KR950002004B1 - 니트릴하이드라타제활성을갖는폴리펩티드를코딩하는dna단편,이것을함유하는형질전환체및이전환체를사용하여아미드류를제조하는방법 - Google Patents

니트릴하이드라타제활성을갖는폴리펩티드를코딩하는dna단편,이것을함유하는형질전환체및이전환체를사용하여아미드류를제조하는방법 Download PDF

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Abstract

내용없음.

Description

니트릴히드라타제 활성을 갖는 폴리헵티드를 코팅하는 DNA단편, 이것을 함유하는 형질전환체 및 이 전환체를 사용하여 아미드류를 제조하는 방법.
제1도는 로도코카스(Rhodococcus) 로도크로우스(rhodochrous) J-1에 의해서 제조되는 2종류의 니트릴 히드라타제의 α 및 β서브유니트의 N-말단 아미노산 배열.
제2도는 DNA 프로브로서 사용한 로도코카스 SP, N-774의 니트릴히드라타제 유전자의 DNA 배열.
제3도는 재조합 플라스미드, PNHJ10H 및 PNHJ20L의 제한 효소지도.
제4도는 로도코카스 로도크로우스 J-1으로부터 유래된 PNHJ10H중의 DNA 단편의 DNA 배열과 예상되는 아미노산 배열.
제5도는 로도코카스 로도크로우스 J-1 으로부터 유래되는 PNHJ20L중의 DNA 단편의 DNA 배열과 예상되는 아미노산 배열.
본 발명은 로도코카스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous) J-1으로부터 유래되는, 니트릴류 아미드류로 수화하는 히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편 및 상기 DNA 단편을 포함하는 재조합체 DNA와 재조합체 DNA로 형질전환된 형질전환체 및 이형질 전환체를 사용하여, 니트릴히드라타제를 제조하고 이 니트릴히드라타제를 사용하여 아미드류를 제조하는 방법에 관한 것이다.
니트릴류를 수화하여 상당하는 아미드류를 생성시키는 효소는 니트릴히드라타제 또는 니트릴라제로 알려져 있고, 이 효소를 생성하는 미생물로서는 예를들면 바실루스(Bacillus)속, 박테리듐(Bacteridium)속, 마이클코카스(Micrococcus)속 및 부레비박테륨(Brevibacterium)속(일본국 특공소 62-21517, 미국특허 4,001,081), 코리네박테륨(corynebacterium)속 및 노카디아(Nocadia)속(일본국 특공소 56-17918, 미국특허 4,248,968), 슈도모나스(pseudomonas)속(일본국 특공소 59-37951, 미국특허 4,637,982), 로도코카스속, 아르스로박타(Arthorbacter)속 및 마이크로박테륨속(일본국 특공소 61-162193, EPA-0188316) 및 로도코카스 로도크로우스(일본국 특개평 2-470, EP-A-0307926)를 들 수 있다.
니트릴히드라타제는 니트릴류를 아미드류로 수화시키는데 사용되었다. 본 발명에서는 미생물이 재조합 DNA 방법에 의해서 니트릴히드라타제를 코딩하여 재조합 DNA를 디카피(multiplecopy)포함하도록 하였다. 이 재조합체는 미생물을 사용하는 종래의 방법에 의해서 비약적으로 높은 레벨의 니트릴히드라타제를 생성한다.
본 발명자등은 이전에 로도코카스 SP로부터 유래되고 니트릴히드라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA단편을 제안했었다(일본국 특개평 2-119778).
이에 대해서 본 발명자등은 니트릴히드라타제의 제조를 위하여 로도코카스 로도크로우스 J-1로 부터 유래된 DNA 단편을 이용하여 니트릴히드라타제를 코딩하는 유전자를 절취하여 적합한 플라스미드 백터내로 삽입하여 재조합을 플라스미드로 미생물을 형질전환시켜 성공적으로 방향족 니트릴에 높은 활성을 갖는 니트릴히드라타제를 생성하여 형질전환체를 얻었다.
본 발명은, (1) 다음 서브유니트 α(H)및 서브유니트 β(H)의 아미노산배열을 갖고 니트릴히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(H)단편
α(H)-서브유니트 :
Figure kpo00001
β(H)-서브유니트 :
Figure kpo00002
(2)는 다음 서브유니트 α(L)및 서브유니트 β(L)의 아미노산 배열을 갖고 니트릴히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(L)단편 :
α(L)-서브유니트 :
Figure kpo00003
β(L)-서브유니트 :
Figure kpo00004
(3) 서브 유니트 α(H)및 서브유니트 β(H)가 다음 DNA배열을 갖는 상기 (1) 기재의 DNA(H)단편
α(H)-서브유니트의 DNA배열 :
Figure kpo00005
β(H)-서브유니트의 DNA배열 :
Figure kpo00006
(4) 서브 유니트 α(L)및 서브유니트 β(L)가 다음 DNA배열을 갖는 상기 (1) 기재의 DNA(L)단편
α(L)-서브유니트의 DNA배열 :
Figure kpo00007
β(L)-서브유니트의 DNA배열 :
Figure kpo00008
(5) 상기 (1)∼(4)기재의 DNA(H)또는 DNA(L)를 벡터에 포함하고 있는 제조합체 DNA, 및
(6) 상기 (5)기재의 재조합체 DNA로 형질전환된 형질전환체
(7) 상기 (6)기재의 형질변환체를 배양하고 이 배양물로부터 니트릴히드라타제를 회수하는 니트릴히드라타제의 제조방법.
(8) 상기 (7)기재의 니트릴히드라타제를 사용하여 니트릴류를 수화하여 아미드류를 생성시키는 아미드류의 제조방법, 및
(9) 상기 (6)기재의 형질변환체를 배양하고 얻어진 배양액, 분리균체, 균체처리물 또는 고정화물을 사용하여 니트릴류를 수화하여 아미드류를 생성하는 아미드류의 제조방법.
본 발명은 다음 공정들(1)∼(8)에 의해서 실시한다.
(1) 니트릴히드라타제의 추출정제와 아미노산배열의 부분적 결정.
배양 집균한 로도코카스 로도크로우스 J-1(비고오겐조기 제1478호)에서 그중에 함유된 2종류의 니트릴히드라타제(각각이 H효소와 L효소)를 추출정제하고 각각의 효소를 더 고속액체 크로마토그래피를 사용하여 각 두가지 서브유니트(α,β)로 분리시킨다. 그리고, 이들의 서브유니트의 N단말의 아미노산 배열의 일부를 결정한다. 이 아미노산 배열은 제1도에 나타낸 것과 같다.
(2) 니트릴히드라타제의 DNA 프로브(probe)의 제조.
본 발명에 있어서는 상기 일본국 특개평 2-119778호 명세서 기재의 로도코카스 sp.N-774의 니트릴히드라타제의 β-서브유니트의 아미노산배열이 상기 각 β-서브유니트와 높은 상동성(homology)를 나타냄으로 인해서 동명세서 기재의 형질전환체 JM105/pYUK121(비고오겐조기 제1937호)를 사용하여 DNA 프로브의 제조를 행하였다. 즉, 배양집균한 pYUK121를 함유하는 형질전환체로 pYUK121을 추출하고 그중에 포함되는 로도코카스 sp.N-774 유래의 니트릴히드라타제 유전자(제2도)를 포함하는 DNA 단편을 제한효소 Sph I 및 SaII로 절단후 추출정제하고, 이것을 방사성 동위원소로 라벨하여 DNA 프로브를 제조했다.
(3) 니트릴히드라타제 염색체 DNA를 포함하는 DNA 단편의 제조.
로도코카스 로도크로우스 J-1 배양물로부터 염색체 DNA를 분리하고 이것을 제한효소로 절단후에 사우산 하이브리다이제이숀법(Southern E.M., J.Mol.Biol.98, 503(1975)에 의해서 목적 유전자를 함유하는 DNA 단편을 상기 (2)의 프로브를 사용하여 검출한다. 이 공정으로 프로브와 하이브리드 다이즈하는 상기 한 2종류의 DNA 단편들이 선별된다.
(4) 제조합체 플라스미드의 구성.
재조합체 플라스미드는 상기 (3)에서 제조한 염색체 DNA 단편을 플라스미드 벡터로 삽입함으로써 구성된다.
(5) 재조합체 플라스미드를 함유하는 형질전환체의 형질전화 및 선별.
형질전환체들을 공정(4)에서 설명한 바와 같이 재조합체 플라스미드를 사용하여 제조한다. 재조합체 플라스미드를 함유하는 형질전환체를 클로니 히브리다이제이숀법[R. Bruce Wallace et. al., Nuc. Aci. Res.9, 879(1981)]에 의해서 공정(2)에 설명한 바와 같이 이 프로브를 사용하여 선별한다. 또, 재조합체 플라스미드중에 니트릴히드라타제 유전자의 존재를 사우산 히브리다이제이숀법을 사용하여 확인한다. 이와 같이 선별된 플라스미드를 각각 pNHJ10H 및 pNHJ20L라고 칭한다.
(6) 플라스미드 DNA의 분리, 정제와 제한효소지도의 작성.
공정(5)에서 제조된 pNHJ10H 및 pNHJ20L의 플라스미드 DNA들을 분리, 정제한다. DNA들의 제한효소지도(제3도)를 작성하여 니트릴히드라타제 유전자를 함유하는 개소를 결정한다.
(7) DNA 배열의 결정.
pNHJ10H 및 pNHJ20L중에 삽입된 DNA 단편의 불요부분을 적당한 제한효소를 사용하여 제거한다. 그리고, 이 삽입된 DNA 단편을 배열결정용으로 사용한다. 이 DNA 단편(제4, 5도)의 DNA 배열은 공정(1)에서 결정한 아미노산 배열로 부터 예상되는 배열을 포함함을 나타낸다.
(8) 형질전환체를 사용하여 니트릴류를 아미드류로 변환시키는 니트릴히드라타제의 제조.
공정(8)에서 설명한 형질전환체를 배양한다. 균체를 니트릴류, 니트릴히드라타제의 기질용액과 혼합시켜 아미드류를 생성한다.
로도코카스 로도크로우스 J-1은 비고겐에 비고오겐 조기 제1478호(FERM BP-1478)로서 또 공정(5)에서 제조한 pNHJ10H를 함유하는 형질전환체 TG1/pNHJ10H는 비고오겐이 비고오겐조기 제2777호(FERM BP-2777)로서 또 마찬가지로 공정(5)에서 제조한 pNHJ20L는 비고오겐에 비고오겐조기 제2778호(FERM BP-2778)로서 기탁되어 있다.
상기 공정에서 사용되는 벡터로서는 플라스미드 벡터(예를들면 pAT153, pM89, pHC624, pKC7)등, 파지벡터(phage Vector)(예를들면 λt11(도오요보오사제), 차론 4A(Amersham사제)중의 임의의 것이 사용된다. 또, 상기 공정에서 사용되는 제한효소로서는 Sph I, SaII, EcoR I, BamH I, Sac I등이고 이들은 어느것이나 시판(다까라슈조사제)되고 있는 것을 사용한다. 형질전환에 사용되는 숙주생물로서는 E. Coli Jm105 또는 E. Coli TG1을 들 수 있으나, 특히 한정되는 것은 아니고, 각종 숙주생물을 사용할 수 있다.
형질전환체용 배양배지는 이 기술분야에서 보통 사용되는 것들이다.
니트릴류의 아미드류로의 변환은 형질전환체의 배양으로, 제조되는 니트릴히드라타제, 크루드(crude) 니트릴히드라타제, 형절전환체의 배양물, 분리된 균체 또는 균체처리물 등을 실행한다.
본 발명에서는 적절한 니트릴류는 구주 특허공보 0307,926 기재의 탄소원자수 4∼10개를 갖는 방향족 니트릴류와 탄소수 2∼6개를 갖는 지방족 니트릴류를 포함한다. 이 니트릴류의 대표적인 예로서는 4-,3- 및 2-시안노피리딘, 벤조니트릴, 2,6-디플루오로벤조니트릴, 2-티오펜카본니트릴, 2-프로니트릴, 시아노피라진, 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, 크로토니트릴, 아세토니트릴 및 3-하이드록시 프로피온니트릴을 들 수 있다.
본 발명은 로도코카스 로도크로우스 J-1으로부터 유래된 니트릴히드라타제의 2종류의 α서브유니트와 β서브유니트의 아미노산 배열과 염기배열을 개시했다. 니트릴히드라타제를 코딩하는 DNA 단편이 발현 벡터내에 삽입되고 재조합체 벡터가 형질전환을 위하여 사용된다. 형질전환체는 디카피의 유전자를 포함하므로 종래에 사용한 미생물들에 비해서 훨씬 높은 레벨의 니트릴히드라타제를 생성할 수 있다.
[실시예]
(1) 니트릴히드라타제의 추출정제와 니트릴히드라타제의 부분아미노산 배열.
로도코카스 로도크로우스 J-1을 배지(효모에키스 3g/ℓ, KH2PO4, 0.5g/ℓ, K2HPO4, 0.5g/ℓ, MgSO4, 4H2O, 0.5g/ℓ, COCI20.01g/ℓ, 크로톤아미드 3g/ℓ, pH 7.2)중에서 28℃로 80시간 배양시켰다. 균세포를 집균하고 이 균세포를 파쇠하고 황산암모늄으로 분획시켰다. 시료를 투석하고 투석물을 원심 분리하여 상층물을 DEAE 셀루로파인 크로마토그래피, 페닐세파로스 크로마토그래피 세파댁스 G-150 크로마토그래피 및 옥틸세파로스 크로마토그래피에 걸어 2종류의 활성획분을 얻었다. 이 투석물을 역상 칼럼(센슈 Pak VP-304-1251 센슈가가꾸제)를 사용하여 고속 액체 크로마토그래피에 걸어 2개의 서브유니트(α 및 β)를 각각 얻었다. α1 (H)-, β1 (H)-,α1 (L)- 및 β1 (L)서브유니트들의 N-말단 아미노산 배열을 어플라이드 바이오시스템 모델 470A 단백질 시퀀서를 사용하여 결정했다. 이 아미노산 배열을 제1도에 나타냈다.
(2) 니트릴 히드라타제 유전자를 위한 DNA 프로브의 제조.
pYUK121을 함유하는 E. Coil JM105를 엠피실린 50㎍/㎖를 함유하는 100㎖의 2×YT 배지중에 30℃로 하루밤(12시간) 배양했다. 세균세포를 집균하고 이 세포에 TNE를 가했다. 이 세포현탁액을 원심분리했다. 이 펠레트에 STE 8㎖와 리소짐(Lysozyme) 10㎎를 가했다. 이 혼합물을 5분동안 0℃로 배양한 후에 0.25 MEDTA 4㎖를 가했다. 그리고 10% SDS 2㎖ 및 5M NaCl 5㎖를 실온에서 이 혼합물에 가했다. 얻어진 혼합물을 3시간동안 0∼4℃에서 배양한 후에 초고속 원심 분리하여 그 상등액에 3% PEG 6000을 1/2당량 가했다. 그 혼합물을 0∼4℃에서 하룻밤(12시간) 배양하여 원심분리했다. TNE를 그 펠레트에 가하여 7.5㎖용액으로 만든 후에 CsCl를 그 현탁액에 가했다. 그 혼합물을 원심분리하여 단백질을 제거한 후에 취화 에티듐용액 300∼500㎎/㎖를 그 상등액에 가했다. 그 혼합물을 원심 튜브로 옮겨 놓았다. 이 튜브를 열시일(heat seal)하여 초고속 원심분리했다. 페리스탈 펌프(Peristaltic pump)를 사용하여 cccDNA를 추출했다. 물로 포화된 이소프로필 알콜을 등량보다 약간 많게 가하여 에티듐을 제거했다. 시료를 TE에 대해서 투석하여 정제된 pYUK121를 약 3㎖를 얻었다.
pYUK121을 Sph I 및 SaII로 소화(digest)하여 로도코카스 sp.N-774로부터 유래된 니트릴히드라타제 유전자를 포함하는 DNA 단편 2.07㎏을 얻었다. 이 DNA 단편을 32p로 방사능 라벨하여 프로브를 만들었다. 염기 배열을 제2도에 나타냈다.
(3) 니트릴히드라타제 유전자 염색체를 함유하는 DNA 단편의 제조.
로도코카스 로도크로우스 J-1을 배지(글루코스 10g/ℓ, KH2PO4, 0.5g/ℓ, K2HPO4, 0.5g/ℓ, MgSO4, 7H2O, 0.5g/ℓ, 효모에키스 1g/ℓ, 펩톤 7.5g/ℓ, COCI20.01g/ℓ, 요소 7.5g/ℓ, 1% 글리신 또는 앰피실린 0.2㎍/㎖, 물 1ℓ, pH 7.2)중에서 배양했다. 세균 세포를 집균하고 그 펠레트를 TNE로 세정한후에 TE 10㎖중에 현탁시켰다. 그 현탁액에 0.25M EDTA 4㎖, 리소짐 10∼20㎎, 아크로모프로티제(achromoprotease) 10∼20㎎, 10×SDS 10㎖를 가하고 이 현탁액을 3시간동안 37℃로 배양했다. 배양후의 현탁액에 페놀 15㎖를 가했다. 그 혼합물을 실온에서 배양한 후에 원심분리했다. 그 상층을 제어하여 2.5M 초산나트륨용액 0.7㎖와 디에틸에테르를 그 상등액에 가했다. 그 혼합물을 원심 분리하여 상층을 버렸다. 그리고 하층에 2용량배의 에탄올을 가하고 DNA를 유리봉으로 제거했다. 그 DNA를 TE:에탄올 2:8, 1:9 및 0:10(용적비)용액으로 각각 5분간씩 적셨다. 그런후에 DNA를 TE 2∼4㎖중(37℃)에 재현탁시켰다. RNaseA 및 T1의 혼합물 10㎕를 그 현탁액에 가하고, 그 혼합물을 37℃에서 배양했다. 동량의 페놀을 그 혼합물에 가하여 원심 분리했다. 동량이상의 에테르를 그 현탁액에 가했다. 그리고, 그 혼합물에 재차 원심 분리했다.
그런후에 상층을 버리고 하층을 클로로프롬(chloroform)을 소량 함유하는 TE 2ℓ에 대해서 하층을 하룻밤 투석했다. 그리고, 새로운 TE로 더 투석시켜 크루드 염색체 DNA 4㎖를 얻었다.
TE 10㎕, 반응 완충액(10배 온도) 3㎕ 및 SaCI 2㎕를 크루드 염색체 DNA 15㎕에 가했다. 그 혼합물을 1시간동안 37℃에서 배양하고 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동을 3시간동안 60V로 걸었다. 염색체 DNA의 사우산 하이브리다이제숀을 공정(2)에 설명한 프로브를 사용하여 실시했다. 그 결과, 약 6.0Kb와 9.4Kb의 단편에 강한 하이브리다이제숀을 나타냄을 알았다.
염색체 DNA 15㎕를 상술한 바와같이 Sac I과 아가로스겔 전기영동으로 소화시켰다. 그 겔로부터 6.0Kb와 9.4Kb의 DNA 단편을 잘라내고 이것을 각각 3배 용적의 8M NaClO4용액에 취하여 가용화된 후에 6㎜직경의 GF/C(와트맨)여과지위에 각 용액으로 점찍어 흡착시켰다. 6M NaClO4함유 TE(100㎕)을 10회 여과지위에 적하시켰다. 그 여과지를 3분간 공기건조하여 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 0.5㎖중에 옮기고, 그 투브에 TE 40㎕를 가하여 30분간 47℃에서 전체를 배양한 후에 원심분리했다. 그결과, 상등액 약 40㎕를 얻었다. 그 상등액에는 염색체 DNA의 니트릴히드라타제 유전자를 함유하는 6.0Kb와 9.4Kb의 DNA 단편을 포함하고 있었다.
6.0Kb DNA 단편을 벡터중에 삽입시키는 방법을 이하에 설명하겠다. 동일한 방법이 9.4Kb DNA 단편을 벡터중에 삽입시키는데 채용된다.
(4) 벡터중으로의 염색체 DNA 단편의 삽입.
TE 10㎕, 반응완충액(10배 농도) 3㎕ 및 Sac I 2㎕를 PUC19 10㎕에 가했다. 그 혼합물을 1시간동안 30℃에서 배양했다. 0.25M EDTA 2㎕를 그 혼합물에 가하여 반응을 정지시켰다. 1M 트리스-HCL 7㎕와 BAP(세균성 알칼라인 포스파타제) 3㎕를 그 혼합물에 가했다. 그 혼합물을 1시간동안 65℃에서 배양했다.
그런후에 TE를 그 혼합물에 가하여 전체용적 100㎕로 만들었다. 이 혼합물을 동량의 페놀로 3회 추출했다. 동량의 에테르를 그 추출물에 가했다. 하층을 제거하여 그것에 3M 초산나트륨 10㎕와 에탄올 250㎕를 가했다. 그 혼합물을 30분간 -80℃에서 배양하고, 원심 분리하고 건조하여 TE중에 재현탁시켰다.
이와같이 행하여 얻어진 pUC19 DNA 5㎕와 공정(3)에 설명한 6.0DNA 단편 40㎕를 혼합시켰다. 그 혼합물에 연결완충액 6㎕, ATP(6㎎/㎖) 6㎕ 및 T4DNA 리가체 3㎕를 가했다. 그 혼합물을 하룻밤(12시간) 40℃에서 배양하고 pUC19의 Sac I 액에 소망하는 효소를 코딩하는 6.0Kb DNA 단편을 함유하는 재조합 플라스키드를 생성했다.
(5) 형질전환체의 형질전환 및 선별
E.Coli TGI(Amersham사체)를 2×YT배지 10㎖중에 식균하여 12시간동안 37℃에서 배양했다. 배양후에 얻어진 배양물을 새로운 2×YT배지에 가하여 1%농도로 하고 원심분리하고 펠레트를 냉 50mM CaCl25㎖에 현탁시켰다. 그 현탁액을 어름에 40분간 방치한후에 원심을 걸었다. 냉 50mM CaCl20.25㎖의 공정(4) 설명한 재조합 DNA 60㎕를 그 펠레트에 가했다. 그 혼합물을 40분간 0℃에서 배양했다. 그런후에 2분동안 42℃로 열충격을 가하고 5분동안 어름위에 방치한후에 2×YT배지 10㎖에 가했다. 그 혼합물에 90분동안 37℃에서 진동을 주면서 배양했다. 그런후에 원심을 가했다. 그 펠레트를 2×YT배지 1㎖중에 현탁시켰다. 그리고, 그 현탁액의 알리퀴드 10㎕씩 앰피실린 50㎍/㎖를 함유하는 2×YT 한천판 2매에 각각 분주시켰다. 이 한천판을 37℃에서 배양했다. 한천판위에 성장된 콜로니를 콜로니 하이브리다이제이숀법으로 선별했다. 그 콜로니를 니트로셀루로스 필터에 옮겨 소화시켰다. 그 DNA를 필터위에 고정시키고, 공정(2)에서 설명한 프로브로 하이브라다이재숀 처리했다. 그 필터를 오토 래디오그프를 행하여 재조합 콜로니를 선택했다. 또, 형질 전환체중의 니트릴 히드라타제 유전자의 존재를 사우산 하이브리다이제어숀법에 의해서 확인했다.
(6) 재조합체 플라스미드의 추출정제와 삽입 DNA 단편의 제한 효소지도의 작성.
공정(5)에서 설명한 바와같이 설정된 형질 전환체를 앰피실린 50㎍/㎖를 함유하는 2×YT배지 100㎖중에서 하룻밤(12시간) 37℃에서 성장시켰다. 세균세포를 집균하여 그것에 TNE를 가했다. 그 세포를 원심을 걸어 재차 집균하여 그세포에 STE 8㎖와 리소짐 10㎎을 가했다. 그 혼합물을 5분동안 0℃에서 배양하여 그 혼합물에 0.25M EDTA 0.25M 4㎖, 10% SDS(실온) 2㎖ 및 5M NaCL 5㎖를 가했다. 그 혼합물을 3시간동안 0∼4℃에서 배양하고 초고속 원심 분리했다. 그 상등액에 30% PEG 6000를 1/2 용적 배가 했다. 그리고, 그 혼합물을 0∼4 에서 하룻밤(12시간) 배양하고, 재차 원심 분리했다. 그 펠레트에 TNE를 가하여 용적을 7.5㎖로 만들었다. CaCl를 현탁액에 가하여 단백질을 제거한후에 취화에티듐 300∼500㎎/㎖를 그 상등액에 가하여 그 혼합물을 원심 튜브로 옮겼다. 그 튜브를 히트 시일하고 초고속 원심분리를 가했다. 페리스탈펌프를 사용하여 ccc DNA를 제거했다. 물로 포화된 등량보다 약간 많은 양의 이소프로필알콜을 ccc DNA에 가하여 취화 에티듐을 제거했다. 그 DNA 시료를 TE에 대해서 투석하여 약 3㎖의 정제된 재조합체 DNA를 얻었다. 이와같이 얻어진 6.7Kb DNA 단편을 함유하는 재조합체 플라스키드를 pNHJ10H라 칭했다(9.4Kb DNA 단편을 함유하는 재조합체 플라스키드를 pNHJ20L라 칭한다).
이들 플라스미드 DNA는 EcoR I, BamH I, Pst I, Sac I 및 Sac I로 소화시키고 제한지도를 제3도에 나타낸 것과 같이 작성했다.
(7) DNA 배열 결정
pNHJ10H의 DNA 단편중의 니트릴히드라타제 유전자의 위치를 작성된 제한지도에 의해서 사우산 하이브리다이제이숀법으로 결정했다. pNHJ10H중의 불요부분을 pst I과 Sal I로 절단 제거하고 6.0Kb DNA 단편을 1.97Kb로 만들었다. 마찬가지로, pNHJ20L중의 불요 부분을 EcoR I와 Sac I로 절단 제거하여 9.4Kb DNA 단편을 1.73Kb로 만들었다.
이들 DNA 단편을 생거법(Sanger method)[Sanger, F.Science 214 : 1205-1210(1981)]에 의해서 M13파지벡터(phage vector)를 사용하여 배열 결정을 하였다. 1.97Kb DNA 단편(pNHJ10H)와 1.73Kb DNA 단편(pNHJ20L)의 염기 배열들을 각각 제4도와 제5도에 나타냈다.
염기로 부터 예상되는 아미노산 배열은 공정(1)에서 결정한 아미노산 배열과 완전히 일치하는 것을 알았다. 이 배열분석으로 부터 α-서브유니트와 β-서브유니트를 위하여 코드하는 배열을 그 DNA 단편이 포함하고 있는 것이 명백해졌다.
(8) 형질 전환체를 사용한 니트릴히드라타제의 제조와 니트릴히드라타제를 사용한 니트릴류의 아미노산류의 변환
TG-1/pNHJ10H와 TG-1/pNH20L를 앰피실린 50㎍/㎖를 함유한 10㎖의 2×YT배지중에 식균하여 30℃에서 하룻밤(12시간) 배양했다. 얻어진 1㎖의 배양체를 100㎖의 2×YT배지(앰피실린 50㎍/㎖, CoCl26H2O/1 0.1g)에 가했다. 그 혼합물을 30℃에서 4시간동안 배양했다. 그 혼합물에 최종 농도 1mM가 되게 IPTO를 가했다. 그 혼합물을 30℃에서 10시간동안 배양하고 집균한후에 그 세균세포를 5㎖의 0.1M 인산 완충액(pH 7.5)중에 현탁시켰다. 그 현탁액을 5분동안 초음파 분쇄하고, 30분동안 12,000×8로 원심 분리하여 얻어진 상등액을 효소 분석용으로 사용되었다. 50mM 포타슘 포스페이드 완충액(pH 7.5), 6mM 벤조니트릴 및 적당량의 효소를 함유하는 반응혼합물(12㎖)중에서 효소 분석이 행해진다. 반응을 30℃에서 30분동안 행하고 1MHCl 0.2㎖를 가하여 정지시켰다. 반응혼합물중에 형성된 벤즈아미드의 양을 HPLC로 결정했다. 대조용으로서의 E.coli TG1을 사용한외는 상기와 같은 수순으로 얻은 혼합물을 사용했다. COCl2와 IPTC의 존재하에 2×YT배지중에서 배양할 pNHJ10H 및 pNHJ20L를 함유하는 E.coli 세포가 없는 추출물중의 니트릴히드라타제 활성의 레벨은 각각 1.75×10-3단위/㎎와 6.99×10-3단위/㎎었다. TG-1/pNHJ10H 및 PNHJ20L의 반응혼합물중에서는 벤즈아미드를 발견하고, 한편 TG-1의 반응혼합물중에서는 벤즈아미드는 발견되지 않았다.

Claims (8)

  1. 하기와 같은 α(H)-서브유니트와 β(H)-서브유니트의 아미노산을 배열을 갖고 니트릴히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(H)단편.
    α(H)-서브유니트 :
    Figure kpo00009
    β(H)-서브유니트 :
    Figure kpo00010
  2. 하기와 같은 α(L)-서브유니트와 β(L)-서브유니트의 아미노산 배열을 갖고 니트릴히드라타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA(L)-단편.
    α(L)-서브유니트 :
    Figure kpo00011
    β(L)-서브유니트 :
    Figure kpo00012
  3. 제1항에 있어서 α(H)-서브유니트와 β(H)-서브유니트가 다음 DNA 배열을 갖는 DNA(H)-단편 α(H)-서브유니트의 DNA배열 :
    α(H)-서브유니트의 DNA배열 :
    Figure kpo00013
    β(H)-서브유니트의 DNA배열 :
    Figure kpo00014
  4. 제2항에 있어서 α(L)-서브유니트와 β(L)-서브유니트가 다음 DNA배열을 갖는 DNA(L)-단편 α(L)-서브유니트의 DNA배열 :
    Figure kpo00015
    β-(L)-서브유니트의 DNA배열 :
    Figure kpo00016
  5. 제1항 또는 제3항 기재의 DNA(H)를 벡터중에 포함하는 재조합체 DNA.
  6. 제5항 기재의 재조합체 DNA로 형질 전환된 형질전환체.
  7. 제2항 또는 제4항 지개의 DNA(L)를 벡터중에 포함하는 재조합체 DNA.
  8. 제7항 기재의 재조합체 DNA로 형질 전환된 형질 전환체.
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