JP2003529343A

JP2003529343A - ６−０−α―Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−ソルビトールの調製方法

Info

Publication number: JP2003529343A
Application number: JP2001548727A
Authority: JP
Inventors: クンズ，マークワート; ムニル，モハメッド; マッテス，ラルフ; クルブ，クラウス，ディエター
Original assignee: シューズッカーアクチエンゲセルシャフト
Priority date: 1999-12-24
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2003-10-07
Also published as: AU3366601A; MXPA02006302A; DE50015319D1; ATE405652T1; EP1244791B1; IL150143A0; RU2002119707A; US7208301B2; WO2001048214A8; DE19963126A1; US20040209356A1; AU782259B2; WO2001048214A3; KR100678001B1; RU2338786C2; EP1244791A2; WO2001048214A2; KR20030032909A; ES2312376T3; CA2395299A1

Abstract

(57)【要約】本発明はイソマルツロースから６−０−α―Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−ソルビトール（１,６−ＧＰＳ）の酵素的調製のための方法に関する。ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）活性を有するユニットを含む反応水溶液にイソマルツロースを加えて保温し、続いて１,６−ＧＰＳを反応溶液から得るように構成した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はイソマルツロース又はスクロースからの６−０−α―Ｄ−グルコピラ
ノシル−Ｄ−ソルビトール（以下１，６−ＧＰＳ）の酵素的調製のための方法及
びこの方法の実施のための手段に関する。

【０００２】スクロースからイソマルツロースへ酵素的変換し、得られたイソマルツロース
を、続いて化学的に水素化して２つの立体異性体１，６−ＧＰＳ及び１−０−α
―Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−マンニット（以下１，１−ＧＰＭ）を作る１，６
−ＧＰＳの調製方法が知られている。

【０００３】スクロースからイソマルツロースへの変換を触媒するスクロースイソメラーゼ
がドイツ国特許第４４１４１８５号明細書により知られている。

【０００４】 Schiweck（alimenta １９（１９８０年）、５−１６）はスクロースからイソ
マルツロースへの酵素的変換及び続いてラネー・ニッケル（Raney nickel）触媒
でイソマルツロースからＰａｌａｔｉｎｉｔ（登録商標）（イソマルト（isomal
t）ともいう）即ち１，６−ＧＰＳと１，１−ＧＰＭの等モル混合物への水素化
を開示する。この刊行物はプロタミノバクター・ルブルム（Protaminobacter ru
brum）によりスクロースを糖転移(transglucosidation)させることによるイソマ
ルツロースの調製方法を記載する。また、微生物によって産生されたイソマルツ
ロースをラネー・ニッケル触媒の存在で水素化して１，６−ＧＰＳ及び１，１−
ＧＰＭに変換し、続いて蒸発及び低温結晶化により濃縮する方法を開示する。

【０００５】ドイツ国特許第１９７０１４３９号明細書は担体に結合したニッケル触媒でイ
ソマルツロースを水素化して、１，６ＧＰＳと１，１−ＧＰＭの混合物を得る方
法を開示する。

【０００６】ドイツ国特許第１９７０５６６４号明細書は１，６−ＧＰＳ又は１，１−ＧＰ
Ｍに富む混合物の調製方法を記載する。この刊行物では１，６−ＧＰＳ及び／又
は１,１−ＧＰＭに富む混合物を水素化イソマルツロース又は水素化イソマルツ
ロースを含む混合物から調製する方法が開示される。この方法によれば１，６−
ＧＰＳに富む混合液を所定の条件のもとで濃縮し、低温結晶化によって純粋な１
，６−ＧＰＳを調製することが可能である。

【０００７】ドイツ国特許第１９５２３００８号明細書は１,１−ＧＰＭ及び１，６−ＧＰ
Ｓの調製方法を開示する。この文献は、５０気圧以下の圧力で種々の触媒を使用
して、イソマルツロースの水素化により１，６−ＧＰＳと１,１−ＧＰＭの混合
物が得られることを記述する。イソマルツロースの変換に使われる開示された触
媒はルテニウム、ニッケル及びその混合物を含む。

【０００８】スクロースからイソマルツロース及びトレハルロースに酵素的に転位させ、続
いて水素化して１,１−ＧＰＭ、１，６−ＧＰＳ及び１−０−α―Ｄ−グルコピ
ラノシル−Ｄ−ソルビトール（１，１−ＧＰＳ）を生成する、１,１−ＧＰＭ及
び１，６−ＧＰＳ含有糖アルコール混合物の調製方法が欧州特許第０６２５５７
８号明細書で明らかである。

【０００９】先行技術による方法は、とりわけ２つの理由から不利と見なされる。まず、従
来の方法では、１，６−ＧＰＳと１,１−ＧＰＭの混合物しか得られず、この混
合物から経費のかかる化学的及び物理的分離法により、対照とする物質（１，６
−ＧＰＳまたは１,１−ＧＰＭ）を単離しなければならないことである。第二に
、スクロースから所望の最終生成物への変換の全プロセスを単一の処理ステップ
で行うことは不可能である。従って先行技術ではスクロースから１，６−ＧＰＳ
を調製するためにかなり複雑なプロセス系列が必要であり、その際種々の反応装
置で様々な物理的、化学的、生物学的処理ステップを用いなければならない。先
行技術では、イソマルツロースの水素化のために、触媒、特殊な水素化反応装置
及び工業用水素が必要である。そこでイソマルツロースから１，６−ＧＰＳ及び
１,１−ＧＰＭへの公知の水素化の重大な欠点は、技術的費用がかかるにある。
水素化のために約５０〜１００気圧の圧力が必要であることが多く、このため特
殊な装置構造が不可欠である。また得られる生成物は通常、食品工業で使用され
るから、例えば触媒の有毒物質が水素化反応の最終産物に入り込まないように、
処理操作を選定しなければならない。生成される製品は主成分が１，６−ＧＰＳ
及び１,１−ＧＰＭである混合物であり、これから目的の物質をそれぞれに応じ
た化学的及び化学物理的精製法で分離しなければならない。従って、化学的に純
粋な１，６−ＧＰＳ又は１,１−ＧＰＭを得るために、化学的水素化を行った後
に経費のかかる濃縮及び単離手順が必要である。この処理ステップの収量は不十
分なことが多い。

【００１０】そこで、本発明の根底にある技術的課題は、イソマルツロースから１，６−Ｇ
ＰＳを簡単、安価かつ選択的に調製することができる方法及びその実施のための
手段を提供することである。

【００１１】本発明は、イソマルツロースから１，６−ＧＰＳの酵素的調製のための方法を
利用可能にすることによってこの技術的課題を解決する。その場合ソルビトール
脱水素酵素（ＳＤＨ）活性を有するユニットを含む反応水溶液にイソマルツロー
スを加えて保温し、反応溶液から１，６−ＧＰＳを回収する。このようにして、
本発明では、ＳＤＨ活性を有するユニットによりイソマルツロースを生化学的又
は酵素的に水素化して１，６−ＧＰＳを生成することができる。本発明に使用さ
れる、ＳＤＨ活性を有するユニットは、イソマルツロースを特異的に１，６−Ｇ
ＰＳに還元する。ＳＤＨ活性を有するユニットは、イソマルツロース又はこれを
含む混合物を酵素的に１，６−ＧＰＳ又はこれを含む混合物に変換できるのが特
徴である。イソマルツロースから１，６−ＧＰＳへの酵素的変換の利点は、それ
によって簡単な処理法が可能になるだけでなく、反応特異性、基質特異性及び立
体特異性が高く、反応生成物が単一で、エネルギーと原料が節約され、環境にや
さしいことである。

【００１２】このようにして本発明は特殊な酵素法によりイソマルツロースから極めて的確
に１，６−ＧＰＳを調製することができるという意外な説に関する。本発明によ
ればソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）活性を有するユニットを含む反応水溶液
に生成物イソマルツロースを加え、１，６−ＧＰＳが生成されるまで保温し、反
応溶液から在来の方法、例えば結晶化により１，６−ＧＰＳを得ることができる
。

【００１３】本発明において、反応水溶液とは、出発条件及び目標条件に応じて添加物、例
えば安定剤、指示薬、還元等価物、再生剤、栄養成分、塩、糖、糖アルコール等
が含まれた未緩衝化又は在来の緩衝系で緩衝化した水のことである。

【００１４】本発明の好ましい実施形態では、ＳＤＨ活性を有するユニットはＳＤＨ酵素で
ある。イソマルツロースから１，６−ＧＰＳへの本発明による酵素的変換のため
に、ＳＤＨ活性を有するユニット、即ちＳＤＨ酵素を精製、濃縮及び／又は分離
した形で反応溶液に入れることができる。酵素は、例えば天然由来のものである
ことが可能である。もちろん、本発明において使用されるＳＤＨは、遺伝子工学
的に改変した生物から組換体として作られた本発明のＳＤＨであることも可能で
ある。この反応の最適化のために、イソマルツロースから１，６−ＧＰＳへの変
換の速度論について研究を行うときは、単離したＳＤＨを使用することが有利で
ある。特に、イソマルツロースから１，６−ＧＰＳへの変換の化学的平衡にかか
わるすべての事象は、単離した酵素を取扱いを必要とする。さもなければ、化学
量論、解離定数、酵素の阻害又は活性化の問題、協同作用、初期速度、立体配座
、リガンドの問題及び酵素速度論及び関連する結合データ等その他のすべての問
題を十分に正確に分析することができないからである。とりわけ反応を的確に調
節するには、ＳＤＨ活性を有するユニットが単離された形であることが好ましい
。さもなければ反応溶液の他成分との相互作用によりｐＨ値、イオン濃度及び温
度の改変の結果の再現性が得られず、精製、部分精製及び細胞結合性酵素が分析
の際に食い違った値を示すからである。

【００１５】従って、本発明はまた、微生物、特にグルコノバクター（Gluconobacter）属
の微生物、とりわけグルコノバクター・スブオキシダンス（Gluconobacter subo
xidans）からＳＤＨを部分的又は完全に分離する方法に関する。その場合、第１
ステップで微生物を慣用の方法により分解し、ホモジナイズして粗抽出物とし、
第２ステップで陰イオン交換体クロマトグラフィーにより粗抽出物を分離し、第
３ステップで濾過、第４ステップで色素アフィニティークロマトグラフィーが行
われる。本発明に基づき色素アフィニティークロマトグラフィーの後に、得られ
た部分的精製酵素をクロマトフォーカッシングにより、又は別の好ましい実施形
態では別の色素アフィニティークロマトグラフィー及び続いて少なくとも１種の
還元等価物で親和溶出を行って単一物になるまで精製することが好ましい。

【００１６】本発明の特に好ましい実施形態では、本発明は第１の処理ステップで微生物を
消化し、ホモジナイズして粗抽出物とし、得られた粗抽出物を、第２の処理ステ
ップで陰イオン交換体クロマトグラフィー、第３の処理ステップで第１の色素ア
フィニティークロマトグラフィー、第４の処理ステップで第２の色素アフィニテ
ィークロマトグラフィーを行う微生物からのＳＤＨの単離方法に関する。特に好
ましい実施形態では、本発明は第１の色素アフィニティークロマトグラフィーの
後かつ第２の色素アフィニティークロマトグラフィーの前に限外濾過を行う上記
方法に関する。特に好ましい実施形態では上記の方法に続いて、即ち第２の色素
アフィニティークロマトグラフィーの後に、純粋なＳＤＨの親和性溶出を行うこ
ととし、そのために1種の還元等価物、特にＮＡＤＨを使用する。

【００１７】別の好ましい実施形態では、ＳＤＨ活性を有するユニットは、ＳＤＨを含む死
微生物又は生微生物もしくはその粗抽出物又はホモジネートである。本発明の好
ましい実施形態では、死微生物が好ましく、特に好ましくは乾燥した死微生物を
用いる反応は、ＳＤＨ酵素溶液の存在下で標準的方法、例えばタンニン及び／又
はグルタルアルデヒドを添加することにより、該微生物を再水和した後に行うも
ので、可溶性酵素が高い濃度の固体条件の微生物に作用するので有利である。も
ちろん再水和化を水で行うこともでき、又は別個の再水和化をまったく行わない
で、死微生物をそのまま反応水溶液に入れることもできる。また本発明に基づき
行われる生微生物によるイソマルツロースの変換は、とりわけ比較的少ない費用
で行える利点がある。

【００１８】微生物を用いるバイオリアクターは通常に使用することができ、イソマルツロ
ースから１，６−ＧＰＳへの化学的触媒反応と比較して少ないエネルギー費及び
保守費で済む。もちろん微生物がイソマルツロースから１，６−ＧＰＳへの最適
な変換を行う能力をもつように、反応条件（ｐＨ値、イオン濃度、酸素／二酸化
炭素消費、微量成分、温度等）を選定しなければならない。この処理条件のもと
で自然の微細環境の、即ち細胞内の、ＳＤＨは、単離された酵素より高い安定性
と効率をもつことができる。また適当な条件のもとで細胞増殖、それとともにＳ
ＤＨ濃度の増加が可能である。製造に費用のかかる触媒と工業用水素を扱わねば
ならない先行技術に比して、微生物による酵素的変換は確実性、自動化及び単純
性並びにプロセスの最終製品の品質と収量に関して重大な利点を意味する。

【００１９】本発明の好ましい実施形態では、本発明に基づき細胞区画又はその一部を互い
に単離し又は精製することを意図している。これにより、ＳＤＨ活性を有するユ
ニット又は酵素に肯定的又は否定的影響を及ぼし得る炭水化物構造、脂質又はタ
ンパク質及び／又はペプチド並びに核酸を精製又は分離することができる。こう
した影響を回避し、又は意図的に利用するために、微生物から粗抽出物を調製す
る。これは、超音波処理、プレス処理、ホモジナイゼーション、ガラスビーズと
の混合、界面活性剤、電界の作用、液体窒素中の機械的処理又は細胞膜又は細胞
壁の酵素消化によって行うことができる。得られた抽出物を別のステップで、遠
心分離して、好ましい実施形態で本発明による変換を上澄み液又は沈殿物を用い
て行うことができる。また粗抽出物の調製は、簡単な吸光測定により核酸と酵素
の比を決定できる利点がある。核酸との複合体はＳＤＨ活性を有するユニットと
共に存在し、イソマルツロースから１，６−ＧＰＳへの変換の効率を低下させ得
るので、適切な処理条件下で核酸を分離することが必要である。本発明における
粗抽出物の調製は、粗抽出物を安定化し、又はその触媒効果を最適化するすべて
の処置を含む。硫酸プロタミン、塩化マンガン及びリゾチームの添加及びイオン
強度の変更、並びにＳＤＨ活性を有するユニットが安定化させ、その効果が最適
化されるように本発明の粗抽出物のプロテアーゼ活性を改良するのに役立つすべ
ての処置がこれに含まれる。

【００２０】別の好ましい実施形態では、ＳＤＨを含む微生物又は完全もしくは部分精製Ｓ
ＤＨの起源となるの生物は、グルコノバクター属、特にグルコノバクター・スブ
オキシダンス、特に好ましくはグルコノバクター・スブオキシダンスＤＳＭ２０
０３である。特に本発明に基づき好んで用いられる補酵素再生系との組合わせＳ
ＤＨ／ＦＤＨ（ギ酸脱水素酵素）では、上記の株によって１，６−ＧＰＳの極め
て良好な収量が得られる。しかし微生物による酵素的変換は、決してこれらの２
つの株に限定されない。イソマルツロースを１つ又は複数のステップで１，６−
ＧＰＳに変換することができるすべての生物、特に微生物、例えば真菌、酵母、
細胞培養等も使用することができる。突然変異体、遺伝子工学的に改変し、もし
くはその他により調製又は分離した上記生物の誘導型、例えばＳＤＨをコードす
るヌクレオチド配列の導入によりＳＤＨ活性を有する生物がこれに含まれる。ス
クロースムターゼ活性を有し、単一の生物種によりスクロースを酵素的に１，６
−ＧＰＳに変換することができる生物が好ましい。

【００２１】別の好ましい実施形態では、本発明によりＳＤＨ活性を有するユニット、特に
微生物、粗抽出物、その一部及び／又は濃縮もしくは分離した酵素が固定化され
ている。固定化によって酵素、細胞小器官及び細胞は反応領域を限定された不溶
の状態にされる。本発明によればＳＤＨ活性を有するユニットは、ＳＤＨ酵素活
性がなるべく高くなる条件のもとで固定化される。本発明では、重合体への生細
胞の封入も意図される。固定化は（ｉ）結合によっても（ｉｉ）封入によっても
行うことができる。ＳＤＨ活性を有するユニットの結合固定化には、担体結合（
イオン又は共有結合）と架橋結合（相互の架橋又は他の重合体との架橋）がある
。ＳＤＨ活性を有するユニットの封入固定化では、ゲル構造（ビーズ、繊維等）
及び膜（マイクロカプセル及び膜リアクター）への封入が考えられる。従って、
固定化とは、ＳＤＨ活性を有するユニットの移動度及び溶解度を生物学的、化学
的又は物理的に制限するためのすべての方法を意味する。これは特に、不活性化
又は荷電化、無機又は有機性の担体材料への吸着によって行うことができる。そ
の場合、無機材料は例えば多孔質ガラス、シリカゲル、酸化アルミニウム及びヒ
ドロキシアパタイト又は金属酸化物である。天然の重合体には、例えばセルロー
ス、デンプン、デキストラン又はアガロースがあり、合成重合体には、ポリアク
リルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン等がある。本発明のＳＤＨ活性を
有するユニットを、三次元ネットワーク構造物に封入することも考えられる。本
発明の一実施形態ではこれはゼラチン又は寒天である。また固定化を二官能試薬
、例えばグルタルジアルデヒド又はベンジジンとの架橋結合によって行うことも
考えられる。ＳＤＨ活性を有するユニットのマイクロカプセル封入も可能である
。人工的又は生物学的膜により反応領域を制限するマイクロカプセル封入も可能
である。また本発明はフロキュレーション及び「架橋」並びに生及び／又は死細
胞と遊離もしくは固定化酵素の共固定化による担体を用いない固定化も包含する
。例えばデキストランとの結合による原子量の増加も本発明の意味の固定化に利
用される。固定化酵素とは、微生物の区画又は完全な生微生物又は乾燥微生物に
結合した酵素であってもよい。しかし本発明の意味における固定化とは、酵素が
単独で又は酵素が生物の区画と組合わされて担体に結合されていることも意味す
る。重要なのは、負荷された基質がイソマルツロースと接触して所望の酵素反応
が起こり、１，６−ＧＰＳが生じることである。しかし本発明は、もちろん、遊
離した、即ち固定化されていない形の、ＳＤＨ活性を有するユニットの使用にも
関する。

【００２２】別の好ましい実施形態では、本発明の酵素的変換がｐＨ調整とともに又はｐＨ
調整なしで行われる。特に好ましい実施形態では、水素伝達体の形の還元等価物
が使用されるから、ｐＨ値の選択は化学反応の平衡にも１，６−ＧＰＳの全収量
にも影響する。従って、イソマルツロースから１，６−ＧＰＳへの酵素的変換は
ｐＨ調整が行われない反応と、ｐＨ調整が行われる反応に分けられる。ｐＨ値の
調整はｐＨ値を引き上げ得る、引き下げ得る又は安定化させ得る物質の添加又は
供給によって行うことができる。本発明によれば、ローリー・ブレンステッド(l
owry-Bronsted)又はルイス・ピアソン(Lewus-Pearson)の定義による酸又は塩基
を使用することができ、その際プロトン、ヒドロニウムイオン、水酸化物イオン
又は遊離電子対を放出又は供給又は吸収することができる。ｐＨ値調整のための
手段として、例えば反応水溶液にＣＯ₂注入(酸の導入という形で)することがで
きる。ｐＨ値を酵素の活性にとって最適とされる範囲に調整するように努めるこ
とが好ましい。このｐＨ最適値は種々のバッファーにより、又はｐＨ低下又はｐ
Ｈ増加剤の添加によって実現することができる。しかし全体として、ｐＨ調整は
決して化学的方法(例えば錯体形成操作、滴定等)に限定されない。ｐＨ値を何ら
かの方法で調整または安定化させるように系に調整することはすべて、本発明の
におけるｐＨ調整の実施といえる。本発明の有利な実施形態では、反応水溶液の
ｐＨ値が約６．０〜８．０、とりわけｐＨ７．０であることが好ましい。

【００２３】本発明の好ましい実施形態では、特に精製又は単離したＳＤＨを使用する場合
、ＳＤＨ活性を有するユニットのほかに、還元等価物も反応水溶液に加えられる
。本発明においては、還元等価物とは、補酵素又は補欠分子族の形で存在し得る
水素伝達体又は電子伝達体である。このような還元等価物は例えばＮＡＤ^＋／Ｎ
ＡＤＨ、ＮＡＤＰ^＋／ＮＡＤＰＨ、ＦＭＮ／ＦＭＮＨ₂又はＦＤＡ／ＦＤＡＨ₂で
ある。補酵素及び補欠分子族は酸化物還元反応により解離可能な及び／もしくは
タンパク質に固結した水素ならびに／又は電子伝達体として使用される。しかし
、還元等価物として、水素原子又は電子を伝達することができる他の補酵素／補
欠分子族を使用することもできる。本発明では、特に環式テトラピロール、グル
タチオン、リポ酸、キノン、鉄−硫黄タンパク質、フラビンタンパク質、フラビ
ンヌクレオチド及び酵素触媒作用の際に官能基のプロトン、原子及び／又は電子
を伝達することができるその他のすべての物質が好適である。

【００２４】ＳＤＨ活性を有する生細胞を１,６−ＧＰＳの酵素的調製のために使用するこ
とが好ましく、還元等価物を添加する必要がない。

【００２５】別の特に好ましい実施形態では、特に精製及び単離したＳＤＨを使用する場合
に、イソマルツロースから１，６−ＧＰＳへの酵素的変換が再生剤(例えばギ酸
脱水素酵素（ＦＤＨ）及び／又はギ酸)の存在下で行われる。ＳＤＨ及びＦＤＨ
を反応水溶液に加えることによって、ギ酸がＣＯ₂に、イソマルツロースが１，
６−ＧＰＳに連続的に変換される化学反応が可能である。ギ酸のＣＯ₂への変換
はＦＤＨによって行われる。同じく反応溶液中にある還元剤、例えばＮＡＤ^＋の
この酸化のときに吸収された水素原子は、平行して起こるイソマルツロースから
１，６−ＧＰＳへの還元で使用される。もちろん再生系の補酵素、ＦＤＨの代わ
りにまったく別の脱水素酵素又は異なる基質特異性をもつ酵素も、再生剤として
考えられる。例えば、他のカルボン酸又はその塩を再生剤として使用することが
できる。重要なのは、１，６−ＧＰＳの連続的生成が可能となるように、添加剤
、特にＦＤＨ／ギ酸が、水素伝達体、補酵素又は補欠分子族と反応して、電子及
び／又は水素原子が伝達されることである。ＳＤＨ活性を有するユニットとして
生細胞を使用する場合は、再生剤及び還元等価物の添加を省くことができる。

【００２６】別の特に好ましい実施形態では、イソマルツロースから１，６−ＧＰＳへの変
換が連続法の中で行われる。本発明の連続法は、微生物の増殖と生成物の産生、
即ち１，６−ＧＰＳの合成が行われる、貫流式の反応装置で実施することができ
る。こうしてすこぶる大量の１，６−ＧＰＳを調製することができる。連続法を
使用することによって精製及び処理サイクルは自由に選択でき、特殊な発酵槽の
パラメータ又は微生物の特定の生理的性質に制約されない。なぜなら連続系では
生成物が絶えず排出され、基質が絶えず供給されるので、微生物を取り巻く環境
が消費される基質や生成する生成物によって変化しないからである。また連続法
ではバイオリアクター又は設備をはるかに小型かつ安価に設計することができる
。本発明における連続法には、基質の通過により系に急速に伝搬する恐れがある
他の生物による感染の危険を防止するためのすべての補足的処置も含まれる。こ
れは無菌及び非無菌条件を包含する。また本発明は、選ばれた極限条件（例えば
極めて低いｐＨ値での緩衝又は抗生物質の使用）に基づき万一の感染に対しても
安定であるように、連続発酵を極限条件により構成するための処置及び手段にも
関する。その場合、本発明に基づきこの感染阻止条件に適応した上記ＳＤＨ活性
ユニットの変異型又は修飾型、例えば抗生物質耐性微生物を使用することができ
る。また本発明における連続法には、一方では栄養溶液が供給され、他方では酵
素的に生成された１，６−ＧＰＳを含む培養液が抽出される、成長する細胞及び
触媒する酵素のあらゆる系が含まれる。この場合均質系も不均質系も取り上げら
れる。

【００２７】もちろん本発明は半連続式又は回分式のプロセス操作にも関する。

【００２８】別の好ましい実施形態では１，６−ＧＰＳへの変換反応の出発材料であるイソ
マルツロースがスクロースの酵素的変換によって調製される。本発明方法で使用
されるイソマルツロースは、スクロースムターゼ活性を有する精製又は濃縮酵素
、粗抽出物又は微生物により、スクロースから酵素的変換（糖転移）により調製
することができる。本発明におけるスクロースムターゼとは、スクロースをイソ
マルツロースに異性化することができ、スクロースイソメラーゼとしても知られ
ている酵素のことである。

【００２９】スクロースムターゼ活性を有するタンパク質に対しコードするヌクレオチド配
列を含む細胞の一例は特にプロタミノバクター属、エルウィニア属、霊菌属、ロ
イコノストック属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、クレブシエラ属
及びエンテロバクター属である。このような微生物の特殊な例はプロタミノバク
ター・ルブラム（Protaminobacter rubrum）（CBS 547,77）、エルウィニア・ラ
ポンティシ（Erwinia rhapontici）（NCPPB 1578）、セラティア・プリムチカ（
Serratia plymuthica）（ATCC 15928）、セラティア・マルセスセンス（Serrati
a marcescens）（NCIB 8285）、ロコノストック・メセンテロイド NRRL B-521f
（Leuconostoc mesenteroides NRRL B-521f）（ATCC 10830a）、シュードモナス
・メソアシドフィラ MX-45（Pseudomonas mesoacidophila MX-45）（FERM 11808
又はFERM BP 3619）、アグロバクテリム・ラジオバクター（Agrobacterium radi
obacter MX-232）（FERM 12379又はFERM BP 3620）、クレブシエラ亜種及びエン
テロバクター種である。

【００３０】スクロースムターゼ活性を有するタンパク質及びこれをコードするプロタミノ
バクター・ルブラム、エルウィニア・ラポンティシ、エンテロバクター種SZ62及
びシュードモナス・メソアシドフィラ由来の核酸の特定の例がPCT/EP95/00165号
明細書に記載されている。

【００３１】上記の細胞又はタンパク質又はこれらの細胞のヌクレオチド配列は本発明のＳ
ＤＨ活性ユニットとともに、例えばＳＤＨをコードするヌクレオチド配列を制限
ユニットの制御のもとで上記の細胞に導入し発現することによって、スクロース
から１，６−ＧＰＳを調製するために使用することができる。

【００３２】特に好ましい実施形態では，スクロースからイソマルツロースへの酵素的変換
が好ましくは固定化したプロタミノバクター・ルブラム細胞（Protaminobacter
rubrum）もしくはプロタミノバクター・ルブラムの細胞消化物又は粗抽出物もし
くは部分的又は完全に精製したスクロースムターゼ（スクロースイソメラーゼと
もいう）によって行われる。この変換をイソマルツロースから１，６−ＧＰＳへ
のＳＤＨ依存性の変換と同時に１つの反応溶液で行うことが好ましい。

【００３３】スクロースからイソマルツロースへの再配列は、例えばDE 195 23 560 A1又は
DE 44 14 185 C1に記載されている。これらの特許明細書はそこに開示されてい
る微生物、ＤＮＡ配列、酵素及びスクロースからイソマルツロースへの酵素的変
換による調製方法に関して、参照により本明細書に完全に組み入れられる。

【００３４】スクロースムターゼを有する細胞、例えばプロタミノバクター・ルブラム、そ
の細胞消化物又は分離された酵素（スクロースムターゼ）の固定化は、生物学的
、化学的及び／又は物理的手段において使用される生体触媒の移動度及び溶解度
を制限するために利用される。本発明の意味での固定化は様々な方法、例えば生
体触媒の相互の又は担体物質への結合、重合体基質の網状構造への定着、人工又
は天然の膜による包被（もちろん逆ミセルの使用を含む）によって行うことがで
きる。細胞、細胞消化物又は／及びスクロースムターゼの固定化によって生じた
生体触媒は再使用可能であるだけでなく、場合によっては別の反応、例えばイソ
マルツロースから１，６−ＧＰＳへの変換を触媒する別の触媒と場合によっては
置き換えるために、とりわけプロセスの後又は間にたやすく分離することができ
る。重要な利点は、固定化により細胞又は酵素をはるかに高い局部濃度で、とり
わけ連続的貫流系で使用できることである。この場合ポリアリルアミドへの封入
又はその他の方法により、セラミック担体、重合体、種々のゲル及びゼラチンに
固定化することができる。

【００３５】別の好ましい実施形態ではスクロースからイソマルツロースへ、イソマルツロ
ースから１，６−ＧＰＳへの変換が単一の処理ステップで行われる。即ち２つの
酵素的変換反応が同一の反応水溶液で同時に又は僅かな時間差で進行する。従っ
て２つの別々の変換反応が酵素により同じ又は類似する処理条件のもとで進行す
るから、スクロースから１，６−ＧＰＳへの変換を１つの処理ステップで行うこ
とができる。

【００３６】特に好ましい実施形態ではスクロースから１，６−ＧＰＳへの変換が単一のバ
イオリアクターで行われる（いわゆる「ワンポット反応」（one-pot reaction）
）。

【００３７】本発明のこの実施形態はスクロースからの１，６−ＧＰＳの直接酵素的変換を
包含し、その場合スクロースからイソマルツロースへの変換にも、イソマルツロ
ースから１，６−ＧＰＳへの変換にも、それぞれＳＤＨ及びスクロースムターゼ
活性を有する上記の未固定及び固定細胞、粗抽出物及び／又は酵素を使用するこ
とができる。

【００３８】本発明によれば回分及び／又は流加回分発酵（間欠発酵）でも変換が可能であ
る。その際所定の時期に栄養培地に接種し、制限基質例えばスクロース、その他
の基質又は酵素／補酵素の消費の後に、又は他の適当な時期に発酵を終了する。
しかし基質の制限的影響がほとんどないように、反応条件を選定することもでき
る。回分反応はいわゆる閉じた系で行うことができる。本発明によれば閉じた液
相に連続的に酸素、空気又はその他の気体又は気体混合物を供給する場合も、こ
の系は閉じているとみなされる。回分法では基質の減少ととりわけ１，６−ＧＰ
Ｓの増加、事情によっては細胞濃度の増加が起こるから、細胞の環境が絶えず変
化する。本発明の意味で上記の「ワンポット法」は１，６−ＧＰＳを絶えず排出
しながら、流量の均衡を保って連続的酵素触媒作用として行うことができる。

【００３９】別の好ましい実施形態では酵素的変換時の反応水溶液の温度は２０℃〜４０℃
、特に２５℃である。精製されたＳＤＨは２５℃の温度で約１週間の安定性を有
する。従って長時間酵素触媒法を行うには、この範囲の温度が好適である。

【００４０】別の好ましい実施形態で本発明は、スクロースをまず酵素によりイソマルツロ
ースに変換し、続いてイソマルツロースを酵素により１，６−ＧＰＳに変換して
行うスクロースから１，６−ＧＰＳの調製方法に関する。この全過程は連続的、
半連続的又は非連続的に、単数又は複数のバイオリアクターで単数又は複数の処
理ステップで進行することが可能である。

【００４１】また本発明は、以下の；ａ）配列番号１に示したアミノ酸配列又はその相補鎖を有するタンパク質をコ
ードする核酸分子；ｂ）配列番号２に示したヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む核酸分子；ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；ｄ）遺伝子コードの縮重により核酸配列が（ｂ）又は（ｃ）に記載の核酸分子
の配列から誘導されたヌクレオチド配列を有する核酸分子；からなる群より選択される、ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）活性を有する酵
素をコードする核酸分子に関する。

【００４２】本発明に関連してソルビトール脱水素酵素活性を有する酵素とは、イソマルツ
ロースから１，６−ＧＰＳへの変換を触媒することができるタンパク質又はペプ
チドを意味する。その場合、変換されるイソマルツロースはスクロースの酵素的
変換に由来する。

【００４３】本発明に係る核酸分子は天然起源、好ましくはグルコノバクター種から単離し
、又は公知の方法により合成することができる。慣用の分子生物学的技術により
種々の突然変異を本発明核酸分子に挿入し、こうして場合によっては変化した生
物学的性質を有する酵素を合成することが可能である。この酵素も本発明に含ま
れる。本発明の意味での突然変異は、また、短縮された酵素をもたらすすべての
失欠変異に関する。その他の分子機構、例えば挿入、複製、転位、遺伝子融合、
ヌクレオチド交換、さらには種々の微生物株と他の株との間の遺伝子転移により
、例えば酵素活性の修飾及び／又は酵素の制限を行うことができる。こうして例
えば改変されたＫ_m値、Ｋ_i値又はＫ_a値を有し、及び／又は細胞に通常ある制御
機構がもはや働かないか又は改変された形で働く突然変異酵素を調製することが
できる。また本発明によれば、改変された安定性、基質及び生成物特異性又は改
変された効果又はパターン又は修飾された活性、温度、ｐＨ値及び／又は濃度プ
ロファイルを有する突然変異酵素を調製することができる。また本発明の教示は
、改変された活性酵素濃度、サブユニットの修飾構造、例えばシグナル及び／又
は輸送ペプチド及び／又はその他の官能基の翻訳前及び翻訳後修飾を有する酵素
に関する。

【００４４】また本発明は、上記の本発明核酸分子とハイブリッド形成する核酸分子に関す
る。本発明の範囲内でハイブリダイゼーションはSambrookら（Molecular Clonin
g．A laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，第２版、198
9年）に記載された在来のハイブリダイゼーション条件、好ましくはストリンジ
ェントな条件下のハイブリダイゼーションを意味する。本発明によれば１ｘＳＳ
Ｃ及び０．１％ＳＤＳにより５５℃、好ましくは６２℃、特に好ましくは６８℃
で１時間、特に０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで５５℃、好ましくは６２℃
、特に好ましくは６８℃で１時間洗浄した後になお正のハイブリダイゼーション
シグナルが観察されるならば、ハイブリダイゼーションしたといえる。

【００４５】本発明に係るヌクレオチド配列は、このような洗浄条件のもとで配列プロトコ
ルに示されたヌクレオチド配列の１つとハイブリダイズするヌクレオチド配列で
ある。

【００４６】なおこのような核酸分子の同定と分離は、本発明の核酸分子又はこの分子もし
くは相補鎖の一部を使用して行うことができる。ハイブリダイゼーションプロー
ブとして、例えば配列番号２に示されたヌクレオチド配列又はこの配列の一部を
厳密に又はおおむね有する核酸分子を使用することができる。ハイブリダイゼー
ションプローブとして使用されるフラグメントには、慣用の合成技術により調製
され、その配列がおおむね本発明核酸分子の配列と一致する合成フラグメントも
含まれる。本発明の核酸分子とハイブリダイズする分子は、本発明に係る酵素を
コードする上記の核酸分子のフラグメント、誘導体及び対立遺伝子変異型も包含
する。なお「フラグメント」とは、上記の酵素をコードするのに十分な長さを有
する核酸分子の一部をいう。本発明において「誘導体」という用語は、この分子
の配列が上記の核酸分子の配列と単数又は複数の位置で相違するが、この配列に
対して高度の相同性を有することを意味する。なお相同性とは核酸レベルで少な
くとも４０％の配列同一性、特に少なくとも６０％、好ましくは８０％以上、特
に好ましくは９０％、９５％、９７％又は９９％超の同一性を意味する。その場
合この核酸配列によりコードされた酵素は、配列番号１に示されたアミノ酸配列
に対してアミノ酸レベルで少なくとも８０％、好ましくは８５％、特に好ましく
は９０％、９５％、９７％及び９９％以上の配列同一性を有する。上記の核酸分
子との差異は、例えば失欠、置換、挿入又は組換えによって生じたものである。
これらは、天然に存在する変異、例えば他の生物の配列又は突然変異においても
起こり得る。この突然変異は自然に発生することが可能であり、又は意図的な突
然変異誘発（紫外線又はＸ線、化学薬品等）により導入することができる。また
この変異には、合成により調製された配列が含まれる。対立遺伝子変異型には自
然に生じる変異型も、合成により調製され又は組換えＤＮＡ技術により作られた
変異型も含まれる。本発明の核酸分子の種々の変異型によりコードされた酵素は
ある共通の特性例えば酵素活性、活性酵素濃度、サブユニット、翻訳後修飾、官
能基、分子量、免疫学的反応性、配座及び／又は物理的性質、例えばゲル電気泳
動での移動挙動、クロマトグラフィー挙動、沈降係数、溶解度、分光特性、安定
性、最適ｐＨ値、等電ｐＨ値、最適温度及び／又はその他の特性を有する。

【００４７】本発明に係る核酸分子はＤＮＡ及びＲＮＡ分子である。本発明に係るＤＮＡ分
子は例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ分子である。

【００４８】また本発明は本発明に係る核酸を含むベクターに関する。好ましくはプラスミ
ド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、シャトルベクター及び遺伝子工
学で慣用のその他のベクターが取り上げられる。本発明に係るベクターはさらに
ベクターの安定化及び／又は宿主生物への複製を生じさせ又はそれに寄与する別
の機能ユニットをもつことができる。

【００４９】特殊な実施形態では本発明に基づき原核及び／又は真核細胞の翻訳可能な核酸
分子の転写及び合成を保証する少なくとも１つの制御エレメントに本発明核酸分
子が機能的に結合されたベクターも含まれる。このような制御エレメントはプロ
モーター、エンハンサー、オペレーター及び／又は転写終結シグナルである。も
ちろんベクターはその安定性及び／又は複製のために必要な要素並びに抗生物質
耐性遺伝子、即ち選択マーカーも含むことができる。

【００５０】また本発明は少なくとも１つの制限要素に制御されてＳＤＨをコードする核酸
配列のほかに、同じく少なくとも１つの制御エレメントに制御され、スクロース
ムターゼをコードする核酸配列を含む上記のベクターに関する。従ってこのよう
なベクターは、スクロースからイソマルツロースを経て１，６−ＧＰＳへの酵素
的変換のために必要な２つの酵素についての遺伝情報を有する。このようなベク
ターは、スクロースを１つの処理ステップで１，６−ＧＰＳに変換するために、
個々の宿主生物の代謝装置を特に簡単に利用することを可能にする。

【００５１】また本発明は本発明核酸分子の１つ又は本発明ベクターの１つを含み、もしく
はこれによって形質転換され、好ましくはＳＤＨ及び場合によってはスクロース
ムターゼを発現し、特に好ましくは１，６−ＧＰＳをイソマルツロース又はスク
ロースから調製することができる宿主細胞に関する。また本発明は本発明核酸分
子又は本発明ベクターにより形質転換された宿主細胞に由来するすべての宿主細
胞に関する。このようにして本発明は本発明核酸分子又はベクターを含む宿主細
胞に関するものであり、その場合宿主細胞とはin vitro組換え核酸分子を受容し
、場合によっては本発明核酸分子によりコードされた酵素を合成することができ
る生物を意味する。これは原核又は真核細胞であることが好ましい。とりわけ本
発明はイソマルツロース又はスクロースから１，６−ＧＰＳを調製するための酵
素の合成の能力を与える本発明ベクター、このベクターの誘導体又は一部を含む
微生物に関する。また本発明に係る宿主細胞は、導入された本発明核酸分子が形
質転換細胞に関して異型であり、即ち自然的にはこの細胞に現われないか、又は
自然的に現われる当該の配列と異なる部位又は異なるコピー数で遺伝子に局在す
ることを特徴とする。

【００５２】本発明の一実施形態ではこの細胞が原核細胞、好ましくはグラム陰性原核細胞
、特に好ましくは腸内細菌細胞である。その場合一方では独自のＳＤＨ及び／又
はスクロースムターゼ遺伝子を含まない細胞、例えば大腸菌を使用することがで
き、他方ではすでに１個又は２個のこのような遺伝子を染色体に含む細胞を使用
することもできる。適当な原核細胞の好ましい例は大腸菌、プロタミノバクター
・ルブラム、エルウィニア・ラポンティシ、腸内細菌科又はシュードモナス・メ
ソアシドフィラ細胞である。外性核酸配列による原核細胞の形質転換は分子生物
学の分野の当業者の熟知するところである。

【００５３】本発明の別の実施形態では、本発明に係る細胞が真核細胞、例えば菌細胞（例
えば酵母）又は動物細胞であることも可能である。核酸配列による真核細胞の形
質転換又はトランスフェクションの方法もまた分子生物学の分野の当業者の熟知
するところである。

【００５４】また本発明は本発明宿主細胞の少なくとも１つを有する細胞培養に関する。そ
の場合本発明に係る細胞培養は特にＳＤＨ及び場合によってはスクロースムター
ゼを産生することができる。

【００５５】また本発明は、ＳＤＨの生成が可能であり、これを得ることができる条件のも
とで本発明宿主細胞を培地で培養するＳＤＨの調製方法に関する。

【００５６】本発明の別の実施形態は本発明核酸分子によりコードされるタンパク質及びそ
の調製方法である。その場合このタンパク質の合成が可能な条件のもとで本発明
宿主細胞を培養し、続いて培養した細胞及び／又は培地からタンパク質を分離す
る。

【００５７】また本発明は本発明に係るＳＤＨ活性ユニットの構造を同定し、場合によって
は結合することができるモノクローナル及びポリクローナル抗体に関する。この
構造はＳＤＨ活性を有するユニットに特異的に関係するタンパク質、炭水化物並
びに脂質複合体及び／又は糖脂質である。ＳＤＨの翻訳後修飾とみなされる構造
に向けられた抗体も本発明に含まれる。重要なのは、ＳＤＨ活性を有するユニッ
トの生物学的、化学的及び物理的性質の推論が可能なように、立体的電子雲構造
が抗体により同定されることである。

【００５８】また別の特殊な実施形態で本発明は、本発明に係る上記の抗体と相互作用し、
特にこれを同定し、結合することができる抗体に関する。

【００５９】また本発明は生物学的、化学的及び物理的に修飾された上記の抗体に関する。

【００６０】配列番号１は、２６２個のアミノ酸を含むＳＤＨのアミノ酸配列を示す。配列番
号２は、７８９個のヌクレオチドを含むＳＤＨのヌクレオチド配列を示す。配列
番号３〜９は、ＳＤＨの部分アミノ酸配列を示す。

【００６１】次に本発明を実施例及び関連する図に基づいて説明する。

【００６２】実施例１：ＳＤＨの調製グルコノバクター・スブオキシダンス（Gluconobacter suboxidans）のバイオマス生産グルコノバクター・スブオキシダンス DSM 20003のバイオマスを十分に供給す
るために、この株を実験室規模で発酵した。培養液１としてＤ−マンニトール（
５０ｇ／ｌ）、カゼインからのペプトン（１０ｇ／ｌ）、酵母抽出物（５ｇ／ｌ
）、ＣａＣＯ₃（２０ｇ／ｌ）を使用した。培養液２の組成は次の通りである。
Ｄ−マンニット（７５ｇ／ｌ）、カゼインからのペプトン（１６ｇ／ｌ）、酵母
抽出物（８ｇ／ｌ）、ＣａＣＯ₃（１ｇ／ｌ）。予備培養としてグルコノバクタ
ー・スブオキシダンスＤＳＭ２００３株の冷凍乾燥した保存物を１ｍｌの培養液
１に懸濁し、寒天平板に培養液１を塗抹し、２５℃で７２時間培養した。次に寒
天平板培養の接種物を２５ｍｌの培養液１に入れ、振とうフラスコで２５℃で４
８時間培養した。第１の予備培養とも称する培養を次に振とうフラスコ（容積１
リットル）中の２５０ｍｌの培養液１で２５℃で４８時間培養した。こうして得
た第２の予備培養とも称する培養を次に発酵のための接種材料として使用した。

【００６３】発酵のために第２の予備培養を振とうフラスコから２０ｌ発酵槽中の１５ｌの
培養液２に移し、２５℃で下記の条件のもとで培養した。即ち、ｐＨ値：６．９（５ＮのＮａＯＨで滴定して一定に保持）攪拌速度：３５０ｒｐｍ酸素飽和度：４０％

【００６４】発酵のあいだ上記の条件を一定に保った。細胞成長の終了（高性能液体クロマ
トグラフィーにより基質消費で確認した）とともに発酵を終了した。

【００６５】こうして得た細胞マスを遠心分離（８０００ｇ、２０分、４℃）により回収し
、０．９％ＮａＣｌ溶液で洗浄し、５０ｍＭのトリスバッファ（ｐＨ７．０）で
１：３に希釈し、次にフレンチプレス法で分解した。生じた細胞破片を超遠心分
離（１１０，０００ｇ、２０分、４℃）により除去した。透明な上澄み液（いわ
ゆる粗抽出物）を直ちに使用し、又は−３０℃で貯蔵した。

【００６６】ＳＤＨの精製ＳＤＨの精製のために次の３ステップ構成を選んだ。

【００６７】ステップ１：粗抽出物を、５０ｍＭのトリス／ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．０）で平衡させた
ＤＥＡＥセファロースカラム（２．６ｘ９ｃｍ）に掛け、５０ｍＭのトリス／Ｈ
Ｃｌバッファ（ｐＨ７．０）で０．０〜０．５ＭＮａＣｌの直線勾配かつ５０
ｃｍ／時間の流動率で溶出した。ＳＤＨを０．２ＭのＮａＣｌで溶出することが
できた。

【００６８】ステップ２：色素アフィニティークロマトグラフィー・カラムを次のように準備した。（ｉ
）セファロース４Ｂ−ＣＬゲルを基質として使用し（Boyer, P. M.及びHsu,J. T
.（1993年）：Fiechter. A（編）、Advances in Biochemical Engineering［生
化学工学の進歩］49, 1-44）、（ｉｉ）色素ブルー１６０（Blue H-ERD）をNeuh
auser, W.ら、1997年（Biochem．J.，326，638〜692）の方法で固定化した。そ
のためにゲル１ｍｌにつき１０ｍｇの色素を使用した。プールしたステップ１の
ＳＤＨ含有画分を透析し、色素リガンドカラム（２．６ｘ７．０ｃｍ、５０ｍＭ
のトリス／ＨＣｌバッファで平衡、ｐＨ７．０）に掛けた（ゲル１ｍｌにつきタ
ンパク質約２〜５ｍｇ）。吸着されたタンパク質を５０ｍＭのトリス／ＨＣｌバ
ッファ、ｐＨ７．０中で０．０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線勾配により流動率２
．０ｍｌ／分で溶出した。ＳＤＨを０．１ＭのＮａＣｌで溶出することができた
。

【００６９】ステップ３：プールしたステップ２の活性画分を透析し、限外濾過により濃縮し、再度色素
リガンドカラムに掛け（２．６ｘ７．０ｃｍ、５０ｍＭトリス／ＨＣｌバッファ
、ｐＨ７．０で平衡）、その際ゲル１ｍｌにつき約０．５ｍｇのタンパク質を用
いた。２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．０中で１０ｍＭのＮＡＤＨにより流動
率１０ｃｍ／時間で親和溶出を行った。続いて透析によりＮＡＤＨを除去した。

【００７０】精製したＳＤＨは−３０℃で約８ヶ月間貯蔵することができ、＋４℃ではＳＤ
Ｈは約３０日間安定である。

【００７１】表１：ＳＤＨの精製の概要

【表１】

【００７２】上記の精製の概要、即ち陰イオン交換体クロマトグラフィーによる粗抽出物の
分離、次の第１の色素アフィニティークロマトグラフィー、限外濾過及び第２の
色素リガンドアフィニティークロマトグラフィーによって、粗抽出物の値に比し
て約５０倍の濃縮が得られる。そして収率は約３３％である。

【００７３】実施例２：イソマルツロースからの１,６−ＧＰＳの調製酵素・膜反応装置による１,６−ＧＰＳの連続酵素的調製ステンレス鋼の反応装置（容積５０ｍｌ）を用いてイソマルツロースから１,
６−ＧＰＳの連続調製を行った。酵素・膜反応装置には水冷式温度調整のための
二重外被、伝導度及びｐＨ値電極の挿入のための穴、並びに圧力測定、基質供給
、生成物排出及び試料採取のための接続部があった。反応装置の内室にある外部
操作可能な磁気攪拌装置は、供給した基質の最適な混和を保証する。反応装置の
蓋は下側に金属焼結板を備え、これに限外濾過膜及びＯリングが取付けられてい
た。反応装置を充填した後、蓋を下部にねじ止めした。基質の供給はピストンポ
ンプで行った。反応溶液の伝導度とｐＨ値を連続的に直接測定し、その際制御系
が滴定によりｐＨ値を一定に保った。限外濾過膜は補酵素の完全な保持を保証し
ないため、Ｎｉｔｔｏ社の帯電膜（Nitto-Membrane NTR-7410）を使用した。こ
の静電気補酵素保持法は解離された補酵素でも所望の反応室内に留まることを保
証する。

【００７４】上記の膜反応装置を５０ｍＭトリス／ＨＣｌバッファ、ｐＨ７．５（＋０．１
％ＮａＮ₃）に２５０ｍＭのイソマルツロース及びグルコースを溶解した溶液で
満たした。万一の漏れ又はその他の問題を識別し、場合によっては除去するため
に、続いて２ｍｌ／時間の流量で反応装置を２４時間「アイドリング」運転した。
次にＳＤＨ及び再生酵素ＦＤＨを、試料をクロマトグラフィーに掛けるために使
用されるスーパーループにより注入した。反応の初めに、完全に精製したＳＤＨ
（実施例１）及びＧＤＨ（バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）由
来のグルコース脱水素酵素）をそれぞれ１Ｕ／ｍｌずつ使用した。２．５μｍの
ＮＡＤ^＋の注入により反応を開始した。ｐＨ値は１Ｍのトリスで滴定してｐＨ７
．０に一定に保った。連続式反応装置の使用時の重要なファクターは滞留時間分
布である。これは反応溶液の最適な混和を仮定して、式ｔ＝［Ｖ］／Ｖ₀ により算定される。ここにＶは反応装置の容積、Ｖ₀は体積流量である。４時間
のバッチテストの後に基質の供給を流量２ｍｌ／時間に調整し、平均滞留時間（
ｔ）は２５時間であった。試験時間は２３４時間で、その際規則的間隔で酵素活
性、アルカリ消費量、導電度、圧力、基質及び生成物容積を測定した。得た生成
物試料の組成を高性能液体クロマトグラフィーで調べ、１,６−ＧＰＳの生成を
検出した。

【００７５】実施例３：スクロースから１,６−ＧＰＳを調製するための酵素式単一バイオリ
アクター法（ワンポット法）スクロースから１,６−ＧＰＳを直接酵素的調製するためにプロタミノバクタ
ー・ルブラムの固定化細胞とG.サボキシダンス 2003（G． suboxidans 2003）由
来の酵素ＳＤＨ及びカンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）由来のＦＤＨに
より下記の条件下でバッチテストを行った。この反応の基質はスクロースとギ酸
アンモニウムであった。

【００７６】容積：１０ｍｌ温度：２５℃ スクロース：５００ｍＭギ酸塩：５００ｍＭプロタミノバクター・ルブラム細胞：１ｇＳＤＨ：５ユニットＦＤＨ：１０ユニットＮＡＤ：１ｍＭ

【００７７】この反応でｐＨ値が上昇したので、１Ｍのギ酸でｐＨ値７．０に一定に調整し
た。反応中の基質の消費をＤＣ及びＤＮＳ法（スクロースからイソマルツロース
への変換に対して）並びに高性能液体クロマトグラフィー（イソマルツロースか
ら１,６−ＧＰＳへの変換に対して）によりモニターした。１つの反応容器内で
１つの処理ステップでスクロースから１,６−ＧＰＳが直接生成されることを示
すことができた。

【００７８】実施例４：ＳＤＨの核酸及び誘導ペプチド配列１．ペプチド配列の決定部分アミノ酸配列の決定のために、実施例１に従って精製したグルコノバクタ
ー・スブオキシダンス DSM 2003のＳＤＨをトリプシンで消化し、標準的方法で
分離した。得られた部分ペプチド配列は配列番号３〜９に示されている。

【００７９】２．ＤＮＡプローブの作成ペプチド配列決定で解析された配列に基づき、グルコノバクター・スブオキシ
ダンス 2003由来のＳＤＨの全遺伝子のクローニングを行うことができるプライ
マーを調製した。

【００８０】３．遺伝子バンクの作成とクローンの分離上記のプライマー（配列番号３及び５）をＰＣＲ反応に使用し、ＳＤＨコード
配列のフラグメントを得た。得られたＰＣＲフラグメントでＤＮＡプローブを調
製した。プローブを標識した後、ゲノム・サザンブロッティングでハイブリダイ
ゼーションバンドを確かめた。pBluescrip SKに精製フラグメント族がある２つ
の独立のサブゲノム遺伝子バンク（ＣｌａＩ消化の後〜９ｋｂフラグメント、Ｂ
ａｍＨＩ消化の後〜３．５ｋｂフラグメント、フラグメントの精製はスクロース
勾配遠心分離による）を作成した。上記の標識プローブを使ってサブゲノム・ク
ローンバンクをハイブリダイゼーションにより検査した。複数のクローンを同定
することができた。そのうちＢａｍＨＩ及びＣｌａＩバンクの各々１つのクロー
ンをさらに分析した。

【００８１】４．配列決定クローニングしたフラグメントの配列決定によりいずれの場合も同じＤＮＡ配
列が得られた。これからＳＤＨのアミノ酸配列を決定することができた。この配
列は、コドン１９６の位置までは、ペプチド配列の配列と一致するが、ペプチド
５のペプチド配列がここで決定されたトリプトファン（Ｗ１９６）ではなくセリ
ン（Ｓ）である。

【００８２】グルコノバクター・スブオキシダンス DSM 2003のＳＤＨのヌクレオチド配列
は配列番号２に示されており、７８９個のヌクレオチドからなる。

【００８３】グルコノバクター・スブオキシダンス DSM 2003のソルビトール脱水素酵素の
アミノ酸配列は配列番号１に示されており、２６２個のアミノ酸からなる。

【００８４】５．大腸菌での発現コーディング配列を５’末端で配列ＧＡＡＴＴＣＴＴにより、３’末端で配列
ＡＡＧＣＴＴにより延長した。この配列をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理
したベクターｐＢｔａｃ２（図１、J. Bosius（1988年）、Biotechnology 10, 2
05〜225）に組み込んだ。生じるプラスミドｐＨＷＧ４６７（図２）はアンピシ
リン耐性遺伝子及びｔａｃプロモータに制御されたＳＤＨコード配列を有する。
プラスミドｐＨＷＧ４６７を大腸菌ＪＭ１０９で形質転換した。この細胞はＩＰ
ＴＧによる誘導の後ＳＤＨ活性を産生する。粗抽出物中の当該のタンパク質の活
性を決定することができる。この抽出物のＳＤＳゲルでクーマシー・ブリリアン
トブルーにより主バンドとして２８ｋＤａで、タンパク質を着色することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】図1は、プラスミドｐＢｔａｃ２のプラスミドの略図である。

【図２】図2は、ｐＨＷＧ４６７のプラスミドの略図である。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 19/44 9/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｐ 19/44 5/00 Ａ (72)発明者マッテス，ラルフデンマーク国 70619 ストットガルト，フリードリッヒ−ツン−デル−シュトラーセ 14 (72)発明者クルブ，クラウス，ディエターデンマーク国エー−1180 ヴァイエン，ザリーリガッセ 20 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 CA04 DA06 EA04 GA11 4B050 CC02 CC03 DD02 EE10 FF05E FF11C FF14C FF20 LL05 4B064 AF41 CA02 CA21 CB18 CC07 CD07 CD09 CE08 CE11 CE12 4B065 AA26X AA28Y AB01 AC14 BA02 BB16 CA28 4H045 AA10 AA11 BA10 CA11 DA75 DA89 FA74 GA23 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】イソマルツロースから６−０−α―Ｄ−グルコピラノシル−
Ｄ−ソルビトール（１，６−ＧＰＳ）の酵素的調製のための方法であって、ソル
ビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）活性を有するユニットを含む反応水溶液にイソマ
ルツロースを加え、保温し、続いて１，６−ＧＰＳを反応溶液から回収すること
を特徴とする、上記方法。
【請求項２】保温の前又は間に反応水溶液に還元等価物を加えることを特
徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】ＳＤＨ活性を有するユニットが単離されたＳＤＨである、請
求項１に記載の方法。
【請求項４】ＳＤＨ活性を有するユニットがＳＤＨを含む生微生物もしく
は死微生物又はその粗抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】ＳＤＨを含む微生物がグルコノバクター・スブオキシダンス
ＤＳＭ２００３である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】ｐＨ調整とともに又はｐＨ調整なしで実施することを特徴と
する、請求項１〜５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】保温の前又は間に反応水溶液に再生剤、特にギ酸塩脱水素酵
素（ＦＤＨ）及びギ酸塩を加えることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか1
項に記載の方法。
【請求項８】微生物、粗抽出物又は酵素が固定化されている、請求項３〜
７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】請求項１〜８のいずれか1項に記載の方法であって、連続的
に実施することを特徴とする、上記方法。
【請求項１０】出発材料として使用されるイソマルツロースをスクロース
からイソマルツロースへの酵素的変換により調製することを特徴とする、請求項
１〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】スクロースからイソマルツロースへの酵素的変換が固定化
したプロタミノバクター・ルブラム細胞、単離したスクロースムターゼ及び／又
はプロタミノバクター・ルブラムの細胞消化物によって行われることを特徴とす
る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】スクロースからイソマルツロースへ、及びイソマルツロー
スから１，６−ＧＰＳへの酵素的変換が、単一の処理ステップで行われる、請求
項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】スクロースからイソマルツロースへ、及びイソマルツロー
スから１，６−ＧＰＳへの酵素的変換が単一のバイオリアクター中で行われる、
請求項１〜１２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】酵素的調製が２０℃〜４０℃、特に２５℃の温度で行われ
る、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】スクロースを酵素的にイソマルツロースに変換し、続いて
又は同時にイソマルツロースを請求項１〜１４のいずれか1項に記載の方法に従
って酵素的に１，６−ＧＰＳに変換することを特徴とする、スクロースから１，
６−ＧＰＳの酵素的調製方法。
【請求項１６】第１の処理ステップで微生物を消化しホモジナイズして粗
抽出物とし、得られた粗抽出物に第２の処理ステップで陰イオン交換体クロマト
グラフィーを、第３の処理ステップで第１の色素アフィニティークロマトグラフ
ィーを、第４の処理ステップで第２の色素アフィニティークロマトグラフィーを
行う、微生物からＳＤＨを単離する方法。
【請求項１７】色素アフィニティークロマトグラフィーの最後に少なくと
も１種の還元等価物を用いて親和性溶出を行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】以下の；ａ）配列番号１に示したアミノ酸配列又はその相補鎖を有するタンパク質をコ
ードする核酸分子；ｂ）配列番号２に示したヌクレオチド配列又はその相補鎖を含む核酸分子；ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；ｄ）遺伝子コードの縮重により核酸配列が（ｂ）又は（ｃ）に記載の核酸分子
の配列から誘導されたヌクレオチド配列を有する核酸分子；からなる群より選択される、ソルビトール脱水素酵素（ＳＤＨ）活性を有する酵
素をコードする核酸分子。
【請求項１９】ＤＮＡ分子である、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡである、請求項１９に記載の核
酸分子。
【請求項２１】ＲＮＡ分子である、請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２２】請求項１８〜２１のいずれか1項に記載の核酸分子を含む
ベクター。
【請求項２３】核酸分子が少なくとも１個の調節エレメント、特にプロモ
ーター、エンハンサー及び／又は転写終結シグナルと結合していることを特徴と
する、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】請求項１８〜２１のいずれか1項に記載の核酸分子又は請
求項２２もしくは２３に記載のベクターで形質転換した宿主細胞、あるいはかか
る宿主細胞から誘導された細胞。
【請求項２５】宿主細胞が原核又は真核細胞である、請求項２４に記載の
宿主細胞。
【請求項２６】請求項２５に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞
培養物。
【請求項２７】ＳＤＨが生成し得る条件下で培養培地中で請求項２４又は
２５に記載の宿主細胞を培養し、SDHを回収することを特徴とする、ＳＤＨの調
製方法。
【請求項２８】請求項１６又は２７に記載の方法で調製され得るか、又は
請求項１８〜２１のいずれか1項に記載の核酸分子によりコードされる、ＳＤＨ
活性を有するタンパク質。
【請求項２９】請求項２８に記載のＳＤＨ活性を有するユニットに対して
特異的親和力を有する抗体、又は該抗体を産生する請求項２４又は２５に記載の
宿主細胞。
【請求項３０】請求項２９に記載の抗体に対して親和力を有する抗体。
【請求項３１】修飾されていることを特徴とする、請求項２９及び３０の
いずれか1項に記載の抗体。