FI102539B - Nitriilihydrataasiaktiivisuutta omaavaa polypeptidiä koodaava DNA-frag mentti, geenin sisältävä transformantti ja menetelmä amidien tuottamis eksi transformanttia käyttäen - Google Patents

Description

102539

Nitriilihydrataasiaktiivisuutta omaavaa polypeptidiä koo-daava DNA-fragmentti, geenin sisältävä transformantti ja menetelmä amidien tuottamiseksi transformanttia käyttäen 5 Keksintö koskee Rhodococcus rhodochrous J - 1 -bak teerista saatua DNA-fragmenttia, joka koodaa polypeptidiä, jolla on nitriilihydrataasiaktiivisuutta ja joka hydratoi nitriilejä amideiksi. Keksintö koskee myös yhdistelmä-DNA:ta, joka sisältää edellä mainitun DNA-fragmentin, ja 10 yhdistelmä-DNA: 11a transformoitua transformanttia. Lisäksi keksintö koskee menetelmää nitriilihydrataasin tuottamiseksi transformanttia käyttäen sekä menetelmää amidien tuottamiseksi nitriilihydrataasia käyttäen.

Nitriilihydrataasi eli nitrilaasi tunnetaan entsyy-15 minä, joka hydratoi nitriilejä amideiksi. Nitriilihydrataasia tuottavia mikro-organismeja ovat Bacillus-, Bac-teridium-, Micrococcus- ja Brevibacterium-sukuihin kuuluvat bakteerit (katso JP-B-62-21 517/1989, US-patentti 4 001 081), Corynebacterium- ja Nocardia-sukuihin kuuluvat 20 bakteerit (katso JP-B-56-17 918/1989, US-patentti 4 248 968), Pseudomonas-sukuun kuuluvat bakteerit (katso JP-B-59-379 51/1984, US-patentti 4 637 982) Rhodococcus-, Arthrobacter- ja Microbacterium-sukuihin kuuluvat baktee-: rit (katso JP-A-61-162 193/1986, EP-A-0 188 316) ja Rhodo- 25 coccus rhodochrous (katso JP-A-470/1990, EP-A-0 307 926). V : Nitriilihydrataasia on käytetty nitriilien hydra- toimiseksi amideiksi. Keksinnön mikro-organismit saatetaan ·;·*: yhdistelmä-DNA-menetelmien avulla sisältämään useita ko- ;*;*j pioita yhdistelmä-DNA: ta, joka koodaa nitriilihydrataa- 30 siä. Rekombinantti tuottaa erittäin korkeita pitoisuuksia nitriilihydrataasia verrattuna tavanomaisesti käytettyihin • · · *.,1' mikro-organismeihin.

Aikaisemmin on esitetty DNA-fragmentti, joka on : : peräisin Rhodococcus-lajista N-774 (FERM BP-1936), joka • 2 102539 myös koodaa polypeptidiä, jolla on nitriilihydrataasiak-tilvisuutta (JP-A-2-119 778/1988).

Esillä olevassa keksinnössä sitä vastoin käytetään nitriilihydrataasin tuottamiseksi DNA-fragmenttia, joka on 5 saatu Rhodococcus rhodochrous J - 1 -bakteerista. Nitrii-lihydrataasia koodaava geeni eristettiin, insertoitiin sopivaan plasmidivektoriin ja sopiva isäntä transformoitiin yhdistelmäplasmidilla, jolloin onnistuttiin saamaan transformantti, joka tuottaa nitriilihydrataasia, joka on 10 erittäin aktiivinen myös aromaattisia nitriilejä kohtaan.

Esillä oleva keksintö koskee (1) DNA,h)-fragmenttia, joka koodaa polypeptidiä, jolla on nitriilihydrataasiaktiivisuutta ja joka käsittää seuraavat aminohapposekvenssit omaavat a(H)- ja 6(H,-alayksi-15 köt: a(H) -alayksikkö:

& 10- IS

HetSerGluilisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr 2 0 t S 3 0

LysAlalleGluThrLeuleuTyrGluArgGlyLeuIleThrPro 20 1S «® «s

AlaAIaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGlulleGly SO SS 00

ProMetGlyGIyAlalysValValAlaLysSerTrpValAspPro

* S 7 0 7 S

GluTyrArglysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMelAla

0 0 OS 9 O

... 25 SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlallisGInl leSerAlaVal :***: PheAsnAspSerGlnThrHisllisValValValCysThrLeuCys ·· · .... 110 I I S Iti * * SerCysTyrProTrpProVaILeuGlyLeuProProA1aTrpTyr : : : its iti ns

LysSerHetGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGly 30 too i4 s iso :Y: ValLeuLysArgAspPheGIyPheAspIIeProAspG1uVaIGI u • · ..... I S S ISO I o s

VaiArgValTrpAspSerSerSerCIuIleArgTyrlIeValI le

Ilo I 7 S 100 : ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu 35 ThrLysLeuVa lSerArgAspSerHe111eGlyValSerAsnAla 2 0 0

LeuThrProGlnGluValIleVal 3 102539 β(Η)-alayksikkö:

s 10 IS

HetAspG 1 y 11eHi sAspThrG 1 yG IylletThrG 1 yTyrG 1 yPro 2 0 2 S 3 0

ValProTyrGlnlysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGIu c IS <0 4 5

GlyArgThrLeuSerlleLeuTtirTrpHetHlsLeuLysGlylle s · 5 S 4 0

SerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgG I uSertle tG 1 yAsn * * 10 is

GluAsnTyrValAsnGlulleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp o os oo 1Q LeuSerAlaAlaGluArgl 1 eLeuVa 1A 1 aAspLys I lei IeTlir OS 10 0 I o 5

GluGI uGluArgLysHisArgVa IGInGlu!leLeuGLuGlyArg 110 IIS I * 0

TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaG nlle IIS ISO I 3 5

GluLysAlalleGluArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeu

15 140 I 4 S ISO

ProGlyAlaGJuProSerPheSerleuGlyAsplysIlelysVal I S 5 ISO Its

LysSerHetAsnProleuGlyKisThrArgCysProLysTyrVal

170 11S ISO

ArgAsnLyslleGlyGlulleValAlaTyrHisGlyCysGlnlle lis ISO I 0 s 20 TyrProGluSe»*SerSerAlaGlyLe;GiyAspAspProArgPro

JOO JOS III

LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp

ZIS 220 ZZS

GlyAsnClyLysAspValVcICysValAspLeuTrpGluProTyr

Leu 11eSerA 1 a; 25 - · · (2) DNA<L)-fragmenttia, joka koodaa polypeptidiä, ·« · ;..j jolla on nitriilihydrataasiaktiivisuutta ja joka käsittää .···. seuraavat aminohapposekvenssit omaavat a<L) - ja e(L)-alayk- * siköt: . , 30 a<L>-alayksikkö: * · · «s V · MetThrA 1aHisAsnProVa 1G I nGIylhrLeuProArgSerAsn ‘ . JO JS 3 0 : GluGlulleAlaAIaArgValLysAlaMetGluAla[leLeuVal 3 S 4 0 4 5 . 35 AspLysGIyLeu I 1 eSerThrAspAI a I1eAspHisMetSerSer 102539 4

S O Si tD

ValTyrGluAsnGluValGIyProGlnLeuGlyAlaLyslleVal

»S 10 IS

AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr so es o o

AspAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyVaiGlyGIyMetGIn os i o o i o s 5 GlyGJuGluHetValValleuGluAsnThrGlyThrValHisAsn IIO IIS I z o

MetValValCysIhrleuCysSerCysTyrProTrpProValleu its i a o i a s

GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaAre

14 0 I 4 S ISO

10 AlaVa1ArgAspProArgGIyVa1 Leu A IaGIuPheGIyTyrThr I S S 1*0 I * 5

ProAspProAspValGlulleArglleTrpAspSerSerAlaGlu 110 IIS I i o

LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn I O S 10 0 I o s

PheThrGluGluGlnLeuAlaAspleuValThrArgAspSerleu 15 too z o s

JleGIyValSerValProThrThrProSerLysAla

Btl)alayksikkö:

s to IS

MetAspGlylleKisAspLeuGIyGlyArgAlaGlyLeuGlyPro 20 2 0 2 s a °

IleLysProGluSerAspGIuProValPheHisSerAspTrpGlu

3 S 4 0 4 S

ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMelAlaLeuAlaGlyAla

SO SS AO

PheAsnLeuAspGInPheArgG 1 yA1aMetG1uG1 n I1eProPro i S 10 7 5 25 HisAspTyrLeuThrSerGInTyrTyrG1uHίsTrpMetHis A 1 a · · * e o as oo :**: Heti leHisHisGlyl leGluAIaGlyl lePheAspSerAspGlu • · · OS 10 0 I o s

Leu AspArgArgThrGInTyrTyrMetAs pHisPro AspAspThr tao ! '· iio iis ito

ThrProThrArgGlnAspProGInleuValGluThrlleSerGln 30 IZS 130 I 3 s

LeuIleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu • · i40 i 4 s iso ’·** AlaAlaPheAlaValGlyAspLysVal I leValArgSerAspAla is s 1*0 ies ’ ·' SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGIyTyrValArgGlyArg . iio iis i e o 35 ValGIyGIuValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp 5 102539 IBS 190 1 0 $

ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisleuTyrThr ZOO Z O S 210

ValArgPheSerAlaThrG1uLeuTrpG!yCluProAlaAlaPro

ZIS ZZO 2ZS

5 AsnVa1Va1AsnHis 11eAspValPheGIuProTyrLeuLeuPro AI a (3) kohdan (1) mukaista DNA(H)-fragmenttia, joka sisältää mainittuja α(Η)- ja B(H)-alayksikköjä koodaavan nuk-10 leotidisekvenssin: a(H)-alayksikköä koodaava DNA-sekvenssi:

GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC

AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC

15 GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGC

CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT

GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG

20 TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC

TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTCTGCACTCTGTGT

TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC

AAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA

; : 25 4 1 0 4 3 5 4 s 0

GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG

> · GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC ’ • ·

:T: CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG

30 ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG

• · • · · too

CTCACACCGCAGGAAGTCATCGTA

• · · β<Η)-alayksikköä koodaava DNA-sekvenssi:

* ; ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCCGATACGGACCG

'. 35 6 102539

gtcccctatcagaaggacgagcccttcttccactacgagtgggag ggtcggaccctgtcaattctgacttggatgcatctcaagggcata TCGTGGTGGGACAAGTCCCGCTTCTTCCGGGAtTCGATGGGGAAC GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAG AGATCCTTGAGGGTCGG 10 TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC

J 7 S Itt 40S

GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCT AGCGCTT CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG

15 s (# ^

CGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGCCGACGATCCTCGCCCG CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTCTGGGGCGACGAC 20 6GAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTAC

CTGATCTCTGCG

(4) kohdan (1) mukaista DNA(L)-fragmenttia, joka sisältää a(L)- ja βα)-alayksikköjä koodaavan nukleotidisek-. ; ; 25 venssin: a(L)-alayksikköä koodaava DNA-sekvenssi.

ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC

* GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATCGAGGCCATCCTCGTC

30 GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG

• · ·

:T: GTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCGGCGCCAAGATCGTC

> GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC

35 GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAG

7 102539

HS 300 3 I S

GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC 5 GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC

GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA CTTCGCT ACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCCAGAAC TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC ATCGGCGT ATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC

B(L)-alayksikköä koodaava DNA-sekvenssi: 15 is äo n

ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG

atcaagcccgaatccgatgaacctgttttccattccgattgggag

I O s I Z O I 3 S

cggtcggttttgacgatgttcccggcgatggcgctggccggcgcg 2o ttcaatctcgaccagttccggggcgcgÄtggagcagatccccccg cacgactacctcÄcctcgcaatactacgagcactggatgcacgcg. atgatccaccacgccatcgaggcgggcatcttcgattccgacgaa : ctcgaccgccgcacccagtactacatggaccatccggacgacacg acccccacgcggcaggatccgcaactggtggagacgatctcgcaa .··: ctgatcacccacggagccgattaccgacgcccgaccgacaccgag : gccgcattcgccgtaggcgacaaagtcatcctgcggtcgcacgcc 30 tcaccgaacacccacacccgccgccccggatacgtccgcggtcgt gtcggcgaactcgtggcgacccacggcgcgtatgtctttccggac : accaacgcactcggcgccggccaaagccccgaacacctgtacacc ; gtgcggttctcggcgaccgagttgtggcgtgaacctgccgccccg 35 8 102539

AACGTCCTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCCTATCTGCTACCG

GCC

(5) yhdistelmävektoria, joka käsittää kohdan (1) - 5 (4) mukaisen DNA(H) :n tai DNA<L):n vektorissa: (6) transformanttia, joka on transformoitu kohdan (5) mukaisella yhdistelmä-DNA:11a; (7) menetelmää nitriilihydrataasin tuottamiseksi, jossa menetelmässä viljellään kohdan (6) mukaista transit) formanttia ja otetaan nitriilihydrataasi talteen viljelmästä; (8) menetelmää amidien tuottamiseksi, jossa menetelmässä hydratoidaan nitriilejä käyttäen kohdassa (7) kuvattua nitriilihydrataasia amidien muodostamiseksi; ja 15 (9) menetelmää amidien tuottamiseksi, jossa mene telmässä viljellään kohdassa (6) kuvattua transformanttia ja hydratoidaan nitriilejä käyttäen viljelmästä eritettyjä bakteerisoluja, niitä käsittelemällä saatua materiaalia tai niihin kiinnittynyttä materiaalia amidien muodostami-20 seksi. Esillä oleva keksintö kuvataan seuraavassa yksityiskohtaisesti.

Keksintö toteutetaan vaiheiden (1) - (8) avulla: . (1) Nitriilihydrataasin eristys, puhdistus ja nit riilihydrataasin osittainen aminohapposekventointi 25 Rhodococcus rhodochrous J - 1 -bakteerista ... (FERM BP-1 1 478) eristetään ja puhdistetaan kahdentyyp- • · ♦ *** * pistä nitriilihydrataasia (H-tyyppiä- ja vastaavasti L-tyyppiä) ja molemmat entsyymit eristetään a- ja B-alayk- • · \V siköiksi HPLC:llä. Osa kummankin alayksikön aminohapposek- V : 30 venssistä määritetään (kuvio 1).

.···. (2) DNA-koettimen valmistus nitriilihydrataasigee- • · it<i; niä varten DNA-koetin valmistetaan JMl05/pYUK121:stä (FERM BP-1937) julkaisussa JP-A-2-119778/1990 kuvatulla tavalla, : 35 koska mainitussa JP-patenttihakemusjulkaisussa kuvatun 9 102539

Rhodococcus-lajin N-774 nitriilihydrataasin β-alayksikön ja Rhodococcus rhodochrous J - 1 -bakteerin nitrii lihydrataasin β-alayksikön aminohapposekvenssien välillä vallitsee suuri homologia. Plasmidi pYUK121, joka sisältää 5 Rhodococcus-lajista N-774 saadun nitriilihydrataasigeenin, valmistetaan JM105/pYUK121-viljelmästä. pYUK121-DNA hajotetaan Sphl:llä ja Sall:llä. SphI-Sall-fragmentti sisältää Rhodococcus-lajin N-774 nitriilihydrataasigeenin (kuvio 2). DNA-fragmentti leimataan radioaktiivisella iso-10 toopilla.

(3) Rhodococcus rhodochrous J - 1 -bakteerin kromosomista saadun nitriilihydrataasigeenin sisältävän DNA-segmentin toteaminen

Kromosomaalinen DNA valmistetaan Rhodococcus 15 rhodochrous J - 1 -viljelmästä. Kromosomaalinen DNA hajo tetaan restriktioentsyymeillä ja hybridisoidaan kohdassa (2) kuvattuun koettimeen käyttäen Southernhybridisaa-tiomenetelmää [Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98 (1975) 503]. Seulotaan kaksi eripituista DNA-fragmenttia.

20 (4) Yhdistelmäplasmidin muodostaminen , . Yhdistelmäplasmidi muodostetaan insertoimalla koh dassa (3) valmistettu kromosomaalinen DNA-fragmentti plas-' ·' midivektoriin.

v : (5) Transformointi ja yhdistelmäplasmidin sisältä- 25 vän transformantin seulonta ·:**: Transformantit valmistetaan käyttäen kohdassa (4) kuvattua yhdistelmäplasmidia. Transformantit, jotka sisäl-tävät yhdistelmäplasmidin, valikoidaan käyttäen kohdassa .·.·. (2) kuvattua koetinta pesäkehybridisaatiomenetelmällä • t · 30 [Wallace, B.R. et ai., Nuc. Aci. Res. 9 (1981) 879]. Nit- • · · riilihydrataasigeenin läsnäolo yhdistelmäplasmidissa var- • · · mistetaan myös Southern-hybridisaatiomenetelmällä. Näin valikoidut plasmidit nimetään pNHJIOHrksi ja pNHJ20L:ksi.

« (6) Plasmidi-DNA:n eristys ja puhdistus ja restrik- . , : 35 tiokartan muodostaminen 10 102539

Kohdassa (5) valmistettujen pNHJ10H:n ja pNHJ20L:n plasmidiDNA:t eristetään ja puhdistetaan. DNA:iden rest-riktiokartta muodostetaan (kuvio 3) nitriilihydrataasigee-nin sisältävän alueen määrittämiseksi.

5 (7) DNA-sekventointi pNHJIOHrssa ja pNHJ20L:ssä oleva insertoidun DNA-fragmentin ylimääräinen segmentti leikataan pois käyttäen sopivaa restriktioentsyymiä. Sitten insertoitua DNA-fragmenttia käytetään sekventointiin. DNA-fragmentin 10 nukleotidisekvenssi (kuviot 4 ja 5) paljastaa, että se sisältää kohdassa (1) kuvatusta aminohapposekvenssistä päätellyn sekvenssin.

(8) Nitriilihydrataasin tuottaminen transformanttia käyttäen ja nitriilien muuttaminen amideiksi 15 Kohdassa (5) kuvattua transformanttia viljellään.

Bakteerisolut sekoitetaan nitriileihin, nitriilihydrataasin substraattiin, ja amideja tuotetaan.

Rhodococcus rhodochrous J - 1 talletettiin talletuslaitokseen Fermentation Research Institute, Agency of 20 Industrial Science and Technology ja sille annettiin tal-letusnumero FERM BP-1 478. Transformantti TGl/pNHJ10H, ; joka sisältää pNHJIOHrn, kuten kohdassa (5) on kvuattu, ja transformantti TGl/pNHJ20L, joka sisältää pNHJ20L:n, kuten ' * kohdassa (5) on kuvattu, talletettiin edellä mainittuun 25 talletuslaitokseen ja niille annettiin talletusnumerot ”**! FERM-2 777 ja vastaavasti FERM BP-2 778.

Mitä tahansa vektoreita, mm. plasmidivektoria (esim. pATl53, pMP9, pHC624, pKC7 jne), faagivektoria .·.·. (esim. lambda-gtll, Toyobo-yhtiö, Charon 4A, Amersham-yh- 30 tiö) jne voidaan käyttää. Käyttökelpoisia entsyymejä ovat • · ·

Sphl, Sali, EcoRI, BamHI, Sacl ja vastaavat entsyymit, • · · :...: jotka ovat kaupallisesti saatavisa (Takara Shuzo). Erilai- siä isäntiä voidaan käyttää tansformointiin, esimerkiksi E. coli JM105 - ja E. coli TG1 -bakteereja mainittuihin 35 rajoittumatta.

u 102539

Transformantin viljelyväliaineet ovat alalla tavallisesti käytettyjä väliaineita.

Nitriilien muuttaminen amideiksi toteutetaan nitriilihydrataasia, puhdistamatonta nitriilihydrataasia, 5 transformanttiviljelmää, eristettyjä bakteerisoluja tai niitä käsittelemällä saatua materiaalia ja vastaavaa transformanttiviljelmästä valmistettua materiaalia käyttäen.

Sopivia nitriilejä keksinnössä ovat aromaattiset 10 nitriilit, joissa on 4 - 10 hiiliatomia aromaattisessa ryhmässä, ja alifaattiet nitriilit, joissa on 2 - 6 hii liatomia, jollaisia on kuvattu EP-patenttijulkaisussa nro 0307 926. Tyypillisiä esimerkkejä nitriileistä ovat 4-, 3- ja 2-syaanipyridiinit, bentsonitriili, 2,6-dif- 15 luoribentsonitriili, 2-tiofeenikarbonitriili, 2-furoni- triili, syaanipyratsiini, akrylonitriili, metakrylonitrii-li, krotonitriili, asetonitriili ja 3-hydroksipropioni-triili.

Keksinnössä on esitetty Rhodococcus rhodochrous 20 J - 1 -bakteerista saadun nitriilihydrataasin kahden tyy pin a- ja 8-alayksikköjen aminohappo- ja nukleotidisek-venssit. Nitriilihydrataasia koodaava DNA-fragmentti in-sertoidaan ekspressiovektoriin ja yhdistelmävektoria käy-’ · tetään transformointiin. Transformantti sisältää useita 25 geenikopioita ja voi tuottaa erittäin korkeita pitoisuuk- *t**: siä nitriilihydrataasia verrattuna tavanomaisesti käytet- tyihin mikro-organismeihin.

Kuviossa 1 esitetään Rhodococcus rhodochrous .·.*. J - 1 -bakteerin tuottaman nitriilihydrataasin kahden • · 30 tyypin a- ja β-alayksikköjen N-terminaalinen aminohappo- • · · sekvenssi.

♦ · ♦

Kuviossa 2 esitetään Rhodococcus-lajin N-774 nit-riilihydrataasigeenin DNA-sekvenssi, jota käytetään .:, DNA-koettimena.

12 102539

Kuviossa 3 esitetään yhdistelmäplasmidien pNHJIOH ja pNHJ20L restriktiokartat.

Kuviossa 4 esitetään Rhodococcus rhodochrous J - 1 -bakteerista saadun, pNHJIOH:ssa olevan DNA-fragmentin 5 DNA-sekvenssi ja siitä päätelty aminohapposekvenssi.

Kuviossa 5 esitetään Rhodococcus rhodochrous J - 1 -bakteerista saadun, pNHJ20L:ssä olevan DNA-fragmentin DNA-sekvenssi ja siitä päätelty aminohapposekvenssi.

Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti seuraavassa 10 esimerkissä, jonka tarkoitus ei ole rajoittaa keksinnön suojapiiriä.

Esimerkissä käytetään seuraavia lyhenteitä: TE: Tris-HCl (10 mmol/1, pH 7,8), EDTA (1 mmol/1, pH 8,0) 15 TNE: Tris-HCl (50 mmol/1, pH 8,0), EDTA (1 mmol/1, pH 8,0), NaCl (50 mmol/1) STE: Tris-HCl (50 mmol/1, pH 8,0), EDTA (5 mmol/1, pH 8,0), sakkaroosi (35 mmol/1) 2 x YT-väliaine: 1,6 % trypton, 1,0 % hiivauute, 0,5 % NaCl 20 Esimerkki (1) Nitriilihydrataasin eristys ja puhdistus ja nitriilihydrataasin osittainen aminohapposekvenssi

Rhodococcus rhodochrous J - 1 -bakteeria viljel-tiin väliaineessa (3 g/1 hiivauutetta, 0,5 g/1 KH2P04:a, .·' 25 0,5 g/1 K2HP04:a, 0,5 g/1 MgS04.4H20:ta, 0,01 g/1 CoCl2:a ja "·*ί 3 g/1 krotonamidia, pH 7,2) 28 °C:ssa 80 tuntia. Bakteeri- solut otettiin talteen. 50 g bakteerisoluja hajotettiin ja fraktioitiin ammoniumsulfaatilla. Näyte dialysoitiin ja .·.·. dialysaatti sentrifugoitiin. Supernatantti vietiin DEAE- • · 30 Cellulofine-kromatografiaan, Phenyl-Sepharose-kromatogra- • · · fiaan ja Octyl-Sepharose-kromatografiaan. Saatiin kaksi • · · *...* entsyymiaktiivisuutta sisältävää fraktiota, jotka dia- lysoitiin. Dialysaatit vietiin korkean suorituskyvyn nes-tekromatografiaan käyttäen käänteisfaasikolonnia ; 35 (Senshu Pak VP-304-1 251, Senshu Kagaku) ja saatiin kaksi vastaavaa alayksikköä (a ja β). ax (H)-, βχ(Η)-, a1(L)- ja 13 102539 β1α)-alayksikköjen N-terminaalinen aminohapposekvenssi määritettiin käyttäen Applied Biosystems malli 470A-prote-iinisekvenaattoria. Aminohapposekvenssit esitetään kuviossa 1.

5 (2) DNA-koettimen valmistus nitriilihydrataasigee- nille E. coli JM105 -bakteeria (FERM BP-1937), joka sisältää pYUK121:n, viljeltiin 100 mlrssa 1 x YT-väliainet-ta, joka sisälsi 50 ,ug/ml ampisilliinia, 30 eC:ssa yli yön 10 (12 tuntia). Bakteerisolut otettiin talteen ja TNE:tä li sättiin soluihin. Sitten solususpensio sentrifugoitiin. 8 ml STE:tä ja 10 mg lysotsyymiä lisättiin solunappiin. Seosta inkuboitiin 0 °C:ssa viisi minuuttia, minkä jälkeen lisättiin 4 ml 0,25 mol/1 EDTA:ta. Seokseen lisättiin sit-15 ten 2 ml 10-%:sta SDS:ää ja 5 ml 5 mol/1 NaCl:a huoneenlämpötilassa. Saatua seosta inkuboitiin 0-4 eC:ssa kolme tuntia ja sitten se ultrasentrifugoitiin. Puoli tilavuutta 30-%:sta PEG 6 000:tta lisättiin supernatanttiin. Seosta inkuboitiin 0-4 °C:ssa yli yön (12 tuntia) ja seos sent-20 rifugoitiin. Solunappiin lisättiin TNE:tä tilavuuteen 7,5 ml ja sitten suspensioon lisättiin CsCl:a. Seos sent-rifugoitiin proteiinien poistamiseksi. Tämän jälkeen 300 -500 mg/ml etidiumbromidia lisättiin supernatanttiin. Seos ·.' siirrettiin sentrifugiputkeen. Putki suljettiin lämmöllä

III

25 ja ultrasentrifugoitiin. cccDNA uutettiin peristalttista *:**: pumppua käyttäen. Hieman enemmän kuin sama määrä isopro- :*·*: pyylialkoholia, joka oli kyllästetty vedellä, lisättiin uutteeseen etidiumbromidin poistamiseksi. Näyte dialysoi-tiin TE:tä vastaa, jolloin saatiin noin 3 ml puhdistettua • · t 30 pYUK121: tä.

PYUK121-DNA hajotettiin Sphltllä ja Sällillä, joi-

• M

loin saatiin 2,07 ke: n DNA-fragmentti, joka sisälsi t

Rhodococcus-lajin N-774nitriilihydrataasigeenin. Fragment-ti leimattiin radioaktiivisesti 32P:llä koettimen valmista- « « i · • · 14 102539 miseksi. Koettimen nukleotidisekvenssi esitetään kuviossa 2.

(3) Kromosomin nitriilihydrataasigeenin sisältävän DNA-fragmentin valmistus 5 Rhodococcus rhodochrous J - 1 -bakteeria viljeltiin 100 ml:ssa väliainetta (10 g/1 glukoosia, 0,5 g/1 KH2P04:a, 0,5 g/1 K2HP04:a, 0,5 g/1 MgS04.7H20:ta, 1 g/1 hiivauutetta, 7.5 g/1 peptonia, 0,01 g/1 CoCl2:a, 7,5 g/1 ureaa, 1 % gly-siiniä tai 0,2 /ug/ml ampisilliinia, 1 1 vettä, pH 7,2).

10 Bakteerisolut otettiin talteen ja solunappi pestiin TNE:llä. Sitten nappi suspendoitiin 10 ml:aan TE:tä. Suspensioon lisättiin 4 ml 0,25 mol/1 EDTA:ta, 10 - 20 mg lysotsyymiä, 10 - 20 mg akromoproteaasia ja 10 ml 10 x SDSrää. Suspensiota inkuboitiin 37 °C:ssa kolme tun- 15 tia. Suspensioon lisättiin 15 ml fenolia ja seosta inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen se sentrifugoitiin. Ylempi kerros poistettiin ja 0,7 ml 2.5 mol/1 natriumasetaattia ja dietyylieetteriä lisättiin supernatanttiin. Seos sentrifugoitiin ja ylempi kerros 20 heitettiin pois. Kaksi tilavuutta etanolia lisättiin alakerrokseen ja DNA poistettiin lasisauvalla. DNA:ta huuhdeltiin viiden minuutin ajan TE:etanoli-seoksilla 2:8, 1:9 ja 0:10 (v/v). Sitten DNA suspendoitiin uudelleen 2-4 ml:aan TE:tä (37 °C). Suspensioon lisättiin 10 /ui RNaasi ·...* 25 A:n ja Tt:n seosta ja seosta inkuboitiin 37 °C:ssa. Yhtä suuri määrä fenolia lisättiin seokesen, joka sitten sentrifugoitiin. Supernatanttiin lisättiin enemmän kuin sama määrä eetteriä. Seos sentrifugoitiin uudelleen ja ylempi kerros heitettiin pois ja alempikerros otettiin • · .·;·. 30 talteen. Alakerros dialysoitiin kahta litraa pienen määrän • · · ^ kloroformia sisältävää TE:tä vastaan yli yön ja edelleen *·..* tuoretta TE:tä vastaan 3-4 tuntia. Saatiin 4 ml puhdis- ’·”· tamatonta kromosomaalista DNA:ta.

·* 10 /ui TE:tä, 3 /ui reaktiopuskuria (lOx) ja 2 /ui ,..: 35 Sacl:tä lisättiin 15 /ul:aan puhdistamatonta DNA:ta. Seos- 15 102539 ta inkuboitiin 37 °C:ssa yksi tunti ja siitä ajettiin elektroforeesi agaroosigeelissä jännitteellä 60 V kolmen tunnin ajan. Kromosomaalisen DNA:n Southern-hybridisaatio suoritettiin käyttäen koettimena kohdassa (2) kuvattua 5 koetinta. Noin 6,0 ke:n ja 9,4 ke:n fragmenttien havaittiin hybridisoituvan vahvasti.

15 /ui kromosomaalista DNA:ta hajotettiin Sacl:llä ja siitä ajettiin elektroforeesi agaroosigeelissä edellä kuvatulla tavalla. 6,0 ke:n ja 9,4 ke:n DNA-fragmentit 10 leikattiin irti geelistä ja molemmat geelipalat vietiin kolmeen tilavuuteen 8 mol/1 NaC104:ää. Kun fragmentit olivat liuenneet, molemmat liuokset pipetoitiin täpläksi GF/C-suodatinpaperille (halkaisija 6 mm, Whatman). Kymmenen tippaa (noin 100 /ui) TE:tä, joka sisälsi 6 mol/1 15 NaC104.ää ja sitten kymmenen tippaa (noin 100 /ui) 95 %:sta etanolia lisättiin suodatinpaperille. Paperia kuivattiin ilmassa kolme minuuttia ja se vietiin sitten 0,5 ml:n ep-pendorfputkeen. Putkeen lisättiin noin 40 /ui TE:tä ja sitä inkuboitiin 47 eC:ssa 30 minuuttia. Sitten putki 20 sentrifugoitiin. Saatiin noin 40 /ui supernatanttia, joka sisälsi 6,0 ke:n ja 9,4 ke:n DNA-fragmentit, jotka sisäl-'···' sivät kromosomaalisen DNA:n nitriilihydrataasigeenin.

Menetelmä 6,0 ke:n DNA-fragmentin insertoimiseksi : vektoriin kuvataan jäljempänä. Samaa menetelmää sovelle- : : 25 taan 9,4 ke:n DNA-fragmentin insertoimiseen vektoriin.

·;··; (4) Kromosomaalisen DNA-fragmentin insertio vekto- riin • · · 10 /ui TE:tä, 3 /ui reaktiopuskuria (lOx) ja 2 /ui #·.·. Sacl:tä lisättiin 10 /ui:aan pUC19:ta. Seosta inkuboitiin • · · 30 30 °C:ssa yksi tunti. Seokseen lisättiin 2 /ui 0,25 mol/1 • · · EDTA:ta reaktion pysäyttämiseksi. Sitten 7 /ui 1 mol/1 s.#,s Tris-HCl:a (pH 9) ja 3 /ui BAP:tä (bakteeriperäistä alka- ·:··: lista fosfataasia) lisättiin seokseen. Seosta inkuboitiin 65 eC:ssa yksi tunti. Sitten seokseen lisättiin TE:tä 35 100 /ui:n kokonaistilavuuteen. Seos uutettiin kolmesti 16 102539 yhtä suurella määrällä fenolia. Uutteeseen lisättiin yhtä suuri määrä eetteriä. Alakerros poistettiin ja 10 /ui 3 mol/1 natriumasetaattia ja 250 /ui etanolia lisättiin alakerrokseen. Seosta inkuboitiin -80 °C:ssa 30 minuuttia, 5 seos sentrifugoitiin, kuivattiin ja suspendoitiin uudelleen TE:hen.

5 /ui näin saatua pUC19-DNA:ta ja 40 /ui kohdassa (3) kuvattua 6,0 ke:n DNA-fragmenttia sekoitettiin. 6 /ui ligaatiopuskuria, 6 /ui ATPrtä (6 mg/ml) ja 3 /ui 10 T4-DNA-ligaasia lisättiin seokseen. Seosta inkuboitiin 4 eC:ssa yli yön (12 tuntia) yhdistelmäplasmidin tuottamiseksi, sisältää haluttua entsyymiä koodaavan 6,0 ke:n DNA-fragmentin pUC19:n Sacl-kohdassa.

(5) Transformointi ja transformanttien seulonta 15 E. coli TG1 -bakteeri (Amersham) siirrostettiin 10 ml:aan 2xYT-väliainetta ja viljelmää inkuboitiin 37 °C:ssa 12 tuntia. Inkuboinnin jälkeen saatu viljelmä lisättiin tuoreeseen 2xYT-väliaineeseen. 1 %:n pitoisuudeksi ja seosta inkuboitiin 37 eC:ssa kaksi tuntia. Vil-20 jelmä sentrifugoitiin ja solunappi suspendoitiin 5 ml:aan kylmää 50 mmol/1 CaCl2:a. Suspensio pantiin jäiden päälle 40 minuutiksi, minkä jälkeen se sentrifugoitiin. 0,25 /ui kylmää 50 mmol/1 CaCl2:a ja 60 /ui kohdassa (4) kuvattua • yhdistelmä-DNA:ta lisättiin solunappiin. Seosta inkuboi- : 25 tiin 0 °C:ssa 40 minuuttia, sille annettiin lämpöshokki ·;··: 42 °C:ssa kahden minuutin ajan, pantiin jäiden päälle vii- :*·*: deksi minuutiksi ja lisättiin 10ml 2xYT-väliainetta. Seos- ta inkuboitiin 37 °C:ssa 90 minuuttia ravistellen, minkä jälkeen se sentrifugoitiin. Nappi suspendoitiin 1 ml:aan • t · 30 2xYT-väliainetta ja kaksi 10 /ui:n tilavuutta suspensiota • · · levitettiin erikseen 2xYT-agarlevylle, joka sisälsi 50 /ug/ml ampisilliinia. Levyä inkuboitiin 37 °C. Levyllä kasvaneet pesäkkeet valikoitiin pesäkehybridisaatiomene-·. telmällä. Tällöin pesäke siirrettiin nitroselluloosasuo- ’. 35 dattimelle ja hajotettiin. DNA kiinnitettiin suodattimelle 17 102539 ja hybridisoitiin kohdassa (2) kuvattuun koettimeen. Suodatin autoradiografoitlln ja yhdistelmäpesäke valikoitiin. Nitriilihydrataasigeenin läsnäolo transformantissa varmistettiin myös Southern-hybridisaatiomenetelmällä.

5 (6) Yhdistelmäplasmidin eristys ja puhdistus ja insertoitujen DNA-fragmenttien restriktiokartan muodostaminen

Kohdan (5) mukaisesti valikoitua transformanttia kasvatettiin 100 ml:ssa 2xYT-väliainetta, joka sisälsi 10 50 /ug/ml ampisilliinia, 37 °C:ssa yli yön (12 tuntia).

Bakteerisolut otettiin talteen ja soluihin lisättiin TNE:tä. Solut otettiin taas talteen sentrifugoimalla ja 8 ml STErtä ja 10 mg lysotsyymiä lisättiin soluihin. Seosta inkuboitiin 0 °C:ssa viisi minuuttia. Sitten seokseen li-15 sättiin 4 ml 0,25 mol/1 EDTA:ta, 2 ml 10-%:sta SDS:ää (huoneenlämpötilassa) ja 5 ml 5 mol/1 NaCl:a. Seosta inkuboitiin 0-4 °C:ssa kolme tuntia, minkä jälkeen se ultra-sentrifugoitiin. Puoli tilavuutta 30-%:sta PEG 6 000:tta lisättiin supernatanttiin. Seosta inkuboitiin 0 -4 °C:ssa 20 yli yön (12 tuntia) ja sentrifugoitiin uudelleen. TNErtä lisättiin solunappiin tilavuuteen 7,5 ml. Suspensioon lisättiin CsCl:a proteiinien poistamiseksi. Sitten supernatanttiin lisättiin 300 - 500 mg/ml etidiumbromidia ja seos : siirrettiin sentrifugiputkeen. Putki suljettiin lämmöllä 25 ja ultrasentrifugoitiin. cccDNA poistettiin käyttäen pe-*:**: ristalttista pumppua. Hieman enemmän kuin sama määrä iso- :*·*: propyylialkoholia, joka oli kyllästetty vedellä, lisättiin cccDNA:hän etidiumbromidin poistamiseksi. DNA-näyte dia-lysoitiin TE:tä vastaan, jolloin saatiin noin 3 ml puhdis- • « · #··*# 30 tettua yhdistelmä-DNA:ta. Näin saatu yhdistelmäplasmidi, • ♦ · joka sisältää 6,0 ke:n DNA-fragmentin, nimettiin ··· ·...♦ pNHJ10H:ksi. (Yhdistelmäplasmidi, joka sisältää 9,4 ke:n '·”· DNA-fragmentin, nimettiin pNHJ20L:ksi).

18 102539 Nämä plasmidit hajotettiin EcoRItllä, BamHI:llä, Pstl:llä, Sacl:llä ja Sällillä. Restriktiokartat muodostettiin ja ne esitetään kuviossa 3.

(7) DNA-sekventointi 5 pNHJIOHrn DNA-fragmentissa olevan nitriilihydrataa- sigeenin paikka määritettiin muodostetun restriktiokartan ja Southern-hybridisaatiomenetelmän avulla. pNHJ10H:ssa ollut ylimääräinen segmentti pilkottiin pois Pstlillä ja Sällillä, jolloin 6,0 ke:n DNA-fragmentista tuli 1,97 ke:n 10 DNA-fragmentti. Samoin pNHJ20L:ssä ollut ylimääräinen segmentti pilkottiin pois EcoRIillä ja Sacl:llä, jolloin 9,4 ke:n DNA-fragmentista tuli 1,73 ke:n DNA-fragmentti.

Nämä DNA-frgmentit sekventoitiin Sangerin menetelmällä [Sanger, F., Science 214 (1981) 1 205 - 1 210] käyt-15 täen M13-faagivektoria. 1,97 ke: n DNA-fragment in (pNHJIOH) ja 1,73 ke:n DNA-fragmentin (pNHJ20L) nukleotidisekvens-sit esitetään kuvioissa 4 ja 5, vastaavasti.

Nukleotidisekvenssistä päätelty aminohapposekvenssi havaittiin täysin identtiseksi kohdassa (1) määritetyn 20 aminohapposekvenssin kanssa. Sekvenssianalyysi osoitti myös sen, että DNA-fragmentti sisälsi a- ja β-alayksikköjä koodaavat sekvenssit.

(8) Nitriilihydrataasin tuottaminen transformanttia V * käyttäen ja nitriilien muuttaminen amideiksi nitriilihyd- : .* 25 rataasia käyttäen ·;·: TG-l/pNHJ10H ja TG-l/pNHJ20L siirrostettiin .*♦*; 10 ml:aan 2xYT-väliainetta, joka sisälsi 50 /ug/ml ampi- silliinia, ja viljelmää inkuboitiin 30 eC:ssa yli yön (12 tuntia). 1 ml saatua viljelmää lisättiin 1 00 ml:aan • · · 30 2xYT-väliainetta (50 /ug/ml ampisilliinia, 0,1 g/1 * · · *. CoCl2.6H20: ta). Seosta inkuboitiin 30 °C:ssa neljä tuntia.

ί...: Seokeen lisättiin IPTG:tä 1 mmol/l:n loppupitoisuudeksi.

Seosta inkuboitiin 30 °C:ssa kymmenen tuntia. Solujen talteenoton jälkeen solut suspendoitiin 5 ml:aan 0,1 mol/1 35 fosfaattipuskuria (pH 7,6). Suspensiot rikottiin sonikoi- 19 102539 maila viisi minuuttia ja seosta sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 12 000 x g 30 minuuttia. Saatuja supernatantteja käytettiin entsyymimäärityksessä.

Entsyymimääritys suoritettiin reaktioseoksessa 5 (12 ml), joka sisälsi 50 mmol/1 kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,6), 6 mmol/1 bentsonitriiliä ja sopivan määrän entsyymiä. Reaktio suoritettiin 20 eC:ssa 30 minuutin ajan ja pysäytettiin lisäämällä 0,2 ml 1 mol/1 HCl:a. Muodostuneen bentsamidin määrä reaktioseoksessa määritettiin HPLC:llä. 10 Kontrollina käytettiin seosta, joka oli saatu edellä kuvatulla menetelmällä, mutta jossa käytettiin E. coli TG-1 -bakteeria. Nitriilihydrataasiaktiivisuuspitoisuudet soluja sisältämättömissä E. coli -uutteissa, jotka sisälsivät pNHJ10H:ta ja pNHJ20L:ää, olivat 1,75 x 10'3 ja vastaavasti 15 6,99 x 10*3 yksikköä/mg, viljeltynä 2xYT-väliaineessa

CoCl2:n ja IPTGrn läsnäollessa. Bentsamidia esiintyi TG-l/pNHJ10H:n ja TG-l/pNHJ20L:n reaktioseoksissa, mutta sitä ei esiintynyt TG-1:n reaktioseoksesta.

• » • · · • · · • · · • · • · · • · · • ♦ • · · • · · « · · • · · • · • · <·« · » * · • · t «

Claims (9)

20 102539

1. Eristetty DNA(H1-fragmentti, tunnettu siitä, että se koodaa polypeptidiä, jolla on nitriilihyd-5 rataasiaktiivisuutta ja joka käsittää a(H)- ja β(Η|-alayksiköt, joilla on seuraavat aminohapposekvenssit: a<H) - alayksikkö: S 10 IS MetSerGIuHisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr

10 Z 0 *5 30 LysAlalleGluThrLeuLeuTyrGluArgGlyLeulleThrPro

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA(H)- fragmentti, tunnettu siitä, että se sisältää a(H) -ja β(Η)-alayksikköjen nukleotidisekvenssit: a<H>-alayksikön DNA-sekvenssi: : 25 GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC • · · :X: AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC g cc gcggtccacccagtcgtttcgtacta cg agaacgagatcgcc CCGATGGGCGGTGCCA AGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT • 30 GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG ;!:* TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC '·'* ZOS 300 3 I S TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT ·:· : 35 TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC o 102539 A AGAGCATGGACT ACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG GTCACGGTTTGGGACAGC AG CTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC 5 CCGGA ACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTA 10 ja β(Η)-alayksikön DNA-sekvenssi: ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCG GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG 15 GGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA tcgtggtgggacaagtcgcggttcttccgggagtcgatggggaac gaaaactacgtcaacgagattcgcaactcgtactacacccactgg 20 ctgagtgcggcagaacgtatcctcgtcgccgacaagatcatcacc gaagaagagcgaaagcaccgtgtgcaagagatccttgagggtcgg tacacggacaggaagccgtcgcggaagttcgatccggcccagatc : GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT

25 CCACGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG • · · AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG • · *··« 510 5 Z S S « O ·:·.· CGGAACAACATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC ··· 5 5 S 570 SOS V : 30 TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC • · · GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCCTCGATCTCTGGGAACCGTAC : ·; CTGATCTCTGCG .35 « 102539

3 S <0 4 S AspLysGlybeuIleSerThrAspAlalleAspHisHetSerSer SO SS 00 ValTyrGluAsnGluValGlyProGlnleuGlyAlaLyslIeVal OS 10 7 s AlaArgAIaTrpYalAspProGluPheLysGliiArgleuleuThr •0 IS «' AspAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyValGlyGlyMetGln 15 13 7S 100 I0S GlyGluGluHetValValLeuG i uAsnThrGlyThrValH tsAsn 110. i s 1X0 MetValValCysThrleuCysSerCysTyrProTrpProValLeu I X S <30 I 3 S GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg on 140 I4S ISO AlaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThr I S S 16 0 I 6 S ProAspProAspValGluIleArglleTrpAspSerSerAIaGlu

17. I 7 S I0O LeuArgTyrTrpValleuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn I I S I o o I o s

25 PheThrGIuGIuGInLeuAIaAspLeuValThrArgAspSerLeu ' zoo x o s I leGlyValSerValProThrThrProSerLysAla • · · ***. S(L)-alayksikkö: i · · · · :T: 3Q MetAspGlylleHisAspleuGlyGIyArgAlaGlyLeuGlyPro * · X S 3 0 MeLysProGluSerAspGluProValPhellisSerAspTrpGlu • ♦ !·· J S 40 45 ArgSerValLeuThrHetPheProAlaHetAlaleuAlaGlyAla SO SS 60 PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnlleProPro 35 6 5 7 0 7 s HisAspTyrleuThrSerGlnTyrTyrGlullisTrpHetHisAla 102539 SO 8 S 8 0 fie LI leHisHisGlyl leGluAlaGlyl lePheAspSerAspGlu is loo I o s LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrHetAspllisProAspAspThr

110. IIS lit ThrProThrArgGlnAspPr'oGlnLeuValGluThrlleSerGln

5. Z S 13 0 I 3 S LeuIleThrHisGIyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu AlaAlaPheAlaValGlyAspLysValileValArgSerAspAla I 5 S ISO I 6 S SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg 10 ValGIyGiuValVa!A IaThrHisG1yA1aTyrVa1PheProAsp IBS 180 1 8 S ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr ZOO ZOS ZIO ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAIaPro *15 Zto 2t)

15 AsnValValAsnHisIIeAspValPheGluProTyrLeuLeuPro A I a

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen eristetty DNA(L)-20 fragmentti, tunnettu siitä, että se sisältää a(L)-ja 6(L)-alayksikköjen nukleotidisekvenssit: a<L) -alayksikön DNA-sekvenssi : ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC 25 gaggagatccccgcacgcgtgaaggccatggaggccatcctcgtc gacaagggcctgatctccaccgacgccatcgaccacatgtcctcg ·:··; gtctacgagaacgaggtcggtcctcaactcggcgccaagatcgtc 30 gcccgcgcctgggtcgatcccgagttcaagcagcgcctgctcacc GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCCGCGGCATGCAG » · GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC 35 ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCPC 102539 GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC CCCGACCCTGACGTCGAGATCCCGATATGGGACTCGAGTGCCGAA CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAG A AC

5 SSS $70 ses TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC 10 ja S(L)-alayksikön DNA-sekvenssi: IS JO «i ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG to is 70 ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG CACGACTACCTGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG 20 atgatccaccacggcatcgaggcgg'gcatcttcgattccgacgaa CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG ACCCCCACCCGGCAGGA TC CGCAACTCGTCGAGACGATCTCGCAA 375 370 tOS

25 CTG ATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC • · 1.. 400 40S :...·· TCACCG A ACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC • · • · * 30 SSS S 7 0 SOS ACCAACGCACTCCCCGCCGGCCAAAGCCCCGAACACCTGTACACC GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCG 35 GCC 102539

5. Yhdistelmä-DNA, tunnettu siitä, että se käsittää jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukaisen DNA(H) :n tai DNA(L) :n vektorissa.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukaisella yhdistelmä-5 DNA:11a transformoitu bakteeritransformantti.

7. Menetelmä nitriilihydrataasin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 6 mukaista transformanttia ja otetaan nitriilihydra-taasi talteen viljelmästä.

8. Menetelmä amidien tuottamiseksi, tunnettu siitä, että hydratoidaan nitriilit käyttäen nitriilihydra-taasia, joka on saatu patenttivaatimuksen 6 mukaisen transformantin viljelmästä.

9. Menetelmä amidien tuottamiseksi, tunnettu 15 siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 6 mukaista transformanttia ja hydratoidaan nitriilit amideiksi käyttäen saatua viljelmää, eristettyjä bakteerisoluja, niistä käsittelemällä saatua materiaalia tai niihin kiinnittynyttä materiaalia. • · • · · • · · • · • · • · · « · i·· i · · · · • · ··· • · • · 1 4 · ·

3. Eristetty DNA<L)-fragmentti, tunnettu siitä, että se koodaa polypeptidiä, jolla on nitriilihyd-rataasiaktiivisuutta ja joka käsittää a<LI - ja S,L)-alayksiköt, joilla on seuraavat aminohapposekvenssit: 5 a(L>-alayksikkö: S io is MetThrAIallisAsnProValGInG i yThrleuProArgSerAsn

10 IS 30 GluGlulleAlaAlaArgValLysAlaNetGluAIalleleuVal

3 S «0 4 S AlaA laVa1AspArgVaIVa1SerTyrTyrG1uAsnG1u11eG1y SO SS 60 ProttetGlyGlyAlaLysValValAlalysSerTrpValAspPro

6 S 7 0 7 5

15 GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMelAla SerleuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnlleSerAlaVal OS 10 0 I o s PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCys

110. I S 12 0 SerCysTyrProTrpProValLeuGlyLeuProProAi aTrpTyr 20 ΙΠ 130 I 3 s LysSerfletGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGly I 4 O I 4 S ISO ValLeuLysArgAspPheGlyPheAsplleProAspGluValGlu ValArgValTrpAspSerSerSerGlulleArgTyrIleVallle J 17 0 I 7 S 10 0

25 ProGluArgProAlaGlyT-hrAspGlyTrpSerGIuGluGluLeu * · i a s no i o s ThrLysLeuValSerArgAspSerMetlleGlyValSerAsnAla LeuThrProGlnGluVal1leVal • · • · e • e · « ·

30 S{H)-alayksikkö: .··*. S 10 IS *···) MetAspGlyllellisAspThrGlyGlyMetThrGIyTyrGlyPro * Z 0 Z S 3 0 ValProTyrGlnLysAspGIuProPhePheHisTyrGluTrpGlu . 3 S 4 0 4 S

35 GlyArgThrLeuSerlleleuThrTrpHetHisLeuLysGlyI le 102539 SO SS 00 SerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgGluSerHetGlyAsn OS 7 0 7 s GluAsdTyrValAsnGluileArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp • o s s 0 0 LeuSerAlaAlaGluArgIleLeuValAlaAspLyslielleThr 5 os too I o s GluGluGluArgLysHisArgValGlnGluIleleuGluGlyArg

110 IIS ISO TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAIaGInlle IIS 13 0 I 3 S GluLysAlalleGluArgleuHisGluProHisSerleuAlaLeu 14. t 4 s ISO

10 ProG1yAIaG1uProSerPheSerLeuG1yAspLys 1 lelysVal 1 5 5 1 0 0 I 0 S LysSerttetAsnProLeuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal

17. I 7 S 10 0 ArgAsnLyslleGlyGluIIeValAlaTyrHisGlyCysGlnlle I 0 S 10 0 I 0 s TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro 15 ZOO ZOS z I 0 LeuTyrTbrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp ZIS ZZO Its GlyAsnGlyLysAspValValCysVaiAspLeuTrpGluProTyr Leu 1 1 eSerA1 a

4. I 4 · · • · 4 4 4 102539