JPH05236957A - 胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子、新規な組み換え体dna及び胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法 - Google Patents
胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子、新規な組み換え体dna及び胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法Info
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- JPH05236957A JPH05236957A JP4043382A JP4338292A JPH05236957A JP H05236957 A JPH05236957 A JP H05236957A JP 4043382 A JP4043382 A JP 4043382A JP 4338292 A JP4338292 A JP 4338292A JP H05236957 A JPH05236957 A JP H05236957A
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Abstract
細菌に由来し、図4に示されるアミノ酸配列をコードす
る胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子、又は、図1又は図
3に示される胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子、該遺伝
子を組み込んだベクターDNA及び胆汁酸硫酸サルファ
ターゼの製造方法。 【効果】胆汁酸硫酸サルファターゼを低コスト、簡易か
つ高収率で製造することができるようになった。
Description
ーゼ、該蛋白質をコードする遺伝子、新規な組み換え体
DNA、及び胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法に関す
る。
抱合型胆汁酸の酵素法による定量を可能とすることを目
的として、硫酸抱合型胆汁酸の3α−硫酸エステルを効
率よく加水分解する酵素の検索を行った。その結果、シ
ュードモナス属に属する細菌であるシュードモナス・テ
ストステロニー(Pseudomonas testosteroni)が目的と
する酵素である胆汁酸硫酸サルファターゼを産生するこ
とを見出した。この細菌が生産する胆汁酸硫酸サルファ
ターゼは、3α−硫酸抱合型胆汁酸に作用し、3β−ヒ
ドロキシ胆汁酸を生成するという作用特性を有する。従
って、この3β−ヒドロキシ胆汁酸にβ−ヒドロキシス
テロイド・デヒドロゲナーゼを該デヒドロゲナーゼの補
酵素であるβ−NADの存在下に作用させ、3β−ヒド
ロキシ胆汁酸を3−オキソ胆汁酸に酸化するとともに、
β−NADをNADHに還元し、このNADHの生成量
を公知の方法にて定量することにより、3α−硫酸抱合
型胆汁酸の定量を可能とした(特開平2−145183
号公報参照)。
汁酸硫酸サルファターゼの製造法では、培地中に高価な
コール酸等を誘導基質として添加することが必須の条件
であり、かつ胆汁酸硫酸サルファターゼの生産量は低
く、また製造操作も煩雑になるなどの欠点があった。
コスト、簡易かつ高収率で製造する方法を提供すること
を目的とする。
サルファターゼを生産するシュードモナス・テストステ
ロニーに属する細菌例えば、シュードモナス・テストス
テロニーATCC11996株由来の該酵素遺伝子領域
(1509bp)を含む2.36kbのDNA断片をベ
クターDNA例えばプラスミドベクターに挿入して作成
した組み換え体DNAを導入した形質転換体例えば大腸
菌を育種して、通常の栄養培地にて培養すれば、培地中
に前述の高価な添加物を全く添加することなく、該形質
転換体内に効率よく該酵素が生産されること等の知見を
得、本発明を完成した。
トステロニーに属する細菌に由来し、下記式:
酸サルファターゼ遺伝子を提供するものである。
A配列を含むことを特徴とする胆汁酸硫酸サルファター
ゼ遺伝子を提供するものである。
する胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子を提供するもので
ある。
ストステロニーに属する細菌に由来し、下記式:
酸硫酸サルファターゼ遺伝子を含有するDNA断片をベ
クターDNAに挿入してなる新規な組み換え体DNAを
提供するものである。
ターゼ遺伝子が、下記式(A):
A配列を含むことを特徴とする新規な組み換え体DNA
を提供するものである。
ストステロニーに属する細菌に由来し、下記式:
酸硫酸サルファターゼ遺伝子を含有するDNA断片をベ
クターDNAに挿入した新規な組み換え体DNAを導入
することにより、胆汁酸硫酸サルファターゼ生産能を獲
得したエッシェリシア属に属する細菌を培地に培養し、
その培養物より胆汁酸硫酸サルファターゼを採取するこ
とを特徴とする胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法を提
供するものである。
ァターゼ遺伝子が、下記式(A):
A配列を含むことを特徴とする胆汁酸硫酸サルファター
ゼの製造法を提供するものである。
サルファターゼを提供するものである。
ファターゼ遺伝子のドナーとして用いられるシュードモ
ナス・テストステロニーに属する細菌としては、例え
ば、シュードモナス・テストステロニーATCC119
96等が挙げられる。次いで上記細菌を培養し、培養物
を得る。培養方法は、例えば特開平2−145183号
公報記載の方法等が挙げられ、具体的にはLB培地など
の一般細菌用の培地中、通常好気的条件下に24〜34
℃程度で12〜24時間程度培養する。この方法により
培養物を得、培養物から常法、例えばろ過、遠心分離な
どにより菌体を得る。菌体からは、例えばフェノール法
[Biochimica et Biophysica Acta Vol.72,pp619-629
(1963) ]などにより染色体DNAを得ることができ
る。
NAのベクターDNAへの挿入は、常法に従って、例え
ば染色体DNA及びベクターDNAを、各種の制限酵素
で切断してDNA断片を調製した後、両DNA断片を混
合し、DNAリガーゼで処理することによって行なうこ
とができる。制限酵素としては、例えば、BamHI、
EcoRI、HindIII 、PstI、SmaI等が挙
げられる。
NAは、常法、例えば塩化カルシウム処理法等により、
宿主菌細胞となるエッシェリシア属に属する細菌、例え
ば大腸菌(Escherichia coli)JM109、大腸菌HB
101などに導入し発現させる。
ーゼ遺伝子が組み込まれた)プラスミドDNAを含有す
る大腸菌は、菌体の破砕抽出液に、硫酸抱合型胆汁酸、
例えばコール酸3−硫酸を作用させ、その脱硫酸化され
た反応生成物であるイソコール酸(5β−コラン酸−3
β、7α、12α−トリオール)を薄層クロマトグラフ
ィーを用いて検出することにより、選択し取得すること
ができる。
酸サルファターゼ活性を有する菌株より、モレキュラー
・クローニング第2版(Molecular Cloning SECOND EDI
TION)第1巻、第21頁〜24頁に記載の方法などによ
り、胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子を含有するDNA
断片が挿入された組み換え体プラスミドDNAの抽出、
精製を行ない、さらにこの組み換え体プラスミドDNA
を用いて常法に従いサブクローニングを行い、胆汁酸硫
酸サルファターゼ遺伝子を含有する2.36kbのDN
A断片を挿入した新規な組み換え体プラスミドDNAを
取得する(図1参照)。
有する組み換え体プラスミドDNAを用いて、胆汁酸硫
酸サルファターゼ遺伝子のみの全塩基配列の解析を行い
(図3参照)、次いで前記塩基配列を有する遺伝子によ
って翻訳されて実際に得られるポリペプタイドのアミノ
酸配列を確定する(図4参照)。以下の実施例に示すよ
うに、得られるポリペプタイドは、図3をそのまま翻訳
したペプタイドではなく、N末端側の28個以上のアミ
ノ酸が除かれたHisから始まるペプタイドであり、こ
のことは本発明により初めて明らかにされた知見であ
る。
酸サルファターゼ遺伝子を含有するDNA断片を挿入し
た、プラスミドDNAが導入された大腸菌を用いて、胆
汁酸硫酸サルファターゼを生産するには、上記大腸菌
を、下記のように培養し培養菌体を得る。
養法で培養してもよいが、液体培養法を用いて培養する
のが好ましい。また、本大腸菌の培養に使用する培地と
しては、炭素源、窒素源、無機化合物その他の栄養素を
含み、細菌の培養に一般的に用いられている合成培地、
半合成培地、或いは天然培地のいずれをも使用すること
ができる。上記培地に利用できる炭素源としては、ブド
ウ糖、果糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、グリ
セロール等の糖質液やピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸
等の有機酸等を例示できる。窒素源としては、硫酸アン
モニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、酒石酸アンモニ
ウム、酢酸アンモニウム、尿素等を例示できる。炭素源
としても窒素源としても利用できるものとしては、ペプ
トン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー
等を例示できる。無機化合物としては、リン酸一カリウ
ム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二
ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩
化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化第一
鉄、硫酸第二鉄、塩化第二鉄、硫酸マンガン、塩化マン
ガン等を例示できる。
が、25℃〜42℃好ましくは30℃前後で、6〜24
時間好ましくは8〜14時間通常の振盪培養あるいは通
気攪拌培養にて行う。
抽出される。抽出は、通常の菌体内酵素抽出法に従い行
うことができる。例えば、超音波処理、各種機械的処
理、酵素処理等の方法により菌体を破砕し、不溶物を遠
心分離等により分離した上清に酵素を回収することがで
きる。この粗酵素は、一般的な酵素精製法を選択・組み
合わせることにより精製することができる。例えば、除
核酸処理、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲルろ過等により胆汁酸硫酸サルファターゼを得ること
ができる。
ミノ酸配列をコードするものであれば、各アミノ酸のコ
ードの種類はいずれでも良い。また、式(A)で示され
るアミノ酸配列は必要最小限のものであり、例えば式
(B)で示されるような該配列よりも長い遺伝子も本発
明に包含される。また、式(B)で示されるDNA配列
のうち、番号1〜3、13〜15及び22〜24の3種
のATGのうち任意のATGから始まるDNA配列も本
発明に包含される。
する本発明の遺伝子は、酵素活性を保持する範囲でN末
端側及び/又はC末端側の複数のアミノ酸を、例えばカ
ルボキシペプチダーゼのようなエキソペプチダーゼで切
断したものも本発明に包含される。
いられるプラスミドDNAとしては、適当な選択マーカ
ーを有し、多コピーのものが好適で、例えばpUC1
8、pUC19、pBR322、pTrc99A等が挙
げられる。
する。
・テストステロニーATCC11996をLB培地(ト
リプトン10g/L、酵母エキス5g/L、塩化ナトリ
ウム10g/L、pH7.0)750mlに接種し30
℃で12時間振盪培養した後、遠心分離により菌体を分
離した。かくして得られた、菌体よりフェノール法(Bi
ochimica et Biophysica Acta Vol.72,pp619-629 (196
3) )にて染色体DNAを抽出し、約5mgの染色体D
NAを得た。
換え体プラスミドDNAの調製 (1)で得られた染色体DNA70μgに、制限酵素E
coRIを加え37℃で30分、60分、90分反応さ
せ、DNAを部分分解した後、低融点アガロースゲルを
用いて電気泳動を行ない、3kb〜7kbの大きさのD
NA断片を回収する。次いで、これをフェノール処理、
エーテル処理、エタノール沈殿により精製を行いDNA
断片を得た。別にベクターとして使用するプラスミドp
UC182μgに制限酵素EcoRIを加え、37℃で
2時間反応させ完全に分解した後、アルカリフォスファ
ターゼ処理、フェノール処理、エーテル処理、エタノー
ル沈殿により精製を行いEcoRI 切断pUC18を
得た。
前述の染色体DNA断片を緩衝液に溶解させ、混合す
る。さらにT4−DNAリガーゼを加え、10℃で15
時間連結反応させ、組み換え体プラスミドDNAを調製
した。
大腸菌の形質転換 大腸菌JM109をLB培地50mlにて37℃で2時
間振盪培養した後、遠心分離にて得た菌体を100mM
塩化マグネシウム溶液50mlに懸濁し、氷中5分間保
持する。その後、遠心分離により菌体を分離し、さらに
100mM塩化カルシウム溶液50mlに懸濁し、氷中
1時間以上保持後、遠心分離により菌体を分離し、10
0mM塩化カルシウム溶液4mlに再懸濁した。この菌
体の懸濁液0.4mlに(2)で調製した組み換え体プ
ラスミドDNA溶液を加え、氷中で30分間保持した
後、42℃で90秒熱処理して該プラスミドDNAを該
菌体の細胞内に取り込ませ形質転換させた。次に、この
形質転換させた菌体の懸濁液に、4mlのLB培地を加
えて、37℃で1時間振盪培養を行なった後、アンピシ
リン100mg/L、IPTG(イソプロピル−1−チ
オ−β−D−ガラクトシド)23.8mg/L、および
X−Gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル
−β−D−ガラクトシド)20mg/Lを添加したLB
培地の寒天平板に塗布し、37℃で18時間培養した。
有する形質転換体の分離 (3)の寒天平板上に生じた白色コロニーを、5mlの
LB培地(アンピシリン100mg/L、IPTG2
3.8mg/Lを含む)で、37℃、13時間振盪培養
した後、遠心分離にて菌体を分離した。この菌体を0.
5mlの緩衝液に懸濁後、超音波破砕、遠心分離によ
り、菌体抽出液を得た。この菌体抽出液を胆汁酸硫酸サ
ルファターゼの基質であるコール酸3−硫酸と30℃で
24時間以上反応させ、反応生成物であるイソコール酸
を薄層クロマトグラフィーにより検出した。かくして、
胆汁酸硫酸サルファターゼ生産能を有する形質転換大腸
菌を取得した。
体プラスミドDNAをpABS101と命名し、その制
限酵素地図を図2に示した。
6DNAの作製 pABS101に挿入されたDNA断片のサブクローニ
ングを行った。各種制限酵素によりさらに切断し、プラ
スミドベクターpUC18に挿入し、大腸菌JM109
に導入させ、胆汁酸硫酸サルファターゼ活性を測定し
た。胆汁酸硫酸サルファターゼ活性の測定は、特開平2
−145183号に記載の方法に従い、リトコール酸硫
酸(シグマ社製)の2.5mM水溶液0.1ml、β−
NAD(オリエンタル酵母工業製)の15mM水溶液
0.2ml、0.1mMトリス塩酸緩衝液(pH8.
0)1.0ml及び蒸留水1.55mlを石英セルにと
り、30℃で平衡化した後、β−ヒドロキシステロイド
・デヒドロゲナーゼ(シグマ社製)溶液(10U/m
l)0.05ml及び菌体破砕液上清0.1mlを順次
添加し、30℃で反応させ、340nmにおける反応初
期吸光度の増加を測定することにより行った。その結
果、図1に示したプラスミドpABS106DNAに挿
入されている2.36kbのDNA断片中に胆汁酸硫酸
サルファターゼ活性の存在を認めた。このプラスミドp
ABS106DNAを導入した大腸菌はエッシェリシア
・コリ JM109/pABS106と命名しEscheric
hia coli JM109/pABS106と表示し、微工
研条菌寄第3715号として、工業技術院微生物工業技
術研究所に寄託されている。
pABS106DNAを導入した大腸菌JM109を用
いて、胆汁酸硫酸サルファターゼの生産を行なった。培
養は、酵母エキス2%、こはく酸1%、および塩化マン
ガン0.01%からなる培地(アンピシリン100mg
/L:pH6.0)1Lを各200mlづつ2L容振盪
フラスコに入れ、それぞれに本菌株を接種し、振盪培養
を行なった。培養開始後、約8時間目にIPTG 0.
1mMを添加し、さらに4時間振盪培養を行なった後、
遠心分離にて菌体を集め、30mMリン酸緩衝液(pH
7.2)に懸濁した。次いで、超音波破砕機により菌体
を破砕後、遠心分離にて沈殿物を除き、粗酵素液を得
た。この粗酵素液をプロタミン硫酸で除核酸処理した
後、硫酸アンモニウムにより塩析処理し、硫酸アンモニ
ウム33〜70%飽和沈殿画分を集め、10mMリン酸
緩衝液(pH7.2)に透析した。この透析液を、10
mMリン酸緩衝液(pH7.2)で平衡化したDEAE
−セルロース(ワットマン社製)カラムに通液した。得
られた非吸着画分を、硫酸アンモニウムによる塩析処理
で濃縮し、次いで0.5mM MnCl2 を含む5mM
トリス塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化したDEAE
−セファロース(ファルマシア社製)カラムに通液し
た。得られた非吸着画分を硫酸アンモニウムによる塩析
処理で濃縮した。この後、0.15M NaCl及び
0.5mM MnCl2 を含む50mMリン酸緩衝液
(pH6.8)で平衡化したセファアクリルS−200
(ファルマシア社製)カラムを通して、ゲルろ過した。
活性画分は、透析により脱塩し、胆汁酸硫酸サルファタ
ーゼ500単位を得た。
システロイド・デヒドロゲナーゼの共存下でリトコール
酸硫酸と30℃で反応させ、340nmにおける反応初
期吸光度の増加を測定する前記の方法で測定し、1分間
に1μmolのNADHを生成する酵素量を1単位とし
た。最終的に組み換え大腸菌JM109を用いての胆汁
酸硫酸サルファターゼの生産性は、シュードモナス・テ
ストステロニーに比べ約100倍高くなった。
含有するDNAの塩基配列の解析 組み換え体プラスミドpABS106DNAの塩基配列
の解析は、ジデオキシ法により行った。また、解析のた
めのゲル電気泳動は、6%ポリアクリルアミドゲルを用
いて行った。
のみの全塩基配列を第3図に、また該遺伝子から翻訳さ
れて得られたポリペプチドのアミノ酸配列を第4図にそ
れぞれ示した。
ロニーが生産する胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子を含
むDNA断片を分離し、該DNA断片を有する組み換え
体プラスミドDNAを得、これを利用して大腸菌を形質
転換し、該形質転換体を培養することにより胆汁酸硫酸
サルファターゼを菌体内に大量に生産させ、これを採取
する方法である。本発明によって得られた遺伝子組み換
え株による胆汁酸硫酸サルファターゼの生産性は、元株
の約100倍と高く、また、胆汁酸硫酸サルファターゼ
を誘導するために高価なコール酸等を誘導基質として添
加する必要はない。
の制限酵素地図を示す図である。
の制限酵素地図を示す図である。
を示す図である。
て得られるポリペプチドのアミノ酸配列を示す図であ
る。
Claims (8)
- 【請求項1】 シュードモナス・テストステロニーに属
する細菌に由来し、下記式: 【化1】 に示される制限酵素地図を有する胆汁酸硫酸サルファタ
ーゼ遺伝子。 - 【請求項2】 下記式(A): 【化2】 で示されるアミノ酸配列をコードするDNA配列を含む
ことを特徴とする請求項1に記載の胆汁酸硫酸サルファ
ターゼ遺伝子。 - 【請求項3】 下記式(B): 【化3】 で示されるDNA配列を含むことを特徴とする請求項2
に記載の胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子。 - 【請求項4】 シュードモナス・テストステロニーに属
する細菌に由来し、下記式: 【化4】 で示される制限酵素地図で規定される胆汁酸硫酸サルフ
ァターゼ遺伝子を含有するDNA断片をベクターDNA
に挿入してなる新規な組み換え体DNA。 - 【請求項5】 胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子が、下
記式(A): 【化5】 で示されるアミノ酸配列ををコードするDNA配列を含
むことを特徴とする請求項4に記載の新規な組み換え体
DNA。 - 【請求項6】 シュードモナス・テストステロニーに属
する細菌に由来し、下記式: 【化6】 で示される制限酵素地図で規定される胆汁酸硫酸サルフ
ァターゼ遺伝子を含有するDNA断片をベクターDNA
に挿入した新規な組み換え体DNAを導入することによ
り、胆汁酸硫酸サルファターゼ生産能を獲得したエッシ
ェリシア属に属する細菌を培地に培養し、その培養物よ
り胆汁酸硫酸サルファターゼを採取することを特徴とす
る胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法。 - 【請求項7】 胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子が、下
記式(A): 【化7】 で示されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする
請求項6に記載の胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法。 - 【請求項8】下記式(A): 【化8】 で示されるアミノ酸配列を含む胆汁酸硫酸サルファター
ゼ。
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1993
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