JP3828590B2 - ニトリルヒドラターゼ遺伝子発現のための調節遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はロドコッカス属細菌に由来し、ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの活性化能を有するポリペプチドをコードする調節遺伝子DNA、このDNAを含む組換え体DNAおよび該組換え体DNAにより形質転換された形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ニトリル類を水和してアミド類を生成させる酵素であるニトリルヒドラターゼを用いたアミド類の製造方法は、常温常圧での反応であること、高い転化率等から、工業的にも優れた方法として用いられてきている。特に、ロドコッカス属細菌は著量の酵素を菌体内に蓄積することが知られており、高い触媒活性を有している（特公昭4-4873号、特開昭62-91189号、特開平2-470号および特開平2-84198号各公報参照）。
【０００３】
遺伝子組換えの方法でクローン化されたニトリルヒドラターゼ遺伝子によるニトリルの水和では、菌体内に同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生物の触媒能力を従来の方法に比して飛躍的に増大させることが期待できる。また、部位特異的変異、ランダム変異等の方法により、遺伝子組換え技術を用いた酵素の改良も容易となる。ロドコッカス属由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子はN774株（特開平2-119778号）又はJ1株（特開平4-211379号）から得られている。このN774株のニトリルヒドラターゼ遺伝子をロドコッカス属-大腸菌複合プラスミドベクター（特開平5-64589号）に組込み、ロドコッカス属細菌に導入した場合には高い活性が得られている（特開平5-68566号）。一方、N774株のニトリルヒドラターゼに比して極めて高い性能を有するロドコッカス ロドクロウスJ1株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子をロドコッカス属細菌に導入して発現させたものはこれまで報告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
発明者らは、J1株由来の遺伝子を導入した場合に発現が認められないのは、ニトリルヒドラターゼ遺伝子のプロモーターが機能しておらず、プロモーターが機能するために必要な調節遺伝子がこれまでに取得されているDNA領域には含まれていないためであろうと考えた。そこで、J1株染色体DNA上のどこかに存在するはずである調節遺伝子について探索した結果、ニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の上流にその存在を見いだし、これを用いてロドコッカス属細菌組換え体においてJ1株ニトリルヒドラターゼ活性を高発現させ、本発明を完成するに至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明はロドコッカス属細菌に由来し、ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの活性化能を有するポリペプチドをコードする調節遺伝子DNA、このDNAを含む組換え体DNAおよび該組換え体DNAにより形質転換された形質転換体に関する。
【０００６】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明は、下記の工程により実施されるものである。
(1) 染色体DNAの調製：
ロドコッカス ロドクロウスJ1株より染色体DNAを分離、調製する。
【０００７】
(2) DNAライブラリーの作製：
J1株ニトリルヒドラターゼ遺伝子を有するプラスミドより、J1株由来の遺伝子部分を切り出しこれを放射線同位元素でラベルしプローブとする。
染色体DNAを制限酵素で切断後、サザーンハイブリダイゼーション法（Southern E. M. , J. Mol. Biol. 98 503 (1975)）により目的遺伝子を含有するDNA断片画分を上記プロープを用いて検出しする。この画分をプラスミドベクターpUC19に挿入しライブラリーとする。
【０００８】
(3) 形質転換体の作製および組換え体DNAの選別：
工程(2)で作製された組換え体DNAのライブラリーによる形質転換体を作製し、その中から工程(2)で作製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法（R. Bruce Wallace. et al. Nuc. Acids Res. 9 879 (1981)）により目的の組換え体DNAを含む形質転換体を選別する。更にサザーンハイブリダイゼーション法により目的の組換え体DNAの再確認を行う。
【０００９】
(4) 組換え体プラスミドの精製と制限酵素地図の作製：
工程(3)で得られた組換え体よりプラスミドを精製する。こうして得られたプラスミドをpNHU10と称する。これを種々の制限酵素を用いて切断したものについて電気泳動で分析し、制限酵素地図を作成する。
【００１０】
(5) 調節遺伝子およびニトリルヒドラターゼ 遺伝子を含む領域およびロドコッカス属において複製可能なベクタープラスミドからなる組換え体プラスミドの作製：
工程(4)で得られたプラスミド、J1株ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドpNHJ10Hおよび複合プラスミドベクターpK4より、調節遺伝子およびニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む領域およびロドコッカス属において複製可能なベクタープラスミドからなる組換え体プラスミドpHK18およびpHK19を作製する。
【００１１】
(6) ロドコッカス属細菌の形質転換および形質転換体を用いたニトリルヒドラターゼの生産：
工程(5)で得られたプラスミドによりロドコッカス属細菌を形質転換し、J1株由来のニトリルヒドラターゼが発現していることを確認する。
【００１２】
(7) 欠失プラスミドとニトリルヒドラターゼ活性：
工程(5)で得られたプラスミドから種々の領域を除いたプラスミドを作製し、どの領域がニトリルヒドラターゼの発現に必須であるかを調べる。ニトリルヒドラターゼ構造遺伝子領域以外の部分で発現のために必要な領域を特定する。
【００１３】
(8) 塩基配列の決定：
工程(7)で特定された領域について塩基配列を決定する。
【００１４】
なお、ロドコッカス ロドクロウスJ1株は FERM BP-1478 として生命工学工業技術研究所に寄託されている。また、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドpNHJ10Hはこれを含有する形質転換体TG1/pNHJ10H（FERM BP-2777）として、複合プラスミドベクターpK4はこれを含有する形質転換体ロドコッカス ロドクロウスATCC12674/pK4（FERM BP-3731）として、プラスミドpNHU10はこれを含有する形質転換体JM109/pNHU10（FERM P-14568) として寄託されている。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の調節遺伝子を、プロモーター領域を含むニトリルヒドラターゼ遺伝子と同一ロドコッカス属菌体内に共存させることにより、該ニトリルヒドラターゼの大量生産を可能にせしめる。また、そのプロモーター下に異種遺伝子を導入することにより、異種タンパク質の高発現が可能となる。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
なお、実施例において下記の略語を用いた。
TE溶液: 10 mM Tris-HCl (pH7.8)-1 mM EDTA (pH8.0)
TNE溶液: 50 mM Tris-HCl (pH8.0)-1 mM EDTA (pH8.0)-50 mM NaCl
STE溶液: 50 mM Tris-HCl (pH8.0)-1 mM EDTA (pH8.0)-35 mMシュークロース
2xYT培地: 1.6 % トリプトン、1 % 酵母エキス、0.5% NaCl
MY培地: 1%ポリペプトン、0.3%酵母エキス、0.3%麦芽エキス、1%グルコース
【００１７】
１）染色体DNAの調製
ロドコッカス ロドクロウス J1株(FERM BP-1478)を100mlの培地（グルコース、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4・7H2O、酵母エキス、ペプトン、CoCl2、尿素、水1L、pH7.2）で２８℃、２日間培養後、集菌した。得られた菌体をTEN溶液で洗浄後、10mlのTE溶液に懸濁し、0.25M EDTA4ml、リゾチーム10〜20 mg、アクロモプロテアーゼ10〜20 mgおよび10%SDS 10 mlを加え、37℃で3時間放置後、遠心分離器にかけて上清を得た。この上清２０mlに2.5M酢酸ナトリウム溶液0.7 ml、ジエチルエーテルを加え遠心分離器にかけて、上層を捨て下層に2倍溶のエタノールを加えガラス棒でDNAを巻き取った。これをTE溶液：エタノール（容積比）2:1、1:9、0:10の各溶液に5分間ずつ浸した後、2〜4 mlのTE溶液に溶かし、リボヌクレアーゼ A とリボヌクレアーゼT1の混合物10μl を加え37℃で処理した。次に、TE溶液で飽和されたフェノールを等量加え、遠心分離後の上層に等量以上のエーテルを加え、下層を得た。これをクロロホルムを少量添加した2LのTE溶液で一晩透析し、2回目の透析を3〜4時間行い、染色体DNA標品4mlを得た。
【００１８】
２）DNAライブラリーの作製
J1株H型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む6.0kbDNA断片がpUC19ベクターに組み込まれたプラスミドpNHJ10H（特開平4-211379、Biochim. Biophys. Acta 1129, 23-33 (1991)）を制限酵素SacIとEcoRIで切断後、0.37kbのSacI-EcoRI断片を1%アガロースゲル電気泳動により分離し、ゲルより切り出し回収した。制限酵素による切断は以下のように行った。pNHJ10H 10μl に対し、制限酵素用緩衝液（10倍濃度）3 μl 、制限酵素SacIおよびEcoRIをそれぞれ2 μl、滅菌水 13μl を加え37℃にて2時間反応させた。
【００１９】
J1株染色体DNAをEcoRIおよびEcoRVにより切断した標品についてアガロースゲル電気泳動を行った。0.37kb SacI-EcoRI断片を放射性同位元素32Pでラベルし、これをプローブとしてサザーンハイブリダイゼーション法により上流域を含む約4.3 kbのDNA断片を検出した。プローブによりハイブリダイズした4.3kb断片を含むDNA断片画分をアガロースゲルより切り出し、SmaIおよびEcoRIで切断したプラスミドベクターpUC19に挿入した。
【００２０】
pUC19の切断は以下のように行った。pUC19 10μl に対し、制限酵素用緩衝液（10倍濃度）3 μl 、制限酵素SmaIおよびEcoRIをそれぞれ 2 μl、滅菌水 13 μl を加え30℃にて2時間反応させた。反応液に等量のTE溶液飽和フェノールを加え撹拌後遠心分離し上層（水層）と下層に分離させた。上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルムを加え同様の抽出操作を2回繰り返した。上層に3 μlの3M酢酸ナトリウムと90μl のエタノールを加え、-80℃にて30分間放置後遠心し、乾燥してTE溶液に溶解した。
【００２１】
4.3kb断片を含むDNA断片画分3 μlを、上記のようにして調製したSmaI,EcoRI切断pUC19 μlとTAKARAライゲーションキットを用いて4℃で一晩反応させることによりpUC19への挿入を行い、DNAライブラリーとした。
【００２２】
３）形質転換体の作製および組換え体DNAの選別
大腸菌JM109株( 宝酒造（株）より入手) を2xYT培地10mlに37℃で12時間培養後、新規な同培地に1%植菌し2時間培養した。遠心分離により集菌した後、冷50 mM CaCl2溶液を 5ml加え、0℃で40分間放置後、再度遠心分離し、冷50 mM CaCl2溶液0.25 mlに懸濁した。これに工程（２）で作製した組換え体プラスミドを含有する溶液（DNAライブラリー）を60μlを加え、0℃で40分間放置後、42℃で2分間ヒートショックを与え、2xYT培地1 mlを加え37℃にて60分間振盪培養した。これを100 μl ずつアンピシリン50μg/ml含有2xYT寒天培地にまき、37℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニーについてコロニーハイブリダイゼーションを行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子上流域を含む形質転換体を選別した。すなわち、寒天培地上に生育させたコロニーにをニトロセルロースフィルター上に移し、菌体を溶かしてDNAを固定した後、これを工程（２）で作製したプローブ（0.37kb断片）で処理し、オートラジオグラフ法で目的の組換え体DNAを含むコロニーを選択した。更に、この選択したコロニーから組換え体プラスミドを抽出し、サザンハイブリダイゼーション法によって上述のプローブとハイブリダイズさせ、選抜したコロニーが目的遺伝子を含む形質転換体であることを再確認した。
【００２３】
４）組換え体プラスミドの精製と制限酵素地図の作製
工程（３）で選択した形質転換体を100 mlの2xYT培地にて37℃一晩培養し、集菌後、TNE溶液により洗浄し、STE溶液を8 ml、リゾチームを10 mg加え、0℃で5分間放置した。0.25 M EDTA 4 ml加え、さらに室温で10 % SDS 2 ml, 5 M NaCl 5 mlを加え、0〜4℃で3時間放置した。これを超遠心し、その上澄みに30 % PEG6000を1/2当量加え、0〜4℃で一晩放置し、遠心後TNEに溶解して7.5 mlとした。CsClを加えた後遠心により除タンパクを行い、臭化エチジウム溶液を300〜500 mg/ml加えシールチューブに移し、熱シールし超遠心を行った。cccDNAを回収し、水飽和イソプロピルアルコールを当量以上加えて臭化エチジウムを除き、TEで透析し精製した組換え体プラスミド約3 mlを得た。これをpNHU10と命名した。この組換え体プラスミドを数種の制限酵素を用いて切断し、図１中に示される制限酵素地図を作製した。
【００２４】
５）調節遺伝子およびニトリルヒドラターゼ 遺伝子を含む領域およびロドコッカス属において複製可能なベクタープラスミドからなる組換え体プラスミドの作製
工程（４）で得られたプラスミドpNHU10は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むpNHJ10Hに含まれるJ1株由来のDNA断片と0.37 kbオーバーラップし、更に3.9 kb上流までを含んでいる。pNHU10より1.4 kb FspI-EcoRI断片および0.9 kb ScaI-EcoRI断片を切り出し、これらをそれぞれ大腸菌-ロドコッカス属細菌用複合プラスミドベクターpK4に挿入し、プラスミドpHJK16およびpHJK17を作製した。これらのプラスミドにpNHJ10H由来の5.9 kb EcoRI断片を挿入し、それぞれpHJK18およびpHJK19を作製した。これらの作製過程は図１および図２に示した。なお、図１のpHJK18において、太い矢印は本発明において見いだされた調節遺伝子の位置と方向を示し、細い矢印はニトリルヒドラターゼ遺伝子の二つのサブユニット遺伝子の位置と方向を示す。また、図２のpHJK19において、太い矢印は本発明において見いだされた調節遺伝子の位置と方向を示し、細い矢印はニトリルヒドラターゼ遺伝子の二つのサブユニット遺伝子の位置と方向を示す。
【００２５】
６）ロドコッカス属細菌の形質転換および形質転換体を用いたニトリルヒドラターゼの生産
ロドコッカス・ロドクロウスATCC12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、15%PEG6000（ポリエチレングリコール6000）溶液に懸濁した（菌体濃度109 cell / ml以上）。工程（５）のプラスミドpHK18DNA またはpHK19 DNA 1 μgと菌体懸濁液100 μlを混合し、氷冷した。ジーンパルサー用のチャンバーにDNAと菌体の混合液を入れ、氷冷した後、静電容量25μF,抵抗 400オーム、電場強度20 kV/cmで電気パルス処理を行った。
【００２６】
電気パルス処理液を氷冷下１０分間静置し、３７℃、５分間熱処理後、ＭＹ培地 1mlを加え、２５℃、３時間振とうした。50μg/mlカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布し28℃、2日間培養した。出現したコロニーが明らかにカナマイシン耐性であることを別に作成したカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布することにより確認した。
【００２７】
こうして作製したロドコッカス・ロドクロウスの組換え体、ロドコッカス・ロドクロウスATCC12674/pHJK18 又はロドコッカス・ロドクロウスATCC12674/pHJK19を培地（グリセロール 10 g、ポリペプトン 5 g、酵母エキス 3 g、麦芽エキス 3 g、KH2PO4 1 g、K2HPO4 1 g、CoCl2・6H2O 0.01 g、尿素 0.75 gまたは3.75 g (pH7.0) / L）にて28℃2日間培養し、ニトリルヒドラターゼの活性測定を行った。培養液より遠心分離により集菌し、150 mM NaClで洗浄後、0.35 % n-酪酸を含む0.1 M HEPES-KOH(pH7.2)に菌体を懸濁した。超音波処理により細胞を破砕し、遠心分離により細胞膜を除き細胞抽出液を得、ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。活性測定は以下のように行った。適当に水で希釈した細胞抽出液0.5 mlに100 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を0.5 ml、200 mMのアクリロニトリルを1 ml加え20℃にて10分間反応後、1N HClを0.2 ml加えることにより反応を停止させた。生成するアクリルアミドの定量をHPLCにより行った。
【００２８】
ロドコッカス・ロドクロウスATCC12674/pHJK18およびロドコッカス・ロドクロウスATCC12674/pHJK19の細胞抽出液について以下の表１の値が得られた。なお、表中、尿素はニトリルヒドラターゼ酵素の誘導剤である。
【００２９】
【表１】
【００３０】
７）欠失プラスミドとニトリルヒドラターゼ活性
pHJK18およびpHJK19には、ニトリルヒドラターゼ発現に必要のない領域がまだ多く残っていると考えられたため、欠失プラスミドを作製しニトリルヒドラターゼ活性を調べたところ、活性発現に必須な調節遺伝子領域はScaIからAccIIIの約1.9 kbの間にあることが明らかとなった。
【００３１】
８）塩基配列の決定
工程（7）で特定された領域についてDNA塩基配列を決定したところ、配列番号1に示されるアミノ酸配列を持つ、唯一の長いオープンリーディングフレームが見いだされた。塩基配列の決定はTth DNA polymeraseを用いたチェーンターミネーション法（Sanger F. Science 214, 1205-1210 (1980)）により行った。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列番号2に示した。
【００３２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３６１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）
株名：J1
配列：
【００３３】
配列番号：２
配列の長さ：１０８６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）
株名：J1
配列：
【００３４】
【図面の簡単な説明】
【図１】組換え体プラスミドpHJK18の作製工程を示す図。
【図２】組換え体プラスミドpHJK19の作製工程を示す図。
【産業上の利用分野】
本発明はロドコッカス属細菌に由来し、ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの活性化能を有するポリペプチドをコードする調節遺伝子DNA、このDNAを含む組換え体DNAおよび該組換え体DNAにより形質転換された形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ニトリル類を水和してアミド類を生成させる酵素であるニトリルヒドラターゼを用いたアミド類の製造方法は、常温常圧での反応であること、高い転化率等から、工業的にも優れた方法として用いられてきている。特に、ロドコッカス属細菌は著量の酵素を菌体内に蓄積することが知られており、高い触媒活性を有している（特公昭4-4873号、特開昭62-91189号、特開平2-470号および特開平2-84198号各公報参照）。
【０００３】
遺伝子組換えの方法でクローン化されたニトリルヒドラターゼ遺伝子によるニトリルの水和では、菌体内に同遺伝子を多コピー存在させることができるため、微生物の触媒能力を従来の方法に比して飛躍的に増大させることが期待できる。また、部位特異的変異、ランダム変異等の方法により、遺伝子組換え技術を用いた酵素の改良も容易となる。ロドコッカス属由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子はN774株（特開平2-119778号）又はJ1株（特開平4-211379号）から得られている。このN774株のニトリルヒドラターゼ遺伝子をロドコッカス属-大腸菌複合プラスミドベクター（特開平5-64589号）に組込み、ロドコッカス属細菌に導入した場合には高い活性が得られている（特開平5-68566号）。一方、N774株のニトリルヒドラターゼに比して極めて高い性能を有するロドコッカス ロドクロウスJ1株由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子をロドコッカス属細菌に導入して発現させたものはこれまで報告されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
発明者らは、J1株由来の遺伝子を導入した場合に発現が認められないのは、ニトリルヒドラターゼ遺伝子のプロモーターが機能しておらず、プロモーターが機能するために必要な調節遺伝子がこれまでに取得されているDNA領域には含まれていないためであろうと考えた。そこで、J1株染色体DNA上のどこかに存在するはずである調節遺伝子について探索した結果、ニトリルヒドラターゼ構造遺伝子の上流にその存在を見いだし、これを用いてロドコッカス属細菌組換え体においてJ1株ニトリルヒドラターゼ活性を高発現させ、本発明を完成するに至った。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明はロドコッカス属細菌に由来し、ニトリルヒドラターゼ遺伝子プロモーターの活性化能を有するポリペプチドをコードする調節遺伝子DNA、このDNAを含む組換え体DNAおよび該組換え体DNAにより形質転換された形質転換体に関する。
【０００６】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明は、下記の工程により実施されるものである。
(1) 染色体DNAの調製：
ロドコッカス ロドクロウスJ1株より染色体DNAを分離、調製する。
【０００７】
(2) DNAライブラリーの作製：
J1株ニトリルヒドラターゼ遺伝子を有するプラスミドより、J1株由来の遺伝子部分を切り出しこれを放射線同位元素でラベルしプローブとする。
染色体DNAを制限酵素で切断後、サザーンハイブリダイゼーション法（Southern E. M. , J. Mol. Biol. 98 503 (1975)）により目的遺伝子を含有するDNA断片画分を上記プロープを用いて検出しする。この画分をプラスミドベクターpUC19に挿入しライブラリーとする。
【０００８】
(3) 形質転換体の作製および組換え体DNAの選別：
工程(2)で作製された組換え体DNAのライブラリーによる形質転換体を作製し、その中から工程(2)で作製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法（R. Bruce Wallace. et al. Nuc. Acids Res. 9 879 (1981)）により目的の組換え体DNAを含む形質転換体を選別する。更にサザーンハイブリダイゼーション法により目的の組換え体DNAの再確認を行う。
【０００９】
(4) 組換え体プラスミドの精製と制限酵素地図の作製：
工程(3)で得られた組換え体よりプラスミドを精製する。こうして得られたプラスミドをpNHU10と称する。これを種々の制限酵素を用いて切断したものについて電気泳動で分析し、制限酵素地図を作成する。
【００１０】
(5) 調節遺伝子およびニトリルヒドラターゼ 遺伝子を含む領域およびロドコッカス属において複製可能なベクタープラスミドからなる組換え体プラスミドの作製：
工程(4)で得られたプラスミド、J1株ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドpNHJ10Hおよび複合プラスミドベクターpK4より、調節遺伝子およびニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む領域およびロドコッカス属において複製可能なベクタープラスミドからなる組換え体プラスミドpHK18およびpHK19を作製する。
【００１１】
(6) ロドコッカス属細菌の形質転換および形質転換体を用いたニトリルヒドラターゼの生産：
工程(5)で得られたプラスミドによりロドコッカス属細菌を形質転換し、J1株由来のニトリルヒドラターゼが発現していることを確認する。
【００１２】
(7) 欠失プラスミドとニトリルヒドラターゼ活性：
工程(5)で得られたプラスミドから種々の領域を除いたプラスミドを作製し、どの領域がニトリルヒドラターゼの発現に必須であるかを調べる。ニトリルヒドラターゼ構造遺伝子領域以外の部分で発現のために必要な領域を特定する。
【００１３】
(8) 塩基配列の決定：
工程(7)で特定された領域について塩基配列を決定する。
【００１４】
なお、ロドコッカス ロドクロウスJ1株は FERM BP-1478 として生命工学工業技術研究所に寄託されている。また、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドpNHJ10Hはこれを含有する形質転換体TG1/pNHJ10H（FERM BP-2777）として、複合プラスミドベクターpK4はこれを含有する形質転換体ロドコッカス ロドクロウスATCC12674/pK4（FERM BP-3731）として、プラスミドpNHU10はこれを含有する形質転換体JM109/pNHU10（FERM P-14568) として寄託されている。
【００１５】
【発明の効果】
本発明の調節遺伝子を、プロモーター領域を含むニトリルヒドラターゼ遺伝子と同一ロドコッカス属菌体内に共存させることにより、該ニトリルヒドラターゼの大量生産を可能にせしめる。また、そのプロモーター下に異種遺伝子を導入することにより、異種タンパク質の高発現が可能となる。
【００１６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が限定されるものではない。
なお、実施例において下記の略語を用いた。
TE溶液: 10 mM Tris-HCl (pH7.8)-1 mM EDTA (pH8.0)
TNE溶液: 50 mM Tris-HCl (pH8.0)-1 mM EDTA (pH8.0)-50 mM NaCl
STE溶液: 50 mM Tris-HCl (pH8.0)-1 mM EDTA (pH8.0)-35 mMシュークロース
2xYT培地: 1.6 % トリプトン、1 % 酵母エキス、0.5% NaCl
MY培地: 1%ポリペプトン、0.3%酵母エキス、0.3%麦芽エキス、1%グルコース
【００１７】
１）染色体DNAの調製
ロドコッカス ロドクロウス J1株(FERM BP-1478)を100mlの培地（グルコース、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4・7H2O、酵母エキス、ペプトン、CoCl2、尿素、水1L、pH7.2）で２８℃、２日間培養後、集菌した。得られた菌体をTEN溶液で洗浄後、10mlのTE溶液に懸濁し、0.25M EDTA4ml、リゾチーム10〜20 mg、アクロモプロテアーゼ10〜20 mgおよび10%SDS 10 mlを加え、37℃で3時間放置後、遠心分離器にかけて上清を得た。この上清２０mlに2.5M酢酸ナトリウム溶液0.7 ml、ジエチルエーテルを加え遠心分離器にかけて、上層を捨て下層に2倍溶のエタノールを加えガラス棒でDNAを巻き取った。これをTE溶液：エタノール（容積比）2:1、1:9、0:10の各溶液に5分間ずつ浸した後、2〜4 mlのTE溶液に溶かし、リボヌクレアーゼ A とリボヌクレアーゼT1の混合物10μl を加え37℃で処理した。次に、TE溶液で飽和されたフェノールを等量加え、遠心分離後の上層に等量以上のエーテルを加え、下層を得た。これをクロロホルムを少量添加した2LのTE溶液で一晩透析し、2回目の透析を3〜4時間行い、染色体DNA標品4mlを得た。
【００１８】
２）DNAライブラリーの作製
J1株H型ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む6.0kbDNA断片がpUC19ベクターに組み込まれたプラスミドpNHJ10H（特開平4-211379、Biochim. Biophys. Acta 1129, 23-33 (1991)）を制限酵素SacIとEcoRIで切断後、0.37kbのSacI-EcoRI断片を1%アガロースゲル電気泳動により分離し、ゲルより切り出し回収した。制限酵素による切断は以下のように行った。pNHJ10H 10μl に対し、制限酵素用緩衝液（10倍濃度）3 μl 、制限酵素SacIおよびEcoRIをそれぞれ2 μl、滅菌水 13μl を加え37℃にて2時間反応させた。
【００１９】
J1株染色体DNAをEcoRIおよびEcoRVにより切断した標品についてアガロースゲル電気泳動を行った。0.37kb SacI-EcoRI断片を放射性同位元素32Pでラベルし、これをプローブとしてサザーンハイブリダイゼーション法により上流域を含む約4.3 kbのDNA断片を検出した。プローブによりハイブリダイズした4.3kb断片を含むDNA断片画分をアガロースゲルより切り出し、SmaIおよびEcoRIで切断したプラスミドベクターpUC19に挿入した。
【００２０】
pUC19の切断は以下のように行った。pUC19 10μl に対し、制限酵素用緩衝液（10倍濃度）3 μl 、制限酵素SmaIおよびEcoRIをそれぞれ 2 μl、滅菌水 13 μl を加え30℃にて2時間反応させた。反応液に等量のTE溶液飽和フェノールを加え撹拌後遠心分離し上層（水層）と下層に分離させた。上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルムを加え同様の抽出操作を2回繰り返した。上層に3 μlの3M酢酸ナトリウムと90μl のエタノールを加え、-80℃にて30分間放置後遠心し、乾燥してTE溶液に溶解した。
【００２１】
4.3kb断片を含むDNA断片画分3 μlを、上記のようにして調製したSmaI,EcoRI切断pUC19 μlとTAKARAライゲーションキットを用いて4℃で一晩反応させることによりpUC19への挿入を行い、DNAライブラリーとした。
【００２２】
３）形質転換体の作製および組換え体DNAの選別
大腸菌JM109株( 宝酒造（株）より入手) を2xYT培地10mlに37℃で12時間培養後、新規な同培地に1%植菌し2時間培養した。遠心分離により集菌した後、冷50 mM CaCl2溶液を 5ml加え、0℃で40分間放置後、再度遠心分離し、冷50 mM CaCl2溶液0.25 mlに懸濁した。これに工程（２）で作製した組換え体プラスミドを含有する溶液（DNAライブラリー）を60μlを加え、0℃で40分間放置後、42℃で2分間ヒートショックを与え、2xYT培地1 mlを加え37℃にて60分間振盪培養した。これを100 μl ずつアンピシリン50μg/ml含有2xYT寒天培地にまき、37℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニーについてコロニーハイブリダイゼーションを行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子上流域を含む形質転換体を選別した。すなわち、寒天培地上に生育させたコロニーにをニトロセルロースフィルター上に移し、菌体を溶かしてDNAを固定した後、これを工程（２）で作製したプローブ（0.37kb断片）で処理し、オートラジオグラフ法で目的の組換え体DNAを含むコロニーを選択した。更に、この選択したコロニーから組換え体プラスミドを抽出し、サザンハイブリダイゼーション法によって上述のプローブとハイブリダイズさせ、選抜したコロニーが目的遺伝子を含む形質転換体であることを再確認した。
【００２３】
４）組換え体プラスミドの精製と制限酵素地図の作製
工程（３）で選択した形質転換体を100 mlの2xYT培地にて37℃一晩培養し、集菌後、TNE溶液により洗浄し、STE溶液を8 ml、リゾチームを10 mg加え、0℃で5分間放置した。0.25 M EDTA 4 ml加え、さらに室温で10 % SDS 2 ml, 5 M NaCl 5 mlを加え、0〜4℃で3時間放置した。これを超遠心し、その上澄みに30 % PEG6000を1/2当量加え、0〜4℃で一晩放置し、遠心後TNEに溶解して7.5 mlとした。CsClを加えた後遠心により除タンパクを行い、臭化エチジウム溶液を300〜500 mg/ml加えシールチューブに移し、熱シールし超遠心を行った。cccDNAを回収し、水飽和イソプロピルアルコールを当量以上加えて臭化エチジウムを除き、TEで透析し精製した組換え体プラスミド約3 mlを得た。これをpNHU10と命名した。この組換え体プラスミドを数種の制限酵素を用いて切断し、図１中に示される制限酵素地図を作製した。
【００２４】
５）調節遺伝子およびニトリルヒドラターゼ 遺伝子を含む領域およびロドコッカス属において複製可能なベクタープラスミドからなる組換え体プラスミドの作製
工程（４）で得られたプラスミドpNHU10は、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むpNHJ10Hに含まれるJ1株由来のDNA断片と0.37 kbオーバーラップし、更に3.9 kb上流までを含んでいる。pNHU10より1.4 kb FspI-EcoRI断片および0.9 kb ScaI-EcoRI断片を切り出し、これらをそれぞれ大腸菌-ロドコッカス属細菌用複合プラスミドベクターpK4に挿入し、プラスミドpHJK16およびpHJK17を作製した。これらのプラスミドにpNHJ10H由来の5.9 kb EcoRI断片を挿入し、それぞれpHJK18およびpHJK19を作製した。これらの作製過程は図１および図２に示した。なお、図１のpHJK18において、太い矢印は本発明において見いだされた調節遺伝子の位置と方向を示し、細い矢印はニトリルヒドラターゼ遺伝子の二つのサブユニット遺伝子の位置と方向を示す。また、図２のpHJK19において、太い矢印は本発明において見いだされた調節遺伝子の位置と方向を示し、細い矢印はニトリルヒドラターゼ遺伝子の二つのサブユニット遺伝子の位置と方向を示す。
【００２５】
６）ロドコッカス属細菌の形質転換および形質転換体を用いたニトリルヒドラターゼの生産
ロドコッカス・ロドクロウスATCC12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、15%PEG6000（ポリエチレングリコール6000）溶液に懸濁した（菌体濃度109 cell / ml以上）。工程（５）のプラスミドpHK18DNA またはpHK19 DNA 1 μgと菌体懸濁液100 μlを混合し、氷冷した。ジーンパルサー用のチャンバーにDNAと菌体の混合液を入れ、氷冷した後、静電容量25μF,抵抗 400オーム、電場強度20 kV/cmで電気パルス処理を行った。
【００２６】
電気パルス処理液を氷冷下１０分間静置し、３７℃、５分間熱処理後、ＭＹ培地 1mlを加え、２５℃、３時間振とうした。50μg/mlカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布し28℃、2日間培養した。出現したコロニーが明らかにカナマイシン耐性であることを別に作成したカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布することにより確認した。
【００２７】
こうして作製したロドコッカス・ロドクロウスの組換え体、ロドコッカス・ロドクロウスATCC12674/pHJK18 又はロドコッカス・ロドクロウスATCC12674/pHJK19を培地（グリセロール 10 g、ポリペプトン 5 g、酵母エキス 3 g、麦芽エキス 3 g、KH2PO4 1 g、K2HPO4 1 g、CoCl2・6H2O 0.01 g、尿素 0.75 gまたは3.75 g (pH7.0) / L）にて28℃2日間培養し、ニトリルヒドラターゼの活性測定を行った。培養液より遠心分離により集菌し、150 mM NaClで洗浄後、0.35 % n-酪酸を含む0.1 M HEPES-KOH(pH7.2)に菌体を懸濁した。超音波処理により細胞を破砕し、遠心分離により細胞膜を除き細胞抽出液を得、ニトリルヒドラターゼ活性を測定した。活性測定は以下のように行った。適当に水で希釈した細胞抽出液0.5 mlに100 mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を0.5 ml、200 mMのアクリロニトリルを1 ml加え20℃にて10分間反応後、1N HClを0.2 ml加えることにより反応を停止させた。生成するアクリルアミドの定量をHPLCにより行った。
【００２８】
ロドコッカス・ロドクロウスATCC12674/pHJK18およびロドコッカス・ロドクロウスATCC12674/pHJK19の細胞抽出液について以下の表１の値が得られた。なお、表中、尿素はニトリルヒドラターゼ酵素の誘導剤である。
【００２９】
【表１】
７）欠失プラスミドとニトリルヒドラターゼ活性
pHJK18およびpHJK19には、ニトリルヒドラターゼ発現に必要のない領域がまだ多く残っていると考えられたため、欠失プラスミドを作製しニトリルヒドラターゼ活性を調べたところ、活性発現に必須な調節遺伝子領域はScaIからAccIIIの約1.9 kbの間にあることが明らかとなった。
【００３１】
８）塩基配列の決定
工程（7）で特定された領域についてDNA塩基配列を決定したところ、配列番号1に示されるアミノ酸配列を持つ、唯一の長いオープンリーディングフレームが見いだされた。塩基配列の決定はTth DNA polymeraseを用いたチェーンターミネーション法（Sanger F. Science 214, 1205-1210 (1980)）により行った。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列番号2に示した。
【００３２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３６１
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：ロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）
株名：J1
配列：
配列番号：２
配列の長さ：１０８６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
起源
生物名：ロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）
株名：J1
配列：
【図面の簡単な説明】
【図１】組換え体プラスミドpHJK18の作製工程を示す図。
【図２】組換え体プラスミドpHJK19の作製工程を示す図。
Claims (6)
- プラスミドpNHJ10H(受託番号 FERM BP-2777)を制限酵素EcoRIで切断して得られるニトリルヒドラターゼ遺伝子を含む DNA 断片に、プラスミド pNHU10( 受託番号 FERM P-14568) を制限酵素 ScaI と EcoRI で切断して得られる約 0.9kb の DNA 断片を、前記ニトリルヒドラターゼ遺伝子の上流側に、両者の EcoRI サイトを介して連結してなる DNA。
- 請求項１記載のDNAを含む、ベクター。
- ロドコッカス属細菌用プラスミドである、請求項２記載のベクター。
- ロドコッカス属−大腸菌複合プラスミドである、請求項２記載のベクター。
- 請求項２〜４のいずれか１項記載のベクターを導入することにより得られる、形質転換体。
- ロドコッカス属細菌である、請求項５記載の形質転換体。
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