CN1054639C - 生产腈水化酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了由玫瑰色红球菌J-1产生的两种腈水化酶的α-和β-亚单位的氨基酸顺序和核苷酸顺序。将编码腈水化酶的DNA片段插入表达载体并将该重组载体用于转化。转化株与常规用的微生物相比含有基因的更多拷贝和能生产更大量的腈水化酶。

Description

生产腈水化酶的方法
本发明涉及由玫瑰色红球菌J-1(Rhodococcus rhodochrous J-1)产生的并编码具有将腈水化为酰胺的腈水化酶活性的多肽的DNA片段。本发明还涉及含该DNA片段的重组DNA和用该重组DNA转化的转化株。本发明进一步涉及用该转化株生产腈水化酶和用该腈水化酶生产酰胺的方法。
公众已知腈水化酶是一种将腈水化为酰胺的酶。产生腈水化酶的微生物包括属于芽孢杆菌属(Bacillus)、杆菌属(Bacteridium)、微球菌属(Micrococcns)和短杆菌属(Brcvibactcrium)(参阅JP-B-62-21517，1989，USP No.4001081)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和诺卡氏菌属(Nocardia)(参阅JB-B-56-17918/1989，USP No.4248968)、假单胞菌属(Pseudomonax)(参阅JP-B-59-37951/1984，USP No.4637982)、红球菌属(Rhodococcus)、节细菌属(Arthrobacter)和微杆菌属(Microbacterium)、(参阅JP-A-61-162193/1986，EP-A-0188316)和玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)(参阅JP-A-2-470/1990，EP-A-0307926)。
腈水化酶已经用于将腈水化为酰胺。在本发明中，根据重组DNA技术，采用遗传工程方法使微生物含有编码腈水化酶的更多拷贝重组DNA。与常规所用的微生物相比，重组体产生显著高水平的腈水化酶。
本发明人先前公开了由Rhodococcus spN-774(FERM-BP-1936)(CCTCC No：M91004)产生的DNA片段，该片段编码具有腈水化酶活性的多肽(JP-A-2-119778/1988)。
可是本发明人由玫瑰色红球菌J-1产生的DNA片段用于产生腈水化酶。我们分离到编码腈水化酶的基因，并将该基因插入到适当的质粒载体中，再用该重组质粒转化适当的寄主，从而成功地获得产生对芳腈具有高活性的腈水化酶的转化株。
本发明涉及如下几个方面。
(1)编码具有腈水化酶活性的多肽的DNA(H)片段，所述多肽含有下列氨基酸顺序的α(H)-和β(H)-亚单位：
α(H)-亚单位：
                  5             10             15
    MetSerGluHisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr
                 20             25             30
    LysAlaIleGluThrLeuLeuTyrGluArgGlyLeuIleThrPro
                 35             40             45
    AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGluIleGly
                 50             55             60
    ProMetGlyGlyAlaLysValValAlaLysSerTrpValAspPro
                 65             70             75
    GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMetAla
                 80             85             90
    SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnIleSerAlaVal
                 95            100            105
    PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCys
                110            115            120
    SerCysTyrProTrpProValLeuGlyLeuProProAlaTrpTyr
                125            130            135
    LysSerMetGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGly
                140            145            150
    ValLeuLysArgAspPheGlyPheAspIleProAspGluValGlu
                155            160            165
    ValArgValTrpAspSerSerSerGluIleArgTyrIleValIle
                170            175            180
    ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu
                185            190            195
    ThrLysLeuValSerArgAspSerMetIleGlyValSerAsnAla
                200
    LeuThrProGlnGluValIleVal
β(H)-亚单位：
                  5             10             15
    MetAspGlyIleHisAspThrGlyGlyMetThrGlyTyrGlyPro
                 20             25             30
    ValProTyrGlnLysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGlu
                 35             40             45
    GlyArgThrLeuSerIleLeuThrTrpMetHisLeuLysGlyIle
                 50             55             60
    SerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgGluSerMetGlyAsn
                 65             70             75
    GluAsnTyrValAsnGluIleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp
                 80             85             90
    LeuSerAlaAlaGluArgIleLeuValAlaAspLysIleIleThr
                 95            100            105
    GluGluGluArgLysHisArgValGlnGluIleLeuGluGlyArg
                110            115            120
    TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnIle
                125            130            135
    GluLysAlaIleGluArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeu
                140            145            150
    ProGlyAlaGluProSerPheSerLeuGlyAspLysIleLysVal
                155            160            165
    LysSerMetAsnProLeuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal
                170            175            180
    ArgAsnLysIleGlyGluIleValAlaTyrHisGlyCysGlnIle
                185            190            195
    TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro
                200            205            210
    LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp
                215            220            225
    GlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGluProTyr
    LeuIleSerAla；
(2)编码具有腈水化酶活性的多肽的DNA(L)片段，所述多肽含有下列氨基酸顺序的α(L)-和β(L)-亚单位：
α(L)-亚单位：
                  5             10             15
    MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsn
                 20             25             30
    GluGluIleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlaIleLeuVal
                 35             40             45
    AspLysGlyLeuIleSerThrAspAlaIleAspHisMetSerSer
                 50             55             60
    ValTyrGluAsnGluValGlyProGlnLeuGlyAlaLysIleVal
                 65             70             75
    AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr
                 80             85             90
    AspAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyValGlyGlyMetGln
                 95            100            105
    GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn
                110            115            120
    MetValValCysThrLeuCysSerCysTyrProTrpProValLeu
                125            130            135
    GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg
                140            145            150
    AlaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThr
                155            160            165
    ProAspProAspValGluIleArgIleTrpAspSerSerAlaGlu
                170            175            180
    LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn
                185            190            195
    PheThrGluGluGlnLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeu
                200            205
    IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAlaβ(L)-亚单位：
                  5             10             15
    MetAspGlyIleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyPro
                 20             25             30
    IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu
                 35             40             45
    ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaGlyAla
                 50             55             60
    PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnIleProPro
                 65             70             75
    HisAspTyrLeuThrSerGlnTyrTyrGluHisTrpMetHisAla
                 80             85             90
    MetIleHisHisGlyIleGluAlaGlyIlePheAspSerAspGlu
                 95            100            105
    LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspHisProAspAspThr
                110            115            120
    ThrProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrIleSerGln
                125            130            135
    LeuIleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu
                140            145            150
    AlaAlaPheAlaValGlyAspLysValIleValArgSerAspAla
                155            160            165
    SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg
                170            175            180
    ValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp
                185            190            195
    ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr
                200            205            210
    ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro
                215            220            225
    AsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuLeuPro
    Ala
(3)含有编码所述α(H)-和β(H)-亚单位的核苷酸顺序的(1)的DNA(H)片段，包括：
α(H)-亚单位的DNA顺序：
                     15             30             45
        GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC
                     60             75             90
        AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC
                    105            120            135
        GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGC
                    150            165            180
        CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT
                    195            210            225
        GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG
                    240            255            270
        TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC
                    285            300            315
        TTCAACGACTCCCAAAC6CATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT
                    330            345            360
        TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC
                    375            390            405
        AAGAGCATGGAGTACCG6TCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA
                    420            435            450
        GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG
                    465            480            495
        GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC
                    510            525            540
        CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG
                    555            570            585
        ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG
                    600
        CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTA
β(H)-亚单位的DNA顺序：
                     15             30             45
        ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCG
                     60             75             90
        GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG
                    105            120            135
        GGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA
                    150            165            180
        TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC
                    195            210            225
        GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG
                    240            255            270
        CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC
                    295            300            315
        GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTCGG
                330            345            360
    TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCACATC
                375            390            405
    GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT
                420            435            450
    CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG
                465            480            495
    AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATCTG
                510            525            540
    CGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC
                555            570            585
    TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG
                600            615            630
    CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGCCGACGAC
                645            660            675
    GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTAC
    CTGATCTCTGCG
(4)含有编码α(L)-和β(L)-亚单位的核苷酸顺序的(2)的DNA(L)片段，包括：
α(L)-亚单位的DNA顺序：
                 15             30             45
    ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC
                 60             75             90
    GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC
                105            120            135
    GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG
                150            165            180
    GTCTACGACAACGAGGTCGGTCCTCAACTCGGCGCCAAGATCGTC
                195            210            225
    GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC
                240            255            270
    GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATCCAG
                285            300            315
    GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC
                330            345            360
    ATGGTCCGATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC
                375            390            405
    GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC
                420            435            450
    GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC
                465            480            495
    CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA
                510            525            540
    CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC
                555            570            585
    TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC
                600            615
    ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCCβ(L)-亚单位的DNA顺序：
                 15             30             45
    ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG
                 60             75             90
    ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG
                105            120            135
    CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG
                150            165            180
    TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG
                195            210            225
    CACGACTACCTGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG
                240            255            270
    ATGATCCACCACGGCATCGAGGCGGGCATCTTCGATTCCGACGAA
                285            300            315
    CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG
                330            345            360
    ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA
                375            390            405
    CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG
                420            435            450
    GGCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC
                465            480            495
    TCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT
                510            525            540
    GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC
                555            570            585
    ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACC
                600            615            630
    GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG
                645            660            675
    AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCG
    GCC
(5)重组DNA，包括载体中(1)-(4)的DNA(H)或DNA(L)；
(6)用(5)的重组DNA转化的转化株；
(7)生产腈水化酶的方法，该方法包括培养(6)所述转化株，并由其培养物回收腈水化酶；
(8)生产酰胺的方法，该方法包括用(7)所述腈水化酶将腈水化成酰胺；
(9)生产酰胺的方法，该方法包括培养(6)所述转化株并用生成的培养物将腈水化成酰胺，所述培养物系经过分离的细菌细胞、其经过处理的或其固定的材料。
本发明详述如下。
本发明按以下(1)-(8)步骤进行：
(1)腈水化酶的分离和纯化及其部分氨基酸顺序的编排
由玫瑰色红球菌J-1(FERM BP-1478)(CCTCC No.M88091)(CGMCC：0143)分离并纯化H型和L型两种腈水化酶，用HPLC将其分离为α和β亚单位。测定该两种亚单位的部分氨基酸顺序(图1)。
(2)制备用于腈水化酶基因的DNA探针
由于日本专利公报中所述的Rhodococcus sp.N-774的腈水化酶β亚单位与玫瑰色红球菌J-1之间的腈水化酶β亚单位在氨基酸顺序上具有高度的同源性，因此由JP-A-2-119778/1990中所述的JM105/pYUK121(FERMBP-1937)(CCTCCNo：M91006)制备DNA探针。含有Rhodocooous sp.N-774产生的腈水化酶基因的质粒pYUK121是由JM105/pYUK121培养制备的。用SphI和Sal I消化pYUK 121 DNA。SphI-Sal I片段含有Rhodococcus sp.N-774的腈水化酶基因(图2)。用放射性同位素标记DNA片段。
(3)检测含由玫瑰色红球菌J-1的染色体产生的腈水化酶基因的DNA片段
由玫瑰色红球菌J-1的培养物制备染色体DNA后，用限制酶对其进行消化，并按Southern杂交方法(Southern，E.M.，J.Mol.Biol，98，503，1975)将其与(2)所述探针杂交。筛选出不同长度的两个DNA片段。
(4)重组质粒的构建
重组质粒的构建是将(3)所制备的染色体DNA片段插入质粒载体。
(5)含有重组质粒的转化株的转化和筛选。
用(4)所述的重组质粒制备转化株。按菌落杂交方法(R.BruceWallace et.al.，Nuc.Aci.Res.9，879，1981)，用(2)所述探针选择含重组质粒的转化株，并再用Southeru杂交方法确认重组质粒中是否存在腈水化酶基因。由此选出的质粒命名为pNHJ10H和pNHJ20L。
(6)质粒DNA的分离和纯化以及限制性图的构建
分离和纯化(5)所制备的pNHJ10H和pNHJ20L的质粒DNA，构建DNA的限制性图(图3)，以测定含腈水化酶基因的区域。
(7)DNA顺序的编排
用适当的限制酶切除插入在pNHJ10H和pNHJ20L中的DNA片段的多余片段，然后将括入的DNA片段用于顺序编排。DNA片段的核苷酸顺序(图4和5)显示其含有由(1)所述氨基酸顺序推导得到的顺序。
(8)用转化株生产腈水化酶并将腈转化为酰胺
培养(8)所述的转化株，将细菌细胞与作为腈水化酶底物的腈混合，生产酰胺。
玫瑰色红球菌J-1保藏在日本工业科学技术厅发酵研究所(FERM)，保藏号为FERM BP-1470。含(5)所述pNHJ10H的转化株TG1/pNHJ10H和含(5)所述pNHJ20L的转化株TG1/pNHJ20L也都保藏在该所，保藏号分别为FERMBP-2777(CCTCC No：M91007)和FERM BP-2778(CCTCC No：M91008)。
任何载体都可用于本发明，包括质粒载体(例如pAT153，pMP9，pHC624，pKC7等)和噬菌体载体(例如λgtll(Toyobo)，Charon 4A(Amersham)等)。可用的酶包括SphI，SalI，SacI，BamHI和EcoRI等，它们均可通过商业途径得到(Takara Shuao)。各种宿主都可用于转化，包括但不限于大肠杆菌JM105和大肠杆菌TG1。用于转化株的培养基系本领域常用的培养基。
将腈转化酰胺是用腈水化酶，粗制腈水化酶和转化株、分离的细菌细胞或其经处理过的材料等的培养物，它们均由转化株的培养物制备。
本发明适用的腈如欧洲专利公报No.0307926中所述，包括在芳族部分具有4-10个碳原子的芳族腈和具有2-6个碳原子的脂族腈。所述腈的典型例子是4-，3-和2-氰基吡啶，苄腈，2，6-二氟苄腈，2-噻吩腈，2-糠腈，氰基吡嗪，丙烯腈，甲基丙烯腈，巴豆腈，乙腈和3-羟丙腈。
本发明已经公开了由玫瑰色红球菌J-1产生的两种腈水化酶的α和β亚单位的氨基酸顺序和核苷酸顺序，插入表达载体编码腈水化酶的DNA片段，重组载体用于转化。与常规用的微生物相比，转化株含有更多的基因拷贝数和产生更大量的腈水化酶。
附图说明如下：
图1表示由玫瑰色红球菌J-1产生的两种腈水化酶的α和β亚单位的N端氨基酸顺序；
图2表示用作DNA探针的Rhodococcus sp.N-774的腈水化酶基因的DNA顺序；
图3表示重组质粒pNHJ10H和pNHJ20L的限制性图；
图4表示在由玫瑰色红球菌J-1产生的pNHJ10H中的DNA片段的DNA顺序推导得到的氨基酸顺序。
图5表示在由玫瑰色红球菌J-1产生的pNHJ20L中的DNA片段的DNA顺序和推导得到的氨基顺序。
本发明将通过以下实施例予以详细说明，但决不是以此来限制本发明。
在实施例中使用了以下省略符号：
TE：Tris-HCl(10mM，pH7.8)，EDTA(1mM，pH8.0)
TNE：Tris-HCl(50mM，pH8.0)，EDTA(1mM，pH8.0)，NaCl(50mM)
STE：Tris-HCl(50mM，pH8.0)，EDTA(5mM，pH8.0)，蔗糖(35mM)
2×YT培养基：1.6％胰蛋白胨，1.0％酵母膏，0.5％NaCl。
                    实施例
(1)腈水化酶的分离和纯化及其部分氨基酸顺序的编排
在28℃下，将玫瑰色红球菌J-1在培养基中培养80小时。培养基含有酵母膏3g/l，KH2PO4 0.5g/l，K2HPO4 0.5g/l，MgSO4·4H2O 0.5g/l，CoCl2 0.01g/l和巴豆酰胺3g/l(pH7.0)。收集细菌细胞，取其50g用硫酸铵破碎和分级分离。将样品进行透析，并离心透析物。取其上清液装载在DEAE-Cellulofine色谱、Octyl-Sepharose CL-4B色谱、Phenyl-Sapharose CL-4B色谱和Sephadex G-150色谱上。收集和透析具有酶活性的两部分，将透析物用反向柱装载在HPLC(Senshu Pak VP-304-1251，Senshu Kagaku)，得到两个亚单位(α和β)。用AppliedBiosystems model 470A蛋白顺序仪测定α(H)-，β(H)-，α(L)-和β(L)-亚单位的N端氨基酸顺序。氨基酸顺序示于图1。
(2)用于腈水化酶基因的DNA探针的制备
在30℃下将含pYUK121的大肠杆菌JM105(FERM BP-1937)培养在100ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中培养过夜(12小时)。收集细胞细胞，加入TNE，离心该细胞悬浮液。将8ml STE和10mg溶菌酶加到细胞碎片沉淀物中，该混合物在0℃下温育5分钟后加入4ml0.25M EDTA，然后再在室温下加入2ml的10％ SDS和5ml的5M NaCl。生成的混合物在0-4℃下温育3小时后进行超速离心。以1/2体积的30％PEG 6000加到上清液中，混合物在0-4℃下温育过夜(12小时)后离心。然后将TNE加入细胞碎片沉淀物中，使体积达到7.5ml，再将CsCl加到悬浮液中。混合物经离心去除蛋白质。将300-500mg/ml溴乙锭加到上清液中，并将混合物转移到离心管中，离心管经热封闭后进行超速离心，并用蠕动泵抽提cccDNA。将略多于等量的水饱和异丙醇加到提取液中，去除溴乙锭。样品经TE透析，得到约3ml纯化的pYUK121。
pYUK121 DNA用SphI和SalI消化，形成含由Rhodococcus sp.N-774产生的腈水化酶基因的2.07kb DNA片段。该片段用32P进行放射性同位素标记，产生探针。探针的核苷酸顺序示于图2。
(3)含染色体腈水化酶基因的DNA片段的制备
将玫瑰色红球菌J-1培养在100ml培养基中，培养基含有葡萄糖10g/l，KH2PO4 0.5g/l，K2HPO4 0.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，酵母膏1g/l，蛋白胨7.5g/l，CoCl2 0.01g/l，尿素7.5g/l，甘氨酸1％或氨苄青霉素0.2μg/ml，水11(pH7.2)。收集细菌细胞，细胞碎片经TNE洗涤后悬浮于10ml TE中，加4ml 0.25M EDTA，10-20mg溶菌酶，10-20mg非染色体蛋白酶(achro-moprotease)和10ml 10×SDS。悬浮液在37℃下温育3小时，再加15ml苯酚。该混合物在室温下温育15分钟后离心。取上层将0.7ml的2.5M乙酸钠和乙醚加到上清液中，然后再离心。滗去上层，向底层加二倍体积的乙醇，用玻璃棒取出DNA。该DNA依次用2∶8、1∶9和0∶10(V/V)的TE∶乙醇各冲洗5分钟，然后再将DNA悬浮在2-4ml的TE(37℃)中。将10μl RNA酶A和T1的混合物加到悬浮液中，在37℃下温育，加入等量苯酚，离心。将多于等量的乙醚加到上清液中，离心。离心后，滗去上层，底层用2l含少量氯仿的TE透析过夜后，再用新鲜的TE透析3-4小时。得到4ml粘制染色体DNA。然后按如下所述对染色体DNA进行酶消化：
将10μl TE，3μl反应缓冲液(10X)和2μl SacI加到15μl粗制染色体DNA中，该混合物在37℃下温育1小时后，在60V的琼脂糖上电泳3小时，用(2)所述探针进行染色体DNA的Southern杂交，得到约6.0kb和9.4kb片段，显示杂交情况极其良好。
15ml的染色体DNA按如上所述用SacI消化，在琼脂糖上进行电泳。从凝胶上切下6.0kb和9.4kb DNA片段后置于3倍体积的8M NaClO4中。经加溶作用后，将各溶液点在GF/C(Whatman)滤纸(直径6mm)上，再在滤纸上先后滴加10滴(≌100ml)含6M NaClO4的TE和10滴(≌10ml)95％乙醇。滤纸经空气干燥3分钟后置于0.5mlEppendorf管中，加40μl TE，在37℃下温育30分钟，离心。得到约40μl上清液，其中6.0kb和9.4kbDNA片段含有染色体DNA的腈水化酶基因。
按如下所述方法将6.0kb DNA片段插入载体中，以同样方法将9.4Kb DNA片段插入载体中。
(4)将染色体DNA片段插入载体
将2μl SacI、3μl反应缓冲液(10X)和10μl TE加到10μl的pUC19 DNA中，在30℃下温育1小时，加2μl的0.25M EDTA，终止反应。然后再加7μl 1M Tris-HCl(pH9)和3μl BAP(细菌碱性磷酸酶)，在65℃温育1小时，将TE加到该混合物中，使总体积达到100μl，再用等量苯酚提取3次，在提取液中加等量的醚。取出底层，将10μl 3M乙酸钠和250μl乙醇加到该底层液中，在-80℃下温育30分钟，离心，干燥。再悬浮在TE中。
将由此得到的5μl pUC19 DNA与(3)所述40μl的6.0kb DNA片段混合后，加入6μl连接缓冲液、6μl ATP(6mg/ml)和3μlT4DNA连接酶。该混合物在4℃温育过夜(12小时)，产生的重组质粒含有编码pUC19的SacI位点上所需酶的6.0kb DNA片段。
(5)转化株的转化和筛选
将大肠杆菌TG1(Amersham)接种到10ml的2×YT培养基后，在37℃下温育12小时。温育后，将生成的培养物加到浓度为1％的新鲜的2×YT培养基中，该混合物在37℃下温育2小时后离心，将碎片沉淀物悬浮在5ml冷却的50mM CaCl2中。悬浮液在冰上下放置40分钟后离心，再将0.25ml冷却的50mM CaCl2和60μl的按(4)所述的重组DNA加到碎片沉淀物中。该混合物在0℃下温育40分钟，在42℃下热休克2分钟，置于冰上5分钟，然后将其加到10ml的2×YT培养基中，在37℃摇动培育90分钟，离心。将碎片沉淀物悬浮在1ml 2×YT培养基中，取10μl悬浮液两份分别置于含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT琼脂板上，在37℃下温育。用菌落杂交方法挑选生长在琼脂板上的菌落，将菌落转移到硝基纤维滤膜上进行消化。将DNA固定在滤膜上并与(2)所述探针杂交，滤膜经放射自显影后，选出重组菌落，再按Southern杂交方法确认转化株中是否存在腈水化酶基因。
(6)重组质粒的分离和纯化以及插入DNA片段限制性图的构建
在37℃下将按(5)选择的转化株在100ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中培养过夜(12小时)，收集细菌细胞，并将TNE加到细胞中。再离心收集细胞，并将8ml STE和10mg溶菌酶加到细胞中。该混合物在0℃下温育5分钟后，加入4ml的0.25M EDTA、2ml的10％SDS(室温)和5ml的5M NaCl，在0-4℃下温育3小时后进行超速离心。将1/2体积的30％PEG 6000加到上清液中，在0-4℃下温育过夜(12小时)，再进行离心。将TNE加到碎片沉淀物中，使体积达高至7.5ml。将CsCl加到悬浮液中，除去蛋白质。然后将300-500mg/ml溴化锭加到上清液中，并将混合物转移到离心管中，离心管经热密封后进行超速离心。用蠕动泵移取cccDNA，加入略多于等量的水饱和异丙醇，以除去溴化锭。DNA样品经TE透析，生成约3ml纯化的重组DNA。由此得到的重组质粒，含有6.7kb DNA片段，命名为pNHJ10H(重组质粒含有9.4kb DNA片段，命名为pNHJ20L)。
上述质粒DNA用EcoRI、BamHI，PstI，SacI和SalI消化。构建的限制性图示于图3。
(7)DNA顺序的编排：
根据构建的限制性图和Southern杂交方法，测定腈水化酶基因在pNHJ10H的片段中的位置。用PstI和SalI切下pNHJ10H中的多余部分即在1.97Kb中形成的6.0Kb DNA片段。并用EcoRI和SacI切下pNHJ20L中的多余部分即在1.73Kb中形成的9.4Kb DNA片段。
采用Sanger方法(Sanger，F.，Science 214：1205-1210，1981)和M13噬菌体载体，将上述DNA片段编排顺序。1.97Kb DNA片段(pNHJ10H)和1.73Kb DNA片段(pNHJ20L)的核苷酸顺序分别示于图4和5。
由核苷酸顺序推导得到的氨基酸顺序与(1)所测定的氨基酸顺序完全一致。顺序分析还证明，该DNA片段含有编码α和β亚单位的顺序。
(8)用转化株生产腈水化酶并用该酶将腈转化为酰胺
将TG 1/pNHJ10H和TG 1/p NHJ20L接种到10ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中，于30℃下温育过夜(12小时)。将1μl生成的培养物加到100ml的2×YT培养基中(50μg/ml氨苄青霉素，0.1gCoCl2·6H2O/l)。该混合物在30℃下温育4小时，将IPTG加到该合物中，使其最终浓度为1mM，再在30℃下温育10小时。将细胞收集后，悬浮在5ml的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)中。悬浮液经超声波破碎5分钟，在12000×g下离心30分钟。生成的上清液用于酶测定。酶测定是在含50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)、6mM苄腈和适量酶的反应混合物(12ml)中进行的。该反应在20℃下进行30分钟，加0.2ml的1M HCl使反应终止。通过HPLC测定反应混合物中形成的苯甲酰胺的量。按上述同样方法但用由大肠杆菌TG1得到的混合物用作对照。当培养在有CoCl2和IPTG存在下的2×YT培养基中时，在含pNHJ10H和pNHJ20L的大肠杆菌无细胞提取液中腈水化酶活性分别为1.75×10-3和6.99×10-3单位/毫克。在TG1/pNHJ10H和pNHJ20L的反应混合物中获得了苯甲酰胺，而在TG1反应混合物中则无苯甲酰胺。
本发明中的下列菌株已于1991年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)：Rhodococcus sp.N-774，保藏号为CCTCC No：M91004：大肠杆菌JM105/pYUK121，保藏号为CCTCC No：M91006；大肠杆菌TG1/pNHJ10H，保藏号为CCTCC No：M91007；大肠杆菌TG1/pNHJ20L，保藏号为CCTCC No：M91008。

Claims (3)

1.一种生产腈水化酶的方法，该方法包括培养用重组DNA转化的转化株，并从培养物中回收腈水化酶，所述重组DNA包括位于载体中的编码具有腈水化酶活性的多肽的DNA(H)或DNA(L)片段，所述多肽含有下列α(H)亚单位和β(H)亚单位，或α(L)亚单位和β(L)亚单位：α(H)亚单位：
                  5             10             15
    MetSerGluHisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr
                 20             25             30
    LysAlaIleGluThrLeuLeuTyrGluArgGlyLeuIleThrPro
                 35             40             45
    AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGluIleGly
                 50             55             60
    ProMetGlyGlyAlaLysValValAlaLysSerTrpValAspPro
                 65             70             75
    GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMetAla
                 80             85             90
    SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnIleSerAlaVal
                 95            100            105
    PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCys
                110            115            120
    SerCysTyrProTrpProValLeuGlyLeuProProAlaTrpTyr
                125            130            135
    LysSerMetGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGly
                140            145            150
    ValLeuLysArgAspPheGlyPheAspIleProAspGluValGlu
                155            160            165
    ValArgValTrpAspSerSerSerGluIleArgTyrIleValIle
                170            175            180
    ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu
                185            190            195
    ThrLysLeuValSerArgAspSerMetIleGlyValSerAsnAla
                200
    LeuThrProGlnGluValIleValβ(H)亚单位：
                  5             10             15
    MetAspGlyIleHisAspThrGlyGlyMetThrGlyTyrGlyPro
                 20             25             30
    ValProTyrGlnLysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGlu
                 35             40             45
    GlyArgThrLeuSerIleLeuThrTrpMetHisLeuLysGlyIle
                 50             55             60
    SerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgGluSerMetGlyAsn
                 65             70             75
    GluAsnTyrValAsnGluIleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp
                 80             85             90
    LeuSerAlaAlaGluArgIleLeuValAlaAspLysIleIleThr
                 95            100            105
    GluGluGluArgLysHisArgValGlnGluIleLeuGluGlyArg
                110            115            120
    TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnIle
                125            130            135
    GluLysAlaIleGluArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeu
                140            145            150
    ProGlyAlaGluProSerPheSerLeuGlyAspLysIleLysVal
                155            160            165
    LysSerMetAsnProLeuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal
                170            175            180
    ArgAsnLysIleGlyGluIleValAlaTyrHisGlyCysGlnIle
                185            190            195
    TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro
                200            205            210
    LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp
                215            220            225
    GlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGluProTyr
    LeuIleSerAlaα(L)亚单位：
                  5             10             15
    MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsn
                 20             25             30
    GluGluIleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlaIleLeuVal
                 35             40             45
    AspLysGlyLeuIleSerThrAspAlaIleAspHisMetSerSer
                 50             55             60
    ValTyrGluAsnGluValGlyProGlnLeuGlyAlaLysIleVal
                 65             70             75
    AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr
                 80             85             90
    AspAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyValGlyGlyMetGln
                 95            100            105
    GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn
                110            115            120
    MetValValCysThrLeuCysSerCysTyrProTrpProValLeu
                125            130            135
    GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg
                140            145            150
    AlaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThr
                155            160            165
    ProAspProAspValGluIleArgIleTrpAspSerSerAlaGlu
                170            175            180
    LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn
                185            190            195
    PheThrGluGluGlnLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeu
                200            205
    IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAlaβ(L)亚单位：
                  5             10             15
    MetAspGlyIleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyPro
                 20             25             30
    IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu
                 35             40             45
    ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaGlyAla
                 50             55             60
    PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnIleProPro
                 65             70             75
    HisAspTyrLeuThrSerGlnTyrTyrGluHisTrpMetHisAla
                 80             85             90
    MetIleHisHisGlyIleGluAlaGlyIlePheAspSerAspGlu
                 95            100            105
    LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspHisProAspAspThr
                110            115            120
    ThrProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrIleSerGln
                125            130            135
    LeuIleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu
                140            145            150
    AlaAlaPheAlaValGlyAspLysValIleValArgSerAspAla
                155            160            165
    SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg
                170            175            180
    ValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp
                185            190            195
    ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr
                200            205            210
    ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro
                215            220            225
    AsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuLeuPro
    Ala
2.权利要求1的生产腈水化酶的方法，其中DNA(H)片段或DNA(L)片段分别包含下述亚单位的核苷酸序列：α(H)亚单位和β(H)亚单位，或α(L)亚单位和β(L)亚单位：α(H)亚单位的核苷酸序列：
                 15             30             45
    GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC
                 60             75             90
    AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC
                105            120            135
    GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGC
                150            165            180
    CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT
                195            210            225
    GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG
                240            255            270
    TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC
                285            300            315
    TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT
                330            345            360
    TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC
                375            390            405
    AAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA
                420            435            450
    GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG
                465            480            495
    GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC
                510            525            540
    CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG
                555            570            585
    ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG
                600
    CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTAβ(H)亚单位的核苷酸序列：
                 15             30             45
    ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCG
                 60             75             90
    GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG
                105            120            135
    GGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA
                150            165            180
    TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC
                195            210            225
    GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG
                240            255            270
    CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC
                285            300            315
    GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTCGG
                330            345            360
    TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC
                375            390            405
    GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT
                420            435            450
    CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG
                465            480            495
    AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG
                510            525            540
    CGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC
                555            570            585
    TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG
                600            615            630
    CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC
                645            660            675
    GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTAC
    CTGATCTCTGCGα(L)亚单位的核苷酸序列：
                 15             30             45
    ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC
                 60             75             90
    GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC
                105            120            135
    GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG
                150            165            180
    GTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCGGCGCCAAGATCGTC
                195            210            225
    GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC
                240            255            270
    GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAG
                285            300            315
    GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC
                330            345            360
    ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC
                375            390            405
    GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC
                420            435            450
    GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC
                465            480            495
    CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA
                510            525            540
    CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC
                555            570            585
    TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC
                600            615
    ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCCβ(L)亚单位的核苷酸序列：
                 15             30             45
    ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG
                 60             75             90
    ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG
                105            120            135
    CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG
                150            165            180
    TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG
                195            210            225
    CACGACTACCTGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG
                240            255            270
    ATGATCCACCACGGCATCGAGGCGGGCATCTTCGATTCCGACGAA
                285            300            315
    CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG
                330            345            360
    ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA
                375            390            405
    CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG
                420            435            450
    GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC
                465            480            495
    TCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT
                510            525            540
    GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC
                555            570            585
    ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACC
                600            615            630
    GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG
                645            660            675
    AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCG
    GCC
3.权利要求1的生产腈水化酶的方法，其中转化株是保藏号为CCTCC No：M91007的大肠杆菌TG1/pNHJ10H或保藏号为CCTCCNo：M91008的大肠杆菌TG1/pNHJ20L。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1961072B (zh) * 2004-05-26 2013-04-24 Dia-Nitrix株式会社 改良型腈水合酶

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2907479B2 (ja) * 1990-02-28 1999-06-21 輝彦 別府 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体及びアミド類の製造法
EP0502476B1 (en) * 1991-03-04 2001-07-18 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Hybrid plasmid vectors containing genes encoding nitrile degrading enzymes and methods of producing amides and acids
AU3692593A (en) * 1992-04-28 1993-11-04 Mitsubishi Kasei Corporation Novel protein having nitrile hydratase activity and the gene encoding the same, and a method for producing amides from nitriles via a transformant containing the gene
JP3828590B2 (ja) * 1994-10-03 2006-10-04 昌 清水 ニトリルヒドラターゼ遺伝子発現のための調節遺伝子
JP3154633B2 (ja) * 1994-12-28 2001-04-09 三菱レイヨン株式会社 ニトリラーゼ遺伝子発現のための調節因子およびその遺伝子
AU7514896A (en) * 1995-10-06 1997-04-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragments encoding stereospecific nitrile hydratase and amidase enzymes and recombinant microorganisms expressing those enzymes useful for the production of chiral amides and acides
CN1240833C (zh) * 1996-02-14 2006-02-08 三井化学株式会社 新型腈水合酶
US5866379A (en) * 1997-01-28 1999-02-02 Novus International Enzymatic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding .alpha.
FR2770214B1 (fr) * 1997-10-24 1999-12-31 Rhodia Chimie Sa Procede de preparation d'un benzamide halogene
JP2000050866A (ja) * 1998-08-06 2000-02-22 Rikagaku Kenkyusho ニトリルヒドラターゼの生産方法
JP4185607B2 (ja) * 1998-12-15 2008-11-26 ダイセル化学工業株式会社 新規な微生物及びアミド化合物の製造方法
EA200100718A1 (ru) * 1999-10-26 2001-12-24 Сова Денко К.К. Новая бактерия rhodococcus, ген нитрилазы, ген нитрилгидратазы и ген амидазы бактерии rhodococcus и способ получения карбоновых кислот с их использованием
KR100547080B1 (ko) * 2000-12-20 2006-01-31 다이야니트릭스 가부시키가이샤 미생물 촉매를 이용한 아미드 화합물의 제조 방법
ES2319875T3 (es) * 2001-01-09 2009-05-14 Lonza Ag Procedimiento microbiologico para la producion de amidas.
JP2002325587A (ja) 2001-03-02 2002-11-12 Daicel Chem Ind Ltd ニトリルヒドラターゼ、およびアミドの製造方法
JP2004194588A (ja) 2002-12-19 2004-07-15 Mitsui Chemicals Inc 新規なニトリルヒドラターゼ
WO2004067738A2 (en) * 2003-01-27 2004-08-12 Degussa Ag Nitrile hydratases from rhodococcus erythropolis and their application
SG148992A1 (en) * 2003-12-02 2009-01-29 Ciba Spec Chem Water Treat Ltd Strain of rhodococcus rhodochrous ncimb 41164 and its use as producer of nitrile hydratase
JP2006187257A (ja) 2005-01-07 2006-07-20 Daiyanitorikkusu Kk アミド化合物の製造方法およびアクリルアミド系ポリマー
EP1842907A1 (en) 2006-04-07 2007-10-10 B.R.A.I.N. Ag A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity
JP5120852B2 (ja) * 2006-07-06 2013-01-16 国立大学法人 筑波大学 新規タンパク質複合体、該タンパク質複合体を用いたコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ、及び該ニトリルヒドラターゼを用いた方法
CN101573326B (zh) 2006-11-09 2013-05-01 三菱丽阳株式会社 甜菜碱的制造方法
KR20140006052A (ko) 2011-05-31 2014-01-15 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 개량형 니트릴 히드라타제
KR101586132B1 (ko) * 2011-06-07 2016-01-19 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 개량형 니트릴 히드라타제
FR3002542B1 (fr) * 2013-02-28 2016-01-22 Servier Lab Procede de synthese enzymatique de l'acide (7s) 3,4-dimethoxybicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene 7-carboxylique et application a la synthese de l'ivabradine et de ses sels
KR101995103B1 (ko) 2014-06-06 2019-07-03 미쯔비시 케미컬 주식회사 개량형 니트릴 히드라타제
WO2018085493A1 (en) * 2016-11-04 2018-05-11 Georgia State University Research Foundation, Inc. Endotoxin free asparaginase
EP4279600A1 (en) 2021-02-10 2023-11-22 Mitsubishi Chemical Corporation Improved nitrile hydratase reactivity using aldehyde
CN114934006A (zh) * 2022-06-02 2022-08-23 无锡新晨宇生物工程有限公司 一种腈水合酶催化乙腈生成乙酰胺的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0307926A2 (en) * 1987-09-18 1989-03-22 YAMADA, Hideaki Process for biological production of amides
FR2633938A1 (fr) * 1988-07-06 1990-01-12 Teruhiko Beppu Dna de codage de polypeptide presentant une activite de nitrile hydratase et procede de production d'amides a partir de nitriles avec un transformant les contenant

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0307926A2 (en) * 1987-09-18 1989-03-22 YAMADA, Hideaki Process for biological production of amides
FR2633938A1 (fr) * 1988-07-06 1990-01-12 Teruhiko Beppu Dna de codage de polypeptide presentant une activite de nitrile hydratase et procede de production d'amides a partir de nitriles avec un transformant les contenant

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1961072B (zh) * 2004-05-26 2013-04-24 Dia-Nitrix株式会社 改良型腈水合酶

Also Published As

Publication number Publication date
NO306684B1 (no) 1999-12-06
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