JP2526021B2 - 遺伝子的に修飾された生物体を使用するビタミンｃ先駆体の製造 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子的に修飾された生
物体を使用するビタミンＣ先駆体の製造、特にＤＮＡ配
列、組換ＤＮＡ分子、この種の配列および分子を含有す
るエルウィニア属およびこの種の生物体による或る種の
酵素の発現、並びにこの種の生物および酵素を用いた醗
酵によるビタミンＣ先駆体の製造に関するものである。
より詳細には、本発明は発現ビークル、並びにこのビー
クルにより形質転換されてグルコースまたはその他の炭
素源を醗酵により２−ケト−Ｌ−グルコン酸（２−ＫＬ
Ｇ）、すなわちビタミンＣ（アスコルビン酸）に対する
化学先駆体まで変換させるために使用する酵素を発現す
る遺伝子的に修飾された生物体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ビタミンＣを製造するには幾つかの方法
がある。１つの方法は、多数の化学合成工程と一つの醗
酵工程とを含む。要するに、これらの工程はグルコース
からソルビトールへの水素化と、アセトバクタ・サブオ
キシダンスを用いるソルビトールからソルボースへの醗
酵と、ソルボースのアセトン化と、２−ＫＬＧへのジア
セトン・ソルボース酸化と、２−ＫＬＧのエステル化
と、エステルからアスコルビン酸への変換とである。こ
の方法は複雑であり、かつ操作プラントのための比較的
高い投資を必要とする。

【０００３】他の方法は、２つの醗酵工程を含んでい
る。この方法はエルウィニア・スペシース（Ｅｒｗｉｎ
ｉａ ｓｐ．）によるグルコースから２，５−ジケト−
Ｄ−グルコネート（２，５−ＤＫＧ）への醗酵から出発
し、コリネバクテリウム・スペシース（Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）による２，５−ＤＫＧから
２−ＫＬＧへの醗酵と、２−ＫＬＧのエステル化と、こ
のエステルからアスコルビン酸への変換とを含む。１つ
の研究が示すところでは、Ｄ−グルコネートおよび２−
ケト−Ｄ−グルコネート（２−ＫＤＧ）がエルウィニア
・スペシースによりグルコースから順次に生成された
後、２，５−ＤＫＧが最初の醗酵工程で生成される。
Ｔ．ソノヤマ等、「２工程醗酵によるＤ−グルコースか
らの２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造」、アプライド・ア
ンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー、
第４３巻、第１０６４〜１０６９頁（１９８２）参照。
この２工程醗酵法は、アセトバクター法よりも若干低い
投資額を有するが、まだ複雑であって操作が高価につ
く。

【０００４】グルコースを２−ＫＬＧまで変換するさら
に他の方法が、ヨーロッパ特許出願第１３２，３０８号
明細書に記載されている。この出願は、１工程の醗酵法
でグルコースを２−ＫＬＧまで変換されることを記載し
ている。これは、先ず特定の２，５−ＤＫＧレダクター
ゼ（２，５−ＤＫＧから２−ＫＬＧへの醗酵を触媒する
といわれる酵素）をコードするＤＮＡ配列の供給源とし
てコリネバクテリウム・スペシースＡＴＣＣ３１０９０
を挙げている。このＤＮＡ配列は、それ自身のまたは合
成のリボソーム結合部位を有して、イー・コリｔｒｐも
しくはｔａｃプロモータ或いは発現ベクターにおけるｐ
ＡＣＹＣ１８４ ＣＡＴプロモータの「下流」に挿入さ
れると言われている。さらに、このベクターはテトラサ
イクリン耐性またはその他の選択可能な標識をコードす
る遺伝子を含有し、かつプラスミドＣｏｌ Ｅ１、１５
ＡまたはＲＳＦ １０１０から誘導される複製源を有す
るとも言われる。さらに、宿主細胞であるエルウィニア
・ヘルビコーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌ
ａ）（ＡＴＣＣ ２１９９８）は、ベクターより形質転
換されると言われる。醗酵に際し、この形質細胞は１工
程でグルコースから２−ＫＬＧを生産すると言われる。
しかしながら、この工程におけるグルコースから２−Ｋ
ＬＧへの変換は充分満足しうるものでない。何故なら、
２−ＫＬＧの収率が極めて低くかつこの低収率を得るに
さえ醗酵時間が長すぎるからである。

【０００５】したがって、たとえばグルコースのような
炭素源を２−ＫＬＧまで許容しうる割合でかつ単一の醗
酵工程にて変換しうる単一の生物が目標とされており、
これはまだ得られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、グルコース
またはその他の炭素源を２−ＫＬＧまで急速かつ高収率
で変換しうる単一の生物を見出だすと言う問題を解決す
る。一具体例において本発明は、グルコースまたはその
他の炭素源を２−ＫＬＧまで単一醗酵にて許容しうる変
換割合にて、中間的な生成物回収工程または中間的な精
製工程なしに変換するのに必要とされる全醗酵工程を行
なうよう、宿主を形質転換しうる発現ビークルを提供す
る。本発明を実施して得られる２−ＫＬＧを次いで上記
の慣用方法におけると同様にエステル化しかつアスコル
ビン酸（ビタミンＣ）まで変換することができる。

【０００７】本発明の方法と異なり、グルコースを２−
ＫＬＧまで変換させるための公知の工業醗酵工程は、グ
ルコースを２−ＫＬＧまで変換させるのに例えばエルウ
ィニアおよびコリネバクテリウムの菌株など２種の別の
生物を必要とする。

【０００８】本発明の一利点は、遺伝子的に修飾された
生物体の単一株により単一醗酵にてグルコースから直接
に２−ＫＬＧの相当な収率を達成することである。した
がって、単一醗酵工程を使用しうる本発明の方法の能力
は公知工業方法よりも比較的簡単な方法をもたらし、し
たがって、グルコースからビタミンＣを製造するための
工程装置およびエネルギの必要性が少なくなる。

【０００９】本発明の他の目的は、ヨーロッパ特許出願
第１３２，３０８号明細書に記載されたものよりも優れ
た新規な２，５−ＤＫＧレダクターゼおよび新規な形質
転換生物を提供し、従って、本発明の方法および生成物
はヨーロッパ特許出願第１３２，３０８号における方法
および生成物よりも予想外に改善されかつ特許性を有す
るものである。

【００１０】本発明のさらに他の目的および特徴は、以
下の記載から明らかとなるであろう。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明に係る組換ＤＮＡ
分子は、２，５−ＤＫＧレダクターゼをコードし、かつ （ａ）式：

【化３】 のＤＮＡ配列、および （ｂ） 前記（ａ）において定義されたＤＮＡ配列によ
ってコードされるアミノ酸と同じアミノ酸をコードする
シノニムコドンによって、一つ以上のコドンが置換さ
れ、かつ２，５−ＤＫＧレダクターゼをコードするＤＮ
Ａ配列よりなる群から選択されるＤＮＡ配列を特徴とす
る。

【００１２】さらに、本発明に係る形質転換細胞は、エ
ルウィニア属および２，５−ＤＫＧを生成するいずれか
他の細胞または生物体からなる群から選択され、かつ少
なくとも一つの組換ＤＮＡ分子により形質転換された宿
主からなり、前記組換ＤＮＡ分子は２，５−ＤＫＧレダ
クターゼをコードし、かつ （ａ）式：

【化４】 のＤＮＡ配列、および （ｂ） 前記（ａ）において定義されたＤＮＡ配列によ
ってコードされるアミノ酸と同じアミノ酸をコードする
シノニムコドンによって、１つ以上のコドンが置換さ
れ、かつ２，５−ＤＫＧレダクターゼをコードするＤＮ
Ａ配列からなる群から選択されるＤＮＡ配列を特徴と
し、前記ＤＮＡ配列が前記分子中で発現制御配列に機能
的に結合されていることを特徴とする。

【００１３】本発明を一層充分に理解しうるよう、以下
詳細に説明する。この説明において、以下の幾つかの用
語を使用する：

【００１４】ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐
酸と含窒素複素環塩基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮＡ
のモノマー単位である。この塩基はグリコシド炭素（ペ
ントースの１′炭素）を介して糖成分に結合され、塩基
と糖との組合せをヌクレオシドと呼ぶ。塩基はヌクレオ
チドを特性化する。４種のＤＮＡ塩基はアデニン
（「Ａ」）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）
およびチミン（「Ｔ」）である。４種のＲＮＡ塩基は
Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。ＤＮＡに
関し、「Ｐ」はプリン（ＡもしくはＧ）のいずれかを示
し、「Ｑ」はピリミジン（ＣもしくはＴ）のいずれかを
示し、かつ「Ｎ」は４種の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃもしくは
Ｔ）のいずれかを示す。ＲＮＡに関し「Ｐ」、「Ｑ」お
よび「Ｎ」は、「Ｕ」を「Ｔ」の代りに用いる以外は同
じ意味を有する。

【００１５】ＤＮＡ配列：隣接するペントースの３′炭
素と５′炭素との間のホスホジエステル結合により互い
に結合されたデオキシヌクレオチドの線状列である。

【００１６】コドン：３種のヌクレオチド（トリプレッ
ト）のＤＮＡ配列であって、そのｍＲＮＡを介しアミン
酸、翻訳開始信号または翻訳停止信号をコードする。例
えば、ヌクレオチドトリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴ
Ｔ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシン
（「Ｌｅｕ」）をコードし；ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧ
Ａは翻訳停止信号であり、かつＡＴＧは翻訳開始信号で
あって、さらにメチオニンをもコードする。

【００１７】解読枠：ｍＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳す
る際のコドンの群である。翻訳に際し、適切な解読枠を
維持せねばならない。例えば、ＤＮＡ配列ＧＣＴＧＧＴ
ＴＧＴＡＡＧは３つの解読枠もしくは相で発現すること
ができ、そのそれぞれは次の異なるアミノ酸配列を生ず
る：

【００１８】

【化５】 ＧＣＴ ＧＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ− Ａｌａ−Ｇｌｙ−
Ｃｙｓ−Ｌｙｓ Ｇ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＡＧ −Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｖａｌ ＧＣ ＴＧＧ ＴＴＧ ＴＡＡ Ｇ −Ｔｒｐ−Ｌｅｕ
−（ＳＴＯＰ）

【００１９】ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−ア
ミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互
いに結合されたアミノ酸の線状列である。「ポリペプチ
ド」と言う用語を本明細書中で使用する場合、「蛋白」
という用語を包含することが当業者には了解されよう。

【００２０】ゲノム：細胞又はウィルスの全ＤＮＡであ
る。これは特に細胞のポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、並びにオペレータ、プロモータおよびリボソームの
結合および相互作用配列を包含し、例えば、これらコー
ド配列のそれぞれにつきシャイン−ダルガルノ配列のよ
うな配列を含む。

【００２１】遺伝子：特定のポリペプチドに特徴的なア
ミノ酸の配列を雛型もしくはメッセンジャＲＮＡ（「ｍ
ＲＮＡ」）を介してコードするＤＮＡ配列である。

【００２２】発現：ポリペプチドを生産すべく遺伝子に
よって受ける過程である。これは、ＤＮＡ配列からｍＲ
ＮＡ配列への転写およびｍＲＮＡ配列からポリペプチド
への翻訳を含む。

【００２３】プラスミド：完全「レプリコン」を含んで
プラスミドを宿主細胞にて複製するような非染色体二重
鎖ＤＮＡ配列である。プラスミドを単細胞生物中に組込
むと、この生物の特徴はプラスミドにおけるＤＮＡの結
果として変化しまたは形質転換する。例えば、テトラサ
イクリン耐性（Ｔｅｔ^Ｒ）の遺伝子を有するプラスミド
は、テトラサイクリンに対し感受性であった細胞をこれ
に対し、耐性の細胞に形質転換させる。プラスミドによ
り形質転換された細胞を「形質転換体」と呼ぶ。

【００２４】ファージもしくはバクテリオファージ：細
菌性ウィルスである。多くのファージは、蛋白エンベロ
プもしくはコートにカプセル化されたＤＮＡ配列（「カ
プシド」）で構成される。

【００２５】クローン化ビークル：宿主細胞中で複製し
うるプラスミド、ファージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ
配列である。クローン化ビークルは１個もしくは少数の
エンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、これらの部位
においてＤＮＡ配列はＤＮＡの本質的な生物学的機能、
例えば、複製、コート蛋白の生成の喪失を伴わずに或い
はプロモータもしくは結合部位の喪失を伴わずに決定可
能に切断することができる。クローン化ビークルは一般
に形質転換細胞の同定に使用するのに適したマーカー、
例えば、テトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐
性を有する。クローン化ビークルはしばしばベクターと
呼ばれる。

【００２６】クローン化：生物群または１種の生物もし
くは配列から誘導されるＤＮＡ配列を無性繁殖によって
得る過程である。

【００２７】組換ＤＮＡ分子、すなわちハイブリッドＤ
ＮＡ：生細胞の外部で末端結合された異なるゲノムから
のＤＮＡの断片からなり、生細胞中に維持しうる分子で
ある。

【００２８】発現制御配列：遺伝子に作用結合された際
これら遺伝子の発現を制御しかつ調整するヌクレオチド
の配列である。これらはｌａｃ系、β−ラクタマーゼ
系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主オ
ペレータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御
領域、ＳＶ４０の早期および後期プロモータ、ポリオー
マウィルスおよびアデノウィルスから誘導されるプロモ
ータ、メタロチオニン・プロモータ、３−ホスホグリセ
レートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモー
タ、酸ホスフォターゼのプロモータ（例えば、Ｐｈｏ
５）、酵母α−接合因子のプロモータ、並びに原核もし
くは真核細胞およびそのウィルスまたはその組合せの遺
伝子の発現を制御することが知られた配列を包含する。
哺乳動物細胞の場合、遺伝子は真核プロモータに結合す
ることができ、例えば、ＳＶ４０の早期領域はジヒドロ
ホレートレダクターゼをコードする遺伝子に結合しかつ
支那ハムスター卵細胞で選択的に増殖して活性転写され
た真核遺伝子の多数のコピーを含有する細胞ラインを生
成することができる。

【００２９】一具体例において、本発明はこの種の組換
ＤＮＡ分子により形質転換された宿主、好ましくはエル
ウィニア・シトレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｉｔｒｅｕ
ｓ）に向けられる。

【００３０】本発明の組換ＤＮＡ分子は、本発明の２，
５−ＤＫＧレダクターゼをコードするＤＮＡ配列および
組換ＤＮＡ分子におけるこのＤＮＡ配列に作用結合され
る発現制御配列を特徴とする。広範な種類の発現制御配
列を、本発明の組換ＤＮＡ分子に使用することができ
る。これらはｌａｃ系、β−ラクタマーゼ系、ｔｒｐ
系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主オペレータお
よびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、ＳＶ
４０の早期および後期プロモータ、ポリオーマウィルス
およびアデノウィルスから誘導されるプロモータ、メタ
ロチオニンプロモータ、３−ホスホグリセレートキナー
ゼまたはその他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファ
ターゼのプロモータ（例えばＰｈｏ５）、酵母α−接合
因子のプロモータ、ネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼのプロモータ、並びにその他の原核もしくは真核細
胞およびそのウィルスまたはその組合せの遺伝子の発現
を制御することが知られた配列を包含する。哺乳動物細
胞の場合、遺伝子は、例えばジヒドロホレートレダクタ
ーゼをコードする遺伝子に結合されかつ支那ハムスター
卵細胞で選択的に増幅されて、その多数コピーを含む細
胞ラインを生成するＳＶ４０早期領域のプロモータなど
の真核プロモータに結合することができる。本発明の好
適発現制御配列は、ｐＵＣ８のｌａｃ配列から誘導され
る。

【００３１】さらに、本発明の組換ＤＮＡ分子は、各種
のプラスミドおよびこれらを選択宿主中で複製させうる
ファージからのＤＮＡ配列を含むことができる。好まし
くは、さらにこれらは選択マーカー、例えば薬剤耐性を
コードするＤＮＡ配列をも包含する。この種のプラスミ
ドおよびファージ配列は例えば染色体、非染色体および
合成のＤＮＡ配列の断片から誘導することができ、例え
ばＳＶ４０および公知の細菌性プラスミド、例えばｃｏ
ｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３３２、ｐＭＢ９およびそ
の誘導体を含むイー・コリからのプラスミド、広範な宿
主範囲のプラスミド、例えばＲＰ４、ファージＤＮＡ、
例えばファージλの多数の誘導体（例えばＮＭ９８
９）、並びにその他のＤＮＡファージ（例えばＭ１３）
およびフィラメント状一本鎖ＤＮＡファージ、並びにプ
ラスミドおよびファージＤＮＡの組合体、例えばファー
ジＤＮＡもしくはその他の発現制御配列を用いて改変さ
れたプラスミド、或いは例えば２μプラスミドもしくは
その誘導体のような酵母プラスミドから誘導されるベク
ターとすることができる。

【００３２】勿論、全てのベクターおよび発現制御配列
が同様に機能して本発明の改変ＤＮＡ配列を発現しかつ
本発明の新規な２，５−ＤＫＧレダクターゼを生産する
とは限らないことを了解すべきである。また、全ての宿
主が同じ発現系にて同等に機能するとも限らない。しか
しながら、当業者はこれらベクター、発現制御配列およ
び宿主のうちから不当な実験を伴わずにかつ本発明の範
囲を逸脱することなく選択を行うことができる。例え
ば、ベクターを選択するには宿主を考慮せねばならな
い。何故なら、ベクターがそこで複製せねばならないか
らである。ベクターのコピー数、このコピー数を制御す
る能力およびベクターによりコードされるその他任意の
蛋白の発現（例えば抗生物質マーカー）も考慮せねばな
らない。

【００３３】発現制御配列を選択するには、各種の因子
も考慮せねばならない。これらは、例えば、この系の相
対的強度、その制御可能性、並びに本発明の２，５−Ｄ
ＫＧレダクターゼをコードするＤＮＡ配列に対する適合
性、特に有力な二次構造を包含する。

【００３４】本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼのＤ
ＮＡ配列に関する宿主は、一般に選択ベクターに対する
適合性、宿主に対する本発明の２，５−ＤＫＧの毒性、
宿主細胞酵素による蛋白分解減成に対する所望蛋白の感
受性、精製に際し除去するのが困難な宿主細胞蛋白によ
る２，５−ＤＫＧレダクターゼの汚染もしくは結合、発
現特性、２，５−ＤＫＧレダクターゼを生産しかつ分泌
する宿主の能力、正確にレダクターゼを複製する宿主の
能力、宿主の醗酵要件、宿主からの２，５−ＤＫＧレダ
クターゼの精製の容易さ、安全性、並びにコストを考慮
して選択すべきである。

【００３５】一具体例において、宿主としてはエルウィ
ニア・シトレウスＳＨＳ２００３を選択する。何故な
ら、これはグルコースから２，５−ＤＫＧを生産しかつ
２−ＫＬＧを形質転換されたエルウィニア・シトレウス
ＳＨＳ２００３によりグルコースから直接に生産しうる
からである。

【００３６】特に好ましくは、本発明の宿主はエルウィ
ニア・シトレウスＳＨＳ２００３（Ｆｅｒｍ−Ｐ Ｎ
ｏ．５４４９；ＡＴＣＣ Ｎｏ．３１６２３）並びにエ
ルウィニア・シトレウスＳＨＳ２００３から突然変異さ
れた菌株、すなわちエルウィニア・シトレウスＥＲ１０
２６であり、これは唯一の炭素源として２，５−ＤＫＧ
もしくは２−ＫＬＧのいずれかを使用することができな
い。

【００３７】以下の実施例は本発明の幾つかの具体例を
示しているが、本発明の範囲を限定する目的でない。

【００３８】

【実施例】本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼのポリペプチド配
列の同定、並びにクローン化ベクターの作成 コリネバクテリウム・スペシースＳＨＳ７５２００１
は、Ｔ．ソノヤマ等、「２段階醗酵によるＤ−グルコー
スからの２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造」、アプライド
・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジ
ー、第４３巻、第１０６４〜１０６９頁（１９８２）に
記載されている。すなわち、コリネバクテリウムの開示
された菌株を、２，５−ＤＫＧレダクターゼをコードす
るＤＮＡ配列の供与体として選択した。コリネバクテリ
ウムのこの菌株からの２，５−ＤＫＧレダクターゼ遺伝
子を同定するため、酵素の試料を分離しかつ次の手順を
用いて純度９５％まで精製した：

【００３９】Ａ． コリネバクテリウムＳＨＳ７５２
００１の培養 １． コリネバクテリウム・スペシースＳＨＳ７５２
００１の凍結乾燥培養物を、開放直後に０．４ｍｌの
０．９％ＮａＣｌ（１２０℃にて２０分間殺菌したも
の）を前記凍結乾燥培養物を含有する小瓶の内容物へ添
加することにより再加水した。

【００４０】２． この培養物を、０．５％のグリコ
ースと０．５％の酵母抽出物（ディフコ社）と０．５％
のペプトン（ディフコ社）と０．１％のＫＨ_２ＰＯ_４と
０．０２％のＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏと２．０％の寒天と
を含有する溶液８ｍｌを入れた試験管に移した。この溶
液のｐＨは７．０であり、かつこの溶液は１２０℃で１
５分間殺菌されている。２８℃にて培養物を添加してか
ら４０時間後、培養物を１２０℃にて２０分間殺菌され
ている０．９％ＮａＣｌの０．４ｍｌで懸濁させた。

【００４１】３． 工程２からの懸濁物０．１ｍｌよ
りなる５個のロットを、工程２の溶液と同じ成分を含有
する５本の寒天スラントに加えた。これら培養物を工程
２と同じ時間かつ同じ条件下で醗酵させた。培養物を５
ｍｌの０．９％ＮａＣｌ（１２０℃にて２０分間殺菌し
たもの）で懸濁させ、かつ２．５ｍｌの懸濁物を５００
ｍｌの培地を含有する１０本の種フラスコのそれぞれに
移した。

【００４２】４． １％のグルコースと０．５％の酵
母抽出物（ディフコ社）と０．５％のペプトン（ディフ
コ社）と０．１％のＮａＮＯ_３と０．１％のＫＨ_２ＰＯ
_４と０．０２％のＭｇＳＯ_４・Ｈ_２Ｏとを含有しかつｐ
Ｈ７．０を有する溶液を１２０℃にて１５分間殺菌し
た。この溶液６０ｍｌを、培養物を含有する５００ｍｌ
フラスコに添加した。２８℃にて１６〜１８時間培養し
た後、１０本のこれら５００ｍｌフラスコの培養内容物
を３０ｌのジャーファーメンタに移した。

【００４３】５． １．８％のグルコースと２．７％
のコーンスチープリカーと０．３１％のＮａＮＯ_３と
０．０６％のＫＨ_２ＰＯ_４と４．４ｐｐｍのＺｎＳＯ_４
・７Ｈ_２Ｏと０．７２ｐｐｍのＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏと
０．２ｐｐｍのビタミンＢ_１−ＨＣｌと０．１５ｐｐｍ
のパントテン酸カルシウムと０．００５％の消泡剤（ア
デカノール）とを含有するｐＨ７．２の溶液２０ｌを、
培養物を含有する３０ｌのジャーファーメンタに加え
た。このファーメンタを４００ｒｐｍにて撹拌しながら
０．５ｖ．ｖ．ｍ．の空気流速にて２８℃で培養した。
培地からグルコースが消失した時（２２時間）、醗酵を
停止させた。最終ｐＨは７．５であり、最終ＯＤは１
９．２であった。

【００４４】Ｂ． 細胞抽出物の作成 約７５０ｇの菌体を、シャープレス遠心分離器を用いて
遠心分離（１０，０００Ｇにて１０分間）することによ
り３０ｌジャーファーメンタから収穫した。これら菌体
を０．１Ｍ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７、２．５ｌ）に懸濁
させ、同じ緩衝液（それぞれの場合２．５ｌずつ）で遠
心分離器により３回洗浄し、最後に１．６ｌの緩衝液中
に再懸濁させた（ＯＤ１５０）。これら菌体（８０ｍｌ
の菌体懸濁物として）を音波処理（１６０ワットにて７
分間）により破壊した。破壊されない菌体および残骸を
遠心分離（１５，０００Ｇで３０分間）により除去し、
かつ上澄液（１ｌ）を集めた。

【００４５】Ｃ． ＡｍＳＯ_４による分画 ４０％飽和と７０％飽和との間で沈殿した蛋白物質を遠
心分離により集め、かつ８０ｍｌの０．１Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７）に再溶解させた。この溶液をｐＨ
７の０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液に対し１晩透析し
た。

【００４６】Ｄ． イオン交換クロマトグラフィー 透析した溶液（９９ｍｌ）を、予め０．０２Ｍトリス−
ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）で平衡化させたＤＥＡＥ−セフ
ァロースＣＬ−６Ｂカラム（１．６×３０ｃｍ）に入れ
た。このカラムをそれぞれ０および０．２ＭのＮａＣｌ
を含有する０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）
で段階的に洗浄した。酵素を、０．３ＭＮａＣｌを含有
する同じ緩衝液（ｐＨ７）で溶出させた。活性フラクシ
ョンを集め、かつＡｍＳＯ_４を７０％飽和まで添加する
ことにより蛋白を濃縮した。沈殿物を集め、かつ工程Ｃ
におけると同様に透析した。

【００４７】Ｅ． 第１親和性クロマトグラフィー 工程Ｄから得られた透析溶液（３７ｍｌ）を、予め０．
０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）で平衡化された
アミコン・マトリックス・レッドＡカラム（１．６×１
９ｃｍ）に入れた。このカラムを０．３〜０．５ＭのＮ
ａＣｌを含有する０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７）で段階的に洗浄した。酵素を、０．７〜１．０Ｍ
のＮａＣｌを含有する同じ緩衝液で溶出させた。活性フ
ラクション（９０ｍｌ）を集めた。

【００４８】Ｆ． 第２親和性クロマトグラフィー ０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ、２２５ｍｌ）
を工程Ｅから集めたフラクションへ添加し、かつ得られ
た溶液を予め０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７）で平衡化されたアミコン・マトリックス・レッドＡ
カラム（１．９×１２．３ｃｍ）に入れた。このカラム
を０．２ＭのＮａＣｌを含有する０．０２Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７）で洗浄した。酵素を、０．５ｍＭ
のＮＡＤＰＨを含有する同じ緩衝液で溶出させた。活性
フラクション（３５ｍｌ）を集め、限外瀘過（分子量１
０，０００以下のカットオフ）により濃縮してＮＡＤＰ
Ｈを除去した。

【００４９】本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼが音
波処理工程に際し変性されなかったことを示しかつ本発
明の２，５−ＤＫＧレダクターゼが２，５−ＤＫＧを２
−ＫＬＧに変換させることを確認するため、７ｍｇのＮ
ＡＤＰＨと２ｍｇの２，５−ＤＫＧと２．５ｍｇ／μｌ
の全蛋白濃度の菌体音波処理物５０μｌとを含有する
０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７）の混合物を作
成した。全反応容積は２００μｌであった。反応の生成
物をＨＰＬＣにより分析し、かつ２−ＫＬＧの存在を確
認した。

【００５０】本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼに対
する抗体を作成した。これらの抗体は、ウサギの複数部
位に対しフロインドアジュバントにおける本発明の２，
５−ＤＫＧレダクターゼ １００μｇを皮内注射し、か
つフロインド不完成溶液における酵素５０μｇにて２１
日後に加速させることにより発生した。加速注射してか
ら１０日後に血清を集め、酵素結合免疫吸収（「ＥＬＩ
ＳＡ」）分析にて、本発明の抗−２，５−ＤＫＧレダク
ターゼ活性につき陽性であることが示された。

【００５１】この精製酵素を、アプライド・バイオシス
テムス社により製作された高感度気相配列決定装置によ
りＮ−末端から配列決定した。この方法により得られた
部分配列を図１に示す。図１における？マークは、特定
アミノ酸が確実性をもって決定しえなかったことを示し
ている。

【００５２】さらに、精製酵素を標準臭化シアノゲン切
断法により切断した。この方法により生成された１種の
１４，０００ダルトンの断片におけるアミノ酸配列の１
部を第２図に示す。

【００５３】クローンの保存物から本発明の２，５−Ｄ
ＫＧレダクターゼをコードするＤＮＡ配列を選択するた
め、ホスホトリエステル法を用いて一連のオリゴヌクレ
オチドプローブ（図３の（ａ）〜（ｅ）に示す）を作成
した。これらのプローブは、図１および図２のアミノ酸
配列から誘導したものである。

【００５４】遺伝子コードの縮退により、各プローブは
実際上１群の構造的に関連した分子であった。たとえ
ば、図３の（ａ）の１４量体ＤＮＡプローブは予想配列
に対し１個のＣ−Ｔ不整合を伴う９６の重複（ｒｅｄｕ
ｎｄａｎｃｙ）を有し、図３の（ｂ）の１４量体ＤＮＡ
プローブ（図１のプローブＩＩ）は１個のＧ−Ｔ不整合
を伴なう３２の重複を有し、図３の（ｃ）および図３の
（ｄ）の１７量体ＤＮＡプローブ（図１のプローブＩＩ
Ｉ）はそれぞれ３２の重複を有しかつ互いに最初の２個
の位置においてのみ相違し、さらに図３の（ｅ）の１４
量体ＤＮＡプローブ（図２のプローブＩＶ）は３２の重
複を有した。

【００５５】本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼ遺伝
子を選択すべく図３の（ａ）〜（ｅ）のプローブによる
スクリーニングを可能にするようコリネバクテリウムＤ
ＮＡの保存物を作成するため、コリネバクテリウム・ス
ペシースＳＨＳ７５２００１の菌体懸濁物を１０ｍＭト
リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）におけるリゾチーム（１
ｍｇ／ｌ）と１ｍＭ ＥＤＴＡと２０％（ｗ／ｖ）の蔗
糖とドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（５ｍｇ／ｍ
ｌ）とで処理することにより、コリネバクテリウム・ス
ペシースＳＨＳ７５２００１を溶菌させた。次いで、溶
菌したコリネバクテリウム・スペシースＳＨＳ７５２０
０１菌体からのＤＮＡを、１５０ｍＭ ＮａＣｌと６ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．９）と６ｍＭのＭ
ｇＣｌ_２と１００μｇ／ｍｌの牛血清アルブミンとから
なる緩衝液において制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３ａ
により断片化させた。次いで、これらＤＮＡ断片を、
Ｊ．ビエラおよびＪ．Ｒ．メッシング、ジーン、第１９
巻、第２５９頁（１９８２）の方法によりＢａｍＨ１部
位にてｐＵＣ８ベクター中へ挿入し、かつ組換プラスミ
ドを大腸菌ＪＭ８３、Ｗ３１１０ｉ^ｑおよびＷ３１１０
ｉ^ｑ ｒｅｃＡに形質転換させた。組換プラスミドからイ
ー・コリＪＭ８３への形質転換法は、Ｊ．Ｒ．メッシン
グ、Ｒ．コレア、Ｐ．Ｈ．シーブルグ、ヌクレイック・
アシッド・リサーチ、第９巻、第３０９頁（１９８１）
に示されている。他の宿主菌株につき同様な方法を用い
た。

【００５６】得られた保存物のコロニーを、Ｒ．Ｂ．ワ
レス、Ｍ．Ｊ．ジョンソン、Ｔ．ヒロセ、Ｔ．ミヤケ、
Ｅ．Ｈ．カワシマおよびＫ．イタクラ、ヌクレイック・
アシッド・リサーチ、第９巻、第８７９〜８９４頁（１
９８１）に記載された方法を用いて図３の（ａ）〜
（ｅ）のプローブでスクリーニングした。これらプロー
ブを３７℃でハイブリッド化させ、かつ６×ＳＳＣと５
×デンハルト緩衝液と０．１％ＳＤＳと５０μｇ／ｍｌ
ｔ−ＲＮＡとからなる標準洗浄液にて３７℃で洗浄し
た。図３の（ｅ）のプローブに対し陽性（ハイブリッド
化したもの）であった１７種のコロニーのうち、２種は
さらに図３の（ｃ）もしくは図３の（ｄ）のクローンま
たはその両者に対しても陽性であった。これらクローン
の２種の組換プラスミドをｐＣＢＲ１０およびｐＣＢＲ
１３と命名した。これら２種の組換プラスミドのそれぞ
れにおける外来ＤＮＡは長さ３．０ｋｂであった。

【００５７】本発明による発現ベクターおよび形質転換
体の性質 形質転換宿主、２種の組換プラスミドおよびｐＵＣ８に
よる本発明の２，５−ＤＫＧレデクターゼの生産速度を
含む組換プラスミドの性質を決定するため、本発明の
２，５−ＤＫＧレダクターゼをコードするＤＮＡを有し
てないベクターを、Ｓ．Ｎ．コーヘン、Ａ．Ｃ．Ｙ．シ
ャングおよびＬ．シュ、プロシーディング・ナショナル
・アカデミー・サイエンス・ＵＳＡ、第６９巻、第２１
１０頁（１９７２）に示された方法によりイー・コリＷ
３１１０ｉ^ｑ ｒｅｃＡおよびエルウィニア・プンクター
タ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）に形質転換さ
せた。ｐＢＲ３３２に関連するベクターｐＵＣ８は、Ｂ
ａｍＨ１部位から僅か上流に位置する強力なｌａｃプロ
モータを有する。

【００５８】本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼを生
産した形質転換細胞から２，５−ＤＫＧレダクターゼを
放出させてその生産割合を測定しうるよう、幾つかの方
法を検査した。音波処理が、イー・コリおよびエルウィ
ニアにつき最良であると判明した。

【００５９】ｐＣＢＲ１０およびｐＣＢＲ１３を含むイ
ー・プンクタータおよびイー・コリの抽出物を、ドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［Ｕ．Ｋ．レムリ、ネイチャー、
第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０）］、並び
にウエスタン・プロット法［Ｐ．Ｓ．トーマス、プロシ
ーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・Ｕ
ＳＡ、第７７巻、第５２０１〜５２０５頁（１９８
０）］によって分析し、その際上記で生産された抗−
（本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼ）抗体を用いて
形質転換体により生産された本発明の２，５−ＤＫＧレ
ダクターゼの量を測定した。

【００６０】ｌａｃインデューサであるイソプロピルβ
−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で処理され
たイー・コリＷ３１１０ｉ^ｑ ｒｅｃＡ（ｐＣＢＲ１３）
の抽出物は、この遺伝子を有するプラスミドで誘発され
ていない菌体からの抽出物よりも約５倍量の酵素を含有
した。

【００６１】本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼが組
換の際に変化しなかったことの確認 ｐＣＢＲ１０およびｐＣＢＲ１３での形質転換後にイー
・プンクタータおよびイー・コリにより生産された２，
５−ＤＫＧレダクターゼを検査して、これがコリネバク
テリウム・スペシースＳＨＳ７５２００１から分離され
たと同じ酵素であったかどうかを調べた。

【００６２】エルウィニア（ｐＣＭＲ１３）、イー・コ
リＷ３１１０ｉ^ｑ ｒｅｃＡ（ｐＣＢＲ１３）およびコリ
ネバクテリウムの抽出物のウエスタンブロットにより標
識された蛋白の分子量は、本発明の精製２，５−ＤＫＧ
レダクターゼの分子量と同じであった。（すなわち、約
２９，０００ｄ）。異なる菌体に対するブロットの比較
に基づき、エルウィニア（ｐＣＢＲ１３）の全菌体蛋白
の１〜２％が本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼであ
ると推定された。

【００６３】さらに、λＰ_Ｌプロモータ、すなわちλｃ
Ｉリプレッサ蛋白により制御しうる強力なプロモータを
用いて作成を行った。λＰ_Ｌプロモータの発現は、λｃ
Ｉ_{８ ５７}温度感受性リプレッサをも有する菌株にて温度
を３０℃から４２℃まで変化させることにより制御する
ことができる。組換菌株からの２−ＫＬＧの収率増加
が、このプロモータ系を用いて得られた。

【００６４】図５は、λＰ_Ｌプロモータの制御下で２，
５−ＤＫＧレダクターゼを発現するプラスミドを作成す
るために用いたベクターの物理的地図を示している。プ
ラスミドｐＰＬｒｅｄ３３２は、プラスミドｐＣＢＲ１
３からの２，５−ＤＫＧレダクターゼをコードする断片
をプラスミドｐ２１０^＊中へ挿入して作成した。挿入し
た断片は、ｐＣＢＲ１３を制限エンドヌクレアーゼＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断して生ぜしめた。こ
れら２種の断片を、低融点のアガロースを用いて電気泳
動により分離した。さらに、このベクターをＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩで切断し（図５参照）、適当な断
片を結合させうるようにした。得られたプラスミド、す
なわちｐＰＬｒｅｄ３３２を菌株Ｗ３１１０ｃＩ_ｔｓ中
に形質転換させて菌株ＥＣ１０８３を形成させた。この
菌株は、ラムダ温度感受性リプレッサ遺伝子ｃＩ_８５７
の染色体挿入物を有する。２１０^＊から得られたベクタ
ー要素と図５に示したｐＣＢＲ１３からの挿入物とから
なるプラスミドｐＰＬｒｅｄ３３２は、ｐＣＢＲ１３で
特定されたものと同様に、イー・コリおよびエルウィニ
ア・シトレウス両者と同じモル重量を有する２，５−Ｄ
ＫＧレダクターゼを特定している。

【００６５】エルウィニア・シトレウスＥＲ１０２６は
ｐＰＬｒｅｄ３３２により形質転換してＥＲ１１１６菌
株を形成した。

【００６６】アミノ酸および本発明の２，５−ＤＫＧレ
ダクターゼのＤＮＡ配列を確認するため、ｐＣＢＲ１３
の３ｋｂ挿入物をマキサムおよびギルバートの技術［プ
ロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス
・ＵＳＡ、第７４巻、第５６０頁（１９７７）並びに
Ａ．Ｍ．マキサムおよびＷ．ギルバート、メソッズ・エ
ンチモロジー、第６５巻、第４９９〜５６０頁（１９８
０）］およびプラスミドＭ１３を用いるサンガーの配列
決定［Ｆ．サンガー、Ｓ．ニッケレンおよびＡ．Ｒ．ク
ールセン、プロシーディング・ナショナル・アカデミー
・サイエンス・ＵＳＡ、第７４巻、第５４６３〜５４６
７頁（１９７７）］によって配列決定した。３．０ｋｂ
挿入物の配列検査は、酵素自身につき決定された最初の
６０個のアミノ酸（図１に示す）をほぼ正確にコードす
る配列を示した。さらに、３．０ｋｂ挿入物は、図２の
アミノ酸配列をほぼ正確にコードする配列をも含有し
た。３．０ｋｂ挿入物におけるレダクターゼ遺伝子の末
端は、停止コドンによって示される。このようにして、
レダクターゼ遺伝子は長さ８３１個のヌクレオチドであ
ると決定され（停止コドンがなく、かつＡＴＧ、すなわ
ち開始コドンを含む）、さらにその配列を図４に示す。

【００６７】本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼのア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、ヨーロッパ特許
出願第１３２，３０８号のポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列およびそのアミノ酸配列と対比することができ
る。図４は本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼに関す
るＤＮＡ配列とアミノ酸配列との両者を示している。ヨ
ーロッパ特許出願第１３２，３０８号の図４は、そのポ
リペプチドの関連ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示し
ている。これら２つの図面を比較すれば、明らかにｐＣ
ＢＲ１３により特定されると同じ分子量を有する２，５
−ＤＫＧレダクターゼをイー・コリおよびエルウィニア
・シトレウスの両者において特定する。

【００６８】エルウィニア・シトレウスＥＲ１０２６を
ｐＰＬｒｅｄ３３２で形質転換させて菌株ＥＲ１１１６
を形成させた。

【００６９】本発明による２，５−ＤＫＧレダクターゼ
のアミノ酸およびＤＮＡ配列を確認するため、ｐＣＢＲ
１３の３．０ｋｂ挿入の２，５−ＤＫＧレダクターゼと
そのＤＮＡ配列とがヨーロッパ特許出願第１３２，３０
８号のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列とは明らかに相違
していることが示される。

【００７０】酵素のミハエリス定数（Ｋｍ）は、この酵
素の反応速度の尺度となる。この数値が低い程、酵素の
活性（すなわち速度）が大である。ヨーロッパ特許出願
第１３２，３０８号明細書に報告された２，５−ＤＫＧ
に対するミハエリス定数は１５．５ｍＭであり、かつ本
発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼに対するミハエリス
定数（コファクターとして１００μＭのＮＡＤＰＨを用
いる）は０．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にて３
０℃で２．０ｍＭである。

【００７１】次の手順は、本発明の遺伝子的に修飾した
生物体を用いるグルコースから２−ＫＬＧ、すなわちビ
タミンＣ先駆体への醗酵を示している。

【００７２】形質転換されたエルウィニアを用いるグル
コースから２−ＫＬＧへの醗酵 アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、メリ
ーランド州、ＵＳＡに寄託したＡＴＣＣ Ｎｏ．３１６
２３並びに日本国醗酵研究所（ヤタベ）に寄託したＦＥ
ＲＭ−Ｐ Ｎｏ．５４４９のエルウィニア・シトレウス
ＳＨＳ２００３は、通常、グルコースを２，５−ＤＫＧ
に変換させる酵素を発現する。この菌株を、上記したよ
うに本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼをコードする
遺伝子を含んだｐＣＢＲ１３によってＳ．Ｎ．コーヘ
ン、Ａ．Ｃ．Ｙ．チャングおよびＬ．シュ、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミー・サイエンス・ＵＳ
Ａ、第６９巻、第２１１０頁（１９７２）に示された方
法により形質転換させた。かくして、ＥＲ８１７と命名
したこの得られた菌株は、単一の醗酵にてグルコースを
２−ＫＬＧに変換させるのに必要な全ての酵素に関する
遺伝子を含有する筈である。

【００７３】菌株ＥＲ８１７を、アンピシリン（４０μ
ｇ／ｍｌ）を含有するＬ−ブロス寒天のプレートに接種
した。この菌株は、Ｌ−ブロス＋１５％グリセリン中で
−７０℃にて保存した保存培養物から得たものである。
このプレートを１８℃にて２４時間培養した後、２５０
ｍｌの三角フラスコにおける種培地（グリセリン、５ｇ
／ｌ；コーンスチープリカー、２７．５ｇ／ｌ；ＫＨ_２
ＰＯ_４、１ｇ／ｌ；ｐＨ６．８）１０ｍｌへプレートか
ら採取した菌株ＥＲ８１７を６５０ｍｍにて０．０５の
吸光値（Ａ_６５０＝０．０５）まで接種した。

【００７４】得られた種培養物を回転振とうしながら１
８℃にて２４時間培養した。２５０ｍｌ三角フラスコに
おける生産倍地（コーンスチープリカー、３０ｇ／ｌ；
ＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ／ｌ；ＮａＣｌ１ｇ／ｌ；ＣａＣＯ
_３、２９ｇ／ｌ；グルコース、１０ｇ／ｌ；ｐＨ６．
８）１０ｍｌに種培養物をＡ_６５０＝０．２まで接種
し、かつ回転振とうしながら２８℃にて６５時間培養し
た。

【００７５】次いで培養物を遠心分離し、かつ上澄液を
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により２−
ＫＬＧの存在につき分析した。上澄液の５０μｌ試料を
６５℃のビオラドＨＰＸ−８７Ｈカラム（０．６ｍｌ／
ｍｉｎ）により０．１８ＮＨ_２ＳＯ_４中で分析した。
８．８６ｍｉｎの滞留時間を有するピークは、２−ＫＬ
Ｇの存在を示す。興味ある他の化合物の滞留時間は次の
通りである：２，５−ＤＫＧ、８．４６ｍｉｎ；２−ケ
ト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＬＧ）、９．２０ｍｉｎ；
グルコン酸、１０．０ｍｉｎ；およびフコース１２．１
ｍｉｎ。

【００７６】上澄液の各試料は８．８６ｍｉｎにピーク
を示し、これは１ｇ／ｌの濃度における２−ＫＬＧの存
在を示す。８．８６ｍｉｎにてピークを生ずる化合物が
２−ＫＬＧであることを確認するため、所定量の既知２
−ＫＬＧ（ナトリウム塩として）を上澄液の試料に添加
した。これは８．８６ｍｉｎにおけるピークをのみを増
大させ、したがって求める確認を示した。これに対し、
培養物の試料を接種してから１８時間後に採取した場合
（６５時間後でなく）、上澄液のＨＰＬＣ分析は７ｇ／
ｌの濃度の２，５−ＤＫＧを示したが、検出しうる２−
ＫＬＧを示さなかった。

【００７７】さらに、２−ＫＬＧ（２−ＫＤＧでない）
が実際に６５時間培養物中に生産されていることを確認
するため、所定量の既知２−ＫＤＧ（カルシウム塩とし
て）を上澄液の試料へ１ｇ／ｌの濃度まで添加した。か
くして、この処理した培養物のＨＰＬＣ分析は９．１６
ｍｉｎに新たなピークの存在を示したが、８．８６ｍｉ
ｎにおける２−ＫＬＧのピークには変化を実質的に示さ
なかった。

【００７８】培養による２−ＫＬＧの生産を示すため、
他の方法をも用いた。醗酵により生産された全ての２−
ＫＬＧをアスコルビン酸（すなわち還元剤）まで変換さ
せることにより、２−ＫＬＧを含有する醗酵培地の還元
能力を測定しかつアスコルビン酸まで変換する前の溶液
中に存在する２−ＫＬＧの量を計算することができる。
醗酵混合物中にアスコルビン酸以外の還元剤が存在する
かどうか確認するため、醗酵混合物の第１試料を処理し
て２−ＫＬＧをアスコルビン酸に変換させ、次いで試料
の全還元能力を測定した。第２の試料を作成し、これは
２−ＫＬＧの変換後に培地から全アスコルビン酸が除去
されている。次いで、２種の試料の還元活性を比較し、
かつ活性におけるこの差は試料中に存在するアスコルビ
ン酸の量を示し、したがって醗酵培地に存在する２−Ｋ
ＬＧの存在を示す。

【００７９】醗酵培地の上澄液試料を処理して、存在す
る全ての２−ＫＬＧをビタミンＣに変換させた。７５μ
ｌの８Ｎ ＨＣｌを５０μｌの上澄液に添加し、かつ混
合物を９５℃にて３０分間培養した。１２０μｌの５Ｎ
ＮａＯＨを添加し、ｐＨを１Ｎ酢酸ナトリウムにより
３．７５に調整した。

【００８０】混合物中のアスコルビン酸およびその他全
ての還元剤は、電子キャリヤＰＭＳ［５−メチルフェナ
ジウムメチルサルフェート］の存在下でテトラゾリウム
塩ＭＴＴ［３−（４．５−ジメチルチアゾリル−２）−
２，５−ジフェニルテトラゾリウムをホルマザンまで還
元する。このような処理を行って、混合物中の全還元剤
（ビタミンＣを含む）を示した。

【００８１】ビタミンＣの特異的決定を容易化させるた
め、ＭＴＴおよびＰＭＳで処理する前の醗酵混合物の試
料をアスコルビン酸オキシダーゼおよび酸素で処理し
て、存在する全てのビタミンＣを破壊した。次いで、Ｍ
ＴＴおよびＰＭＳでの処理は存在するビタミンＣ以外の
還元剤の量を示し、かつその差によりビタミンＣ（した
がって２−ＫＬＧ）の量を決定した。このようにして、
混合物中のビタミンＣの存在、したがって上澄液中の２
−ＫＬＧの存在が証明された。

【００８２】既知濃度の２−ＫＬＧを含有する試料を用
いて２−ＫＬＧをビタミンＣへ変換させる手順により、
標準曲線を作成した。この曲線は、菌株ＥＲ８１７の６
５時間培養物から得られた上澄液が１ｇ／ｌの２−ＫＬ
Ｇを含有することを示し、これはＨＰＬＣ分析の結果と
一致した。２−ＫＬＧは、ｐＣＢＲ１３を欠如するエル
ウィニア・シトレウスの他の菌株（菌株ＳＨＳ２００
３）の同様に作成されかつ処理された培養物の上澄液に
は検出されなかった。

【００８３】グルコースから２−ＫＬＧへの変換は、形
質転換菌株ＥＲ８１７を用いて下記の醗酵手順によって
行った。接種は実施例１におけると同様に行ったが、生
産培地における培養は６５時間でなく３０時間とし、か
つ１００ｍｌの培地を用いた。培養上澄液は１ｇ／ｌの
２−ＫＬＧを含有したが、０．１ｇ／ｌ未満のグルコー
ス、２−ＫＤＧ、２，５−ＤＫＧもしくはグルコン酸を
含有した。

【００８４】２−ＫＬＧのより良好な収率を得るための
１つの方法は、グルコースから２−ＫＬＧへの醗酵に際
し生産される中間体が２−ＫＬＧ生産に無関係な生物学
的反応で全く消費されないよう確保することである。し
たがって、唯一の炭素源として２，５−ＤＫＧもしくは
２−ＫＬＧを使用しえないエルウィニア・シトレウス
（ＳＨＳ２００３）の突然変異種を、ミラーにより記載
された方法［エキスペリメンツ・イン・モレキュラ・ジ
ェネティックス、コールド・スプリング・ハーバー（１
９７４）］でニトロソグアニジン突然変異にしたがって
分離し、ただし菌体は３０℃にてニトロソグアニジンの
存在下で培養した。突然変異の後、菌体をグルコース
（０．２％ｗ／ｖ）またはグリセリン（０．４％ｗ／
ｖ）を含有するＭ９培地にて３０℃で１８時間培養し、
これについてもミラーのエキスペリメンツ・イン・モレ
キュラ・ジェネティックス、コールド・スプリング・ハ
ーバー（１９７４）に記載されている。培養物の試料を
Ｍ９グルコースもしくはＭ９グリセリン培地のプレート
上に展延し、次いで２，５−ＤＫＧ（０．５％ｗ／ｖ）
または２−ＫＬＧ（０．２％ｗ／ｖ）を含有するＭ９培
地のプレート上で複製させた。これら培地のいずれでも
増殖しえない突然変異種を再塗抹によって精製し、かつ
唯一の炭素源として各種の基質を使用する能力につき試
験した。２，５−ＤＫＧ、２−ＫＤＧまたは２−ＫＬＧ
のいずれをも唯一の炭素源として使用しえない数種の突
然変異種が得られた。この種の一突然変異種をプラスミ
ドｐＣＢＲ１３で形質転換させて菌株ＥＲ１０３７を形
成させ、次いでこれをグルコースを２−ＫＬＧに変換さ
せる能力につき試験した。

【００８５】エルウィニア・シトレウスＥＲ１０３７の
培養物は、ドイッチェ・ザンムルンク・フォン・マイク
ロオルガニスメン・カルチャー・コレクションに寄託し
た。さらに、この培養物は１９８５年７月２２日付けで
寄託し、次のように同定された：ＤＳＭ Ｎｏ．３４０
４。

【００８６】菌株ＥＲ１０３７の培養物をＬ−ブロス中
で１８時間増殖させ、かつこの培養物９０ｍｌを１ｌ当
りＫ_２ＨＰＯ_４、４ｇ；ＫＨ_２ＰＯ_４、１ｇ；ＮＨ_４Ｃ
ｌ、１ｇ；ＣａＣｌ_２、０．０１ｇ；Ｋ_２ＳＯ_４、２．
６ｇ；カザミノ酸、１０ｇ；酵母抽出物、１．５ｇ；コ
ーンスチープリカー、１０ｇ；Ｄ−マニトール、２０
ｇ；およびグルコース、１０ｇからなる培地５００ｍｌ
に接種した。１ｌファーメンタ中でｐＨ６．０にて２０
時間増殖した後（０．７容器容積ｍｉｎ^−１（ｖ．ｖ．
ｍ．）の通気；８００ｒ．ｐ．ｍ．の攪拌）、増殖培地
における２−ＫＬＧの濃度は６．２５ｇ／ｌであった。

【００８７】プラスミドｐＰＬｒｅｄ３３２で形質転換
させたエルウィニア・シトレウスＥＲ１０２６を用い
て、２−ＫＬＧ収率の向上をさらに達成することができ
る。得られた菌株ＥＲ１１１６を上記と同様に増殖させ
た。しかしながら、実施例に記載した醗酵を２０時間後
に停止させる代りに、醗酵を１０ｇ／ｌのグルコースを
追加してさらに接種後１２時間延長した。

【００８８】さらに、２回にわたり１０ｇ／ｌのグルコ
ースの追加を醗酵の開始後３６時間および６０時間で行
った。醗酵ブロスにおける２−ＫＬＧの最終レベルは１
９．８３ｇ／ｌであり、これは４９．４％のグルコース
からの変換を示している。

【００８９】本発明の範囲または思想から逸脱すること
なく本発明において種々の改変を行うことができ、さら
にこの基本構成を変化させて本発明の方法および構成を
利用する他の具体例を与えうることが当業者には了解さ
れよう。したがって、本発明の範囲は実施例として示し
た特定具体例のみに限定されないことが了解されよう。

【００９０】

【発明の効果】本発明によれば、グルコースまたはその
他の炭素源を２−ＫＬＧまで急速かつ高収率で変換しう
る単一の生物を見出だすと言う問題を解決する。一具体
例において本発明は、グルコースまたはその他の炭素源
を２−ＫＬＧまで単一醗酵にて許容しうる変換割合に
て、中間的な生成物回収工程または中間的な精製工程な
しに変換するのに必要とされる全醗酵工程を行なうよ
う、宿主を形質転換しうる発現ビークルを提供する。本
発明を実施して得られる２−ＫＬＧを次いで上記の慣用
方法におけると同様にエステル化しかつアスコルビン酸
（ビタミンＣ）まで変換することができる。

【００９１】本発明の一利点は、遺伝子的に修飾された
生物体の単一株により単一醗酵にてグルコースから直接
に２−ＫＬＧの相当な収率を達成することである。した
がって、単一醗酵工程を使用しうる本発明の方法の能力
は公知工業方法よりも比較的簡単な方法をもたらし、し
たがって、グルコースからビタミンＣを製造するための
工程装置およびエネルギの必要性が少なくなる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における２，５−ＤＫＧレダクターゼの
Ｎ末端からの部分アミノ酸配列を示す説明図である。

【図２】本発明における２，５−ＤＫＧレダクターゼの
分子量１４，０００ダルトンの臭化シアノゲン断片に関
するアミノ酸配列の１部を示す説明図である。

【図３】本発明における２，５−ＤＫＧレダクターゼ遺
伝子を有するコリネバクテリウム・ゲノムの部分をハイ
ブリッド化により位置決定するのに使用される数種のヌ
クレオチドプローブの配列を示す説明図である。

【図４】本発明における２，５−ＤＫＧレダクターゼ遺
伝子のＤＮＡ配列および本発明における２，５−ＤＫＧ
レダクターゼの対応アミノ酸配列を示す説明図である。

【図５】プラスミド２１０^＊およびｐｃＢＲ１３からの
プラスミドｐＰＬｒｅｄ３３２の作成を示す説明図であ
る。

【符号の説明】

ＰＬ Ｐ_Ｌプロモータ Ｓ−Ｄ シャイン−ダルガルノ配列 ｏｒｉ 複製のオリジン Ｌａｃ ｌａｃプロモータ ａｍｐ−ｒ アンピシリン耐性遺伝子

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:18） Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｎ 9/04 (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:18） Ｃ１２Ｒ 1:18） (72)発明者 グリンドリー，ジューン アメリカ合衆国、カリフォルニア州 94501、アラミーダ、オーク パーク ドライブ 138 (72)発明者 ペイトン，マーク エイ スイス国、1226 ジュネーブ、アベニュ ー トロンシェ 22ベー

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２，５−ジケト−Ｄ−グルコネートレダ
   クターゼをコードし、かつ （ａ）式： 【化１】 のＤＮＡ配列、および （ｂ） 前記（ａ）において定義されたＤＮＡ配列によ
   ってコードされるアミノ酸と同じアミノ酸をコードする
   シノニムコドンによって、一つ以上のコドンが置換さ
   れ、かつ２，５−ジケト−Ｄ−グルコネートレダクター
   ゼをコードするＤＮＡ配列 よりなる群から選択されるＤＮＡ配列を特徴とする組換
   ＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 前記ＤＮＡ配列が分子中において発現制
   御配列に機能的に結合されている特許請求の範囲第１項
   記載の組換ＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 前記発現制御配列がｌａｃ系；β−ラク
   タマーゼ系；ｔｒｐ系；ｔａｃ系；ｔｒｃ系、ファージ
   λの主オペレータおよびプロモータ領域；ｆｄコート蛋
   白の制御領域、ＳＶ４０の早期および後期プロモータ、
   ポリオーマウィルスおよびアデノウィルス由来のプロモ
   ータ、メタロチオニンプロモータ、３−ホスホグリセレ
   ートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモータ、
   酸ホスファターゼのプロモータ（例えばＰｈｏ５）、酵
   母α−接合因子のプロモータ；例えばＳＶ４０の早期お
   よび後期プロモータのような哺乳動物細胞のプロモー
   タ、アデノウィルス後期プロモータ、並びにその他の原
   核もしくは真核細胞およびそのウィルスおよびそれらの
   組み合わせの遺伝子の発現を制御する配列よりなる群か
   ら選択される特許請求の範囲第２項記載の組換ＤＮＡ分
   子。
4. 【請求項４】 エルウィニア属およびイー・コリからな
   る群から選択され、かつ少なくとも一つの組換ＤＮＡ分
   子により形質転換された宿主からなり、前記組換ＤＮＡ
   分子は２，５−ジケト−Ｄ−グルコネートレダクターゼ
   をコードし、かつ （ａ）式： 【化２】 のＤＮＡ配列、および （ｂ） 前記（ａ）において定義されたＤＮＡ配列によ
   ってコードされるアミノ酸と同じアミノ酸をコードする
   シノニムコドンによって、一つ以上のコドン が置換さ
   れ、かつ２，５−ジケト−Ｄ−グルコネートレダクター
   ゼをコードするＤＮＡ配列 からなる群から選択されるＤＮＡ配列を特徴とし、前記
   ＤＮＡ配列が前記分子中で発現制御配列に機能的に結合
   されていることを特徴とする形質転換細胞。
5. 【請求項５】 前記宿主が、エルウィニア・シトレウス
   である特許請求の範囲第４項記載の形質転換細胞。
6. 【請求項６】 前記宿主が、エルウィニア・シトレウス
   ＳＨＳ２００３およびエルウィニア・シトレウス Ｅ
   Ｒ１０２６からなる群から選択される特許請求の範囲第
   ５項記載の形質転換細胞。