KR20030032909A

KR20030032909A - 6-오-알파-디-글루코피라노실-디-소르비톨의 제조방법

Info

Publication number: KR20030032909A
Application number: KR1020027008196A
Authority: KR
Inventors: 쿤쯔마르크바르트; 뮤니르모하마드; 마테스랄프; 쿨베클라우스디에테르
Original assignee: 쥐드주커 아게 만하임/옥센푸르트
Priority date: 1999-12-24
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2003-04-26
Also published as: ES2312376T3; IL150143A0; ATE405652T1; WO2001048214A2; EP1244791B1; AU782259B2; EP1244791A2; AU3366601A; CA2395299A1; RU2002119707A; WO2001048214A8; RU2338786C2; KR100678001B1; US7208301B2; US20040209356A1; MXPA02006302A; DE50015319D1; JP2003529343A; WO2001048214A3; DE19963126A1

Abstract

본 발명은 이소말툴로스로부터 6-O-α-D-글루코피라노실-D-소르비톨(1,6-GPS)을 효소적으로 제조하는 방법에 관련된다. 이 방법은, 이소말툴로스가 소르비톨 데하이드로게나제(SDH) 활성을 갖는 단위를 포함하는 수성 반응 용액에 첨가되고, 배양된 후 1,6-GPS가 반응 용액으로부터 회수되는 것을 특징으로 한다.

Description

6-오-알파-디-글루코피라노실-디-소르비톨의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING 6-O-α-D-GLUCOPYRANOSYL-D-SORBITE}

슈크로스로부터 1,6-GPS를 제조하는 공지의 방법에서는 슈크로스를 이소말툴로스로 효소적 전환 후, 이를 두 가지 입체 이성질체인 1,6-GPS와 1-O-α-D-글루코피라노실-D-만니톨(1-O-α-D-Glucopyranosyl-D-Mannitol, 이하 "1,1-GPM" 이라 한다)로 화학적 수소화시키는 단계를 포함한다.

슈크로스 이성화 효소(sucrose isomerase)가 슈크로스를 이소말툴로스로 전환하는 과정에 촉매작용을 한다는 사실은 독일특허 DE 44 14 185 C1에 알려져 있다.

쉬베크(Schiweck, alimenta 19, 1980, 5~16)는 슈크로스를 이소말툴로스로 효소적 전환하고, 이어서 라니 니켈(Raney Ni)을 촉매로 이소말툴로스를 수소화하여 1,6-GPS와 1,1-GPM의 거의 동몰(equimolar) 혼합물인 이소말트(isomalt, 상품명은 Palatinit)를 얻는 방법을 개시하고 있다. 이 문헌에는 프로타미노박터 루브럼(Protaminobacter rubrum)을 이용한 슈크로스의 배당체화(transglucosidation)를 통해 이소말툴로스를 제조하는 방법도 기술되어 있다. 또한, 미생물에 의해 생성된 이소말툴로스가 라니 니켈 촉매의 존재중에서 수소화에 의해 어떻게 1,6-GPS와 1,1-GPM으로 전환되고, 그 후 증발과 냉각 결정화를 통해 농축되는 것도 알려져 있다.

독일특허 DE 197 01 439 A1에는 운반체-결합 니켈 기질에 의해 이소말툴로스를 1,6-GPS와 1,1-GPM의 혼합물로 수소화하는 방법이 개시되어 있다.

독일특허 DE 197 05 664 A1에는 1,6-GPS와 1,1-GPM 농축 혼합물의 제조방법이 기술되어 있다. 이 문헌에서는 수소화된 이소말툴로스나 수소화된 이소말툴로스를 포함하는 혼합물로부터 1,6-GPS와 1,1-GPM 농축 혼합물을 얻는 방법을 개시하고 있다. 이 방법에 의하여 특정 조건하에서 1,6-GPS가 풍부한 모액을 농축 및 냉각 결정화함으로써 순수한 형태의 1,6-GPS를 제조하는 것이 가능하다.

독일특허 DE 195 23 008 A1에서는 1,1-GPM과 1,6-GPS의 생산방법을 개시하고 있다. 이 문헌에서는 50 기압하에서 얼마나 다양한 종류의 촉매들이 사용되어 이소말툴로스의 수소화에 의해 1,6-GPS와 1,1-GPM의 혼합물이 얻어지는지를 보여준다. 이소말툴로스의 전환에 대한 개시된 촉매로는 루테늄(Ru), 니켈(Ni) 및 이들의 혼합물을 포함한다.

유럽특허 EP 0 625 578 B1에 의하면, 슈크로스를 이소말툴로스와 트레할룰로스 (trehalulose)로 효소적 전이시키고, 이어서 1,1-GPM, 1,6-GPS 및 1-O-α-D-글루코피라노실-D-소르비톨(1,1-GPS)로 수소화시킴으로써 1,1-GPM과 1,6-GPS를 포함하는 당(sugar)-알콜 혼합물이 제조된다.

그러나 상기와 같은 선행 기술은 두 가지 이유로 단점이 있다. 첫째로, 현재의 방법으로는 1,6-GPS와 1,1-GPM의 혼합물만을 얻을 수 있으며, 이로부터 주요 물질(1,6-GPS 또는 1,1-GPM)이 고가의 화학적, 물리적 분리 방법에 의해 분리되어야 한다. 둘째로, 슈크로스를 원하는 목적물까지 전환하는 전체 공정이 단일 공정 단계로 수행될 수 없다. 따라서, 선행기술에서 슈크로스로부터 1,6-GPS를 제조하기 위해서는 여러가지 물리적, 화학적 및 생물학적 공정 단계들을 각각 다른 반응기에서 수행하는 대단히 복잡한 공정 단계가 필요하다. 현재의 기술상태에 따르면 이소말툴로스의 수소화에는 촉매, 특정 수소화 반응기 및 기능적 수소(technical hydrogen)가 필요하다. 따라서 이소말툴로스를 1,6-GPS와 1,1-GPM으로 수소화하는 공지의 방법에 있어서 중요한 단점은 요구되는 산업 비용에 존재한다. 일반적으로 수소화에 필요한 압력은 대략 50 내지 100 기압 정도인데, 이는 특별히 고안된 장치를 필요로 한다. 또한, 최종 생산물이 일반적으로 식품 산업에 사용되기 때문에, 예를 들어 촉매와 같이 독성이 없는 물질이 수소화 반응의 목적 생산물에 들어가도록 공정 작업이 선택되어야 한다. 형성된 생산물은 중요 성분인 1,6-GPS와 1,1-GPM의 혼합물로, 이로부터 각 경우의 목적 물질이 화학적 및 화학-물리적 정제 방법을 통해서 분리되어야 한다. 화학적으로 순수한 1,6-GPS 또는 1,1-GPM을 얻기 위해서는 화학적 수소화 이후 고가의 농축 및 분리 과정이 필요하다. 이 공정 단계에서의 수율은 일반적으로 만족스럽지 못하다.

본 발명은 이소말툴로스(isomaltulose) 또는 슈크로스(sucrose)로부터 6-O-α-D-글루코피라노실-D-소르비톨(6-O-α-D-Glucopyranosyl-D-Sorbitol, 이하 "1,6-GPS" 라 한다)를 효소적으로 제조하는 방법 및 이 방법을 실시하기 위한 수단에 관한 것이다.

도 1은 플라스미드(plasmid) pBtac 2의 플라스미드 지도를 나타내고,

도 2는 pHWG 467의 플라스미드 지도를 나타낸다.

서열번호 1(SEQ ID No. 1)은 262 아미노산으로 구성되는 SDH의 아미노산 서열을 나타내고,

서열번호 2(SEQ ID No. 2)는 789 뉴클레오티드로 구성되는 SDH의 뉴클레오티드 서열을 나타내고,

서열번호 3 내지 9(SEQ ID No.3∼9)는 SDH의 부분적 아미노산 서열을 나타낸다.

본 발명은 상기와 같은 산업상의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 이소말툴로스로부터 1,6-GPS를 간단하고 저렴한 비용으로 선택적 제조하는 것이 가능한 유용한 공정 및 이를 실시하기 위한 수단으로 구성되어 있다.

본 발명에서는 이소말툴로스로부터 1,6-GPS의 효소적 제조방법을 통해 상기 산업상 문제점들을 해결하였다. 여기에서는 이소말툴로스를 소르비톨 데하이드로게나아제(sorbitol dehydrogenase, 이하 "SDH"라 한다) 활성을 갖는 유닛(unit)을 포함하는 수성(aqueous) 반응 용액에 첨가하고 배양시킨 후, 1,6-GPS를 반응 용액으로부터 회수한다. 따라서, 본 발명에서는 이소말툴로스가 SDH 활성을 갖는 유닛에 의하여 생화학적 또는 효소적으로 1,6-GPS로 수소화된다. 본 발명에 따라 사용되는 SDH 활성을 갖는 유닛은 이소말툴로스를 1,6-GPS로 특정하게 환원시킨다. SDH 활성을 갖는 유닛은, 이소말툴로스 또는 이소말툴로스를 포함하는 혼합물을 1,6-GPS 또는 1,6-GPS를 포함하는 혼합물로 효소적으로 전환할 수 있다는 사실에 의하여 특징지어진다. 이소말툴로스를 1,6-GPS로 효소적 전환하는 것의 잇점은, 이에 따라 가능해진 간단한 공정 외에, 높은 반응 및 기질 특이성과 입체 특이성, 반응 생산물의 균일성, 원료 물질(raw material)의 절약 및 그의 환경적 적합성에 존재한다.

본 발명은 이에 따라 전체적으로 목표하는 방식으로 특정 효소 과정을 통해 이소말툴로스로부터 1,6-GPS가 생산될 수 있다는 예기치 않는 교시에 관련된다. 본 발명에 따라, 이소말툴로스 추출물을 소르비톨 데하이드로게나아제(SDH) 활성을 갖는 유닛(unit)을 포함하는 수성 반응 용액에 첨가하고 배양하여 1,6-GPS가 형성되고 결정화법과 같은 일반적인 방법으로 반응 용액으로부터 회수되도록 한다.

본 발명과 관련하여 수성 반응 용액은 비완충수 또는 일반적인 완충 시스템에 의해 완충된 물을 의미하는 것으로 이해된다. 이 경우, 출발 조건과 목표하는 조건에 따라 안정화제, 지시약 시스템(indicator system), 환원 당량(reduction equivalent), 재생 시약(regeneration agent), 영양 성분(nutrient component), 고형 물질(solid), 당(sugar), 당-알콜 등의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, SDH 활성을 갖는 유닛은 SDH 효소이다. 본 발명에 따라 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 효소적 전환을 위해, SDH 활성을 가진 유닛, 즉 효소 SDH를 정제, 농축(enriched) 및/또는 분리된 형태로 반응 용액에 도입할 수 있는데, 여기에서 효소는 예를 들어 천연물 기원일 수 있다. 물론, 본 발명에 따라 사용되는 SDH는 유전 공학에 의해 변형된(modified) 생물체로부터 본 발명에 따라 재조합 방식으로 생산될 수도 있다. 반응조건을 최적화하기 위해 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 전환과 관련한 동력학(kinetics)을 시험하는데는 분리된 SDH를 사용하는 것이 유리하다. 특히, 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 전환의 화학 평형(chemical equilibrium)과 관련되는 모든 것은 분리된 효소의 작용을 필요로 하는데, 그렇지 않을 경우, 화학양론(stoichiometry), 해리 상수(dissociation constant), 효소의 저해 또는 활성화 문제, 연관성 (cooperativity) 문제, 초기 속도, 입체 형태(conformation), 리간드, 그리고 효소 동력학(enzyme kinetics)과 문제되는 결합(binding) 데이터의 모든 자료들을 충분한 정확도로 분석할 수 없기 때문이다. 특히, 반응을 목적하는 방향으로 수행하기위해서는 SDH 활성을 갖는 유닛을 분리된 형태로 사용하는 것이 유리한데, 그렇지 않을 경우, 정제, 부분적 정제 및 세포 결합 효소가 분석에 있어서 다른 값을 보이기 때문에 반응 용액의 다른 성분들과의 상호작용으로 인해 pH, 이온 농도 및 온도의 조절 결과가 재현성이 없게 되는 것을 배제할 수 없다.

또한 본 발명은 미생물, 특히 글루코노박터(Gluconobacter)속의 미생물, 그중에서도 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxidans) 종의 미생물로부터 SDH를 부분적 또는 완전 분리하는 방법과 관련된다. 이 방법에서는, 제 1 단계에서 미생물이 통상적인 방법에 의해서 다이제스트(digest) 및 균질화되어 조 추출물(raw extract)로 된다. 제 2 단계에서는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 조 추출물의 분리가 일어나고, 제 3 단계에서는 여과, 제 4 단계에서는 다이 친화성 크로마토그래피(dye affinity chromatography)가 수행된다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 다이 친화성 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제된 효소는 크로메이트 포커싱(chromate focusing)에 의하거나, 또는 다른 바람직한 실시예에 의하면 또 다른 다이 친화성 크로마토그래피법에 이어서 적어도 하나의 환원 당량과 함께 친화성 추출에 의해 균질화될 때까지 정제된다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 본 발명은 미생물로부터 SDH를 분리하는 방법과 관련된다. 이 방법에서는, 제 1 단계에서 미생물이 다이제스트되고 균질화되어 조 추출물로 된다. 제 2 단계에서 이 조 추출물은 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 처리되고, 제 3 단계에서 제 1 다이 리간드 친화성 크로마토그래피에 의해 처리되고, 제 4 단계에서 제 2 다이 리간드 친화성 크로마토그래피에 의해 처리된다. 특히 바람직한 실시예에서 본 발명은, 한외 여과(ultrafiltration)가 제 1 다이 리간드 친화성 크로마토그래피 후 제 2 다이 리간드 친화성 크로마토그래피 전에 수행되는 방법과 관련된다. 특히 바람직한 실시예에서, 순수 SDH의 친화성 용출은 상기 공정의 마지막 단계, 즉, 제 2 다이 리간드 친화성 크로마토그래피 후에 환원 당량, 특히 NADH를 이용하여 수행된다.

또 다른 바람직한 실시예에서, SDH 활성을 갖는 유닛은 SDH를 함유하는 사멸하거나 생존한 미생물 또는 그의 균질물(homogenate)이다. 본 발명에 따라, 바람직하게는 사멸한, 특히 바람직하게는 건조된 미생물로 특정된 반응은, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 이들 미생물이 SDH 효소 용액의 존재하에 표준 방법, 예를 들어, 탄닌(tannin) 및/또는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 첨가하는 방법으로 으로 재수화(rehydration)된 후 일어나고, 가용성 효소가 높은 농도의 고체 조건하에서 미생물을 재배열하기 때문에 유리하다. 물론, 재수화는 물에서 수행되거나, 특정 재수화가 전적으로 생략될 수 있는데, 이 경우, 사멸한 생물체는 수용액으로 직접 도입된다. 본 발명에 따라 또한 특정된 생존 미생물에 의한 이소말툴로스의 전환은, 다른 것 중에서도 비교적 저비용으로 수행될 수 있다는 장점이 있다.

미생물이 사용되는 생물 반응기(bioreactor)가 일반적으로 사용될 수 있고, 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 화학 촉매 전환에 비해, 보다 적은 에너지와 유지 비용을 갖는다. 물론, 반응 조건(pH 값, 이온 농도, 산소/이산화탄소 요구량, 미량 원소(trace element), 온도 등)은 미생물이 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 최적 전환이 가능하도록 선택되어야 한다. 이러한 공정 조건하에서, 세포내와 같은 자연상태의 미생물 환경에 존재하는 SDH는 분리된 효소보다 높은 안정성과 유효성을 가질 수 있다. 더우기, 적당한 조건하에서는 세포 증식 및 이에 따른 SDH의 농도 증가가 가능할 수 있다. 비싼 촉매와 기능적 수소를 사용해야 하는 선행기술에 비해, 미생물을 이용한 효소적 전환은 최종 생산물의 질(quality)과 수득률 뿐 아니라 신뢰도(reliability), 자동화(automation), 간편성(simplicity)에 관련된 중요한 장점을 갖는다.

본 발명에 따라 바람직한 실시예에서는, 어떤 세포 분획(cell compartment) 또는 그의 부분을 서로 분리하거나 결합하도록 의도된다. SDH 활성을 갖는 유닛이나 효소에 양성적(positive) 또는 음성적(negative)으로 영향을 미칠 수 있는 핵산 뿐 아니라 탄화수소 구조, 지방 또는 단백질 및/또는 펩티드가 이에 따라 결합되거나 분리될 수 있다. 이러한 영향을 피하기 위해서 또는 발명의 목적을 달성하는데 이용하기 위해서 조 추출물이 미생물로부터 만들어진다. 이는 초음파 처리 (sonication), 가압(pressing), 균질화(homogenization), 글래스 비드(glass bead)와의 혼합, 세척제(detergent), 전기장의 영향, 액체 질소중에서의 기계적인 공정 또는 세포막과 세포벽의 효소적 다이제스쳔(digestion)에 의하여 일어날 수 있다. 다른 단계에서는 형성된 추출물이 본 발명의 바람직한 실시예에서 원심분리되어 상등액(supernantant) 또는 침전(sediment)의 전환이 수행된다. 조 추출물의 제조는 효소에 대한 핵산의 비가 단순히 흡광도의 측정에 의해 결정될 수 있다는 이점을 추가로 갖는다. 어떤 공정 조건하에서는, 이들 복합체가 SDH 활성을 갖는 유닛을 수반하고 따라서 이소말툴로스가 1,6-GPS로 전환되는 효율을 감소시키므로, 핵산을분리하는 것이 특히 필요할 수 있다. 본 발명에 있어서 조 추출물의 제조는 조 추출물을 안정화하거나 그의 촉매 작용을 최적화하는 모든 방법을 포함한다. 여기에는 이온 강도의 변형 뿐 아니라 프로타민 설페이트(protamine sulfate), 염화 망간 (manganese chloride) 및 라이소자임(lysozym)의 첨가 그리고 SDH 활성을 갖는 유닛을 안정화하고 그 효과를 최적화하기 위해 본 발명에 따라 조 추출물의 프로테아제(protease) 활성을 변형시키도록 작용하는 방법이 포함된다.

또 다른 바람직한 실시예에서, SDH를 포함하는 미생물이나, 이로부터 완전 또는 부분 정제된 SDH가 유리되는 생물체는 글루코노박터(Gluconobacter)속의 생물체, 특히 글루코노박터 서브옥시단스(Gluconobacter suboxidans), 특히 바람직한 것은 글루코노박터 서브옥시단스 DSM 2003(Gluconobacter suboxidansDSM 2003)이다. 1,6-GPS의 매우 양호한 수득율은 바람직하게는 본 발명에 따라 조효소 재생 시스템(coenzyme regeneration system) SDH/FDH(포르메이트 데하이드로게나아제 (formate dehydrogenase))로 불리는 조합에서 달성될 수 있다. 그러나, 미생물에 의한 효소적 전환은 이들 두 균주만으로 제한되지 않는다. 모든 생물체, 특히 하나 또는 그 이상의 단계로 이소말툴로스를 1,6-GPS로 전환할 수 있는 미생물이 본 발명에 따라 사용될 수 있으며, 예를 들어 곰팡이(fungi), 효모(yeast), 세포 배양(cell culture) 등이 가능하다. 이들 중에는 유전공학을 이용하여 변형되거나, 또는 달리 제조하거나 분리된 상기 생물체, 예를 들어 SDH-코딩 뉴클레오티드 서열의 삽입에 의해 SDH 활성을 갖는 생물체의 돌연변이 유도체를 포함시킬 수 있다. 슈크로스 뮤타아제(mutase) 활성도 갖는 생물체가 바람직한데, 여기에서는 슈크로스가 한 가지 형태의 생물체에 의해 1,6-GPS로 효소적 전환될 수 있다.

또 다른 바람직한 실시예에서 본 발명에 따라 SDH 활성을 갖는 유닛, 특히 미생물, 조 추출물, 그의 부분 및/또는 농축되거나 분리된 효소는 고정된다. 효소 고정화를 통해서 세포 기관(organelles)과 세포들은 불용성 및 반응 공간-제한된 상태로 된다. 본 발명에 따라 SDH 활성을 갖는 유닛은 가능한 높은 SDH 효소 활성을 갖는 조건 하에서 고정된다. 폴리머(polymer)중에 생존 세포를 봉입(inclusion)시키는 것도 본 발명에 따라 의도된다. 고정화(immobilization)는 (ⅰ) 결합 및 (ⅱ) 봉입에 의하여 일어날 수 있다. SDH 활성을 갖는 유닛의 결합 고정화에서는, 운반체 화합물 이온성 또는 공유성과 교차 결합(cross-linking) 서로간 다른 폴리머와의 결합이 존재한다. SDH 활성을 갖는 유닛의 봉입 고정화에서는 겔 구조(비드, 섬유 등)로의 봉입과 멤브레인(마이크로캡슐 및 멤브레인 반응기) 내의 봉입이 의도된다. 따라서 고정화는 생물학적, 화학적 또는 물리적 수단에 의해 SDH 활성을 갖는 유닛의 이동도와 용해도를 제한하도록 작용하는 모든 방법을 의미하는 것으로 이해된다. 이는 특히 불활성 또는 전기적으로 전하를 띤, 무기 또는 유기 운반체 물질에서의 흡착에 의해 일어날 수 있다. 여기에서 무기 물질의 예로는 다공성 유리, 실리카 겔, 산화 알루미늄(aluminum oxide), 하이드록시애퍼타이트 (hydroxyapatite) 또는 금속 산화물(metal oxide); 천연 폴리머로는 예를 들어 셀룰로스(cellulose), 전분(starch), 덱스트란(dextran) 또는 아가로스(agarose); 그리고 합성 폴리머로는 폴리아크릴아미드, 폴리비닐알콜, 나일론 등이 있다. 본 발명에 따르면, SDH 활성을 갖는 유닛을 3 차원 네트워크로 포함시키는 것도 의도되는데; 본 발명의 한 실시예에서 이것은 젤라틴(gelatin) 또는 한천(agar)이 될 수 있다. 또한, 글루타릭 디알데히드(glutaric dialdehyde) 또는 벤지딘(benzidine)과 같은 두 관능기를 갖는 시약과의 교차 결합에 의한 고정화도 의도될 수 있다. 인공막이나 생체막에 의한 반응 공간의 제한을 야기하는 SDH 활성을 갖는 유닛의 마이크로캡슐화도 역시 가능하다. 또한 본 발명에서는 유리 또는 고정된 효소와 생존 및/또는 사멸된 세포들의 공동-고정화(coimmobilization) 뿐 아니라 응집 (flocculation) 및 교차 결합(cross-linking)에 의한 운반체 없는 고정화도 포함한다. 또한 예를 들어 덱스트란과 결합하는 것에 의한 분자량의 증가도 본 발명의 개념에서 고정화를 위해 작용한다. 고정화된 효소는 미생물의 분획, 또는 완전히 생존하거나 건조된 미생물과 결합한 효소일 수 있지만, 본 발명의 개념에서 고정화는 효소가 운반체에 스스로 결합하거나 효소가 유기체의 분획과 결합된 운반체에 결합한 경우를 의미할 수도 있다. 1,6-GPS로 원하는 효소적 반응이 일어나도록 하전된 매트릭스(matrix)가 이소말툴로스와 접촉하는 것이 중요하다. 그러나, 본 발명에서는 SDH 활성을 갖는 상기 유닛이 유리, 즉 고정되지 않은 형태로 사용되는 것도 물론 포함한다.

또 다른 바람직한 실시예에서 본 발명에 따른 효소적 전환은 pH 조절과 함께 또는 pH 조절 없이 수행된다. 특히, 환원 당량(reduction equivalent)은 수소 전달 시약(hydrogen transfer agent)의 형태로의 특히 바람직한 실시예에서 사용되므로, pH 값의 선택은 1,6-GPS의 전체적인 수득율 뿐 아니라 화학 반응의 평형에 영향을 미친다. 따라서, 이소말툴로스의 1,6-GPS로의 효소적 전환은 pH 값의 조절이 없는반응과 pH 값이 조절된 반응으로 나눌 수 있다. pH 값의 조절은 pH 값을 높이거나 낮추거나 안정화시킬 수 있는 물질의 첨가 또는 사입에 의해 일어날 수 있다. 본 발명에 따라, 브뢴스테드-로우리(Bronsted-Lowry)나 루이스-피어슨(Lewis-Pearson)에 따른 산과 염기가 사용될 수 있으며, 이에 의해 양성자(proton), 하이드로늄 이온(hydronium ion), 하이드록사이드 이온(hydroxide ion) 또는 자유 전자쌍이 유리되거나 사용할 수 있게 되거나, 흡수될 수 있다. 예를 들어, 수성 반응 용액에 CO₂가 주입될 수 있는데, 이는 산의 사입과 같이 pH 값의 조절을 위한 방법이다. 이는 pH 값을 효소 활성에 최적으로 보이는 범위로 정하는데 잇점으로 작용할 수 있다. 최적의 pH는 다양한 완충용액을 통하여, 또는 pH를 낮추거나 높이는 물질을 첨가함으로써 도달할 수 있다. 그러나 모든 pH 조절은 어떠한 경우에도 복잡한 조작이나 적정(titration)과 같은 화학적인 방법으로 한정되지 않는다. pH 값을 조절하고 안정화시키는 시스템으로의 어떠한 간섭도 본 발명의 의도에서 pH 조절을 수행하는 것으로 간주될 수 있다. 본 발명의 유리한 실시예에서 수용액의 pH 값은 약 6.0~8.0 이고, 바람직하게는 7.0 이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 특히 정제되거나 분리된 SDH가 사용될 때, SDH 활성을 갖는 유닛에 추가하여 환원 당량도 수용액에 첨가된다. 본 발명의 의도에서 환원 당량은 조효소(coenzyme)나 보결분자단(prosthetic group) 형태일 수 있는 수소 운반체 또는 전자 운반체이다. 환원 당량은, 예을 들어 NAD⁺/NADH,NADP⁺/NADPH, FMN/FMNH₂또는 FAD/FADH₂일 수 있다. 산화 환원(oxidoreduction) 반응의 조효소와 보결분자단은 단백질로부터 해리될 수 있고/있거나 단백질에 단단하게 결합되어 있는 수소 및/또는 전자 운반체로서 작용한다. 그러나, 수소 원자나 전자를 운반할 수 있는 다른 조효소/보결분자단은 환원 당량으로서도 작용할 수 있다. 본 발명에 따라 바람직한 것은, 특히 사이클릭 테트라피롤(cyclic tetrapyrrole), 글루타치온(glutathione), 리포산(lipoic acid), 퀴논(quinone), 철-황 단백질(iron-sulfur protein), 플라보프로테인(flavoprotein), 플라빈 뉴클레오티드(flavin nucleotide), 그리고 효소 촉매 작용 중에 작용기를 위해 양성자 (proton), 원자 및/또는 전자를 운반할 수 있는 모든 다른 것들이다.

SDH 활성을 갖는 생존 세포는 1,6-GPS의 효소적 제조에 바람직하게 사용되어, 환원 당량의 첨가가 불필요하게 된다.

또 다른 특히 바람직한 실시예에서, 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 효소적 전환은, 특히 정제되고 분리된 SDH가 사용될 때, 포르메이트 데하이드로게나아제 (formate dehydrogenase, FDH) 및/또는 포르메이트(formate)와 같은 재생 시약의 존재하에 일어난다. 수용액에 SDH와 FDH를 첨가함으로써 포르메이트는 CO₂로, 이소말툴로스는 1,6-GPS로 연속적으로 전환되는 동안 화학 반응이 일어난다. 포르메이트에서 CO₂로의 전환은 FDH를 통해서 일어난다. 반응 용액 중에 임으로 존재하는 환원제(예를 들어 NAD⁺)에 의하여 이러한 산화에서 흡수된 수소 원자는 이소말툴로스의 1,6-GPS로의 병렬적 환원에 사용된다. 물론, 완전히 다른 데하이드로게나아제 (dehydrogenase) 또는 다른 기질 특이성을 갖는 효소가 재생 시스템(regeneratioin system)의 조효소로서, 즉, 재생 시약으로서 가능하게 될 수 있다. 예를 들면, 다른 카르복실산(carboxylic acid) 또는 그의 염이 재생 시약으로서 사용될 수 있다. 첨가된 물질, 특히 FDH/포르메이트가 수소 운반체, 조효소 또는 보결분자단과 반응하여 1,6-GPS의 연속적 형성이 가능하도록 전자 및/또는 수소 원자가 이동하는 것이 중요하다. 살아있는 세포가 SDH 활성을 갖는 유닛으로서 사용되는 경우에는 재생 시약 및 환원 당량의 첨가가 생략될 수 있다.

또 다른 특히 바람직한 실시예에서 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 전환은 연속적인 공정의 범위내에서 일어난다. 본 발명의 연속 공정은 미생물의 성장 및 이에 따라 1,6-GPS의 합성이 일어나는 플로우-쓰루 반응기(flow-through reactor)에서 수행될 수 있다. 이러한 방식에서는 매우 대량의 1,6-GPS가 생산될 수 있다. 연속적 공정의 사용을 통해 정제와 제조 사이클은 자유롭게 선택될 수 있고, 특정 발효제(fermenter)나 미생물의 특정 생리학적 성질과 같은 파라미터에 의해 특정되지 않는데, 이는 연속 공정에서 미생물 주변 환경은 소비되는 물질 및 생성되는 생산물에 의해 바뀌지 않고, 생산물은 계속적으로 회수되고 기질은 계속적으로 공급되기 때문이다. 또한 연속 공정에서 생물 반응기나 플랜트는 훨씬 더 작고 더 싸게 설계된다. 본 발명의 의도에서 연속 공정은 기질 차단(substrate locking)을 통해서 시스템내에 급속하게 퍼질 수 있는 다른 생물체의 감염에 대한 위험을 방지하도록 작용하는 모든 보조적 방법을 포함하는 것으로 히해된다. 이는 비살균 조건 뿐아니라 살균 조건도 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 선택된 극한 조건(예를 들어, 매우 낮은 pH 값에서의 완충 또는 항생제의 사입)으로 인해 발생 가능한 감염으로부터 안정하도록 극한 조건을 통한 연속적 발효를 할 수 있는 공정 단계와 수단과 관련된다. 여기에서, 본 발명에 따라 항생제 저항성 미생물과 같이 이들 감염 대립(infection-hostile) 조건과 대치되는 상기 SDH 활성을 갖는 유닛의 편차(deviation) 또는 변형(modification)을 이용하는 것이 가능하다. 그러나, 본 발명의 의도에서는 연속 공정하에서 영양액(nutrient solution)이 번갈아 공급되고 다른 한편으로는 효소적으로 생산된 1,6-GPS를 포함하는 배양액이 회수되는 어떠한 세포 성장 및 효소 촉매 시스템이라도 이해될 수 있고; 이들은 비균질화된 시스템 뿐 아니라 균질화된 시스템도 될 수 있다.

물론, 본 발명은 반연속적 또는 배치 방식의 공정과도 관련된다.

또 다른 바람직한 실시예에서 1,6-GPS로의 전환 반응의 출발 물질인 이소말툴로스는 슈크로스의 효소적 전환에 의한 생산된다. 본 발명에 따라 본 방법에 사용되는 이소말툴로스는 정제된 또는 농축된 효소, 조 추출물, 또는 슈크로스 뮤타아제(mutase) 활성을 가지고 있는 미생물에 의한 효소적 전환 즉, 배당체화 (transglucosidation)에 의해 슈크로스로부터 생산될 수 있다. 본 발명과 관련하여 슈크로스 뮤타아제는 이소말툴로스로 이성화할 수 있는 효소를 의미하는 것으로 이해되고 슈크로스 이성화효소(isomerase)로도 알려져 있다.

슈크로스 뮤타아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포의 예로는 프로타미노박터(Protaminobacter), 에르위니아(Erwinia), 세라티아(Serratia), 루코노스톡(Leuconostoc), 슈도모나스(Pseudomonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 클레브시엘라(Klebsiella) 및 엔테로박터(Enterobacter) 속(genus)의 특정 미생물들이 있다. 이들 미생물의 특정예에는 프로타미노박터 루브럼(Protaminobacter rubrum, CBS 547,77), 에르위니아 라폰티씨(Erwinia rhapontici,NCPPB 1578), 세라티아 플리무티카(Serratia plymuthica,ATCC 15928), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens,NCIB 8285), 루코노스톡 메센테로이드 NRRL B-521f(Leuconostoc mesenteroidesNRRL B-521f, ATCC 10830a), 슈도모나스 메소아시도필라 MX-45(Pseudomonas mesoacidophilaMX-45, FERM 11808 또는 FERM BP 3619), 아그로박테리움 라디오박터 MX-232(Agrobacterium radiobacterMX-232, FERM 12397 또는 FERM BP 3620), 클레브시엘라(Klebsiella) 아종(subspecies)과 엔테로박터(Enterobacter) 종(species)이 있다.

P. 루브럼, E. 라폰티시, 엔테로박터속 SZ62와P. 메소아시도필라로부터 그것을 코딩하는 핵산 및 슈크로스 뮤타아제 활성을 갖는 단백질의 특정예는 PCT/EP 95/00165에 게재되어 있다.

상기 세포들, 또는 이들 세포로부터의 단백질이나 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 슈크로스로부터 1,6-GPS를 생산하는 SDH 활성을 갖는 유닛과 함께 사용될 수 있는데, 예를 들면, 조절자(regulator) 유닛의 제어하에서 상기 세포에 발현(expressing) SDH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 삽입하는 방법이다.

슈크로스로부터 이소말툴로스의 효소적 전환의 특히 바람직한 실시예는, 바람직하게는 고정된P. 루브럼(Protaminobacter rubrum) 세포 또는 다이제스트 된세포 물질 또는P. 루브럼의 조 추출물에 의하거나, 부분적 또는 완전 정제된 슈크로스 뮤타아제(및 슈크로스 이성화 효소)에 의하여 수행된다. 이 반응은 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 SDH-의존성 전환과 함께 반응 용액에서 바람직하게 일어난다.

슈크로스로부터 이소말툴로스의 효소적 전이(enzymatic rearrangement)는, 예를 들어 독일특허 DE 195 23 560 A1 또는 독일특허 DE 44 14 185 C1에 게재되어 있는데, 이들은 개시된 미생물, DNA 서열, 효소 그리고 효소적 전환에 의한 슈크로스로부터 이소말툴로스의 제조방법과 관련하여 본 출원의 개시 내용에 완전 도입된다.

슈크로스 뮤타아제를 가지고 있는 세포, 예를 들어, 세포 다이제스트나 분리된 효소(슈크로스 뮤타아제)로부터의P. 루브럼의 고정화는 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 방식으로 사용되는 생물 촉매(biocatalyst)의 이동도와 용해도를 제한하도록 작용한다. 본 발명의 의도에서 고정화는 다양한 방법, 예를 들어, 생물 촉매의 상호간 또는 운반체와의 결합, 폴리머 매트릭스의 그물 구조 내에서의 고정, 또는 역 미셀(inverse micelle)의 사용을 당연히 포함하는 인공 또는 천연 멤브레인에 의해 둘러싸는 방법으로 수행될 수 있다. 세포, 세포 다이제스트 및/ 또는 슈크로스 뮤타아제의 고정화에 의해 생성되는 생물 촉매는 재사용이 가능할 뿐 아니라, 무엇보다도 공정 후에 또는 공정 중에 쉽게 분리 가능하여, 이소말툴로스로부터 1,6-GPS의 전환과 같은 다른 반응에서 촉매로 작용하는 다른 촉매와 이들을 임의로 대체할 수 있다. 세포 또는 효소가 훨씬 더 높은 국소 농도로 사용될 수 있고, 무엇보다도 연속 플로우-쓰루 시스템(flow-through system)에서 사용될 수 있다는 것은 중요한 잇점이다. 여기에서 고정화는 폴리아릴아미드(polyarylamide) 내의 봉입 또는 다른 방법에 의해 세라믹 운반체, 폴리머, 다양한 겔과 젤라틴 등에서 일어날 수 있다.

또 다른 바람직한 실시예에서, 슈크로스로부터 이소말툴로스로, 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 전환은 단일 공정 단계 즉, 두 가지 효소적 전환 반응이 같은 수용액 내에서 동시에 또는 약간의 시간 간격을 두고 일어난다. 두 가지 각각의 반응이 동일 또는 유사한 공정 조건에서 효소적으로 진행할 수 있으므로, 슈크로스로부터 1,6-GPS로의 전환은 하나의 공정 단계로 일어날 수 있다.

또 다른 바람직한 실시예에서 슈크로스로부터 1,6-GPS로의 전환은 단일의 생물 반응기에서 일어난다(이른바, 원-포트 반응(one-pot reaction)).

본 발명의 실시예는 슈크로스로부터 1,6-GPS로의 효소를 이용한 직접적 생산으로 구성되는데, 여기에서 SDH 및 슈크로스 뮤타아제 활성을 갖는 효소는 상기의 비고정화된, 그리고 고정화된 세포, 조 추출물, 및/또는 슈크로스로부터 이소말툴로스의 전환과 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 전환에 모두 사용될 수 있다.

본 발명에 따라, 전환은 또한 배치(batch) 및/또는 사입 배치 발효(fed batch fermentation)(불연속적 발효)에서 가능한데, 여기에서는 특정 시간에 영양 배지(nutrient medium)가 주입되고, 한정된 기질, 예를 들면, 슈크로스, 여러가지 기질(substrate), 효소/조효소 일 수 있는 기질의 소비 후에 또는 다른 적절한 시간대에 발효가 끝난다. 그러나, 반응 조건은 기질의 한정된 영향을 크게 배제할 수도 있도록 선택될 수도 있다. 배치 반응은 이른바 닫힌 시스템(closed system)에서 수행될 수도 있다. 이 시스템은 산소, 공기 또는 다른 기체, 또는 기체 혼합물이 닫힌 액체상(closed liquid phase)으로 계속적으로 공급될 때, 본 발명에 따라 닫힌 시스템으로도 해석된다. 배치 공정에서 세포의 환경은 계속적으로 변화하는데, 기질의 양의 감소, 다른 것들 둥에서도 1,6-GPS의 양의 증가 및 어떤 환경하에서는 심지어 세포 농도의 증가도 있을 수 있기 때문이다. 상기 원-포트 공정(one-pot process)은 1,6-GPS가 계속적으로 제거되면서 흐름 평형(flow equilibrium)을 유지한 상태로 본 발명의 의도에 따라 계속적인 효소적 촉매 작용으로 수행될 수도 있다.

또 다른 바람직한 실시예에 따르면, 효소적 전환에서 수성 반응 용액의 온도는 20 ℃~40 ℃, 특히 25 ℃이다. 25 ℃에서는 정제된 SDH가 약 1 주일 정도까지는 안정성을 갖는다. 따라서 이 범위의 온도는 장시간의 효소-촉매 공정을 수행하는데 적합하다.

또 다른 바람직한 실시예에서 본 발명은 슈크로스로부터 1,6-GPS를 제조하는 방법과 관련된다. 여기에서 슈크로스는 먼저 이소말툴로스로 효소적 전환된 후, 이소말툴로스가 1,6-GPS로 효소적 전환된다. 이러한 전체 공정은 하나 또는 그 이상의 공정 단계로, 그리고 하나 또는 그 이상의 생물 반응기에서 연속적으로, 반연속적으로, 또는 비연속적으로 진행 가능하다.

본 발명은 또한,

a) 서열번호 1(SEQ ID No. 1)로 주어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 상보적 스트랜드(complimentary strand);

b) 서열번호 2(SEQ ID No. 2)로 표시되는 뉴클레오티드(nucleotide) 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 이의 상보적 스트랜드;

c) (a) 또는 (b)로 주어지는 핵산 분자와 혼성화하는(hybridize) 핵산 분자;

d) 유전 암호의 축퇴(degeneration)로 인해 뉴클레오티드 서열이 (b) 또는 (c)로 주어지는 핵산 분자의 서열로부터 벗어나는 핵산 분자로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 소르비톨 데하이드로게나아제(sorbitol dehydrogenase, SDH) 활성을 갖는 효소를 코딩하는 핵산 분자와 관련된다.

본 발명과 관련하여, 소르비톨 데하이드로게나아제(SDH) 활성을 갖는 효소는 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 전환을 촉매 작용할 수 있는 단백질(protein) 또는 펩티드(peptide)를 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명에 있어서 핵산 분자는 천연 원료, 바람직하게는 글루코노박터 종(Gluconobacter spec.)으로부터 분리되거나 잘 알려진 방법에 의해서 합성할 수 있다. 본 발명에 따라, 핵산 분자에 다양한 돌연변이를 삽입하는 것은 현재의 분자 생물학적 기술에 의해 가능하며, 이로부터 생물학적 성질이 변경 가능한 효소를 합성하게 되는데, 이 또한 본 발명의 범위내에 있다. 본 발명에 있어서 돌연변이는 잘려진(truncated) 효소를 유도하는 모든 결실된(deletion) 돌연변이와 관련된다. 삽입(insertion), 복제(duplication), 전위(transposition), 유전자 융합(gene fusion), 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)과 같은 다른 분자 메카니즘을 통해서, 또한 다른 미생물 균주(strain)와 다른 메카니즘간의 유전자 전이(genetransfer)을 통해서, 예를 들어 효소 활성의 변형(modification) 및/또는 효소 조절(regulation)도 일어날 수 있다. 이와 같은 방식으로 돌연변이 효소는 예를 들어, K_m값, K_i값, K_a값이 변경된 상태로 생산될 수 있고/있거나, 변형된 형태로 세포내에 일반적으로 존재하는 조절 메카니즘의 대상이 되거나, 대상(subject)이 더이상 되지 않는다. 또한, 본 발명에 있어서 돌연변이 효소는 변경된 안정성, 기질 특이성(substrate specificity), 생산물 특이성(product specificity) 또는 변경된 효과(effect)나 패턴(pattern) 또는 변형된 활성(activity), 온도, pH 값, 및/또는 농도 또한 프로파일을 갖도록 생산될 수 있다. 본 발명에 따른 교시는 변경된 활성 효소 농도, 변형된 서브유닛(subunit)의 구조, 예를 들어, 신호(signal) 및/또는 수송 펩타이드(transport peptide) 및/또는 다른 작용기(functional group)의 전- 및 후- 번역상의 변형(pre- and posttranslational modification)을 갖는 효소와 관련된다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 상기 핵산 분자와 혼성화하는 핵산 분자들과 관련된다. 본 발명의 범위내에서, 혼성화는 삼부룩 등(Sambrook et al. Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2^nded., 1989)에 기술된 통상의 혼성화 방법하에서, 바람직하게는 엄격한 조건하에서의 혼성화를 의미한다. 본 발명에 따르면, 55℃에서, 바람직하게는 62℃에서, 더욱 바람직하게는 68℃에서, 1×SSC와 0.1% SDC로 1시간 동안 세척 후, 특히 55℃에서, 바람직하게는 62℃에서, 더욱 바람직하게는 68℃에서, 0.2×SSC와 0.1% SDC로 1시간동안 세척 후, 양성(positive) 혼성화 신호가 여전히 관찰될 때, 혼성화라고 한다.

상기 세척(washing) 조건하에서 서열 프로토콜(sequence protocol)에서 주어진 뉴클레오티드 서열의 하나와 혼성화가 일어나는 뉴클레오타이드 서열은 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열이다.

이러한 핵산 분자의 확인과 분리는 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 이들 분자나 상보적 스트랜드(strand)의 일부의 사용으로 수행될 수있다. 정확하게 또는 필수적으로 서열번호 2(SEQ ID No. 2)로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 이들 서열의 부분을 갖는 핵산 분자는 예를 들어 혼성화 탐침(probe)으로 사용될 수 있다. 혼성화 탐침으로 사용되는 단편(fragment)은 일반적인 합성 기술을 통해 제조되고 그 서열이 본 발명에 따른 핵산 분자의 서열과 본질적으로 일치하는 합성 단편일 수도 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자와 혼성화하는 분자는 또한 본 발명의 효소를 코딩하는 상기에서 기술된 핵산 분자의 단편, 유도체 및 대립 형질 유전자의 변형제(allelic variant)를 포함한다. "단편(fragment)"은 상기 효소를 코딩하는데 충분히 긴 핵산 분자의 일부분을 의미하는 것으로 이해된다. 본 발명에 있어서 "유도체(derivative)"라는 용어는 이 분자의 서열이 하나 또는 그 이상의 위치에서 상기 핵산 분자의 서열과 다르지만, 이들 서열과 높은 정도의 상동성(homology)을 갖는 것을 의미한다. 여기에서, 상동성은 핵산 수준에서 적어도 40 %, 특히 적어도 60 %, 바람직하게는 80 % 이상, 특히 바람직하게는 90 %, 95 %, 97 % 또는 99 % 이상의 서열 동일성(sequence identity)을 의미한다. 여기에서, 이들 핵산 서열에 의해서 코딩되는 효소는 아미노산 수준에서 서열번호 1(SEQ ID No. 1) 아미노산과 적어도 80 %, 바람직하게는 85 %, 그리고 특히 바람직하게는 90 %, 95 %, 97 % 및 99 % 이상의 서열 동일성을 갖는다. 상기에서 기술된 핵산 분자의 벗어남(deviation)은 예를 들어 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 재조합 (recombination)을 통하여 야기될 수 있다. 이들은 둘다 자연적으로 일어나는 변이체, 예를 들어 다른 생물체로부터의 서열 또는 돌연변이 일 수 있으며, 여기에서 이들 돌연변이는 자연적으로 발생할 수도 있고, 표적 돌연변이 유도(자외선(UV) 또는 X-선 방사(X-ray radiation), 화학 시약(chemical reagent) 등)에 의하여 삽입될 수도 있다. 또한 변형(variation)은 합성에 의해 생산된 서열일 수 있다. 대립 형질 유전자의 변형제(allelic variant)는 합성에 의해 제조된 변형체(variant)나 DNA 재조합 기술로 생산된 변형체 뿐 아니라 자연적으로 일어나는 변형체일 수 있다. 본 발명에 따른 핵산의 다른 변형체에 의해서 코딩되는 효소는 효소 활성, 활성 효소 농도, 서브유닛(subunit), 번역 후의 변형(posttranslational modificatioin), 작용기(functional group), 분자량, 면역 반응성(immunological reactivity), 형태(conformation) 및/또는 겔 전기영동(gel electrophoresis)에서의 유동 양상(flow behavior), 염색체 거동(chromatic behavior), 침전 계수(sedimentation coefficient), 용해도(solubility), 분광학적 성질 (spectroscopic), 안정성(stability), 최적 pH, 등전점(isoelectric)의 pH 값, 최적 온도 등과 같은 물리적 성질에서 어떤 공통적인 특성을 갖는다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 DNA 및 RNA 분자가 모두 가능하다. 본 발명에 따른 DNA 분자는 예를 들어 게놈(genomic) DNA 또는 cDNA 분자이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터(vector)와 관련된다. 바람직하게는, 이들은 유전공학에서 통상적인 플라스미드(plasmid), 코스미드 (cosmid), 바이러스(virus), 박테리오파아지(bacteriophage), 셔틀 벡터(shuttle vector) 및 다른 벡터들이다. 본 발명에 따른 벡터는 숙주(host) 생물체에서 벡터의 안정화 및/또는 복제를 유도하거나 이에 기여하는 다른 작용 유닛을 또한 가질 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 분자가 원핵(procaryotic) 및/또는 진핵(eucaryotic) 세포내에서 번역가능한(translatable) 핵산 분자의 전사(transcription)와 합성을 가능하게 하는 적어도 하나의 조절 요소(regulatory element)에 작동적으로 결합된 벡터는 본 발명에 따라 특정 실시예에 포함되어 있다. 이 조절 요소는 프로모터 (promoter), 인핸서(enhancer), 오퍼레이터(operator) 및/또는 전사 종결 신호 (transcription termination signal)일 수 있다. 물론, 벡터는 항생제 저항성 유전자 즉, 선택 표지(selection marker) 뿐 아니라 안정성 및/또는 복제(replication)를 위해 필요한 요소를 포함할 수도 있다.

본 발명은 또한 상기 벡터에 관련되는데, 이들 벡터는 SDH를 코딩하고 적어도 하나의 조절 요소의 제어를 받는 핵산 서열 외에도, 슈크로스 뮤타아제를 코딩하고 마찬가지로 적어도 하나의 조절 요소의 제어를 받는 핵산 서열을 포함한다. 따라서 이러한 벡터는 슈크로스로부터 이소말툴로스를 거쳐 1,6-GPS로의 효소적 전환에 필요한 두가지 효소를 위한 유전 정보를 가지고 있다. 이러한 벡터는 단일 공정 단계로 슈크로스를 1,6-GPS로 효소적 전환하기 위해, 특히 간단한 방법으로 하나의 숙주 생물체의 대사 장치(metabolic apparatus)를 이용하는 것을 가능하게 한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 핵산 분자의 하나 또는 본 발명에 따른 벡터의 하나를 포함하거나, 또는 형질전환되고 바람직하게는 SDH 및 임의로 슈크로스 뮤타아제를 발현할 수 있을 뿐 아니라 특히 바람직하게는 이소말툴로스나 슈크로스로부터 1,6-GPS를 생산할 수 있는 숙주 세포와 관련된다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자나 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포로부터 유래된 모든 숙주 세포와 관련된다. 따라서 본 발명은, 본 발명에 따른 핵산 분자나 벡터를 포함하는 숙주 세포와 관련되는데, 여기에서 숙주 세포는in vitro상의 재조합 핵산 분자를 흡수할 수 있고 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해서 코딩되는 효소를 임의로 합성할 수 있는 생물체를 의미하는 것으로 이해된다. 바람직하게, 이들은 원핵세포 또는 진핵세포이다. 무엇보다도, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터, 벡터의 유도체 또는 부분, 이들 벡터, 벡터의 유도체 또는 부분이 이소말툴로스 또는 슈크로스로부터 1,6-GPS를 제조하기 위한 효소를 합성하도록 하는 미생물과 관련된다. 본 발명에 있어서의 숙주 세포는 또한 본 발명에 따라 도입된 핵산 분자가 세포내에서 자연적으로 일어나는 것이 아닌 형질전환된 세포와 관련하여 이질적이거나(heterologous), 자연적으로 일어나는 서열에 상응하기 보다는 게놈상에서 다른 위치나 다른 복제 수(copy number)로 편재된다는 사실에 의해 특징지어질 수 있다.

본 발명의 실시예에서 이 세포는 원핵 세포, 바람직하게는 그램 음성(gramnegative) 원핵 세포, 보다 바람직하게는 엔테로박테리움(enterobacterium) 세포이다. 한편으로는, 내재적인 SDH 및/또는 슈크로스 뮤타아제 유전자를 포함하지 않는 세포(예를 들어E. coli)가 사용 가능하지만, 다른 한편으로 그들의 염색체 (chromosome) 내에 이미 하나 또는 두 개의 이러한 유전자를 포함하고 있는 세포를 사용하는 것도 가능하다. 적합한 원핵세포로 바람직한 예로는 E. 콜라이(E. coli)프로타미노박터 루브럼(Protaminobacter rubrum), 에르위니아 라폰티씨(Erwinia rhapontici), 엔테로박터(Enteroacter) 종(spec.) 또는 슈도모나스 메소아시도필라 (Pseudomonas mesoacidophila) 세포가 있다. 외인성(exogenous) 핵산 서열을 가지고 있는 원핵 세포의 변형은 분자 생물학 분야의 당업자에게 있어서 일반적인 지식이다.

그러나, 본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명에 따른 세포는 곰팡이 세포(예를 들어, 효모) 또는 동물 세포와 같은 진핵 세포가 될 수도 있다. 핵산 서열로 진핵 세포를 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection)시키는 방법도 마찬가지로 분자 생물학 분야의 당업자에게 일반적인 지식이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따라 최소한 하나의 숙주 세포를 가진 세포 배양물(cell culture)과 관련되는데, 여기에서 본 발명에 따른 세포 배양물은 특히 SDH 및 임의로 슈크로스 뮤타아제를 생산할 수 있다.

또한 본 발명은 SDH를 생산하는 방법에 관련되는데, 여기에서 본 발명에 따른 숙주 세포는 SDH의 형성이 허용되고 SDH가 회수 가능한 조건하에서 배양 배지 (culture medium) 중에서 배양된다.

본 발명의 또 다른 실시예는 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질 뿐 아니라, 그들을 생산하는 방법으로 구성되는데 여기에서는 본 발명에 따른 숙주 세포가 단백질의 합성이 허용된 조건하에서 배양된 후 단백질이 배양 세포 및/또는 배양 배지로부터 분리된다.

또한, 본 발명은 SDH 활성을 갖는 본 발명에 따른 유닛의 구조를 확인 및 임의로 결합할 수 있는 단클론성(monoclonal), 다클론성(polyclonal) 항체와 관련된다. 이 구조는 단백질, 탄수화물 뿐 아니라 지질 복합체(lipid complex) 및/또는 당지질(glycolipid)일 수 있는데, 이는 SDH를 포함하는 유닛과 특정 관계를 갖는다. 또한, 번역 후 변형(posttranslational modification)으로서 SDH에 매칭되는 구조로 나아가는 항체도 본 발명에 포함된다. 공간상의 전자 구름 구조가 항체에 의해서 확인되어, SDH 활성을 갖는 유닛의 생물학적, 화학적, 물리적 성질에 관한 결론에 이를 수 있다는 사실은 중요하다.

또 다른 특정 실시예에서 본 발명은, 본 발명에 따른 상기 항체와 반응하는 항체 특히, 이들 항체와 확인 및 결합 가능한 것과도 관련된다.

또한, 본 발명은 상기 항체들과 관련되는데, 여기에서 이들은 생물학적, 화학적 및 물리적 수단에 의해서 변형된다.

본 발명은 하기 실시예 및 관련 도면에 의해서 설명될 것이다.

실시예 1 SDH의 제조

글루코노박터 서브옥시단스의 바이오매스(biomass)제조

글루코노박터 서브옥시단스 DSM2003의 바이오매스(biomass)를 충분히 얻을 수 있도록 실험실 규모로 발효시켰다. 다음은 배지 1로 사용되었다: D-만니톨(50 g/ℓ), 카세인으로부터 얻은 펩톤(10 g/ℓ), 효모 추출물(5 g/ℓ), 및 CaCO₃(20 g/ℓ). 다음은 배지 2로 사용되었다: D-만니톨(75 g/ℓ), 카세인으로부터 얻은 펩톤(16 g/ℓ), 효모 추출물(8 g/ℓ), 및 CaCO₃(1 g/ℓ). 글루코노박터 서브옥시단스 DSM 2003 균주의 동결건조 제조물을 1 ㎖의 배지 내에 전배양물(preculture)로서 현탁시키고 배지 1과 함께 한천 평판 배지 상에 도말하여 25 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 그 후 한천 배지의 배양물을 25 ㎖의 배지 1에 도입하고, 25 ℃에서 48 시간 동안 진탕 플라스크(shaker flask)에서 배양하였다. 이 배양물은 제 1 전배양물(preculture)로도 불리는 것으로, 그 후 25 ℃에서 48 시간 동안 진탕 플라스크(용적 1 ℓ)내 250 ㎖의 배지 1 중에서 배양하였다. 이러한 방법으로 얻은 배양물은 제 2 전배양물로 불리는 것으로, 발효를 위한 접종물로 작용하였다.

발효를 위해 제 2 전배양물을 진탕 플라스크로부터 20 ℓ발효기 내의 15 ℓ배지 2로 옮기고 25 ℃에서 다음 조건으로 배양하였다:

pH 값:6.9 (5 N NaOH의 적정에 의해 일정하게 유지)

교반기 속도:350 rpm

산소 포화도: 40 %

상기 조건은 발효중 일정하게 유지되었다. 발효는 세포성장의 종결과 함께 종결되는데, 이는 HPLC에 의해 기질의 소모로부터 설정되었다.

세포 집합체를 원심분리(800 g, 20 분, 4 ℃)로 수확하여, 0.9 %의 NaCl 용액으로 세척하고, 50 mM 트리스-완충액(pH 7.0)으로 1:3 희석한 후, 프렌치 프레스(French press) 공정으로 분쇄하였다. 세포 단편을 초원심분리(110,000 g, 20 분, 4 ℃)에 의해 제거하였다. 이른바 조 추출물(raw extract)로 불리우는 투명한 상등액을 즉시 사용하거나 영하 30 ℃에서 저장하였다.

SDH의 제조

SDH의 제조를 위해 다음 3 단계 계획이 선택되었다.

단계 1:

조 추출물(raw extract)을 50 mM 트리스/HCl 완충액(pH 7.0)과 평형을 이루도록 된 DEAE 세파로스 컬럼(2.6 ×9 ㎝)에 도입하고, 50 mM 트리스/HCl 완충액(pH 7.0) 내의 0.0∼0.5 M NaCl의 선형 구배에 따라 50 ㎝/h의 유속으로 용출시켰다.SDH는 0.2 M NaCl에서 용출될 수 있다.

단계 2:

다이 리간드 크로마토그래피 컬럼(dye ligand chromatography column)은 다음과 같이 준비되었다: (ⅰ) 세파로스 4B-CL 겔은 매트릭스로 사용되고(Boyer, P. M. and Hsu, J. T. (1993) In: Fiechter, A. (ed.)Advances in Biochemical Engineering, 49, 1-44), (ⅱ) 염료 블루 160(Blue H-ERD)은 노이하우저 등(Neuhauser, W.et al., 1997,Biochem. J., 326, 683-692)의 방법에 의해 고정되었다. 겔 1 ㎖ 당 10 ㎎의 염료가 사용되었다. 단계 1로부터 모아진 SDH-함유 분획을 투석하고, 다이 리간드 컬럼(2.6×7.0 ㎝, 50 mM 트리스/HCl 완충액으로 평형을 이룬 것, pH 7.0)에 도입하였다(대략 2∼5 ㎎ 단백질/㎖ 겔). 흡착된 단백질을 50 mM 트리스/HCl 완충액(pH 7.0) 내의 0.0∼0.5 M NaCl의 선형구배로 유속 2.0 ㎖/분으로 용출하였다. SDH는 0.1 M HCl에서 용출될 수 있다.

단계 3:

단계 2로부터 모아진 활성 분획을 투석하고, 한외여과에 의해 농축하고, 다시 1 ㎖ 겔 당 약 0.5 ㎎의 단백질이 적용된 다이 리간드 컬럼(2.6 ×7.0 ㎝, 50 mM 트리스/HCl 완충액, pH 7.0)으로 도입하였다. 순수한 SDH의 친화성 용출은 20 mM 트리스/HCl 완충액(pH 7.0) 내의 10 mM NADH로 10 ㎝/h의 유속에서 수행되었다. 다음에 NADH는 투석에 의해 제거되었다.

정제된 SDH는 영하 30 ℃에서 대략 8 달 동안 저장될 수 있고, SDH는 4 ℃에서 대략 30일 동안 안정하다.

다음 표 1은 SDH의 정제 계획을 나타낸 것이다.

정제단계	총 활성도(U)	총 단백질(㎎)	비활성도(U/㎎)	농축인자	수율(%)
조 추출물	360.0	782.6	0.46	1.0	100
DEAE-세파로스	281.0	78.5	3.58	7.8	78
Blue 160-Affigel	174.0	15.7	11.12	24.2	48
Blue 160-Affigel	120.0	4.9	24.49	53.2	33

이러한 정제 계획에 의하여, 음이온 교환 크로마토그래피, 그 후 제 1 다이 리간드 친화성 크로마토그래피, 한외여과 및 제 2 다이 리간드 친화성 크로마토그래피에 의한 조 추출물의 분리, 조 추출물과 비교하여 대략 50 인자에 의한 농축이 달성될 수 있다. 그 수율은 약 33 %이다.

실시예 2: 이소말툴로스로부터 1,6-GPS의 제조

효소 멤브레인 반응기 내 1,6-GPS의 효소적 연속 제조

이소말툴로스로부터 1,6-GPS의 연속 제조는 스테인레스 스틸 반응기(용적 50 ㎖)를 사용하여 수행되었다. 효소 멤브레인 반응기는 수 냉각에 의한 온도 조절을 위한 이중 쟈켓(jacket), 전도성 및 pH 전극의 삽입을 위한 구멍, 그리고 압력측정, 기질의 공급, 생산물의 회수 및 표본의 획득을 위한 접속부를 갖고 있다.

외부로 작동될 수 있는 반응기 안쪽에 위치한 자석식 교반기는 공급된 기질의 최적 혼합을 보장한다. 반응기 상부에는 아래쪽에 금속 소결 플레이트가 있고, 그 위에 한외여과 멤브레인과 O-링이 장착되어 있다. 반응기를 채운 후 바닥부를 갖는 상부를 나사 고정하였다. 기질을 피스톤 펌프에 의해 공급하였다. 적정에 의해 pH를 일정하게 유지하는 제어시스템으로 반응용액의 전도도와 pH 값을 연속적및 직접적으로 측정하였다. 한외여과 멤브레인이 조효소의 완전한 유지를 보장하지 않기 때문에, 니토 사(Nitto Co.)에 의해 만들어진 하전된 멤브레인(Nitto Membrane NTR-7410)이 사용되었다. 이러한 조효소 유지의 정전기적 방법은 또한 분리된 조효소가 원하는 반응 공간에 남을 것임을 보장한다.

기술된 멤브레인 반응기를 50 mM 트리스/HCl 완충액(pH 7.5) 내의 250 mM 이소말툴로스와 글루코스 용액으로 채웠다(+0.1 % NaN₃). 다음에 누수 또는 다른 문제들을 검출하고, 필요에 따라 교정하기 위해 반응기를 24 시간 동안 2 ㎖/h의 유속으로 "공전(idle)" 시켰다. 그후 크로마토그래피로 입력되는 샘플에서 사용되는 것과 같이 SDH 및 재생 효소 FDH를 수퍼루프(superloop)에 도입하였다. 반응 개시시, 완전 정제된 SDH(실시예 1에 의한)와 GDH(바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 얻은 글루코스 데하이드로제나스)를 각각 1 U/㎖씩 사용하였다. 반응은 2.5 ㎛ NAD⁺의 주입에 의해 개시되었다. pH는 1 M의 트리스로 적정하는것에 의해 7.0으로 일정하게 유지되었다. 연속 반응기의 작동에서 중요한 인자는 잔류 시간 분배이다. 이것은 반응용액의 최적 혼합을 가정하여 다음식에 의해 계산된다.

t=[V]/V0

여기에서 V는 반응기 용적이고, V₀는 용적 유속이다. 4 시간의 배치 실험 후, 기질 사입을 2 ㎖/h의 유속으로 조정하여, 평균 잔류 시간(t)을 25 시간이 되도록 하였다. 234 시간의 시험 기간 동안 효소 활성, 알칼리 소비, 전도도, 압력, 기질, 및 생산물 용적은 일정 간격으로 측정하였다. 얻어진 생산물 샘플은 그의 소비 및 1,6-GPS의 생성에 의해 HPLC로 시험되었다.

실시예 3: 슈크로스로부터 1,6-GPS 생산을 위한 효소적 단일 생물 반응기 공정 ("one-pot reaction")

슈크로스로부터 1,6-GPS의 직접적 효소적 제조를 위해, P. 루브럼(P. rubrum)의 고정화된 세포와 G. 서브옥시단스 2003으로부터의 SDH 효소 및 칸디다 보이디니(Candida boidinii)로부터의 FDH의 배치 실험이 하기 조건 하에서 수행되었다. 이 반응에서 기질은 슈크로스와 암모늄 포르메이트였다.

부피:10 ㎖

온도:25 ℃

슈크로스:500 mM

포르메이트:500 mM

P. rubrum세포:1 g

SDH:5 U

FDH:10 U

NAD:1 mM

이 반응 동안 pH 값이 증가하였기 때문에, 1 M 포름산으로 지속적으로 pH 7.0으로 조절하였다. 기질 소비는 DC 및 DNS 방법(슈크로스의 이소말툴로스로의 전환을 위한) 및 HPLC(이소말툴로스의 1,6-GPS로의 전환을 위한)에 의해 반응 동안측정되었다. 하나의 반응용기 내에서 하나의 공정 단계로 슈크로스로부터 1,6-GPS의 직접적 형성을 예시하는 것이 가능하다.

실시예 4: 핵산 및 이로부터 유래된 SDH의 펩티드 서열

1. 펩티드 서열 결정

부분적 아미노산 서열을 결정하기 위해, 실시예 1에 따라 정제된 글루코노박터 서브옥시단스 DMS 2003의 SDH를 트립신으로 다이제스트하고 표준적인 방법에 의해 분리하였다. 생성된 부분적 펩티드 서열은 서열번호 3∼9(SEQ ID No. 3∼9)로 나타낸다.

2. DNA 탐침 제조

펩티드 서열 결정에서 분석된 서열을 기본으로 프라이머를 준비하여, 글루코노박터 서브옥시단스 DMS 2003으로부터 SDH의 완전한 유전자의 클로닝(cloning)에 사용하였다.

3. 유전자 은행의 형성과 클론 분리

상기 프라이머(SEQ ID Nos. 3 및 5)를 PCR 반응에 이용하여, SDH 코딩 서열의 단편을 얻었다. DNA 탐침은 PCR 단편으로 제조되었다. 탐침의 라벨링 후, 게노믹 서던 블롯(genomic southern blot) 내에서 혼성화 밴드(hybridizing bands)를 설정하였다. 단편과 함께 두 개의 독립된 서브게노믹 유전자 은행(CIaI 다이제스쳔 후의 ~9 kb 단편,BamHI 다이제스쳔 후의 ~3.5 kb 단편, 슈크로스 구배 원심분리에 의한 단편의 정제)을 pBlueskrip SK 안에 설정하였다. 이 서브게노믹 클론 은행(subgenomic clone banks)은 상기 표지된 탐침으로 혼성화(hybridization)시키는 것에 의해 시험되었다. 몇 개의 클론(clone)을 확인하여 이들 중BamHI와ClaI 은행 각각의 한 클론을 더욱 분석하였다.

4. 서열 분석

클론 단편의 서열 결정은 두 가지 경우에 상응하는 DNA 서열을 부여하였다. 이로부터 SDH의 아미노산 서열을 설정하는 것이 가능하였다. 이는 코돈(codon) 196 위치까지 펩티드 서열로부터의 서열과 일치하는데, 펩티드 5를 위한 펩티드 서열은 현재 결정된 트립토판 대신 세린(serine)을 갖는다(W 196).

글루코노박터 서브옥시단스 DSM 2003의 SDH의 뉴클레오티드(nucleotide) 서열은 서열번호 2(SEQ. ID No. 2)로 표시되고, 789 뉴클레오티드가 포함된다.

글루코노박터 서브옥시단스 DSM 2003의 소르비톨 데하이드로게나제(sorbitol dehydrogenase)의 아미노산 서열은 서열번호 1(SEQ. ID No. 1)로 표시되고, 262 아미노산을 포함한다.

5.E. coli에서의 발현

코딩 서열은 5' 말단에서 서열 GAATTCTT, 3' 말단에서 서열 AAGCTT가 연장되었다. 이 서열을 벡터 pBtac2(도 1; J. Bosius (1988),Biotechnology10, 205-225) 내에서 통합하는데, 이는EcoRI와HindⅢ로 제조되었다. 생성된 플라스미드 pHWG 467(도 2)은 tac-프로모터의 제어하 SDH 코딩 서열과 앰피실린(ampicillin) 저항 유전자를 포함한다. 플라스미드 pHWG 467은 대장균(E. coli) JM109로 형질전환되었다. 이들 세포는 IPTG로 유도 후 SDH 활성을 생성한다. 상응하는 단백질의 활성은 조 추출물 내에서 측정될 수 있다. 이들 추출물의 SDS 겔에서 단백질은 우세종으로서, 28 kDa에서 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색 가능하다.

본 발명에 따르면, 이소말툴로스로부터 1,6-GPS를 간단하고 저렴한 비용으로 선택적 제조하는 것이 가능하다.

Claims

이소말툴로스(isomaltulose)로부터 6-O-α-D-글루코피라노실-D-소르비톨 (1,6-GPS)을 효소적으로 제조하는 방법에 있어서, 이소말툴로스가 소르비톨 데하이드로게나제(SDH) 활성을 갖는 유닛을 포함하는 수성 반응 용액에 첨가되고, 배양된 후, 1,6-GPS가 반응 용액으로부터 회수되는 방법.
제 1 항에 있어서, 배양 전 또는 도중에 환원 당량(reduction equivalent)이 수성 반응 용액에 첨가되는 방법.
제 1 항에 있어서, SDH 활성을 갖는 유닛이 분리된 SDH인 방법.
제 1 항에 있어서, SDH 활성을 갖는 유닛이 SDH를 포함하는 생존 또는 사멸한 미생물이거나, 또는 이의 조추출물인 방법.
제 4 항에 있어서, SDH를 포함하는 미생물이 글루코노박터 서브옥시단스 DSM 2003(Gluconobacter suboxidansDSM 2003)인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 pH 값 조절 하에, 또는 pH 값 조절 없이 수행되는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항의 어느 한 항에 있어서, 배양 전 또는 도중에 재생 시약(regeneration agent), 특히 포르메이트 데하이드로게나제(FDH) 및 포르메이트 (formate)가 수성 반응 용액에 첨가되는 방법.
제 3 항 내지 제 7 항의 어느 한 항에 있어서, 미생물, 조 추출물(raw extract) 또는 효소가 고정화되는(immobilized) 방법.
제 1 항 내지 제 8 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 연속적으로 수행되는 방법.
제 1 항 내지 제 9 항의 어느 한 항에 있어서, 출발 물질로 사용되는 이소말툴로스가 슈크로스로부터 이소말툴로스로의 효소적 전환에 의하여 제조되는 방법.
제 10 항에 있어서, 슈크로스로부터 이소말툴로스로의 효소적 전환이 고정화된 P. 루브럼(P. rubrum) 세포, 분리된 슈크로스 뮤타제 및/또는 P. 루브럼(P. rubrum)의 세포 다이제스트(cell digest)에 의하여 수행되는 방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 슈크로스로부터 이소말툴로스로의 효소적 전환 및 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 효소적 전환이 단일 공정 단계로 일어나는 방법.
제 1 항 내지 제 12 항의 어느 한 항에 있어서, 슈크로스로부터 이소말툴로스로의 효소적 전환 및 이소말툴로스로부터 1,6-GPS로의 효소적 전환이 단일 생물반응기(bioreactor)에서 수행되는 방법.
제 1 항 내지 제 13 항의 어느 한 항에 있어서, 효소적 제조는 20 내지 40 ℃의 온도, 특히 25 ℃에서 일어나는 방법.
슈크로스(sucrose)로부터 1,6-GPS를 효소적으로 제조하는 방법에 있어서, 슈크로스는 이소말툴로스로 효소적으로 전환되고, 이어서 또는 동시에, 제 1 항 내지 제 14 항의 어느 한 항의 방법에 의하여 이소말툴로스가 1,6-GPS로 효소적으로 전환되는 방법.
미생물로부터 SDH를 분리하는 방법에 있어서, 미생물이 제 1 공정 단계에서 다이제스트 및 균질화되어 조 추출물(raw extract)로 되고, 제 2 공정 단계에서 조 추출물이 음이온 교환 크로마토그래피 처리되고, 제 3 공정 단계에서 제 1 다이 리간드 친화성 크로마트그래피(first dye ligand affinity chromatography) 처리되고, 그리고 제 4 공정 단계에서 제 2 다이 리간드 친화성 크로마토그래피 처리되는 방법.
제 16 항에 있어서, 다이 리간드 친화성 크로마토그래피 말기에 적어도 하나의 환원 당량으로 친화성 용출이 수행되는 방법.
a) 서열번호 1(SEQ ID No. 1)로 주어지는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 상보적 스트랜드;

b) 서열번호 2(SEQ ID No. 2)로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 이의 상보적 스트랜드;

c) (a) 또는 (b)로 주어지는 핵산 분자와 혼성화하는(hybridize) 핵산 분자;

d) 유전 암호의 축퇴(degeneration)로 인해 그의 핵산 서열이 (b) 또는 (c)로 주어지는 핵산 분자의 서열로부터 벗어나는 핵산 분자로 구성되는 그룹으로부터 선택된, 소르비톨 데하이드로게나제(SDH)의 활성을 갖는 효소를 코딩하는 핵산 분자.
제 18 항에 있어서, DNA 분자인 핵산 분자.
제 19 항에 있어서, cDNA 또는 게놈 DNA(genomic DNA)인 핵산 분자.
제 18 항에 있어서, RNA 분자인 핵산 분자.
제 18 항 내지 제 21 항의 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제 22 항에 있어서, 핵산 분자가 적어도 하나의 조절 요소, 특히 프로모터, 인핸서(enhancer) 및/또는 전사 종결 신호와 결합되는 벡터.
제 18 항 내지 제 21 항의 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제 22 항 또는 제 23 항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포 또는 이러한 숙주 세포로부터 유도된 숙주 세포.
제 24 항에 있어서, 원핵 세포 또는 진핵 세포인 숙주 세포.
제 25 항의 숙주 세포의 적어도 하나를 포함하는 세포 배양물(cell culture).
SDH를 생산하는 방법에 있어서, SDH의 형성이 허용되고 SDH가 회수되는 조건 하에서, 제 24 항 또는 제 25 항의 숙주 세포가 배양 매체 중에 배양되는 방법.
제 16 항 또는 제 27 항의 방법에 의하여 제조될 수 있거나, 또는 제 18 항 내지 제 21 항의 어느 한 항의 핵산 분자에 의하여 코딩되는, SDH의 활성을 갖는 단백질.
제 28 항의 SDH 활성을 갖는 유닛에 대한 특정 친화성을 갖는 항체, 또는 이러한 항체를 생산하는 제 24 항 또는 제 25 항의 숙주 세포에 대한 특정 친화성을 갖는 항체.
제 29 항의 항체와 친화성을 갖는 항체.
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 변형된(modified) 항체.