JPS63500493A - 遺伝子的に修飾された生物体を用いるビタミンｃの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝学的に改変した生物を用いる ビタミンＣ先駆体の製造 ［発明の技術分野］ 本発明はＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子、この種の配列および分子を含有する生物 、この種の生物による或る種の酵素の発現、並びにこの種の生物および酵素を用 いた醗屏によるビタミンＣ先駆体の製造に関するものである。より詳細には、本 発明は発現ビークル、並びにこのビークルにより形質転換されてグルコースまた はその他の炭素源を醗酵により２−ケトーし−グルコン酸（２−ＫＬＧ＞　、す なわちビタミンＣ（アスコルビン酸に対する化学先駆体まで変換させるために使 用する酵素を発現する遺伝学的に改変された生物に関するものである。

［従来技術］ ビタミンＣを製造するには幾つかの方法がある。１つの方法は、多数の化学合成 工程と１つの醗酵工程とを含む。要するに、これらの工程はグルコースからソル ビトールへの水素化と、アセトバクタ・サブオキシダンスを用いるソルビトール からソルポースへの鐙酵と、ソルボースのアセトン化と、２−ＫＬＧへのジアセ トン・ソルポース酸化と、２−ＫＬＧのエステル化と、エステルからアスコルビ ン酸への変換とである。この方法は複紺であり、かつ操作プラントのための比較 的高い投資を必要とする。

他の方法は２つの醗酵工程を含んでいる。この方法はエルウィニア・スベシース （Ｅｒｗｉｎｉａ　ｓｐ．　）によるグルコースから２．５−ジケトーＤ−グル コネート（２．５−ＤＫＧ＞への醗酵から出発し、コリネバクテリウム・スペシ ース（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．　）による２．５−ＤＫＧから ２−ＫＬＧへの胆酵と、２−ＫＬＧのエステル化と、このエステルからアスコル ビン酸への変換とを含む。１つの研究が示すところでは、Ｄ−グルコネートおよ び２−ケトーＤ−グルコネート（２−ＫＤＧ）がエルウイニア・スペシースによ りグルコースから順次に生成ざれた後、２．５−ＤＫＧが最初の醗酵工程で生成 される。王．ソノヤマ等、「２工程醗酵によるＤ−グルコースからの２一ケトー Ｌ−グロン酸の製造」、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロ バイオロジー、第４３巻、第１０６４〜１０６９頁（１９８２｝参照。この２工 程醗酵法は、アセトバクター法よりも若干低い投資額を有するが、まだ複雑であ って操作が高価につく。

グルコースを２−ＫＬＧまで変換するざらに他の方法が、ヨーロッパ特許出願第 １３２，３０８号明細書に記載ざれている。

この出願は、１工程の醗酵法でグルコースを２−ＫＬＧまで変換されることを記 載している。これは、先ず特定の２，５−ＤＫＧレダクターゼ（２．５−ＤＫＧ から２−ＫＬＧへの醗酵を触媒すると言われる酵素）゜をコードするＤＮＡ配列 の供給源としてコリネバクテリウム・スベシースＡＴＣＣ３１０９０を挙げてい る。このＤＮＡ配列は、それ自身のまたは合成のリポソーム結合部位を有して、 イー・コリｔｒｐもしくはｔａｃプロモータ或いは発現ベクターにおけるｐＡＣ ＹＣ１８４ＣＡＴプロモータの「下流」に挿入されると言われている。さらに、 このベクターはテトラサイタリン耐性またはその他の選択可能な標識をコードす る遺伝子を含有し、ら誘導される複製源を有するとも言われる。さらに、宿主細 胞であるエルウィニア・ヘルビコーラ（Ｆｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ　 ）（ＡＴＣＣ２１９９８）は、ベクターより形質転換されると言われる。醗酵に 際し、この形質細胞は１工程でグルコースから２−ＫＬＧを生産すると言われる 。しかしながら、この工程におけるグルコースから２−ＫＬＧへの変換は充分満 足しうるちのでない。何故なら、２−ＫＬＧの収率が極めて低くしたがって、た とえばグルコースのような炭素源を２−ＫＬＧまで許容しうる割合でかつ単一の 醗酵工程にて変換しうる単一の生物が目標とされており、これはまだ得られてい ない。

［発明の要点］ 本発明は、グルコースまたはその他の炭素源を２−ＫＬＧまで急速かつ高収率で 変換しうる単一の生物を見出すと言う問題を解決する。−具体例において本発明 は、グルコースまたはぞの他の炭素源を２−ＫＬＧまで単一醗酵にて許容しうる 変換割合にて、中間的な生成物回収工程または中間的な精製工程なしに変換する のに必要とされる全醗酵工程を行なうよう、宿主を形質転換しうる発現ビークル を提供する。本発明を実施して得られる２−ＫＬＧを次いで上記の慣用方法にお けると同様にエステル化しかつアスコルビン酸（ビタミンＣ）まで変換すること ができる。

させるための公知の工業１１ｅ工程は、グルコースを２−ＫＬＧまで変換させる のにたとえばエルウィニアおよびコリネバクテリウムの菌株など２種の別の生物 を必要とする。

本発明の一利点は、遺伝学的に改変された生物の単一株により単一醗酵にてグル コースから直接に２−ＫＬＧの相当な収率を達成することである。したがって、 単一醗酵工程を使用しうる本発明の方法の能力は公知工業方法よりも比較的簡単 な方法をもたらし、したがってグルコースからビタミンＣを製造するための工程 装置およびエネルギの必要性が少なくなる。

本発明の他の目的は、ヨーロッパ特許出願箱１３２，３０８号明細書に記載され たものよりも優れた新規な２．５−ＤＫＧレダクターゼおよび新規な形質転換生 物を提供し、したがって本発明の方法および生成物はヨーロッパ特許出願箱１３ ２，３０８号における方法および生成物よりも予想外に改善されかつ特許性を有 するものである。

本発明のさらに他の目的および特徴は、以下の記載から明らかとなるであろう。

［図面の簡単な説明］ 第１図は本発明における２、５−ＤＫＧレダクターゼのＮ末端からの部分アミン 酸配列を示し、 第２図は本発明における２、５−ＤＫＧレダクターゼの分子［１４，０００ダル トンの臭化シアノゲン断片に関するアミノ酸配列の１部を示し、 ゼ遺伝子を有するコリネバクテリウム・ゲノムの部分をハイブリッド化により位 置決定するのに使用される数種のヌクレオチドプローブの配列を示し、 第４図は本発明における２、５−ＤＫＧレダクターゼ遺伝子のＤＮＡ配列および 本発明における２、５−ＤＫＧレダクターゼの対応アミノ酸配列を示し、 第５図はプラスミド２１０＊およびｐＣ８Ｒ１３からのプラスミドｐＰＬｒｅｄ ３３２の作成を示し、第５図において記号は次の意味を有する：ＰＬ＝Ｐ１プロ モータ：５−Ｄ＝シャインーダルガルノ配列；ｏｒ　ｉ＝複製のオリジン＝１− ａｃ＝ｌａｃプロモータ：ａｍｐ−ｒ＝アンピシリン耐性遺伝子。

［本発明を実施する最良の方式］ 本発明を一層充分に理解しうるよう、以下詳細に説明する。

この説明において、以下の幾つかの用語を使用する：ヌクレオチド：糖成分（ペ ントース）と燐酸と含窒素複素環塩基とよりなるＤＮＡもしくはＲＮＡのモノマ ー単位である。この塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介して糖 成分に結合され、塩基と糖との組合せをヌクレオシドと呼ぶ。塩基はヌクレオチ ドを特性化する。、４種のＤＮＡ塩基はアデニン（ｒＡＪ　）　、グアニン（ｒ ＧＪ　）　、シトシン（ｒｃＪ　）およびチミン（ＩＴＪ　）である。４種のＲ ＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（ｒＵＪ　）である。ＤＮＡに関し、「Ｐ 」はプリン（ＡもしくはＧ）のいずれかを示し、「Ｑ」はピリミジン（Ｃもしく はＴ）のいずれかを示し、かつｒＮＪは４種の塩基（Ａ、Ｇ、ＣもしくはＴ）の いずれかを示す。ＲＮＡに関しｒＰＪ、ｒＱＪおよびｒＮＪは、ｒＵＪをｒＴＪ の代りに用いる以外は同じ意味を有する。

ＤＮＡ配列：隣接するペントースの３′炭素と５′炭素との間のホスホジエステ ル結合により互いに結合されたデオキシヌクレオチドの線状列である。

コドン：３種のヌクレオチド（トリプレット）のＤＮＡ配列であって、そのｍＲ ＮＡを介しアミン酸、翻訳開始信号または翻訳停止信号をコードする。たとえば 、ヌクレオチドトリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ，ＣＴＡおよびＣ ＴＧはアミノ酸ロイシン（ｒＬｅｕＪ　）をコードし：ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴ ＧＡは翻訳停止信号であり、かつＡＴＧは翻訳開始信号であって、ざらにメチオ ニンをもツ一群である。翻訳に際し、適切な解読枠を維持せねばならない。

たとえば、ＤＮＡ配列Ｇ　ＣＴ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｇは３つの 解読枠もしくは相で発現すること力（でき、そのそれぞれは次の異なるアミノ酸 配列を生ずる： ＧＣＴ　ＧＧＴ　Ｔ（、Ｔ　ＡＡＧ　−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＬｙｓＯＳ工 ９９！工　９工Δ　ＡＧ　−Ｋ、ａｕ−ＶａニーＶａ工にＣＴＧＧ　ＴｒＧ　Ｔ ＡＡ　Ｇ−τｒｐ　−に、ｅｕ−（Ｓτｏｐ）ポリペプチド：隣接するアミノ酸 のα−アミン基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに結合された アミノ酸の線状列である。「ポリペプチド」と言う用語を本明細書中で使用する 場合、「蛋白」と言う用語を包含することが当業者には了解されよう。

ゲノム：細胞またはウィルスの全ＤＮＡである。これは特−に細胞のポリペプチ ドをコードするＤＮＡ、並びにオペレータ、プロモータおよびリポソームの結合 および相互作用配列を包含し、たとえばこれらコード配列のそれぞれにつきシャ インーダルガルノ配列のような配列を含む。

遺伝子：特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸の配列を雛型もしくはメツセン ジャＲＮＡ　（ｒｍＲＮＡＪ　）を介してコードするＤＮＡ配列である。

Ｒ貝：ポリペプチドを生産すべく遺伝子によって受（プる過程である。これは、 ＤＮＡ配列からｍＲＮＡ配列への転写およびｍＲＮＡ配列からポリペプチドへの 翻訳を含む。

プラスミド：完全「レプリコン」を含んでプラスミドを宿主細胞にて複製するよ うな非染色体二重鎮ＤＮＡ配列である。

プラスミドを単細胞生物中に組込むと、この生物の特徴はプラスミドにおけるＤ ＮＡの結果として変化しまたは形質転換する。たとえば、テトラサイクリン耐性 （ＴｅｔＲ）の遺伝子を有するプラスミドは、テトラサイタリンに対し感受性で ｆｄコート蛋白の制御領域、ＳＶ４０の早期および後期プロあった細胞をこれに 対し・耐性の細胞に形質転換させる。プラスミドにより形質転換された細胞を「 形質転換体」と呼、Ｓ−。

ファージもしくしバクテリオファージ：細菌性ウィルスである。多くのファージ は、蛋白エンベロブもしくはコートにカプセル化されたＤＮＡ配列（「カプシド 」）で構成される。

クロ、−ン化ビークル：宿主細胞中で複製しうるプラスミド、ファージＤＮＡま たはその他のＤＮＡ配列である。クローン化ビークルは１個もしくは少数のエン ドヌクレアーゼ認識部位を特徴とし、これらの部位においてＤＮＡ配列はＤＮＡ の本質的な生物学的機能、たとえば複製、コート蛋白の生成の喪失を伴わずに或 いはプロモータもしくは結合部位の喪失を伴わずに決定可能に切断することがで きる。クローン化ビークルは一般に形質転換細胞の同定に使用するのに適したマ ーカー、たとえばテトラサイクリン耐性もしくはアンピシリン耐性を有する。ク ローン化ビークルはしばしばベクターと呼ばれる。

クローン化：生物群または１種の生物もしくは配列から誘導されるＤＮＡ配列を 無性繁殖によって得る過程である。

組換ＤＮＡ分子、すなわ亡イエ粒ドＤＮＡ：生細胞の外部で末端結合された異な るゲノムからのＤＮＡの断片からなり、生細胞中に維持しうる分子である。

発現制御配列二Ｍ伝子に作用結合された際これら遺伝子の発現を制御しかつ調整 するヌクレオチドの配列である。これらはｔａｃ系、β−ラクタマーぜ系、ｔｒ ｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域、 マーゼ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主モータ、ポリオーマ ウィルスおよびアデノウィルスから誘導されるプロモータ、メタロチオニン・プ ロモータ、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモ ータ、酸ホスファターゼのプロモータ（たとえばＰｂｏ２）、酵母α、−接合因 子めプロモータ、並びに原核もしくは真核細胞およびそのウィルスまたはその組 合せの遺伝子の発現を制御することが知られた配列を包含する。＠乳動物細胞の 場合、遺伝子は真核プロモータに結合することができ、たとえばＳＶ４０の早期 領域はジヒドロホレートレダクターゼをコードする遺伝子に結合しかつ支那ハム スター卵細胞で選択的に増殖して活性転写された真核遺伝子の多数のコピーを含 有する細胞ラインを生成することができる。

−具体例において、本発明はコリネバクテリウム・スベシースＳ　ＨＳ　７５２ ００１から得られる組換ＤＮＡ分子に向けられ、これは本発明の２．５−ＤＫＧ レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を特徴とする。他の具体例において、本発 明はこの種の組換ＤＮＡ分子により形質転換された宿主、好ましくはエルウィニ ア・シトレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃｉｔｒｅｕｓ　）に向けられる。

本発明の組換ＤＮＡ分子は、本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼをコードする ＤＮＡ配列および組換ＤＮＡ分子におけるこのＤＮＡ配列に作用結合される発現 制御配列を特徴とする。広範な種類の発現制御配列を、本発明の組換ＤＮＡ分子 に使用することができる。これらはｔａｃ系、β−ラクタ／Ｔ／＼レーメｄ５訴 υｊ［−Ｊｔ−夕淑滅、ＴＯコート虫臼の旧ｊ樹１狽域、ＳＶ４０の早期および 後期プロモータ、ポリオーマウィルスおよびアデノウィルスから誘導されるプロ モータ、メタロチオニンブロモータ、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはそ の他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータ（たとえばＰｂ ｏ２）、酵母α−接合因子のプロモータ、ネオマイシンホスホトランスフェラー ゼのプロモータ、並びにその他の原核もしくは真核細胞およびそのウィルスまた はその組合せの遺伝子の発現を制御することが知られた配列を包含する。哺乳動 物細胞の場合、遺伝子は、たとえばジヒドロホレートレダクターゼをコードする 遺伝子に結合されかつ支那ハムスター卵細胞で選択的に増幅されて、その多数コ ピーを含む細胞ラインを生成するＳＶ４０早期領域のプロモータなどの真核プロ モータに結合することができる。

さらに、本発明の組換ＤＮＡ分子は、各種のプラスミドおよびこれらを選択宿主 中で複製させうるファージ−がらのＤＮＡ配列を含むことができる。好ましくは 、さらにこれらは選択マーカー、たとえば薬剤耐性をコードするＤＮＡ配列をも 包含する。この種のプラスミドおよびファージ配列はたとえば染色体、非染色体 および合゛成のＤＮＡ配列の断片から誘導することができ、たとえばＳＶ４０お よび公知の細菌性プラスミド、たとえばｃｏｔ　Ｅｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３３２ 、ｐＭＢ９およびその誘導体を含むイー・コリからのプラスミド、広範な宿主範 囲のプラスミド、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえばファージλの多数 の誘導体くたとえばＮＭ９８９）、並びにその他のＤＮＡファージ（たとえばＭ １ラスミ下およびファージＤＮＡの組合体、たとえばファージＤＮＡもしくはそ の他の発現制御配列を用いて改変されたプラスミド、或いはたとえば２μプラス ミドもしくはその誘導体のような酵母プラスミドから誘導されるベクターとする ことができる。

勿論、全てのベクターおよび発現制御配列が同様に機能して本発明の改変ＤＮＡ 配列を発現しかつ本発明の新規な２゜５−ＤＫＧレダクターゼを生産するとは限 らないことを了解すべきである。また、全ての宿主が同じ発現系にて同等に機能 するとも限らない。しかしながら、当業者はこれらベクター、発現制御配列およ び宿主のうちから不当な実験を伴わずにかつ本発明の範囲を逸脱することなく選 択を行なうことができる。たとえば、ベクターを選択するには宿主を考慮せねば ならない。何故なら、ベクターがそこで複製せねばならないからである。ベクタ ーのコピー数、このコピー数を制御する能力およびベクターによりコードされる その他任意の蛋白の発現（たとえば抗生物質マーカー）も考慮せねばならない。

発現制御配列を選択するには、各種の因子も考慮せねばならない。これらは、た とえばこの系の相対的強度、その制御可能性、並びに本発明の２．５−ＤＫＧレ ダクターゼをコードするＤＮＡ配列に対する適合性、特に有力な二次＠造を包含 する。

本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼに対するＤＮＡ配列を用いて、広範な種類 の宿主、たとえばイー・コリの菌株のような細菌類（たとえばイー・コリＣ６０ ０、イー・コリＥＤ８７６７、イー・コリＤＨ１、イー・コリＬＥ３９２、イー ・コリＨＢｉｏｔ、イー・コリｘ１７７６、イー−ｍｌすｘ　２２８２、イー・ コリＭＲＣ１）或いはシュードモナス、バチルスおよびストレプトミセス、酵母 並びにその他の真菌類の菌株、動物宿主、たとえば支那ハムスター卵細胞もしく はネズミ細胞、その他の動物（ヒトを含む）宿主、培養植物細胞またはその他の 宿主などにおいてこのレダクターゼを生産させることができる。

発現の後、゛酵素は２．５−ＤＫＧを２−ＫＬＧまで変換するのに使用すること ができる。

本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼのＤＮＡ配列に関する宿主は、一般に選択 ベクターに対する適合性、宿主に対する本発明の２．５−ＤＫＧの毒性、宿主細 胞酵素による蛋白分解減成に対する所望蛋白の感受性、精製に際し除去するのが 困難な宿主細胞蛋白による２、５−ＤＫＧレダクターゼの汚染もしくは結合、発 現特性、２．５−ＤＫＧレダクターゼを生産しかつ分泌する宿主の能力、正確に レダクターゼを複製する宿主の能力、宿主の醗酵要件、宿主からの２，５−ＤＫ Ｇレダクターゼの精製の容易さ、安全性、並びにコストを考慮して選択すべきで ある。

一具体例において、宿主としてはエルウィニア・シトレウスＳ　Ｈ３２００３を 選択する。何故なら、これはグルコースから２．５−ＤＫＧを生産しかつ２−Ｋ ＬＧを形質転換されたエルウィニア・シトレウスＳ　ＨＳ　２００３によりグル コースから直接に生産しうるからである。

特に好ましくは、本発明の宿主はエルウィニア・シトレウスＳ　Ｈ３２００３（ Ｆ　ｅ　ｒｍ　−ＰＮｏ、５４４９　：　ＡＴＣＣＮｏ、　３１６２３）並びに アルライニア・シトレウスＳ　ＨＳ　２００３から突然変異された菌株、すなわ ちエルウィニア・シトレウスＥ　Ｒ１０２６でおり、これは唯一の炭素源として ２．５−ＤＫＧもしくは２−ＫＬＧのいずれかを使用することができない。

以下の実施例は本発明の幾つかの具体例を示しているが、本発明の範囲を限定す る目的でない。

Ｘ思■ 本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼのポリペプチド配列の同定、並びにクロー ン化ベクターの作成コリネバクテリウム・スペシーズＳ　ＨＳ　７５２００１は 、■、ソノヤマ等、「２段階醗酵によるＤ−グルコースからの２−ケトーＬ−グ ロン酸の製造」、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオ ロジー、第４３巻、第１０６４〜１０６９頁（１９８２）に記載されている。す なわち、コリネバクテリウムの開示された菌株を、２．５−ＤＫＧレダクターゼ をコードするＤＮＡ配列の供与体として選択した。コリネバクテリウムのこの菌 株からの２．５−ＤＫＧレダクターゼ遺伝子を同定するため、酵素の試料を分離 しかつ次の手順を用いて純度９５％まで精製した： Ａ、　コリネバクテリウムＳ　ＨＳ　７５２００１の培養１、　コリネバクテリ ウム・スペシーズＳ　ＨＳ　７５２００１の凍結乾燥培養物を、開放直後に０． ４Ｉｎｌの０．９％Ｎａｐ（１２０°Ｃにて２０分間殺菌したもの）を前記凍結 乾燥培養物を含有す母抽出物（ディフコ社）と０．５％のペプトン（ディフコ社 ）と０．１％のに８２　ＰＯ４と０．０２％のＭＣｌＳＯ４・７Ｈ２０と２．０ ％の寒天とを含有する溶液８Ｉｎｌを入れた試験管に移した。この溶液のｐＨは ７８０であり、かつこの溶液は１２０°Ｃで１５分間殺菌されている。２８℃に て培養物を添加してから４０時間後、培養物を１２０℃にて２０分間殺菌されて いる０、９％Ｎａαの０．４戒で懸濁させた。

３、　工程２からの懸濁物ｏ、ｉ威よりなる５個のロットを、工程２の溶液と同 じ成分を含有する５本の寒天スラントに加えた。これら培養物を工程２と同じ時 間かつ同じ条件下で醗酵させた。培養物を５ｄの０．９％Ｎａα（１２０℃にて ２０分間殺菌したもの）で懸濁させ、かつ２．５ｍｌの懸濁物を５００ｄの培地 を含有する１０本の種フラスコのそれぞれに移した。

４、　１％のグルコースと０．５％の酵母抽出物（ディフコ社）と０．５％のペ プトン（ディフコ社）と０．１％のＮａＮＯ３と０．１％のＫＨ２ＰＯ４と０． ０２％のＭｇ５Ｏａ・Ｈ２Ｏとを含有しかつｐＨ７，０を有する溶液を１２０℃ にて１５分間殺菌した。この溶液６０ｄを、培養物を含有する５００ｍフラスコ に添加した。２８℃にて１６〜１８時間培養した後、１０本のこれら５００ｄフ ラスコの培養内容物を３ＯＮのジャーファーメンタに移した。

５、１．８％のグルコースと２．７％のコーンスヂープ、りカーと０．３１％の ＮａＮＯ３と０．０６％のＫＨ２ＰＯ４と４、４ｐｐｍのＺｎＳＯ４・７Ｈ２０ と０．７２ｐｐｍのＭｎＣｌ２・４日２０と０．２ｐｐｍのビタミンＢ１−ＨＧ と０．１５ｐｐｍのパンＩ・テン酸カルシウムと０．００５％の消泡剤（アデカ ノール）とを含有するｐＨ７，２の溶液２０４２を、培養物を含有する３０２の ジャーファーメンタに加えた。このファーメンタを４０Ｏｒｐｍにて撹拌しなが ら０．５ｖ、　ｖ、　ｍ、の空気流速にて２８℃で培養した。

培地からグルコースが浦失した時（２２時間）、醗酵を停止させた。最終ｐＨは ７．５であり、最終ＯＤは１９，２であった。

Ｂ、　細胞抽出物の作成 約７５０ｇの菌体を、シャープレス遠心分離器を用いて遠心分離（１０，０ＯＯ Ｇにて１０分間）することにより３０６ジヤーフアーメンタから収穫した。これ ら菌体を０．１Ｍ−ＨＣｆ！緩衝液（ｐＨ７，２，！Ｍ）に懸濁させ、同じ緩衝 液（それぞれの場合２．５℃づつ）で遠心分離器により３回洗浄し、最後に１， ６！の緩衝液中に再懸濁させた（ＯＤ　１５０）。これら菌体（８０ｄの菌体懸 濁物として）を音波処理（１６０ワツトにて７分間）により破壊した。破壊され ない菌体および残骸を遠心分離（１５，０ＯＯＧで３０分間）により除去し、か つ上澄液（１Ｌ）を集めた。

Ｃ，Ａｍ５Ｏａによる分画 ４０％飽和と７０％飽和との間で沈澱した蛋白物質を遠心分離により集め、かつ ８０ａ！！のｏ、ｉＭトリスート１ｃ！！緩衝液（ｐＨ７）に再溶解させた。こ の溶液をｐｆ−１７の０．０２Ｍトリス−ＨＣ１緩衝液に対し１晩透析した。

Ｄ、　イオン交換クロマトグラフィー 透析した溶液（９９７）を、予め０．０２Ｍトリス−ｉ−＋ａｗ衝液（ｐＨ’７ ）で平衡化させたＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂカラム（１，６ｘ３０ｃｍ ）に入れた。このカラムをそれぞれＯおよび０．２ＭのＮａＣ１を含有する０、 ０２Ｍトリス−Ｈα緩衡液（ｐＨ７＞で段階的に洗浄した。酵素を、０．３ＭＮ ａＱ！を含有する同じ緩衝液（ｐＨ７）で溶出させた。活性フラクションを集め 、かつＡｍ５０４を１０％飽和まで添加することにより蛋白を濃縮した。沈澱物 を集め、かつ工程Ｃにおけると同様に透析した。

Ｅ、　第１親和性クロマトグラフイー ■程りから得られた透析溶液（３７ｍｅ）を、予め０．０２　Ｍトリス−ＨＣ１ ２緩衝液（ｐｔ−１７＞で平衡化されたアミコン・マトリックス・レッドＡカラ ム（１，６ｘ　１９ｃｍ＞に入れた。このカラムを０．３〜０．５ＭのＮａＧを 含有する０、０２Ｍトリス−ＨＧ緩衝液（ｐｌ−１７）で段階的に洗浄した。酵 素を、０．７〜１．０ＭのＮａＱ！を含有する同じ緩衝液で溶出させた。活性フ ラクション（９０ｍｌ）を集めた。

Ｆ、　第２親和性クロマトグラフイー （）、０２Ｍトリス−ＨＧ緩衝液（１）Ｈ，２２５ｄ＞を工程Ｅから集めたフラ クションへ添加し、かつ得られた溶液を予め０．０２Ｍトリス−Ｈｃ２緩衝液（ ｐｌ−１７＞で平衡化されたアミコン・マトリックス・レッドＡカラム（１，９ ｘ　１２．３ｃｍ）に入れた。このカラムを、０．２ＭのＮａＧを含有０．０２ Ｍトリス−ＨＣ１！緩衝液（ｐｔ−１７＞で洗浄した。酵素を、０．５ｍ）Ｉの ＮＡＤＰＩ−１を含有する同じ緩衝液で溶出させた。活性フラクション（３５ｒ ＩＬ２）を集め、限外濾過（分子ｉ　１０．０００以下のカットオフ）により濃 縮してＮＡＤＰＨを除去した。

本ｉ明の２．５ＤＫＧレダクターゼが音波処理工程に際し変性されなかったこと を示しかつ本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼが２．５−ＤＫＧを２−　Ｋ　 Ｉ−Ｇに変換させることを確認するため、７ｍｑのＮＡＤＰＨと２ｍｇの２，５ −ＤＫＧと２．５ｍＭμ２の全蛋白濃度の菌体音波処理物５０成とを含有する０ 、１Ｍトリス−Ｈα緩衝液（ｐＨ７）の混合物を作成した。全反応容積は２００ μｉであった。反応の生成物をＨＰＬＣにより分析し、かつ２−ＫＬＧの存在を 確認した。

本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼに対する抗体を作成した。これらの抗体は 、ウサギの複数部位に対しフロインドアシュパン１−における本発明の２．５− ＤＫＧレダクターゼ１００ＪＪ９ｊを皮肉注射し、かつフロインド不完成溶液に おける酵素５０ｉにて２１日後に加速させることにより発生した。加速注射して から１０日後に血清を集め、酵素結合免疫吸収（ｒＥＬＩＳＡＪ）分析にて、本 発明の抗−２，５−ＤＫＧレダクターゼ活性につき陽性でおることが示された。

この精製酵素を、アプライド・バイオシステムス社により製作された高感度気相 配列決定装置によりＮ−末端から配列決定した。この方法により得られた部分配 列を第１図に示す。

第１図における？マークは、特定アミノ酸が確実性をもって決定しえなかったこ とを示している。

さらに、精製酵素を標準臭化シアノダン切断法により切断した。この方法により 生成された１種の１４，０００ダルトンの断片におけるアミノ酸配列の１部を第 ２図に示す。　゛クローンの保存物から本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼを コードするＤＮＡ配列を選択するため、ホスホトリエステル法を用いて一連のオ リゴヌクレオチドプローブ（第３ａ〜ｅ図に示す）を作成した。これらのプロー ブは、第１図および第２図のアミノ酸配列から誘導したものである。

遺伝子コードの縮退により、各プローブは実際上１群の構造的に関連した分子で あった。たとえば、第３ａ図の１４量体ＤＮＡプローブは予想配列に対し１個の Ｃ−Ｔ不整合を伴う９ｅノ重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ　）を有し、第３ｂ図の １４量体ＤＮＡプローブ（第１図のプローブ■）は１個のＧ−Ｔ不整合を伴う３ ２の重複を有し、第３Ｃ図および３ａ図の１７量体ＤＮＡプローブ（第１図のプ ローブ■）はそれぞれ３２の重複を有しかつ互いに最初の２個の位置においての み相違し、ざらに第３ｅ図の１４量体ＤＮＡプローブ（第２図のプローブＩＶ　 ）は３２の重するようコリネバクテリウムＤＮ’Ａの保存物を作成するため、（ １ｍＭｆりと１ｍＨＥＤＴＡと２０％（Ｗ／Ｖ）（７）蔗ｔＱ４　トド７シル５ Ａ酸ナトリウム（ＳＤＳ）（５ｍａ／ｍ！ｌ）とで処理するごとにより、コリネ バクテリウム・スペシーズＳ　Ｈ３７５２００１を溶菌させた。次（、Ａで、溶 菌したコリネバクテリウム・スペシーズＳ　ＨＳ　７５２００１ｉ体からのＤＮ Ａを、１５０ｍＨＮ　ａｃ！と６　ｍ！−１μ９／ｍｌの牛血清アルブミンとか らなる緩衝液において制限エンドヌクレアーゼ５ａｕ３ａにより断片化させた。

次いで、これらＤＮＡ断片を、Ｊ、ビエラおよび、Ｌ　Ｒ，メツタンプ、シーン 、第１９巻、第２５９頁（１９８２）の方法により旦ａｍＨ１部位にてｐＵｃ８ ベクター中へ挿入し、かつ組換プラスミドを大腸菌ＪＭ８３、Ｗ　３１１０　ｉ 　ｑおよびＷ３ｔｌＯｉｑｒ　ｅ　ｃ　Ａに形質転換させた。組換プラスミドか らイー・コリＪＭ８３への形質転換法は、Ｊ、Ｒ，メッタンプ、Ｒ，コレア、Ｐ 、Ｈ。

シーブルグ、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第９巻、第３０９頁（１９８ １）に示されている。他の宿主菌株につき同様な方法を用いた。

得られた保存物のコロニーを、Ｒ，Ｂ。ワレス、Ｍ、Ｊ。

ジョンソン、王、ヒロセ、Ｔ、ミャケ、Ｅ、１」。カワシマおよびに、イタクラ 、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第９巻、第８７９〜８９４頁（１９８１ ）に記載された方法を用いて第３（ａ−ｅ）図のプローブでスクリーニングした 。これらプローブを３７°Ｃでハイブリッド化させ、かつ６ｘＳＳＣと５ｘデン ハルト緩衝液と０．１％ＳＤＳと５０ｕａ／ｍＩ！ｔ　−ＲＮ　Ａとからなる標 準洗浄液にて３７°Ｃで洗浄した。第３ｅ図のプローブに対し陽性（ハイブリッ ジ化したもの）であった１７種のコロニーのうち、２種はざらに第３Ｃ図もしく は３ｅ図のクローンまたはその両者に対しても陽性であった。これらクローンの ２神の組換プラスミドをＤＣＢＲＩＯおよびｐＣＢＲ１３と命名した。これら２ 種の組換プラスミドのそれぞれにおけ形質転換宿主、２種の組換プラスミドおよ びｐＵｃ８による本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼの生産速度を含む組換プ ラスミドの性質を決定するため、本発明の２，５−ＤＫＧレダクターゼをコード するＤＮＡを有していないベクターを、Ｓ、Ｎ、コーヘン、Ａ、Ｃ，Ｙ、シヤツ クおよびり。

シュ、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第６ ９巻、第２１１０頁（１９７２）に示された方法によりイー・コリＷ３１１０ｉ 　Ｑ　ｒ　ｅ　ｃＡおよびエルウィニア・プンクタータ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｐｕ ｎｃｔａｔａ）に形質転換させた。ｐＢＲ３３２に関連するベクターｐｕｃｓは 、Ｂａｍ８１部位から僅か上流に位置する強力な！ａＣプロモータを有する。

本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼを生産した形質転換細胞から２，５ＤＫＧ レダクターゼを放出させてその生産割合を測定しうるよう、幾つかの方法を検査 した。音波処理がイー・コリおよびエルウィニアにつき最良であると判明した。

ｐｃＢＲｌｏおよびＤＣＢＲ１３を含むイー・ブンクタータおよびイー・コリの 抽出物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３ −ＰＡＧＥ）［Ｕ、に、ラムダ、ネイチャー、第２２７巻、第６８０〜６８５頁 （１９７０）　］　、並びにウェスタン・プロット法［Ｐ、Ｓ、トーマス、プロ シーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７７巻、第５ ２０１〜５２０５頁（１９８０）　］によってＤＫＧレダクターゼ）抗体を用い て形質転換体により生産された本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼの量を測定 した。

［ａＣインデューサであるイソプロピルβ−・Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ ＰＴＧ）で処理されたイー・コリＷ　３１１０ｉ　ｑｒｅｃＡ　（ｐｃＢＲ１３ ）の抽出物は、この遺伝子を有するプラスミドで誘発されていない菌体からの抽 出物よりも約５倍量の酵素を含有した。

本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼが組換の際に変化しなかったことの確認 ｐＣＢＲｌｏおよびｐＣＢＲ１３での形質転換後にイー・プンクタータおよびイ ー・コリにより生産された２、５−ＤＫＧレダクターゼを検査して、これがコリ ネバクテリウム・スペシーズＳ　ＨＳ　７５２００１から分離されたと同じ酵素 であったかどうかを調べた。

エルウィニア（ｐＣＭＲ１３）、イー・コリＷ３１１０　ｉ　”ｒｅｃＡ　（ｐ ＣＢＲ１３）およびコリネバクテリウムの抽出物のウェスタンプロッドにより標 識された蛋白の分子量は、本発明の精製２，５−ＤＫＧレダクターゼの分子量と 同じであった（すなわち、約２９，０ＯＯｄ　）。異なる菌体に対するプロット の比較に基づき、エルウィニア（ｐＣＢＲ１３）の仝菌体蛋白の１〜２％が本発 明の２．５−ＤＫＧレダクターゼでおると推定された。

さらに、λＰＬプロモータ、すなわちλＣＩリプレッサ蛋白により制御しうる強 力なプロモータを用いて作成を行なつせることにより制御することができる。組 換菌株からの２−に、ＬＧの収率増加が、このプロモータ系を用いて得られた。

第５図は、λＰＬプロモータの制御下で２．５−ＤＫＧＬ／ダクターゼを発現す るプラスミドを作成するために用いたベクターの物理的地図を示している。プラ スミドｐＰＬｒｅｄ３３２は、プラスミドｐｃＢＲ’１３からの２．５−ＤＫＧ レダクターゼをコードする断片をプラスミドｐ　２１０＊中へ挿入して作成した 。挿入した断片は、Ｉ）ＣＢＲ１３を制限エンドヌクレアーゼＥ　Ｃ’ＯＲＩお よび＠　ｉ　ｎｄｌＩ［で切断して生ぜしめた。これら２種の断片を、低融点の アガロースを用いて電気泳動により分離した。さらに、このベクターをＥＣ０Ｒ ＩおよびＨｉ　ｎｄＩ［Ｉで切断しく第５図参照）、適当な断片を結合させうる ようにした。得られたプラスミド、すなわちｐＰＬｒｅｄ３３２を菌株ｗＳｉｔ ｏｃ　Ｉ　ｚ　ｓ中に形質転換させて菌株ＥＣ１０８３を形成させた。この菌株 は、ラムダ温度感受性からの挿入物とからなるプラスミドｐＰＬｒｅｄ３３２は 、物をマキサムおよびギルバー１〜の技術［プロシープインク・ナショナル・ア カデミ−・サイエンス・ＵＳＡ、第７４巻、第５６０頁（１９７７）並びにＡ、 　ＩＶＬマキサムおよびＷ、ギルバート、メソッズ・エンチモロジー、第６５巻 、第４９９〜５６０頁（１９８０）］ｃｌ＞よびプラスミド〜１１３を用いるサ ンガーの配列決定、［Ｆ、サンか−、Ｓ、ニラケレンおよびＡ、Ｒ，クールセン 、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ｔ、ｉＳＡ、第７ ４巻、第５４６３〜５４６７頁（１９７７）　］によって配列決定した。、、３ ．Ｏｋｂ挿入物の配列検査は、酵素自身につき決定された最初の６０個のアミノ 酸（第１図に示す）をほぼ正確にコードする配列を示した。ざらに、３．０ｋｂ 挿入物は、第２図のアミノ酸配列をほぼ正確にコードする配列をも含有した。３ ．Ｏｋｂ挿入物におけるレダクターゼ遺伝子の末端は、停止コドンによって示さ れる。このようにして、レダクターゼ遺伝子は長さ８３１個のヌクレオチドであ ると決定され（停止コドンがなく、かつＡＴＧ、すなわち開始コドンを含む）、 さらにその配列を第４図に示す。

本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は 、ヨーロッパ特許出願用１３２．３０８＠のポリペプチドをコードするＤＮＡ配 列およびそのアミノ酸配列と対比することができる。第４図は本発明の２．５− ＤＫＧレダクターゼに関するＤＮＡ配列とアミノ酸配列との両者を示している。

ヨーロッパ特許出願用１３２，３０８号の第４図は、そのポリペプチドの関連Ｄ ＮＡ配列およびアミノ酸配列を示している。これら２つの図面を比較すれば、明 らかにｐＣＢＲ１３により特定されると同じ分子量をｉする２、５−ＤＫＧレダ クターゼをイー・コリおよびエルウィニア・シトレウスの両者において特定する 。

エルウィニア・シトレウスＥＲ１０２６をｐＰＬｒｅｄ　３３２で形質転換させ て菌株Ｅ　Ｒ１１１６を形成させた。

本発、明による２、５−ＤＫＧレダクタ−Ｕのアミノ酸およびＤＮＡ配列を確認 するため、ｐｃＢＲ１３の３．Ｏｋｂ挿入の２．５−ＤＫＧレダクターゼとその ＤＮＡ配列とがヨーロッパ特許出願用１３２．３０８号のアミノ酸配列およびＤ ＮＡ配列とは明らかに相違していることが示される。

酵素のミバエリス定数（Ｋｒｎ＞は、この酵素の反応速度の尺度となる。この数 値が低い程、酵素の活性（すなわち速度）が大である。ヨーロッパ特許出願用１ ３２．３０８＠明細書に報告された２、５−ＤＫＧに対するミバエリス定数は１ ５．５曲であり、かつ本発明の２．５−ＤＫＧレダクターゼに対するミバエリス 定数（コファクターとして１００μＭのＮＡＤＰＨを用いる）は０．１Ｍトリス −ｔ−（Ｃ！（ｐＨ７，（））にて３０℃で２．０ｍＭである。

次の手順は、本発明の遺伝学的に改変した生物を用いるグルコースから２−ＫＬ Ｇ、すなわちビタミンＣ先駆体への醗酵を示している。

醗酵研究所（ヤタベ）に寄託したＦ　Ｅ　ＲＭ　−ＰＸａ５４４９のエルウィニ ア・シトレウスＳＨ３２００３は、通常、グルコースを２゜５−ＤＫＧに変換さ せる酵素を発現する。この菌株を、上記したように本発明の２．５−ＤＫＧレダ クターゼをコードする遺伝子を含んだｐＣＢＲ１３によってＳ、Ｎ、コーヘン、 Ａ、Ｃ，Ｙ、チヤツクおよびり、シュ、プロシーディング・ナショナル・アカデ ミ−・サイエンス・ＬＩＳＡ、笥６９巻、第２１１０頁（１９７２）に示された 方法により形質転換させた。かくして、ＥＲ８１７と命名したこの得られた菌株 は、単一の醗酵にてグルコースを２−ＫＬＧに変換させるのに必要な全ての酵素 に関する遺伝子を含有する筈である。

菌株ＥＲ８１７を、アンピシリン（４０℃１ｇ／ｄ＞を含有するし一ブロス寒天 のプレートに接種した。この菌株は、Ｌ−ブロス＋１５％グリセリン中で一７０ ℃にて保存した保存培養物から得たものである。このプレートを１８℃にて２４ 時間培養した後、２５０ｄの三角フラスコにおける種培地（グリセリン、５ｇ／ ２：コーンスチーブリカー、２７．５ｇ　／Ｉｔ　：　ＫＨ２ＰＯ４，１ｇ／ｆ 　；　ｐＨ６，８）　１０ｄへプレートから採取した菌株ＥＲ８１７を６５０ｍ ｍにて０．０５の吸光値（Ａ　６５ｏ＝　０．０５　）まで接種した。

得られた種培養物を回転振とうしながら１８℃にて２４時間培養した。２５０ｍ １三角フラスコにおける生産培地（コーンスチープリカー、３０ｇ　／乏：ＫＨ ２ＰＯ４，１ｇ／Ｉｌ：ＮａＧ１０／１　：　ＣａＣＯ５，２９ｇ／ｌ　；グル コース、１０ａ　／ｌ　：　ｐＨ６，８＞　１０ｒ１１１に種培養物をＡ６５ｏ ＝０．２まで接種し、かつ回転振とうしながら２８℃にて６５時間培養した。

次いで培養物を遠心分離し、かつ上澄液を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰ 　Ｌ　Ｇ　＞により２−ＫＬＧの存在につき分析した。上澄液の５０μ２試料を ６５°ＣのビオラドＨＰＸ−８７Ｈカラム（０，６ｄ／ｍｉｎ　＞により０．１ ８　Ｎ　Ｈ２ＳＯ４中で分析した。８．８６ｍ１ｎの滞留時間を有するピークは 、２−　′通りである：　２．５−ＤＫＧ、＆、４６ｍ１ｎ；２−ケトーＤ−’ ｊルコンｍ（２ＫＬＧ＞、９．２０ｍ１ｎ；グルコン酸、１０．０ｍ１ｎ　；お よびフコース１２．１ｍ１ｎ　。

上澄液の各試料は８．８６ｍ１ｎにピークを示し、これは１ｇ／ｌの濃度におけ る２−ＫＬＧの存在を示す。８．８６ｍ１ｎにてピークを生ずる化合物が２−Ｋ ＬＧでおることを確認するため、所定量の既知２−ＫＬＧ　（ナトリウム塩とし て）を上澄液の試料に添加した。これは８．８６ｍ１ｎにおけるピークをのみを 増大させ、したがってめる確認を示した。これに対し、培養物の試料を接種して から１８時間後に採取した場合（６５時間後でなり）、上澄液のＨＰＬＣ分析は ７Ｍでの濃度の２，５−ＤＫＧを示したが、検出しうる２−ＫＬＧを示さなかっ た。

さらに、２−ＫＬＧ　（２−ＫＤＧでない）が実際に６５時間培養物中に生産さ れていることを確認するため、所定量の既知２−ＫＤＧ　（カルシウム塩として ）を上澄液の試料へ１（Ｊ／２の濃度まで添加した。かくして、この処理した培 養物のＨＰＬＧ分析は９．１６ｍ１ｎに新たな°ビークの存在を示したが、８． ８６ｍ１ｎにおける２−ＫＬＧのピークには変化を実質的に示さなかった。

培養による２−ＫＬＧの生産を示すため、他の方法をも用いた。醗酵により生産 された全ての２−Ｋ　Ｌ　Ｇをアスコルビン酸（すなわち還元剤）まで変換させ ることにより、２−ＫＬＧを含有する醗酵培地の還元能力を測定しかつアスコル ビン酸まで変換する前の溶液中に存在する２−Ｋ　Ｌ　Ｇの量を計算す・ること ができる。醗酵混合物中にアスコルビン芯以外の還元剤が存在するかどうか確認 するため、醗酵混合物の第１試料を処理して２−ＫＬＧをアスコルビン酸に変換 させ、次いで試料の全還元能力を測定した。第２の試料を作成し、コレは２−Ｋ ＬＧの変換後に培地から全アスコルビン酸が除去れている。次いで、２種の試料 の還元活性を比較し、かつ活性におけるこの差は試料中に存在するアスコルビン 酸の量を示し、したがって醗酵培地に存在する２−ＫＬＧの存在を示す。

醗酵培地の上澄液試料を処理して、存在する仝での２−ＫＬＧをビタミンＣに変 換させた。、７５μでの８Ｎ　ｌ−１ｃ１２を５０ｐｌの上澄液に添加し、かつ 混合物を９５℃にて３０分間培養した。

１２０μｆｆの５Ｎ　ＮａＯＨを添加し、ｐｌ−（を１Ｎ酢酸ナトリウムにより ３６７５に調整した。

混合物中のアスコルビン酸およびその信金ての還元剤は、電子キャリヤＰＭＳ　 ［５−メチルフエナジウムメチルサルフ工−ト］の存在下でテトラゾリウム塩Ｍ ＴＴ　［３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２＞−２，５−ジフェニルテトラ ゾリウムをホルマザンまで還元する。このような処理を行なって、混合物中の全 還元剤（ビタミンＣを含む）を示した。

ビタミンＣの特異的決定を容易化させるため、ＭＴＴおよびＰＭＳで処理する前 の醗酵混合物の試料をアスコルビン酸オキシダーゼおよび酸素で処理して、存在 する全てのビタミンＣを破壊した。次いで、ＭＴＴおよびＰＭＳでの処理は存在 するビタミンＣ以外の還元剤の♀を示し、かつその差によりビタ尽ンＣ（ｂた′ がって２−ＫＬＧ）の量を決定した。このようにして、混合物中のビタミンＣの 存在、したがって上）σ液中の２ＫＬＧの存在が証明された。

既知濃度の２−ＫＬＧを含有する試料を用いて２−ＫＬＧをビタミンＣへ変換さ せる手順により、標準曲線を作成した。

この曲線は、菌株ＥＲ８１７の６５時間培養物から得られた上澄液が１ｇ／２の ２−ＫＬＧを含有することを示し、これはＨＰＬＣ分析の結果と一致した。２− ＫＬＧは、ｐｃＢＲ１３を欠如するエルウィニア・シトレウスの他の菌株（菌株 ５Ｈ３２００３）の同様に作成されかつ処理された培養物の上澄液には検出され なかった。

グルコースから２−ＫＬＧへの変換は、形質転換菌株ＥＲ８１７を用いて下記の 醗酵手順によって行なった。接種は実施例１におけると同様に行なったが、生産 培地におＣブる培養は６５時間でなり３０時間とし、かつ１００ｍＮの培地を用 いた。培養上澄液は１（ＩＩ／１２（７）２−ＫＬＧヲ含有Ｌタカ、０．１ｇ／ Ｎ未ｉのグルコース、２−ＫＤＧ、２，５−ＤＫＧもしくはグルコン酸を含有し た。

２−　Ｋ　ｉ−Ｇのより良好な収率を得るための１゛っの方法は、グルコースか ら２−ＫＬＧへの醗酵に際し生産される中間体が２−ＫＬＧ生産に無関係な生物 学的反応で全く消費されないよう確保することである。したがって、唯一の炭素 源として２’、５−ＤＫＧもしくは２−ＫＬＧを使用しえないエルウィニア・シ １〜レウス（ＳＨ３２００３＞の突然変異種を、ミラーにより記載された方法［ エキスベリメンツ・イン・モレキュ（１９７４）　コでニトロソグアニジン突然 変異にしたがって分離し、ただし国体は３０℃にでニトロソグアニジンの存在下 で培養した。突然変異の後、菌体をグルコース（０，２％Ｗ／Ｖ）またはグリセ リン（０，４％Ｗ／Ｖ）を含有するＭ９培地にて３０℃で１８時間培養し、これ についてもミラーのエキスベリメンツ・イン・モレキュラ・ジエネテイツクス、 コールド・スプリング・ハーバ−（１９７４）に記載されている。培養物の試料 をＭ９グルコースもしくはＭ９グリセリン培地のプレート上に展延し、次いで２ ．５−ＤＫＧ　（０，５％Ｗ／Ｖ）または２−ＫＬＧ（，０，２％ｗ／ｖ）を含 有するＭ９培地のプレート上で複製させた。これら培地のいずれでも増殖しえな い突然変異種を再塗抹によって精製し、かつ唯一の炭素源として各種の基質を使 用する能力につき試験した。２．５−ＤＫＧ、２−ＫＤＧまたは２−ＫＬＧのい ずれをも唯一の炭素源として使用しえない数種の突然変異種が得られた。この種 の一突然変異種をプラスミドｐＣＢＲ１３で形質転換させて菌株ＥＲ１０３７を 形成させ、次いでこれをグルコースを２−ＫＬＧに変換させる能力につき試験し た。

エルウィニア・シトレウスＥ　Ｒ１０３７の培養物は、ドイツチェ・ザンムルン ク・フミン・マイクロオルガニスメン・カルチャー・コレンクションに寄託した 。さらに、この培養物は１９８５年７月２２日づけで寄託し、次ぎのように同定 された：ＤＳ〜ｌＮｏ、３４０４０ 菌株ＥＲ１０３７の培養物をＬ−ブロス中で１８時間増殖させ、かつこの培養物 ９０ｄを１２当りに２ＦＩＰＯａ　、４ｇ：Ｋｔ−ｔ２　ＰＯ４、ｉｇ　：　Ｎ 　Ｈ４０！、　１ｇ　：ＣａＱ！ｚ　、ｏ、ｏｉｇ；に２ＳＯ４，２゜６ｇ；カ ザミノ酸、１０ｇ：酵母抽出物、１．５ｇ：コーンスチープリカー、１０ｇ：Ｄ −マニトール、２０（Ｊ　：およびグルコース、１０（ｌからなる培地５００７ に接種した。１１フアーメンタ中でｐＨ６，０にて２０時間増殖した後（０，７ 容器容積ｍｉｎ　−４（ｖ、ｖ、ｍ、　）の通気；　５ｏｏｒ、　ｐ、　ｍ、の 撹拌）、増殖培地における２−ＫＬＧの濃度は６．２５９／ｆｆｉであった。

プラスミドｐＰＬｒｅｄ３３２で形質転換させたエルウィニア・シトレウスＥＲ １０２６を用いて、２−ＫＬＧ収率の向上をざらに達成することができる。得ら れた菌株Ｅ　Ｒ１１１６を上記と同様に増殖させた。しかしながら、実施例に記 載した醗酵を２０時間後に停止させる代りに、醗酵を１０ｃ＋／ｊのグルコース を追加してさらに接種後１２時間延長した。

さらに、２回にわたり１０ｑ／ｌのグルコースの追加を醗酵の開始後３６時間お よび６０時間で行なった。醗酵ブロスにおける２−ＫＬＧの最終レベ／ＬＬｔ１ ９．８３ｃ＋／　ｌ　テアリ、コｔＬハ４９．４％のグルコースからの変換を示 し゛ている。

本発明の範囲または思想から逸脱することなく本発明において種々の改変を行な うことができ、さらにこの基本構成を変化させて本発明の方法および構成を利用 する他の具体例を与えうろことが当業者には了解されよう。したがって、本発明 の範囲は実施例として示した特定具体例のみに限定されないことが了解されよう 。

５　Ｔｈｒ　３５　Ａｌａ ６　工１ｅ　３６　Ａｌａ ７　Ｓｅｒ　３７　１１ａ ８　Ｌｅｕ　３８　Ａｓｐ ９　Ａｓｎ　３９　５ｅｒ １０　Ａｓ＋　４０　Ｇｌｙ ｌｌ　Ｇｌｙ　４１　Ｔｙｒ １２　Ａ＋ｒｇ　４２　Ａｒｇ １３　Ｐｒｏ　４３　Ｌｅｕ １４　Ｐｈｅ　４４　Ｌｅｕ １５　Ｐｒｏ　４５　Ａｓｐ １６　Ｇｌｕ　４６　Ｔｈｒ １７　Ｌｅｕ　４フ　Ａｌａ ｌＢ　Ｇｌｙ　４８　Ｖａｌ ＦＩＧ　、　１ 　Ｌｅｕ ２０　Ｈｉｓ　１Ｐｊｌ　Ａｒｇ ２８　Ｌｅｕ ２９　？ ３０　Ａｌａ ５’　ＧＧＰＡＴＰＴＴＮＧＧ　５’　ＡＣＮＣＣＴＴＣＰＴＣＮＣＣＤＮＡ　 プローブエ　ＤＮＡ　ブロープエエ（ａ）　（ｂ） ５’　ＧＡＱＴＣＰＴＴＱＴＣＰＴＡＰＴＴ　５’　ＣＴＱＴＣＰＴＴＱＴＣＰ ＴＡＰＴＴＤＮＡ　ブローブエエエ’　ＤＮＡ　プローブＩエエ■（ｃ）　ｃｄ ） ＤＮＡプローブＸＶ ＰＬ−ｒ−ｓ　Ｑｌ 国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．２，５−ＤＫＧレダクターゼをコードし、かつ（ａ）式： 【配列があります】 のＤＮＡ配列、および （ｂ）遺伝子コードの結果として前記（ａ）に規定したＤＮＡ配列まで縮退し、 かつ２，５−ＤＫＧレダクターゼをコードするＤＮＡ配列 よりなる群から選択されることを特徴とする組換ＤＮＡ分子。
2. ２．ＤＮＡ配列が分子中の発現制御配列に作用結合されている請求の範囲第１項 記載の組換ＤＮＡ分子。
3. ３．発現制御配列がｌａｃ系：β−ラクタマーゼ系，ｔｒＰ系：ｔａＣ系；ｔｒ Ｃ系、ファージλの主オペレータおよびプロモータ領域；ｆｄコート蛋白の制御 領域；ＳＶ４０の早期および後期プロモータ；ポリオーマウィルスおよびアデノ ウィルスから誘導されるプロモータ；メタロチオニンプロモータ；３−ホスホグ リセレートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモータ；酸ホスファターゼ のプロモータ（たとえばＰｈｏ５）；酵母α−接合因子のプロモータ；たとえば ＳＶ４０の早期および後期プロモータのような哺乳動物細胞のプロモータ；アデ ノウィルス後期プロモータ、並びにその他の原核もしくは真核細胞およびそのウ イルスおよびその組合せの遺伝子の発現を制御する配列よりなる群から選択され る請求の範囲第２項記載の組換ＤＮＡ分子。
4. ４．請求の範囲第２項または第３項記載の少なくとも１種の組換ＤＮＡ分子によ り形質転換された宿主からなる形質転換体。
5. ５．宿主が、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生成するエルウィニア属および その他任意の細胞または生物よりなる群から選択される請求の範囲第４項記載の 形質転換体。
6. ６．宿主がエルウィニア・シトレウスである請求の範囲第４項記載の形質転換体 。
7. ７．（ａ）アミノ酸配列： 【配列があります】 を有する２，５−ＤＫＧレダクターゼ、および（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列 を有し、さらにそのアミノ末端にメチオニンを含む２，５−ＤＫＧレダクターゼ よりなる群から選択される２，５−ＤＫＧレダクターゼ。
8. ８．請求の範囲第４項記載の宿主により生産される２，５−ＤＫＧレダクターゼ 。
9. ９．請求の範囲第１項または第２項記載の組換ＤＮＡ分子により形質転換された 宿主を培養することを特徴とする２，５−ＤＫＧレダクターゼの生産方法。
10. １０．２，５−ＤＫＧレダクターゼを分離する工程をさらに含む請求の範囲第９ 項記載の方法。
11. １１．請求の範囲第６項記載の形質転換体を、グルコースを含む培地中で醗酵さ せることを特徴とするグルコースからの２−ＫＬＧの製造方法。
12. １２．（ａ）請求の範囲第６項記載の形質転換体をグルコースを含む培地中で醗 酵させて２−ＫＬＧを生成させ、かつ （ｂ）この２−ＫＬＧをビタミンＣに変換させることを特徴とするビタミンＣの 製造方法。
13. １３．宿主がエルウィニア・シトレウスＳＨＳ２００３およびエルウィニア・シ トレウスＥＲ１０２６よりなる群から選択される請求の範囲第６項記載の形質転 換体。