化酶基因在pPCN1和pPCN3的DNA片段中的位置。根据所得结果，采用Sanger方法（Sanger  F.，Science  214：1205-1210，1981）和M13噬菌体载体，将2.456  kb  BamHI-Hinc  Ⅱ  DNA片段编排顺序。由Pseudomonas  chlororaphis  B23得到的2.456  kb  DNA片段示于图4。
由（1）所测定的氨基酸顺序推导得到的全部核苷酸顺序与上述测定的顺序相一致。顺序分析还证明，该DNA片段含有编码α和β亚单位的顺序。
（8）将BamHI-Hinc  Ⅱ  DNA片段插入表达载体和转化
切下pPCN1的2.2kb  SphI-BamHI片段和pPCN3的4.7kb  BamHI-SalI片段，将这两个片段连接（图3）。将连接的片段插入到表达载体pUC19的SphI-SalI位点中，该构建命名为pPCN4。
按类似（5）的方法，用pPCN4转化大肠杆菌JM105，所得转化株命名为JM105/pPCN4（FERM  BP-2779）。
（9）用转化株生产腈水化酶并用该酶将腈转化为酰胺
将JM105/pPCN4接种到10ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中，于26.5℃下温育过夜（12小时）。将100μl生成的培养物加到10ml的2×YT培养基中（50μg/ml氨苄青霉素，50mg/ml FeSO4·7H2O，10mg/l MgSO4·7H2O，1mg/l吡咯并喹啉醌）。该混合物在26.5℃下温育5小时，将IPTG加到该合物中，使其最终浓度为1mM，再在26.5℃下温育10小时。将细胞收集后，悬浮在5ml的1/20M磷酸盐缓冲液（pH7.7）中。将10μl底物溶液（1M丙烯腈）加到0.1ml悬浮液中，在20℃下温育20分钟。按上述同样方法但是由大肠杆菌JM105制备的混合物用作对照。用HPLC测定反应混合物中是否存在丙烯酰胺（酶反应的产物）和丙烯腈。结果在JM105/pPCN4的反应混合物中存在丙烯酰胺，但没有丙烯腈;而在JM105反应混合物中存在丙烯腈，但没有丙烯酰胺。

Claims (7)

1、编码具有腈水化酶活性的多肽的基因，所述多肽含有下列氨基酸顺序的α和β亚单位：
α-亚单位：
              5             10             15
MetSerThrSerIleSerThrThrAlaThrProSerThrProGly
             20             25             30
GluArgAlaTrpAlaLeuPheGlnValLeuLysSerLysGluLeu
             35             40             45
IleProGluGlyTyrValGluGlnLeuThrGlnLeuMetAlaHis
             50               55          60
AspTrpSerProGluAsnGlyAlaArgValValAlaLysAlaTrp
             65             70             75
ValASpProGlnPheArgAlaLeuLeuLeuLysAspGlyThrAla
             80             85             90
AlaCysAlaGlnPheGlyTyrThrGlyProGlnGlyGluTyrIle
             95            100             105
ValAlaLeuGluAspThrProGlyValLysAsnValIleValCys
            110            115            120
SerLeuCysSerCysThrAsnTrpProValLeuGlyLeuProPro
            125            130            135
GluTrpTyrLysGlyPheGluPheArgAlaArgLeuValArgGlu
            140            145            150
GlyArgThrValLeuArgGluLeuGlyThrGluLeuProSerAsp
            155            160            165
ThrValIleLysValTrpAspThrSerAlaGluSerArgTyrLeu
            170            175            180
ValLeuProGlnArgProGluGlySerGluHisMetSerGluGlu
            185            190            195
GlnLeuGlnGlnLeuValThrLysAspValLeuIleGlyValAla
            200
LeuProArgValGly
β-亚单位：
              5             10             15
MetAspGlyPheHisAspLeuGlyGlyPheGlnGlyPheGlyLys
             20             25             30
ValProHisThrIleAsnSerLeuSerTyrLysGlnValPheLys
             35             40             45
GlnAspTrpGluHisLeuAlaTyrSerLeuMetPheValGlyVal
             50             55             60
AspGlnLeuLysLysPheSerValAspGluValArgHisAlaVal
             65             70             75
GluArgLeuAspValArgGlnllisValGlyThrGlnTyrTyrGlu
             80             85             90
ArgTyrIleIleAlaThrAlaThrLeuLeuValGluThrGlyVal
             95            100            105
IleThrGlnAlaGluLeuAspGglnAlaLeuGlySerhisPhel,ys
            110            115            120
LeuAlaAsnProAlaHisAlaThrGlyArgProAlaIleThrGly
            125            130            135
ArgProProPheGluValGlyAspArgValValValArgAspGlu
            140            145            150
TyrValAlaGlyHisIleArgMetProAlaTyrValArgGlyLys
            155             160            165
GluGlyValValLeu11isArgThrSerGluGlnTrpProPhePro
            170             175            180
AspAlaIleGlyHisGlyAspLeuSAerAlaAlaHisGlnProThr
            185            190            195
TyrHisValGluPheArgValLysAspLeuTrpGlyAspAlaAla
            200            205            210
AspAspGlyTyrValValValAspLeuPheGluSerTyrLeuAsp
            215            220
LysAlaProGlyAlaGinAlaVaiAsnAla
2、编码α和β亚单位的权利要求1的基因，含有α-亚单位编码顺序：
15  30  45
ATGAGTACATCTATTTCCACGACTGCGACACCTTCGACACCCGGC
60  75  90
GAGAGGGCATGGGCCTTGTTTCAAGTGCTCAAGAGCAAGGAACTC
105  120  135
ATCCCAGAGGGCTATGTCGAGCAGCTCACTCAATTGATGGCCCAT
150  165  180
GACTGGAGCCCGGAGAACGGCGCTCGCGTGGTCGCCAAGGCATGG
195  210  225
GTCGATCCGCAGTTCCGGGCGCTGCTGCTCAAGGACGGAACAGCC
240  255  270
GCTTGCGCGCAGTTCGGCTACACCGGCCCACAAGGCGAATACATC
285  300  315
GTCGCCCTGGAAGATACACCGGGGGTGAAGAACGTCATCGTCTGC
330  345  360
AGCCTGTGCTCCTGCACCAACTGGCCGGTCCTCGGCCTGCCGCCC
375  390  405
GAGTGGTACAAGGGCTTTGAGTTTCGTGCGCGCCTGGTCCGGGAG
420  435  450
GGGCGCACCGTACTGCGCGAGCTGGGGACGGAGTTGCCGAGCGAC
465  480  495
ACGGTCATCAAAGTCTGGGATACCAGCGCCGAAAGCCGTTACCTG
510  525  540
GTGTTGCCGCAAAGGCCTGAAGGCTCTGAGCACATGAGTGAAGAA
555  570  585
CAGCTTCAACAGCTGGTGACCAAAGACGTGCTGATTGGCGTCGCC
600
CTGCCACGCGTTGGC
β-亚单位编码顺序：
15  30  45
ATGGATGGCTTTCACGATCTCGGCGGTTTCCAAGGCTTTGGCAAA
65  75  90
GTGCCGCACACCATCAACAGCCTCAGCTACAAACAGGTTTTCAAG
105  120  135
CAGGACTGGGAACACCTGGCCTATAGCTTGATGTTTGTCGGCGTT
150  165  180
GACCAATTGAAAAAGTTCAGCGTGGACGAAGTGCGTCATGCCGTC
195  210  225
GAACGCCTGGACGTTCGCCAGCATGTCGGCACCCAGTACTACGAA
240  255  270
CGCTACATCATCGCGACCGCCACGCTGCTGGTGGAAACGGGCGTT
205  300  315
ATCACCCAGGCGGAGCTCGATCAGGCATTGGGTTCCCACTTCAAG
330  345  360
CTGGCGAACCCCGCCCATGCGACAGGTCGCCCGGCGATCACCGGC
375  390  405
AGGCCGCCCTTCGAAGTGGGCGATCGGGTTGTGGTTCGAGACGAA
420  435  450
TATGTGGCGGGGCATATCCGCATGCCGGCCTACGTGCGCGGTAAG
465  480  495
GAAGGCGTGGTCCTGCACCGCACCTCAGAGCAGTGGCCCTTCCCC
510  525  540
GACGCCATTGGCCACGGCGACTTGAGCGCAGCCCATCAGCCTACC
555  570  585
TACCACGTCGAGTTTCGCGTGAAAGATCTATGGGGTGACGCGGCA
600  615  630
GATGACGGTTACGTCGTGGTCGATCTTTTCGAAAGCTACTTGGAT
645  660
AAGGCCCCCGGTGCCCAAGCGGTGAACGCA
3、含有权利要求1或2所述基因的重组DNA。
4、用权利要求3的重组DNA转化的转化株。
5、生产腈水化酶的方法，该方法包括培养权利要求4所述的转化株和由该培养物回收腈水化酶。
6、生产酰胺的方法，该方法包括用由权利要求4的转化株培养物得到的腈水化酶将腈水化。
7、生产酰胺的方法，该方法包括培养权利要求4所述的转化株和用其生成的培养物、分离的细菌细胞、以及其经过处理的材料，或其固定的材料，将腈水化为酰胺。
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