CZ284017B6 - Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu - Google Patents

Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu Download PDF

Info

Publication number
CZ284017B6
CZ284017B6 CZ943170A CZ317094A CZ284017B6 CZ 284017 B6 CZ284017 B6 CZ 284017B6 CZ 943170 A CZ943170 A CZ 943170A CZ 317094 A CZ317094 A CZ 317094A CZ 284017 B6 CZ284017 B6 CZ 284017B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
transformant
dna
nitrile hydratase
amides
nitrile
Prior art date
Application number
CZ943170A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ317094A3 (cs
Inventor
Teruhiko Beppu
Hideaki Yamada
Toru Nagasawa
Sueharu Horinouchi
Makoto Nishiyama
Original Assignee
Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
Teruhiko Beppu
Hideaki Yamada
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Rayon Co., Ltd., Teruhiko Beppu, Hideaki Yamada filed Critical Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
Publication of CZ317094A3 publication Critical patent/CZ317094A3/cs
Publication of CZ284017B6 publication Critical patent/CZ284017B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Fragment DNA .sup./L/.n., kodující polypeptid a nitril-hydratasovou aktivitou, který je vložen do expresního vektoru a tento rekombinantní vektor se použije pro transformaci E.coli. Fransformant obsahuje mnoho kopií genu a produkuje mnohem vyšší hladinu nitril-hydratasy při porovnání s běžně používanými mikroorganismy. Amidy se připravují z nitrilů za užití uvedených transformantů.ŕ

Description

Oblast techniky
Vynález se týká DNA fragmentutL) odvozeného od Rhodococcus rhodochrous J-l a kódujícího polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, který hydratuje nitrily a amidy. Vynález se také týká 10 rekombinantní DNA, obsahující uvedené DNA|L) fragment a transformantu transformovaného rekombinantní DNA. Vynález se dále týká způsobu přípravy nitril-hydratasy za použití tohoto transformantu a způsobu přípravy amidů pomocí nitril-hydratasy.
Dosavadní stav techniky
Nitril-hydratasa nebo nitrilasa je známa jako enzym, který hydratuje nitrily na amidy. Mezi mikroorganismy, které produkují nitril-hydratasu patří mikroorganismy rodu Bacillus, rodu Bacterium, rodu Micrococcus a rodu Brevibacterium (viz japonský patent 8—62-21517/1989, US 20 patent č. 4001081), rodu Corynebacterium a rodu Nocardia (viz japonský patent B-5617918/1989, US patent č. 4248968), rodu Pseudomonas (viz japonský patent 59-37951/1984, US patent č. 4637982), rodu Rhodococcus, rodu Arthrobacter a rodu Microbacterium (viz japonský patent A—61—162193/1986, evropská patentová přihláška č. 0188316) a rodu Rhodococcus rhodochrous (viz japonský patent 470/1990 a evropská patentová přihláška č. 0307926).
Nitril-hydratasa se používá pro hydratování nitrilů na amidy. Podle tohoto vynálezu se upraví mikroorganismy tak, aby obsahovaly více kopií rekombinantní DNA, kódující nitril-hydratasu technologií rekombinantní DNA. Rekombinant produkuje pozoruhodně vysoké hladiny nitrilhydratasy ve srovnání s běžně používanými mikroorganismy.
Autoři vynálezu jíž dříve objevili fragment DNA odvozené od Thodococcus sp.N-774 (FERM BP-1936), který také kóduje polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou (japonský patent č. A-2119778/1988).
Na rozdíl od objevu uvedeného v předchozím odstavci využívají autoři tohoto vynálezu pro přípravu nitril-hydratasy fragmentu DNA odvozeného od Rhodococcus rhodochrous J-l. Byl izolován gen, kódující nitril hydratasu, tento gen byl vložen do vhodného plasmidového vektoru a příslušný hostitel byl transformován tímto rekombinantním plasmidem. Byl tak úspěšně získán transformant, který produkuje nitril-hydratasu s vysokou aktivitou také k aromatickým nitrilům.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká:
Fragmentu DNA<L), kódujícího polypeptid, který má nitril-hydratasovou aktivitu, kde tento peptid obsahuje α''-βιΈι- podjednotky následujících sekvencí aminokyselin:
- 1 CZ 284017 B6 a(L - podjednotka:
s i ais
MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsn z 9 zsii
GluGlui leAlaAlaArgVallysAlaMetGtuAlalleLeuVal
J S *9tS
AspLysGlyLeoIleSerThrAspAlaHeAspHisMetSerSer β S S«9
ValTyrGluAsnGluValGIyProGlnLeuGtyAlaLysHeVal
H f 97 $
AlaArgAlaTrpValAspProGtuPheLysGInArgLeuleuThr • « * S« «
AspAlaThrSerAIaCysArgGIuMetGlyValGtyGlyMetGln »S 19«| « J
GlyGluGluMetValValletíGluAsnThrGlyrhrValHiíAsn ll9 IISII»
MetValValCysThrLeuCysSerCysTyrProTrpProValLeu
I z 5 II»I1S
GlyLeuProProAsaTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg
1*9 I * S15»
AlaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyryrThr
155 i kai»5
ProAspProAspValGluíleArgllerrpAspSerSerAlaGlu
179 1151*9
LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn
15 i ’»i»s
PheThrGluGHGinLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeu
9 9Z 9 S
IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAla
P(L - podjednotka:
S 1915 říetAspGlylleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyleuGlyPro
Z 9 Z S3 9
IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu
S * 9 * S
ArgSerValLeuThrMetPheProAiaMetAlaLeuAlaGlyAla
S 9 S SkO
PheAsnLeuAspGlnPheArgGíyAlařletGluGlnlleProPro k 5 7 97 $
HisAspTyrLeuThrSerGInTyrfyrGIuHisTrpřletHisAla ·« 15Μ
Metl lellisHisGlyl leGluAlaGlyl lePheAspSerAspGlu *5 14 0| 4 5
LeuAspArgArgThrGInTyrTyrMetAspHisProAspAspThr
114 17 5I M
ThrProThrArgGínAspProGInleuValGluThríleSerGItt
I Z 5 13 4US
LeulleThrHisGlyAtaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu
I 4 4 14$| S 9
AlaAlaPheAlaValClyAspLysValileValArgSerAspAla
5 I t 0| k ;
SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGIyArg
174 175110
ValGlyGluValValAlaThrlIisGlyAlaTyrValPheProAsp • » 5 I » 4Μ) rhrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr i 4 4 t 45
ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro
Z I S 77 4ti
AsnValValAsnHis( leAspValPheGluProTyrLeuleuPro
A l a
Dále se předložený vynález týká fragmentu DNA(L) uvedeného výše, který obsahuje sekvence nukleotidů oc(L>- a βα>- podjednotek, kde DNA sekvence a(L)- podjednotky znamená atgaccgcccacaÁtcccgtccagggcacgttgccacgatcgaÁc
0 7 57 0
GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC
5 1X413 5 gacaagggcctgatctccaccgacgccatcgaccacatgtcctcg
150 10 5119 gtctacgagaacgaggtcggtcctcaactcggcgccaagatcgtc
5 t I 0í t 5 gcccgcgcctgggtcgatcccgagttcaagcagcgcctgctcacc
Z 4 0 Z 5 5X74 gacgccaccagcgcctgccgtgaaatgggcgtcggcggcatgcag ggcgaagaaatggtcgtgctggaaaacaccggcacggtccacaac atggtcgtatgtaccttgtgctcgtgctÁtccgtggccggttctc
J7S 370405 ggcctgccacccaactggtacaagtaccccgcctaccgcgcccgc
-3CZ 284017 B6 z o *35
GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC < 5 0
CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGA A
51» ’zss 4 9
CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC
555 5 7 «
TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC
ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC a DNA sekvence P(L - podjednotky znamená
0
ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG
T s 90
ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG t»$ 1X9 1 ’'
CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG TTCA A TCTCG A C C A G T TCCGGG G C G CG A TG G A GC AG A T C CC C C C G cacgactacctgÁcctcgcaatactacgagcactggatgcacgcg atgatccaccacggcatcgaggcgggcatcttcgattccgacgaa ctcgaccgccgcacccagtactacatggaccatccggacgacacg acccccacgcggcaggatccgcaactggtggagacgatctcgcaa ctgatcacccacggagccgattaccgacgcccgaccgacaccgag gtcagggtttgggacagcagctccgaaaŤccgctacatcgtcÁtc ccggaacggccggccggcaccgacggttggtccgaggaggagctg acgaagctggtgagccgggactcgatgatcggtgtcagtaatgcg CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTA
Dále se vynález týká rekombinantní DNA, obsahující ve vektoru DNA11' jak byla uvedena výše.
Ještě dále se vynález týká transformantu, který je transformován rekombinantní DNA, jak byla ío uvedena výše.
Ještě dále se vynález týká způsobu přípravy nitril-hydratasy kultivací transformantu uvedeného výše a izolací nitril-hydratasy z kultury.
Dále se vynález týká způsobu přípravy amidů, vyznačujícího se tím, že se nitrily hydratují nitrilhydratasou jak je uvedeno výše, za tvorby amidů.
-4CZ 284017 B6
Ještě dále se vynález týká způsobu přípravy amidů, který se vyznačuje tím, že se kultivuje výše uvedený transformant a nitrily se hydratují výslednou kulturou izolovaných bakteriálních buněk, materiálem z nich získaných nebo fixovaným.
Dále bude předložený vynález podrobněji popsán. Postupuje se podle stupňů 1 až 8.
1. stupeň: Izolace a čištění nitril-hydratasy a částečné aminokyselinové sekvenování nitril— hydratasy
Z Rhodococcus rhodochrous J-l (FERM BP-1478) se izolují a vyčistí dva typy nitril-hydratasy (označené jako typ H a L). Oba enzymy se rozdělí pomocí HPLC na podjednotky a a β. Určí se část aminokyselinové sekvence každé z podjednotek (obr. 1).
2. stupeň: Příprava DNA sondy na gen nitril-hydratasy
DNA sonda se připraví z JM105/pYUK121 (FERM BP-193 7) jak je popsáno v japonském patentu A-2-119778/1990 díky vysokému stupni homologie aminokyselinové sekvence nitril— hydratasové β-podjednotky z Rhodococcus sp. N-774 (popsané v uvedeném oficiálním 20 japonském patentovém časopise „Japanese Patent Official Gazette“) a z Rhodococcus rhodochrous J-l. Plasmid zpYUK.121, obsahující gen nitril-hydratasy odvozený od Rhodococcus ps. N-774 se připraví z kultury JM105/pYUK121. PYUK121 DNA se rozštěpí působením Sphl a Sáli. SphI-SalI fragment obsahuje gen nitril-hydratasy odvozený do Rhodococcus sp. N-774 (obr. 2). Fragment DNA se radioaktivně označí.
3. stupeň: Detekce segmentu DNA, obsahující gen nitril-hydratasy z chromosomu Rhodococcus rhodochrous J-l
Chromosomová DNA se připraví z kultury Rhodococcus rhodochrous J-l. Chromosomová DNA 30 se rozštěpí restrikčními enzymy a hybridizuje se sondou popsanou ve stupni 2 s použitím
Southemovy hybridizační metody (Southerm E.M.: J. Mol. Biol. 98, 503 (1975)). Testují se dva DNA fragmenty různé délky.
4. stupeň: Konstrukce rekombinantního plasmidu
Rekombinantní plasmid se zkonstruuje vložením chromosomového DNA fragmentu připraveného podle stupně 3 do plasmidového vektoru.
5. stupeň: Transformace atestování transformantu, obsahujícího rekombinantní plasmid
Z rekombinantního plasmidu popsaného ve stupni 4 se připraví transformanty. Transformant. obsahující rekombinantní plasmid se vybere pomocí sondy popsané ve stupni 2 způsobem hybridizace kolonií (Bruče Wallace R. a kol., Nucl. Acids Res. 9, 879/1981)). Přítomnost genu nitril-hydratasy v rekombinantním plasmidu se potvrdí Southemovou hydridizační metodou. 45 Takto vy brané plasmidy se označí pNHJlOH a pNHJlOL.
6. stupeň: Izolace a čištění plasmidové DNA a konstrukce restrikční mapy
Plasmidové pNHJlOH a pNHJ20L, které byly připraveny podle stupně 5, se izolují a vyčistí. Pro 50 určené oblasti, obsahující gen nitril-hydratasy se zkonstruuje restrikční mapa DNA (obr. 3).
-5CZ 284017 B6
7. stupeň: Sekvenování DNA
Příslušným restrikčním enzymem se vyštěpí zplasmidů pNHJlOH a pHNJIOL segment vloženého fragmentu DNA. Tento vložený fragment DNA se pak použije pro sekvenování. Nukleotidová sekvence fragmentu D (obr. 4, 5) ukazuje, že fragment obsahuje sekvenci odvozenou od aminokyselinové sekvence popsané ve stupni 1.
8. stupeň: Příprava nitril-hydratasy pomocí transformantu a konverse nitrilů na amidy
Kultivuje se transformant popsaný v bodě 8. Tyto bakteriální buňky se smíchají s nitrily. Připraví se tak substrát nitril-hydratasy a amidů.
Rhodococcus rhodochrous J-l byl uložen ve „Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology“ a byl označen číslem FERM-BP-1478. Transformant TGl/pNHJlOH, obsahující pNHJlOH popsaný ve stupni 5 a transformant TGl/pNHJ20L, obsahující pHJJIOL popsaný ve stupni 5 byl uložen v uvedené sbírce a označen číslem FERM BP-2777 a FERM BP-2778.
Lze použít jakékoliv vektory včetně plasmidového vektoru (např. pAT153, pMP9, pHC624, pKC7 atd.), fágového vektoru (např. gtll (Toyobo), Charon 44 (Amersham) atd). Mezi enzymy, které se mohou používat, patří Sphl, Sáli, ECORI, Bam HI, Sací a podobné, komerčně dostupné do Takara Shuzo. Pro transformaci lze použít různé hostitele včetně (ale bez omezení pouze na tyto) E.coli JMI05 a E.coli T01. Jako kultivační média pro transformanty se používají taková kultivační média, která jsou obvykle v této oblasti používána.
Nitrily se na amidy převádějí pomocí nitril-hydratasy, surové nitril-hydratasy, kultury transformantů, izolovaných bakteriálních buněk nebo zpracovaných materiálů těchto buněk a pod., připravených z kultury transformantů.
Mezi vhodné nitrily podle vynálezu patří aromatické nitrily se čtyřmi až deseti atomy uhlíku v aromatické části a alifatické nitrily se dvěma až šesti atomy uhlíku, které jsou popsány v evropské patentové přihlášce č. 0307926. Typickými příklady jsou 4-, 3- a 2-kyanopyridiny. 2-furonitril, kyanopyrazin. akrylonitril, methakrylonitril, krotonnitril, acetonitril a 3-hydroxypropionitril.
Tento vynález popisuje aminokyselinovou sekvenci a nukleotidovou sekvenci a- a β-podjednotek typu nitril-hydratasy odvozené od Rhodococcus rhodochrous J-l. Fragment DNA, kódující nitril-hydratasu se vloží do expresního vektoru a rekombinantní vektor se použije pro transformaci. Transformant obsahuje více kopií genu a může produkovat mnohem vyšší hladiny nitril-hydratasy při srovnávání s konvenčně používanými mikroorganismy.
Dále je uveden popis obrázků na připojených výkresech.
Obr. 1 - představuje N-koncové aminokyselinové sekvence a- a β-podjednotek dvou typů nitril-hydratasy produkovaných Rhodococcus rhodochrous J-l.
Obr. 2 - představuje sekvenci DNA genu nitril-hydratasy z Rhodococcus sp. N-774, která se používá jako sonda DNA.
Obr. 3 - představuje restrikční mapy rekombinantních plasmidů pHHJlOH a pNHJ20L.
Obr. 4 - představuje DNA sekvenci fragmentu DNA a pNHJlOH odvozeném od Rhodococcus rhodochrous J-l a odvozenou aminokyselinovou sekvenci.
Obr. 5 - představuje DNA sekvenci fragmentu v pNHJ20L odvozeném od Rhodococcus rhodochrous J-l a odvozenou aminokyselinovou sekvenci.
-6CZ 284017 B6
Předložený vynález bude dále podrobněji ilustrován v následujících příkladech, které jej v žádném případě nikterak neomezují. V příkladech jsou použity tyto zkratky: TE znamená Trist-HCl (10 mM, ph 7,8) a EDTA (lmM, pH 8,0), TNE znamená Tris-HCl(50 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM, pH 8,0) a NaCl (50 mM), STE znamená Tris-HCl (50 mM, pH 8,0), EDTA (5 mM, pH 8,0) a sacharosa (35 mM), 2x YT médium znamená 1,6% Tryptonu, 1,0% kvasničného extraktu a 0,5 % NaCl.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace a čištění nitril-hydratasy a částečné sekvenování aminokyselin nitril-hydratasy
Rhodococcus rhodochrous J-l se kultivuje v médiu (3 g/1 kvasničného extraktu, 0,5 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 síranu hořečnatého.4H2O, 0,01 g/1 chloridu kobaltnatého a 3 g/1 krotonamidu, pH 7,2) 80 hodin při teplotě 28 °C. Izolují se bakteriální buňky. 50 g bakteriálních buněk se rozruší a frakcionuje se síranem amonným. Vzorek se dialyzuje a dialvzát se odstřeďuje. Supematant se nanese na chromatografíckou kolonu naplněnou nosičem DEAE-Cellulofine, Phenyl-Sepha rose, Sephadex G-150 a Octyl-Sepharose. Získají se dvě frakce s enzymovou aktivitou. Obě frakce se dialyzují. Dialyzáty se nanesou na kolonu s reverzní fází (Senshu Pak VP-304—125, Senahu Kagaku) a chromatografují se vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii. Získají se dvě podjednotky (a a β). N-koncové aminokyselinové sekvence βι<Η), ai(L)- a βΛ* - podjednotek byla stanovena na proteinovém sekvenátu Applied Biosystems model 470A. Sekvence aminokyselin jsou uvedeny na obr. 1.
Příklad 2
Příprava DNA sondy pro gen nitril-hydratasy
E.coli JM105 (FERM BP-1937), obsahují pYUK121 se kultivuje ve 100 ml média 2xYT. obsahující 50 pg/ml ampicilinu při 30 °C přes noc (12 hodin). Bakteriální buňky se izolují. K buňkám se přidá TNE. Suspenze buněk se pak odstraňuje. K peletě se přidá 8 mlSTe a 10 mg lysozymu. Směs se inkubuje 5 minut při teplotě 0 °C. Potom se přidá 4 ml 0,25M EDTA. Ke směsi se za teploty místnosti přidají 2 ml 10% SDS a 5 ml chloridu sodného. Výsledná směs se inkubuje tři hodiny při teplotě 0 až 4 °C. Potom se směs odstřeďuje na ultraodstředivce. K supematantu se přidá 1/2 objemu 30% PEG 6000. Směs se inkubuje přes nos (12 hodin) při 0 °C až 4 °C a odstředí se. K peletě se přidá tolik TNE, aby objem roztoku byl 7,5 ml. K suspenzi se přidá CaCl. Odstředěním směsi se odstraní proteiny. K supematantu se pak přidá 300 až 500 mg/ml ethdiniumbromidu. Směs se přinese do ultracentrifugační zkumavky. Zkumavka se zataví a potom se odstřeďuje v ultraodstředivce. cccDNA se vyextrahuje peristaltickou pumpou. K extraktu se přidá o něco více než je stejné množství isopropylalkoholu nasyceného vodou, pro odstranění ethidiniumbromidu. Vzorek se dialyzuje proti TE. Získají se tak asi 3 ml vyčištěného pYUK121.
PYUK121 DNA se rozštěpí působením Sphl a Sall. Získá se tak fragment DNA o 2070 nukleotidech, obsahující gen nitril-hydratasy odvozený od Rhodococcus sp. N-774. Označením fragmentu 32P se získá sonda. Sekvence nukleotidů sondy je uvedena na obr. 2.
-7CZ 284017 B6
Příklad 3
Příprava fragmentu DNA, obsahující gen nitril-hydratasový gen z chromosomu
Rhodococcus rhodochrous J-l se kultivuje ve 100 ml média (10 g/1 glukosy, 0,5 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 0,5 g/1 síranu hořečnatého. 7 H20), 1 g/1 kvasničného extraktu, 7,5 g/1 peptonu, 0,01 g/1 chloridu kobaltnatého, 7.5 g/1 močoviny, 1 % glycinu nebo 0,2 pg/ml ampicilinu, 1 litr vody, pH 7,2). Bakteriální buňky se izolují a pelety se promyjí TNE. Pelety se suspendují v 10 ml TE. K suspenzi se přidají 4 ml 0,25M EDTA, 10 až 20 mg lysozymu, 10 až 20 mg acromoproteasy a 10 ml lOxSDS. Suspenze se inkubuje tři hodiny při 37 °C. K suspenzi se přidá 15 ml fenolu. Směs se inkubuje patnáct minut při teplotě místnosti, odstředí, horní vrstva se odloží a k supematantu se přidá 0,7 ml 2,5M octanu sodného a diethylether. Směs se odstřeďuje. Horní vrstva se odstraní. Ke spodní vrstvě se přidají dva objemy ethanolu a DNA se odebere skleněnou tyčinkou. DNA se promývá pět minut směsí TE:ethanol 2:8, 1:9 a 0:10 (objemové díly:objemovým dílům). Potom se DNA suspenduje ve dvou až čtyřech ml TE (37 °1). K suspenzi se přidá 10 μί směsi RNA—sy A a Tb Směs se inkubuje při teplotě 37 °C. Ke směsi se přidá stejné množství fenolu a výsledná směs se odstředí. K supematantu se přidá více než stejné množství etheru. Směs se opět odstřeďuje. Horní vrstva se oddělí. Spodní se přes noc dialyzuje proti dvěma litrům TE, obsahujícího malé množství chloroformu, potom se dialyzuje tři až čtyři hodiny proti čerstvému TE. Získají se tak 4 ml surové chromosomové DNA.
K 15 μί surové chromosomové DNA se přidá 10 μί TE, 3 μί reakčního pufru (lOx) a 2 μί Sací. Směs se inkubuje jednu hodinu při teplotě 37 °C. Potom se elektroforezuje na agarosovém gelu tři hodiny při 60 V. Southemova hybridizace chromosomové DNA se provádí sondou, která je popsána v příkladu 2. Silnou hydrodizaci vykazovaly fragmenty s asi 6000 nukleotidy a 9400 nukleotidy.
Působením Sací se rozštěpí 15 μί chromosomové DNA. Směs se elektroforezuje na agarosovém gelu jak bylo dříve popsáno. Z gelu se vyříznou fragmenty DNA se 6000 a 9400 nukleotidy a přenesou se do třech objemů 8M chloristanu sodného. Po rozpuštěni se každý roztok natečkuje na filtrační papír GF/C (Whatman//průměr 6 mm). Na filtrační papír se pak přidá 10 kapek (přibližně 100 mikrolitrů) TE, obsahujícího 6M chloristan sodný a 10 kapek (přibližně 100 mikrolitrů) 95% ethanolu. Papír se suší tři minuty na vzduchu, přenese se do 0,5 ml eppendorfovy zkumavky, přidá se 40 mikrolitrů TE a vše se inkubuje třicet minut při teplotě 47 °C. Zkumavka se pak odstřeďuje. Získá se asi 40 mikrolitrů supematantu, který obsahuje fragmenty DNA o 6000 a 94 000 nukleotidech, které obsahují nitrilhydratásový gen chromosomové DNA.
Dále je popsán způsob inzerce fragmentu DNA o 6000 nukleotidech do vektoru. Stejný způsob se použije také pro inzerci fragmentu DNA o 9400 nukleotidech do vektoru.
Příklad 4
Inzerce fragmentu chromosomové DNA do vektoru
K 10 μί pUC19 se přidá 10 μί TE, 3 μί reakčního pufru (lOx) a 2 μί Sací. Směs se inkubuje jednu hodinu při 30 °C. Pro zastavení reakce se ke směsi přidají 2 μί 0,25M EDTA. Potom se ke směsi přidá 7 μί 1M Tris-HCl (pH 9) a 3 μί BAP (bakteriální alkalická fosfatása).Směs se inkubuje jednu hodinu při teplotě 65 °C. Ke směsi se přidá tolik TE, aby konečný objem byl 100 mikrolitrů. Směs se extrahuje 3x stejným množstvím fenolu. K extraktu se přidá stejné množství
-8CZ 284017 B6 etheru. Spodní vrstva se odebere a přidá se kní 10 mikrolitrů 3% octanu sodného a 250 mikrolitrů ethanolu. Směs se inkubuje třicet minut při teplotě -80 °C, odstředí se, vysuší a resuspenduje v TE.
Pět mikrolitrů takto získané pUC19 DNA se smísí se 40 jul fragmentu DNA o 6000 nukleotidech, který byl popsán v příkladu 3. Ke směsi se přidá 6 μΐ ligačního pufru, 6 μΐ ATP (6 mg/l) a 3 μΐ T4 DNA ligasy. Směs se inkubuje přes noc (12 hodin) při 4 °C. Získá se tak rekombinantní plasmid, obsahující fragment DNA o 6000 nukleotidech, kódující žádaný enzym v místě Sací pUC19.
Příklad 5
Transformace a testování transformantů
Do 10 ml média 2xYT se naočkuje E.coli Tgl (Amersham) a inkubuje se dvanáct hodin při 37 °C. Po inkubaci se výsledná kultura přidá k čerstvému médiu 2xYT na koncentraci asi 1 % a směs se inkubuje 2 hodiny při teplotě 37 °C. Kultura se odstředí a peleta se suspenduje v 5 ml chladného 50 mM chloridu vápenatého. Suspenze se vloží do ledu na 40 minut a pak se odstředí. K peletě se přidá 0,25 ml chladného 50 mM chloridu vápenatého o 60 mikrolitrů rekombinantní DNA, která je popsána v příkladu 4. Směs se inkubuje 40 minut při teplotě 0 °C, vystaví se dvouminutovému působení tepelného šoku (42 °C), vloží se na pět minut do ledu a přidá se k 10 ml média 2xYT. Směs se inkubuje 90 minut při 37 °C za třepání. Potom se odstředí. Peleta se suspenduje v 1 ml média 2xYT. Na agarosovou plotnu, obsahující (2xYT) 50 pg/ml ampicilinu se jednotlivě vy sejí dva podíly (po 10 mikrolitrech) suspenze. Plotna se inkubuje při 37 °C. Kolonie vyrostlé na plotně se vyberou způsobem hybridizace kolonií: kolonie se přenesou na nitrocelulosový filtr a rozštěpí. DNA zůstala fixována na filtru. Byla hybridizována sondou jak je to popsáno v příkladu 2. Filtr se autoradiografuje. Vybere se rekombinantní kolonie. Přítomnost genu nitril hydratasy v transformantů byla potvrzena také Southemovou hybridizační metodou.
Příklad 6
Izolace a čištění rekombinantního plasmidu a konstrukce restrikční mapy vložených fragmentů DNA
Transformant, který se vybere jak je popsáno v příkladu 5, se nechá růst ve 100 ml média 2xYT, obsahujícího 50 μΐ/,ΐ ampicilinu přes noc (12 hodin) při 37 °C. Izolují se bakteriální buňky. K buňkám se přidá TNE. Buňky se opět odstředí. K buňkám se přidá 8 ml STE a 10 mg lysozymu. Směs se inkubuje pět minut při 0 °C. Ke směsi se přidá 4 ml 0,25N EDTA 2 ml 10% SDS (za teploty místnosti) a 5 ml 5M chloridu sodného. Směs se inkubuje tři hodiny při teplotě 0 až 4 °C a odstřeďuje se na ultraodstředivce. K supematantu se přidá 1/2 objemu 30% PEG. Směs se inkubuje přes noc (12 hodin) při teplotě 0 až 4 °C a opět se odstřeďuje. K peletě se přidá tolik TNE, aby konečný objem byl 7,5 ml. K suspenzi se přidá CsCI. Tím se suspenze zbaví proteinů. K supematantu se potom přidá 300 až 500 mg/ml ethidiniumbromidu a směs se přenese do centrifugační zkumavky. Zkumavka se zataví a odstřeďuje se na ultracentrifuze. Peristaltickou pumpou se odstraní cccDNA. K cccDNA se pro odstranění ethidiniumbromidu přidá o něco víc než stejné množství isopropylalkoholu nasyceného vodou. Vzorek DNA se dialyzuje proti TE. Získají se asi 3 ml vyčištěné rekombinantní DNA. Takto získaný rekombinantní plasmid, obsahující fragment DNA o 67 000 nukleotidech se označí pNHJlOH a rekombinantní plasmid, obsahující fragment DNA o 9400 nukleotidech se označí pNHJ20L.
-9CZ 284017 B6
Tyto plasmidové DNA se rozštěpí působením EcoRI, BamHI, Pstl, Sací, popř. Sáli. Zkonstruované mapy jsou uvedeny na obr. 3.
Příklad 7
Sekvenování DNA
Umístění genu nitril-hydratasy ve fragmentu DNA pNHJlOH bylo stanoveno podle zkonstruované restrikční mapy a podle Southemovy hybridizační metody. Přidaný segment v pNHJlOH byl štěpen působením Pstl a Sáli. Fragment DNA o 6000 nukleotidech poskytl fragment o 1970 nukleotidech. Podobně byl štěpen působením EcoRI a Sací přidaný fragment v pNHJ201. Z fragmentu o 9400 nukleotidech vyl získán fragment o 1730 nukleotidech.
Tyto fragmenty DNA byly sekvenovány způsobem podle Sangera (Sanger F.: Science 214, 1205 až 1210(1981)) pomocí fágového M13 vektoru. Sekvence nukleotidů fragmentu DNA o 1970 nukleotidech (pNHJlOH) a sekvence nukleotidů fragmentu DNA o 1730 nukleotidech (pNHJ20L) jsou uvedeny na obr. 4 a 5.
Bylo zjištěno, že sekvence aminokyselin odvozená od sekvence nukleotidů je plně identická se sekvencí aminokyselin, která byla stanovena v příkladu 1. Sekvenční analýza také odhalila, že fragment DNA obsahoval sekvenci, obsahující a- a β-podjednotky.
Příklad 8
Příprava nitril-hydratasy pomocí transformantů a konverze nitrilů na amidy pomocí nitrilhydratasy
Do 10 ml média 2xYT, které obsahuje 50 pg/ml ampicilinu se naočkuje TG-l/pNHJ10H a TGl/pNHJ20L. Směs se inkubuje přes noc při teplotě 30 °C (12 hodin). Jeden mililitr výsledné kultury se přidá ke 100 ml média 2xYT (50 pg/ml ampicilinu, 0,1 g CoC122.6H2O/l). Směs se inkubuje čtyři hodiny při 30 °C. Ke směsi se přidá IPTG na konečnou koncentraci 1 mM. Směs se inkubuje 10 hodin při 30 °C. Po izolování buněk se buňky suspendují v 5 ml 0,lM fosforečnanového pufru (pH 7.5). Suspenze se rozbije ultrazvukem (pět minut) a odstřeďuje se 30 minut při 12 000 g. Výsledné supematanty se použijí pro enzymovou analýzu.
Enzymová analýza se provádí v reakční směsi (12 ml), obsahující 50 mM pufru fosforečnanu draselného (pH 7,5), 6 ml benzonitrilu a příslušné množství enzymu. Reakce se nechá probíhat 30 minut při 20 °C. Reakce se zastaví přidáním 0,2 ml 1MHC1. Množství vytvořeného benzamidu v reakční směsi bylo stanoveno HPLC. Jako kontrola se používá reakční směs získaná stejným postupem jako bylo výše popsáno z E.coli TG-1. Hladiny nitril-hydratasy v bezbuněčných extraktech E.coli, obsahujících pNHJlOH a pHJ20L byly 1.75.10’3 a 6,99.10 ’ jednotek na mg při kultivaci v médiu 2xYT za přítomnosti CoCl2 a IPTG. V reakční směsi s TG-l/pNHJ10H a pNHJ20L byl nalezen benzamid, zatímco v reakční směsi sTG-1 žádný benzamid nalezen nebyl.

Claims (7)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Fragment DNA(L>, kódující polypeptid, který má nitril-hydratasovou aktivitu, kde uvedený polypeptid obsahuje a,L)— a β,ι>—podjednotky následujících sekvencí aminokyselin: cc(L)-podjednotka:
    5 I « IS
    MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsn
    Z 9 Z S 3«
    GluGlulleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlalleLeuVal
    3 5 ♦ · *S
    AspLysGlyLeuI leSerThrAspAIal leAspHisřletSerSer
    5 ai s
    ValTyrGluAsnGluValGIyProGlnLeuGlyAlalyslleVal *5 »oT S
    AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr o a 5» o
    AspAlarhrSerAlaCysArgGIurtetGlyValGIyGlyřtetGln »5 10«19 5
    GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn t ž s
    I 3 9
    I 3 $
    GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgA I aArg, i < a ·4 *
    AI aVatArgAspProArgG1yValLeuAlaGIuPheGIyTyrThr
    155 1*01*5
    ProAspProAspVa l G i u 11 eArg HeTrpAspSerSerA I aC I u ! 7 9 17 510«
    Leu A r gTyrT rpValLeuProGlnArgProA laGlyThrGIuAsn i as
    PheThrG1uGluGInLeuA I aAspLeuVa I ThrArgAspSerLeu io« tas
    HeGlyValSerValProThrThrProSerLysAla
    15 P<L)-podjednotka:
    -11CZ 284017 B6 s t oi j
    MetAspGlylleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyleuGlyPro z o 2 530 íleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu
    3 5 4 04 5
    ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaGlyAla
    SO SSk a
    PheAsnLeuAspGlnPheArgGIyAlaMetGluGlnlIeProPro k 5 7 47 5
    HisAspTyrLeuThrSerGInTyrryrGIuHisTrpHetHisAla >4 OS10
    Metl lellisHisGlyl leGluAlaGlyl lePheAspSerAspGlu «5 14 0t O 5
    LeuAspArgArgThrGínTyrTyrfletAspHisProAspAspThr
    I t O I I 5| lo
    ThrProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrtleSerGln •t5 110135
    LeulleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu
    14 0 14 515 0
    AlaAlaPheAlaValGIyAspLysValIleValArgSerAspAla
    15 5 I k Ot 4 5
    SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGIyArg t 7 O 17 510 4
    ValGlyGluValValAlaThrHisGtyAlaTyrValPheProAsp
    1 0 5 10 410 5
    TJirAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisleuTyrThr
  2. 2 0 0 Z OSz I o
    ValArgPheSerAlaThrGIuLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro
    Z I S Z 2 0 Z Z 5
    AsfiValValAsnHislleAspValPheGluProTyrleuLeuPro
    A l a
    2. Fragment DNA(L) podle nároku 1, obsahující sekvence nukleotidů a(L)- a p(L-podjednotek. kde DNA sekvence a<L)-podjednotky znamená:
    atgaccgcccacaatcccgtccagggcaČgttgccacgatcgaac
    40 7500 gaggagatcgccgcacgcgtgaaggccatggaggccatcctcgtc los I Z OI 3 $ gacaagggcctgatctccaccgacgccatcgaccacatgtcctcg
    15 4 I k S10 0 gtctacgagaacgaggtcggtcctcaactcggcgccaagatcgtc
    10 5 2 1 0 Z Z 5 gcccgcgcctgggtcgatcccgagttcaagcagcgcctgctcacc
    240 25S tTO gacgccaccagcgcctgccgtgaaatgggcgtcggcggcatgcag
    -12CZ 284017 B6
    115 3 0 03 t S
    GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC
    ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGG-TTCTC
    Π5 3 ’ »
    GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC <20 <35< S »
    GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC <45 < SD« ’ S
    CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGA A
    Sto 5 Z5S < O
    CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC
    55$ 57058$
    TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC a DNA sekvence P(L -podjednotky znamená:
    IS 30«'
    ATGGATGGAATCCACCACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG ttcaatctcgacČagttccggggcgcgÁtggagcagatccccccg cacgactacctgÁcctcgcaatactacgÁgcactggatgcacgcg
    240 t S 5 270 atgatccaccacggcatcgaggcgggcatcttcgattccgacgaa
    2 15 SOD 3 t S ctcgaccgccgcacccagtactacatggaccatccggacgacacg acccccacgcggcaggatccgcaactggtggagacgatctcgcaa ctgatcacccacggagccgattaccgacgcccgaccgacaccgag gccgcattcgccgtaggcgacaaagtcatcgtgcggtcggacgcc tcaccgaacacccacacccgccgcgccggÁtacgtccgcggtcgt gtcggcgaagtcgtggcgacccacggcgcgtatgtctttccggac accaacgcactcggcgccggcgaaagccccgaacacctgtacaČc gtgcggttctcggcgaccgagttgtggggtgaacctgccgccccg aacgtcgtcaatcacatcgacgtgttcgaaccgtatctgctaccg GCC
    -13CZ 284017 B6
  3. 3. Rekombinantní DNA, obsahující ve vektoru DNA<L) podle nároků 1 a 2.
  4. 4. Transformant TGl/pNHJ20L/FERM BP-2778/ E.coli, který je transformován rekombinantní DNA podle nároku 3.
  5. 5. Způsob přípravy nitril-hydratasy, vyznačující se tím, že se kultivuje transformant podle nároku 4 a nitril-hydratasa se izoluje z kultury.
  6. 6. Způsob přípravy amidů vybraných ze skupiny zahrnující 4-pyridinkarboxamid, nikotinamid, 2-pyridinkarboxamid, benzamid, 2,6-difluorbenzamid, 2-thiofenkarboxamid, 2-furankarboxamid, pyrazinamid, akrylamid, methakrylamid, krotonamid, acetamid a 3-hydroxypropionamid, vyznačující se tím, že se aromatické nitrily, mající 4 až 10 atomů uhlíku v aromatické skupině, a alifatické nitrily, mající 2 až 6 atomů uhlíku, hydratují nitril-hydratasou získanou z kultury transformantů podle nároku 4.
  7. 7. Způsob přípravy amidů vybraných ze skupiny zahrnující 4-pyridinkarboxamid, nikotinamid, 2-pyridinkarboxamid, benzamid, 2,6-difluorbenzamid, 2-thiofenkarboxamid, 2-furankarboxamid, pyrazinamid, akrylamid, methakrylamid, krotonamid, acetamid a 3-hydroxypropionamid, vyznačující se tím, že se kultivuje transformant podle nároku 4 a aromatické nitrily, mající 4 až 10 atomů uhlíku v aromatické skupině, a alifatické nitrily, mající 2 až 6 atomů uhlíku, se hydratují výslednou kulturou izolovaných bakteriálních buněk, materiálem z nich zpracovaným nebo fixovaným za vzniku odpovídajících amidů.
CZ943170A 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu CZ284017B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP4807890 1990-02-28
US08/028,463 US5731176A (en) 1990-02-28 1993-03-09 DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ317094A3 CZ317094A3 (cs) 1998-05-13
CZ284017B6 true CZ284017B6 (cs) 1998-07-15

Family

ID=26388301

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ943170A CZ284017B6 (cs) 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu
CS91531A CZ284048B6 (cs) 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA kodující polypeptid s nitril-hydra tasovou aktivitou, transformant obsahující tento gen a způsob přípravy amidů použitím tohoto transformantu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS91531A CZ284048B6 (cs) 1990-02-28 1991-02-28 Fragment DNA kodující polypeptid s nitril-hydra tasovou aktivitou, transformant obsahující tento gen a způsob přípravy amidů použitím tohoto transformantu

Country Status (18)

Country Link
US (1) US5731176A (cs)
EP (1) EP0445646B1 (cs)
JP (1) JP3162091B2 (cs)
KR (1) KR950002004B1 (cs)
CN (1) CN1054639C (cs)
AT (1) ATE138101T1 (cs)
AU (1) AU627648B2 (cs)
CA (1) CA2037291C (cs)
CZ (2) CZ284017B6 (cs)
DE (1) DE69119454T2 (cs)
DK (1) DK0445646T3 (cs)
ES (1) ES2089044T3 (cs)
FI (1) FI102539B (cs)
MX (1) MX193790B (cs)
NO (1) NO306684B1 (cs)
PL (1) PL166201B1 (cs)
RU (1) RU2081173C1 (cs)
SK (1) SK280199B6 (cs)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2907479B2 (ja) * 1990-02-28 1999-06-21 輝彦 別府 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体及びアミド類の製造法
DE69231939T2 (de) * 1991-03-04 2002-04-04 Mitsubishi Rayon Co Hybrid-Plasmid-Vektoren, die für Nitril-abbauende Enzyme kodierende Gene enthalten und Verfahren zur Herstellung von Amiden und Säuren
AU3692593A (en) * 1992-04-28 1993-11-04 Mitsubishi Kasei Corporation Novel protein having nitrile hydratase activity and the gene encoding the same, and a method for producing amides from nitriles via a transformant containing the gene
JP3828590B2 (ja) * 1994-10-03 2006-10-04 昌 清水 ニトリルヒドラターゼ遺伝子発現のための調節遺伝子
JP3154633B2 (ja) * 1994-12-28 2001-04-09 三菱レイヨン株式会社 ニトリラーゼ遺伝子発現のための調節因子およびその遺伝子
WO1997012964A2 (en) * 1995-10-06 1997-04-10 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragments encoding stereospecific nitrile hydratase and amidase enzymes and recombinant microorganisms expressing those enzymes useful for the production of chiral amides and acides
CN1243825C (zh) * 1996-02-14 2006-03-01 三井化学株式会社 新型腈水合酶
US5866379A (en) * 1997-01-28 1999-02-02 Novus International Enzymatic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding .alpha.
FR2770214B1 (fr) * 1997-10-24 1999-12-31 Rhodia Chimie Sa Procede de preparation d'un benzamide halogene
JP2000050866A (ja) * 1998-08-06 2000-02-22 Rikagaku Kenkyusho ニトリルヒドラターゼの生産方法
JP4185607B2 (ja) 1998-12-15 2008-11-26 ダイセル化学工業株式会社 新規な微生物及びアミド化合物の製造方法
ATE450607T1 (de) * 1999-10-26 2009-12-15 Showa Denko Kk Rhodococcus-stamm, nitrilase-gen aus rhodococcus, nitrilhydratas-gen und amidase-gen und verfahren zur herstellung carboxylsäuren unter deren verwendung
KR100547080B1 (ko) 2000-12-20 2006-01-31 다이야니트릭스 가부시키가이샤 미생물 촉매를 이용한 아미드 화합물의 제조 방법
HU229283B1 (en) * 2001-01-09 2013-10-28 Lonza Ag Microbiological method for producing amides
JP2002325587A (ja) * 2001-03-02 2002-11-12 Daicel Chem Ind Ltd ニトリルヒドラターゼ、およびアミドの製造方法
JP2004194588A (ja) 2002-12-19 2004-07-15 Mitsui Chemicals Inc 新規なニトリルヒドラターゼ
WO2004067738A2 (en) * 2003-01-27 2004-08-12 Degussa Ag Nitrile hydratases from rhodococcus erythropolis and their application
EP1689861B1 (en) * 2003-12-02 2011-11-09 Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited Strain of rhodococcus rhodochrous ncimb 41164 and its use as producer of nitrile hydratase
EP1767624B1 (en) * 2004-05-26 2013-11-06 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Improved nitrile hydratase
JP2006187257A (ja) 2005-01-07 2006-07-20 Daiyanitorikkusu Kk アミド化合物の製造方法およびアクリルアミド系ポリマー
EP1842907A1 (en) 2006-04-07 2007-10-10 B.R.A.I.N. Ag A group of novel enantioselective microbial nitrile hydratases with broad substrate specificity
JP5120852B2 (ja) * 2006-07-06 2013-01-16 国立大学法人 筑波大学 新規タンパク質複合体、該タンパク質複合体を用いたコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ、及び該ニトリルヒドラターゼを用いた方法
WO2008056827A1 (en) 2006-11-09 2008-05-15 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Process for production of betaine
AU2012264058B2 (en) 2011-05-31 2015-10-22 Mitsubishi Chemical Corporation Improved nitrile hydratase
CN104531654B (zh) * 2011-06-07 2018-06-12 三菱化学株式会社 改良型腈水合酶
FR3002542B1 (fr) * 2013-02-28 2016-01-22 Servier Lab Procede de synthese enzymatique de l'acide (7s) 3,4-dimethoxybicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene 7-carboxylique et application a la synthese de l'ivabradine et de ses sels
CN116536293A (zh) 2014-06-06 2023-08-04 三菱化学株式会社 改良型腈水合酶
WO2018085493A1 (en) * 2016-11-04 2018-05-11 Georgia State University Research Foundation, Inc. Endotoxin free asparaginase
JPWO2022172880A1 (cs) 2021-02-10 2022-08-18
CN114934006A (zh) * 2022-06-02 2022-08-23 无锡新晨宇生物工程有限公司 一种腈水合酶催化乙腈生成乙酰胺的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DD274631A5 (de) * 1987-09-18 1989-12-27 Kk Verfahren zur biologischen herstellung von amiden
JP2840253B2 (ja) * 1988-07-06 1998-12-24 輝彦 別府 ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法

Also Published As

Publication number Publication date
ATE138101T1 (de) 1996-06-15
CS9100531A2 (en) 1991-10-15
NO910797L (no) 1991-08-29
EP0445646A2 (en) 1991-09-11
EP0445646A3 (en) 1992-01-08
MX193790B (en) 1999-10-19
KR950002004B1 (ko) 1995-03-08
RU2081173C1 (ru) 1997-06-10
NO306684B1 (no) 1999-12-06
EP0445646B1 (en) 1996-05-15
CZ284048B6 (cs) 1998-07-15
CA2037291A1 (en) 1991-08-29
PL166201B1 (pl) 1995-04-28
CN1054639C (zh) 2000-07-19
FI102539B1 (fi) 1998-12-31
PL289239A1 (en) 1992-03-23
AU7129391A (en) 1991-09-12
KR910021473A (ko) 1991-12-20
FI910960A0 (fi) 1991-02-27
US5731176A (en) 1998-03-24
DE69119454D1 (de) 1996-06-20
AU627648B2 (en) 1992-08-27
NO910797D0 (no) 1991-02-27
FI910960A (fi) 1991-08-29
CN1054616A (zh) 1991-09-18
CA2037291C (en) 2001-07-24
DE69119454T2 (de) 1996-09-26
FI102539B (fi) 1998-12-31
JPH04211379A (ja) 1992-08-03
SK280199B6 (sk) 1999-09-10
JP3162091B2 (ja) 2001-04-25
DK0445646T3 (da) 1996-09-30
CZ317094A3 (cs) 1998-05-13
ES2089044T3 (es) 1996-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ284017B6 (cs) Fragment DNA(L), kodující polypeptid s nitril-hydratasovou aktivitou, transformant, obsahující tento gen a způsob přípravy nitril-hydratasy a amidů použitím tohoto transformantu
US5922583A (en) Methods for production of recombinant plasmids
JP2840253B2 (ja) ニトリルヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、これを含有する形質転換体によるニトリル類からアミド類の製造法
JPH0787788B2 (ja) イソペニシリンｎ合成酵素をコ−ドしているｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクタ−
JP3408737B2 (ja) ニトリルヒドラターゼの活性化に関与するタンパク質及びそれをコードする遺伝子
EP0444639B1 (en) A gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
Asano et al. Bacillus Phenylalanine Dehydrogenase Produced in Escherichia coli—Its Purification and Application to l-Phenylalanine Synthesis—
EP1174499B1 (en) Novel amidase gene
US5683913A (en) Regulatory gene for the expression of nitrile hydratase gene
JPH06319564A (ja) 遺伝子的に修飾された生物体を使用するビタミンｃ先駆体の製造
US5648256A (en) Gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
WO2000058478A1 (en) MICROBIOLOGICAL PRODUCTION METHOD FOR α-L-ASPARTYL-L-PHENYLALANINE
JP3531997B2 (ja) 形質転換体を用いたアミド化合物の製造法
US5753472A (en) DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
US5830693A (en) Gene encoding a regulatory factor involved in activating expression of the nitrilase gene promoter
US5789211A (en) Gene encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
EP1165799A1 (en) Microbiological production method for alpha-l-aspartyl-l-phenylalanine
JP2000032988A5 (cs)
US5721353A (en) DNAs coding for LCU13 ! motilin
HU215231B (hu) Géntechnológiai eljárás S-(+)-2,2-dimetil-ciklopropán-karboxamid előállítására mikroorganizmusok segítségével
RU2173708C2 (ru) Фрагмент днк, кодирующий полипептид с активностью нитрилгидратазы, рекомбинантная плазмидная днк рnhj20l, кодирующая полипептид, штамм escherichia coli tg1/рnhj20l, способ получения полипептида со свойствами нитрилгидратазы
US5043279A (en) DNA encoding a bacillus creatinase
JP3798460B2 (ja) コバルト輸送活性を有するポリペプチドおよびその遺伝子
KR970001566B1 (ko) 티로신 페놀리아제(Tyrosine phenollyase)를 코드(code)하는 유전자, 상기 유전자에 의해 형질전환된 대장균 및 이를 이용한 티로신 페놀리아제의 제조방법
JP2005151999A (ja) ニトリルヒドラターゼ遺伝子発現のための調節遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20110228