KR101106943B1 - 로도코커스 로도크로스 ｎｃｉｍｂ 41164의 균주 및 니트릴하이드라타제의 생산자로서의 이의 용도 - Google Patents

로도코커스 로도크로스 ｎｃｉｍｂ 41164의 균주 및 니트릴하이드라타제의 생산자로서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164인 미생물 또는 이의 돌연변이체가 청구된다. 우레아 또는 우레아 유도체를 포함하는 배양 배지에서 미생물을 배양하는 방법이 청구된다. 상기 미생물로부터 수득될 수 있는 니트릴 하이드라타제가 청구된다. 또한, 상응하는 니트릴을, 로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164인 미생물, 이의 돌연변이체 및 로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164 또는 이의 돌연변이체로부터 수득가능한 니트릴 하이드라타제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생물촉매의 존재하에, 수성 배지에서 수화 반응시켜, 상응하는 니트릴로부터 아미드를 제조하는 방법이 청구된다. 또한, 로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164를 보관하는 방법이 청구된다.
로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164, 니트릴 하이드라타제, 니트릴, 수화 반응

Description

로도코커스 로도크로스 ＮＣＩＭＢ 41164의 균주 및 니트릴 하이드라타제의 생산자로서의 이의 용도{Strain of Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 and its use as producer of nitrile hydratase}
본 발명은 미생물 및 당해 미생물을 배양하고 보관하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규한 니트릴 하이드라타제 효소 및 및 당해 니트릴 하이드라타제 효소를 사용하여 니트릴을 아미드로 전환시키는 방법에 관한 것이다.
화학 반응을 수행하는데 있어서 생물촉매(biocatalyst), 예를 들어 효소를 함유하는 미생물을 사용하는 것이 익히 공지되어 있다. 니트릴 하이드라타제 효소는 니트릴을 상응하는 아미드로 직접 수화시키는 반응을 촉매하는 것으로 알려졌다. 통상적으로, 니트릴 하이드라타제 효소는 각종 미생물, 예를 들어 바실러스(Bacillus), 박테리디움(Bacteridium), 마이크로코커스(Micrococcus), 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 슈도모나스(Pseudomonas), 아시네박터(Acinetobacter), 크산토박터(Xanthobacter), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 리조비움(Rhizobium), 클렙시엘라(Klebsiella), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 에어로모나스(Aeromonas), 시트로박터(Citrobacter), 아크로모박터(Achromobacter), 아그로박테리움(Agrobacterium), 슈도노카르니아(Pseudonocardia) 및 로도코커스(Rhodococcus) 속(genus)의 미생물 에 의해 생산될 수 있다.
많은 문헌들이 미생물 내에서의 니트릴 하이드라타제의 합성을 기술하고 있다. 문헌 [Arnaud et al., Agric. Biol. Chem. 41:(11) 2183-2191 (1977)]에는, 브레비박테리움 종 R312 중의 '아세토니트릴라제'로서 호칭하는 효소의 특징이 기재되어 있는데, 이는 아세토니트릴을 아미드 중간체를 경유하여 아세테이트로 분해한다. 문헌 [Asano et al., Agric. Biol. Chem. 46:(5) 1183-1189 (1982)]에서는 슈도모나스 클로로라피스 B23 (Pseudomonas chlororaphis B23)을 분리하였는데, 이는 아크릴로니트릴의 아크릴아미드로의 전환을 촉매하여, 400 g/L의 아크릴아미드를 생성시키는 니트릴 하이드라타제를 생산한다. 문헌 [Yamada et al., Agric. Biol. Chem. 50: (11) 2859-2865 (1986), "Optimum culture conditions for production by Pseudomonas chlororaphis B23 of nitrile hydratase"]에서는, 니트릴 하이드라타제 합성을 위하여 첨가된 유도물질을 포함하는 성장 배지의 배지 성분의 최적화를 고려하였다. 메타크릴아미드가 상기 생물체를 위한 가장 우수한 유도물질인 것으로 밝혀졌다. 메타크릴아미드는 성장의 개시시에 배양물 중에 포함되었다.
로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) 종의 다양한 균주가 매우 효과적으로 니트릴 하이드라타제 효소를 생산한다는 것이 밝혀졌다.
EP-0 307 926에는, 코발트 이온을 함유하는 배양 배지에서의 로도코커스 로도크로스, 구체적으로 균주 J1의 배양이 기재되어 있다. 코발트 이온의 존재 하에 배양되어진 로도코커스 로도크로스 J1에 의해 생산된 니트릴 하이드라타제의 작용 에 의해 니트릴을 수화시켜, 아미드를 생물학적으로 생산하는 방법이 기재되어 있다. 니트릴 하이드라타제를 합성하는데 있어서 다양한 유도물질 (예를 들면, 크로톤아미드)의 사용이 기재되어 있다. 일 태양에서, 아미드는 기질로서 니트릴이 존재하는 미생물의 배양 배지 중에서 생산된다. 또 다른 태양에서, 니트릴 하이드라타제가 축적되어진 배양 배지에 기질 니트릴을 첨가하여 수화 반응을 수행한다. 또한, 미생물 세포를 분리하고, 이들을 적합한 운반체 중에, 예를 들어 고정화에 의해 유지시킨 다음, 이들을 기질과 접촉시키는 방법이 기재되어 있다. 니트릴 하이드라타제를 사용하여, 니트릴을 아미드로 수화시킬 수 있으며, 특히 3-시아노피리딘을 니코틴아미드로 전환시킬 수 있다.
EP-0 362 829에는, 니트릴 하이드라타제 활성을 지닌 로도코커스 로도크로스의 세포를 수득하기 위하여 하나 이상의 우레아 및 코발트 이온을 포함하는, 로도코커스 로도크로스 종의 세균을 배양하는 방법이 기재되어 있다. 구체적으로, 니트릴 하이드라타제 활성을 현저히 증가시키는 우레아 또는 우레아 유도체를 사용하여 로도코커스 로도크로스 J1 중의 니트릴 하이드라타제를 유도하는 방법이 기재되어 있다. 우레아 또는 이의 유도체는 상기 배양 배지에 일시에 한번에 또는 연속적으로 첨가하고, 배양은 30 시간 이상, 예를 들면 최대 120 시간에 걸쳐 수행한다.
문헌 [Nagasawa et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 34: 783-788 (1991), "Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous J1"]에는, 사용된 배양 조건에 따라 2종의 상이한 니트릴 하이드라타제 및 니트릴라제를 합성하는 균주를 사용하여 아세토니트릴로서 J1을 분리하는 방법이 기재되어 있다. 1종의 니트릴 하이드라타제는 우레아 및 우레아 유사체에 의해 최적으로 유도된다. 우레아는 배양 과정의 개시시에 첨가되며, 기본 배지에 영양물이 풍부할 때에만 유도물질로서 효과적인 것으로 보인다. 효소의 유도는 점진적으로 시작되며, 배양 5일 후 최대에 도달할 때까지 성장 면에서 증가한다. 활성은 장기간의 배양시에 감소하는 것으로 밝혀졌다.
로도코커스 로도크로스 J1은 또한 아크릴로니트릴로부터 아크릴아미드 단량체를 제조하는데에 상업적으로 이용되며, 이러한 방법은 문헌 [Nagasawa and Yamada Pure Appl. Chem. 67: 1241-1256 (1995)]에 기재되어 있다.
문헌 [Leonova et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 88: 231-241 (2000) "Nitrile Hydratase of Rhodococcus"]에는, 로도코커스 로도크로스 M8 중의 니트릴 하이드라타제의 성장 및 합성이 기재되어 있다. 상기 균주의 니트릴 하이드라타제 합성은 배지 내의 우레아에 의해 유도되며, 이때 우레아는 또한 상기 생물체의 성장을 위한 질소원으로서 작용한다. 코발트는 또한 고도의 니트릴 하이드라타제 활성에 요구된다. 상기 문헌은 주로 유도 및 대사 효과에 주목한다.
문헌 [Leonova et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 88: 231-241 (2000)]에는 또한, 러시아에서 로도코커스 로도크로스 M8을 사용하여 아크릴아미드가 상업적으로 제조되었음이 기재되어 있다. 러시아 특허 제1731814호에는 로도코커스 로도크로스 균주 M8이 기재되어 있다.
우레아와 같은 유도물질의 필요없이, 니트릴 하이드라타제를 생산하는 로도 코커스 로도크로스 균주 M33이 US-A-5827699에 기재되어 있다. 이러한 균주의 미생물은 로도코커스 로도크로스 M8의 유도체이다.
특히, 아크릴아미드 단량체의 제조는 생물촉매적(biocatalytic) 경로를 통하는 것이 바람직하다. 문헌 [Yamada and Kobayashi, Biosci. Biotech. Biochem. 60:(9) 1391-1400 (1996), "Nitrile Hydratase and its Application to Industrial Production of Acrylamide"]을 검토해 보면, 아크릴아미드에 대한 생물촉매적 경로의 개발에 관한 상세한 내용이 기재되어 있다. 아크릴아미드 제조를 위한, 순차적으로 우수한 3종의 촉매 및 이들의 특징, 특히 3세대 촉매인, 로도코커스 로도크로스 J1이 다소 상세히 기재되어 있다.
생물촉매의 사용에 따른 주요 단점은 보관, 수송 및 사용 중에 습윤 미생물 물질을 사용하였을 때 관찰되는 전반적인 안정성 부재이다. 비교적 안정한 효소 및 세균, 예를 들어 로도코커스 세포 중의 니트릴 하이드라타제를 사용하는 경우일지라도, 사용 전의 손상 우려 때문에, 생물촉매 세포 현탁액을 어떤 식으로든, 예를 들면 수성 혼합물을 동결하거나 동결-건조하거나 또는 달리 특정 중합체 매트릭스 중에 세포를 고정시키는 방식으로 처리할 필요가 업계 내에서 받아들여져 왔다. 생물촉매로부터 최대 생산성을 달성하기 위하여, 최대 생물촉매 활성이 사용 전 이의 제조 및 보관 중에 유지되는 것이 중요하다. 문헌 [Chaplin and Bucke (1990) In: Enzyme Technology, Cambridge University Press, p 47 (Enzyme preparation and use)]에서, 효소 불활성화가 가열, 단백질분해, 준최적(suboptimal) pH, 산화 변성제 및 비가역성 억제제에 의해 야기될 수 있다는 것이 인식되었다. 다수의 물 질이 반응을 촉매하는 효소 능력의 속도를 감소시킬 수 있다. 이에는 비-특이적 단백질 변성제 물질, 예를 들어 우레아가 포함된다.
바그닌겐(Wageningen) 대학의 빌렘 제이에이취 폰 베켈(Willem JH van Berkel)에 의한 단백질 안정성(Protein Stability)에 관한 발표에서, 불활성화 또는 언폴딩(unfolding)을 야기할 수 있는 인자들이 고려되었으며, 이들에는 프로테아제, 산소 또는 산소 라디칼의 존재로 인한 산화, 및 가역적 언폴딩을 일으키는 변성제, 예컨대 우레아가 포함되었다.
문헌 [Chaplin and Bucke (1990), In Enzyme Technology, Cambridge University Press, p73 (Enzyme preparation and use)]에서는, 효소 활성의 보존에 관한 주요 인자가 효소 구조의 입체형태(conformation)를 유지하는데 관련되어있음이 밝혀졌다. 따라서, 공유결합 구조에서 언폴딩, 응집 및 변화를 방지하는 것이 중요한 것으로 고려되었다. 이를 달성하기 위한 3가지 접근법이 고려된다: (1) 첨가제의 사용 (2) 공유결합 변형의 제어된 사용; 및 (3) 효소 고정화.
EP-B-0 243 967에는, 니트릴, 아미드 및 유기산 및 이들의 염으로부터 선택된 안정화 화합물을 효소 또는 고정된 형태의 효소의 용액 또는 현탁액에 첨가하여 니트릴라제의 니트릴 수화 활성을 보존하는 방법이 기재되어 있다. 본 명세서에는, 니트릴, 예를 들어 아크릴로니트릴을 수화시켜 상응하는 아미드, 예를 들어 아크릴아미드를 생성하는 니트릴라제를 생산할 수 있는 미생물의 용액 또는 현탁액은, 보관 기간이 짧다면, 실온에서 보관될 수 있으나, 저온, 특히 0℃에 가까운 온도에서의 보관이 바람직하다고 명백히 기재되어 있다. EP-A-0 707 061에는, 100mM 내지 포화 농도의 무기 염을 미생물 세포 또는 고정된 미생물 세포의 현탁액을 함유하는 수성 배지에 첨가하면, 세포 및 효소 활성이 장기간 동안 보존된다는 것이 기재되어 있다. 이러한 기법은 니트릴 하이드라타제 또는 니트릴라제 활성을 가진 미생물 세포의 보존을 위한 것으로 기재되어 있다. 니트릴라제 활성을 가진 고정되거나 고정되지 않은 미생물 세포의 수용액에 중탄산염 또는 탄산염을 첨가하는 것이 US-B-6,368,804에 기재되어 있다. 고정화는 종종, 매트릭스 내에 효소를 고정시키기 전에, 전세포(whole cell)로부터 효소의 제거를 수반하였다. 그러나, 이러한 고정화가 효소에 대해 매우 양호한 보호를 제공할지라도, 전세포로부터 효소를 추출하는 것은 시간 소모적이고, 비용이 많이 들고, 효소가 손실될 수 있는 복잡한 단계이다. US-A-5,567,608는 우수한 보관 안정성을 가지며 부패를 방지하는 양이온성 공중합체 내에 전세포 생물촉매를 고정시키는 방법을 제공한다.
아크릴아미드 단량체를 제조하는데 상업적으로 이용되는 로도코커스 로도크로스 J1은 고정화되어 (a) 수송이 가능해지고, (b) 사용 중의 생물촉매의 수명을 늘린다. US-A-5,567,608에서, 발명자들은, 반응 생성물로부터 생물촉매의 분리를 용이하게 하여 생물촉매로부터의 불순물이 생성물로 용출되는 것을 방지하고, 연속적 공정 및 생물촉매의 재활용을 보조하기 위하여, 산업적 규모로 사용하기 위하여는 생물촉매가 통상적으로 고정된다고 말하고 있다. 그러나, 고정화는 추가적 생산설비 및 잠재적으로 다수의 다른 원료, 예를 들면 알기네이트, 캐러기난(carrageenan), 아크릴아미드 및 기타 아크릴레이트 단량체, 및 비닐 알코올의 사용을 요구하는 별도 공정 단계이다. 따라서, 이는 비용이 많이 드는 공정 단계 이다.
화학 반응 공정에 대한 부정적 영향을 감소시키려는 시도로 효소 불활성화의 유해한 효과를 최소화하려는 다양한 다른 방법이 제안되어왔다.
장기간에 걸쳐 보관 중의 효소의 활성을 보존하기 위하여, 생물촉매를 동결 건조시키는 것이 또한 공지되었다. 이 또한, 소규모로 제조된 생물촉매를 사용하여 통상적으로 수행되는, 잠재적으로 비용이 많이 드는 공정 단계이다. 액체 질소 또는 액체 질소의 증기 상에 동결보존하면, 미생물 세포를 장기간 보관할 수 있으나, 액체 질소의 일정한 공급을 요구한다. 회수된 바이오매스(biomass) 또는 반-순수한 또는 순수한 효소를 -18℃ 미만의 온도에서 동결시키는 것이 또한 장기간 동안 생물촉매 활성을 보존시키는 것으로 공지되었다.
게다가, 일단 세포 덩어리가 반응기로 도입되고 반응이 일어나면, 효능 상실의 최소화가 작업 효율 및 공정 경제학에 있어서 중요하다. 한번 더, 미생물 세포를 특정 중합체 매트릭스에 고정화시키는 것이 이들 공정 파라미터를 최적화시키는 표준 공정이다.
따라서, 이들 단점이 극복될 수 있는 공정 및 생물촉매를 제공하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명에 따르면, 본원의 발명자들은 로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164인 미생물 또는 이의 돌연변이체를 제공한다.
이 신규 미생물은 니트릴 하이드라타제를 신속하게 생산하는 것으로 밝혀졌다. 본원의 발명자들은, 이 신규 미생물 (및 이로부터 생성된 니트릴 하이드라타 제)이 니트릴을 아미드로 전환시키는 공정에 사용될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164는 특히 (메트)아크릴로니트릴을 (매트)아크릴아미드로 전환시키는데 사용된다. 상기 미생물 및 효소는 장기간에 걸쳐 활성이 유지되며, 심지어 어떤 경우에는 활성이 증가되며, 게다가 50% w/w 초과로 아크릴아미드의 제조 후 감소되지 않은 활성을 가진 반응 혼합물로부터 회복될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 필요하다면, 이는 바로 재사용되거나 추가의 보관 기간 후 재사용될 수 있다.
신규 균주인 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164의 상세한 설명은 후술된다:
1. 기원 및 기탁
상기 로도코커스 로도크로스 균주는 영국 브래드포드(Bradford)의 토양으로부터 본원의 발명자들에 의해 분리되었으며, 2003년 3월 5일에 국제기탁기관[National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB)]에 기탁되어, 부다페스트 조약하에 수탁번호 NCIMB 41164를 부여받았다.
2. 미생물의 분류학적 동정
토양 분리물의 동정은 16S rDNA의 기법을 사용하여 수행하였다. 상기 토양 분리물로부터 수득된 16S rDNA 유전자의 서열을 핵산 서열 데이터베이스와 비교하였다. 수득된 서열을 독점소유의 데이터베이스 (MicroseqTM)에서 발견된 것들과 비교하고, 상위 20개의 적중(hit)을 결정하였다. 당해 서열을 상기 데이터베이스와 비교한 결과, 최우수 정합(match)이 97.48% 유사성으로 로도코커스 로도크로스로서 동정되었다. 이는 속(genus) 수준의 정합이지만, 십중팔구 로도코커스 로도크로스 균주일 것이다. 공용의 EMBL 데이터베이스에 대해 추가로 연구조사한 결과, 상기 데이터베이스에 대한 최우수 정합이 99.698% 유사성으로 로도코커스 로도크로스로 동정되었다.
3. 형태학적 특징 및 배양 특징
(1) 다형성(Polymorphic) 성장
(2) 운동성: 비운동성
(3) 포자 형성하지 않음
(4) 그람 포지티브
(5) 호기성
(6) 영양 아가 상에서의 성장은 30℃에서 48 시간 내에 콜로니 주변에 연어 살빛을 제공한다.
4. 배양 및 니트릴 하이드라타제 합성
본 발명의 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164는, 예를 들면 상기된 종래의 기술에 기재된 바와 같이 모든 공지된 방법에 따른 목적에 적합한 임의의 조건하에서 배양될 수 있다. 바람직하게는, 당해 미생물은 우레아 또는 우레아의 유도체를 포함하는 배양 배지에서 배양된다. 본원의 발명자들은, 이러한 미생물이 니트릴 하이드라타제의 유도물질로서 아세토니트릴 또는 아크릴로니트릴을 함유하는 배지 에서 성장할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 유도물질로서 우레아 또는 우레아 유도체가 존재하고 코발트 이온의 공급원으로서 염화코발트가 존재하는 가운데, 매우 고도의 니트릴 하이드라타제 활성이 달성된다. 예를 들면, 우레아 및 코발트를 실험 실시예에 기재된 배지에 첨가한다.
바람직하게는, 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164는 고도의 효소 활성, 예를 들면 15℃에서 약 250 내지 300,000 μmol min-1/g(무수 바이오매스)를 제공하도록 배양될 수 있다. 고도의 니트릴 하이드라타제 활성은, 우레아 또는 우레아 유도체가 배양 배지 중에 존재하는 경우에, 달성될 수 있다. 이는 배양의 개시시에 존재할 수 있거나 성장 도중 어느 시점에 첨가될 수 있으나, 일반적으로, 성장의 정지기의 시작 전에 첨가되어야 한다. 고도의 니트릴 하이드라타제 활성은 바람직하게는, 우레아 또는 우레아 유도체가 당해 미생물 성장의 개시시에는 배양 배지 중에 상당량으로 존재하지 않지만, 나중에 도입되는 경우에 달성될 수 있다. 본원의 발명자들은, 이것이 우레라 또는 우레아 유도체가 존재하지 않거나, 0.2 g/l 미만, 바람직하게는 0.1 g/l 미만의 양으로 존재하는 것을 의미한다고 본다. 보다 바람직하게는, 미생물 성장 중의 적어도 처음 6시간 동안은 배양 배지 중에 우레아 또는 우레아 유도체가 실질적으로 부존재한다(즉, 0.2 g/l 미만). 미생물의 성장 속도가 우레아 또는 우레아 유도체의 부재시에 더 높기 때문에, 우레아 또는 우레아 유도체의 도입 전에 적어도 12 시간 동안 및 어떤 경우에는 적어도 24 시간 동안, 미생물의 성장 배지가 우레아 또는 우레아 유도체를 실질적으로 함유하지 않는 것이 특히 바람직하지만, 미생물을 배양한지 48 시간 전에 우레아 또는 우레아 유도체를 첨가한다. 본원의 발명자들은, 이러한 방법에 의해 니트릴 하이드라타제 활성을, 우레아 또는 우레아 유도체가 배양 개시시에 첨가된 경우 보다 더 짧은 기간 내에 높일 수 있다는 것을 밝혀내었다.
또한, 본 발명은 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164인 미생물 또는 이의 돌연이체로부터 수득가능한 니트릴 하이드라타제에 관한 것이다.
본 발명의 추가적 양태는, 상응하는 니트릴을, 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164인 미생물, 이의 돌연변이체 및 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164 또는 이의 돌연변이체로부터 수득가능한 니트릴 하이드라타제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생물촉매의 존재하에, 수성 배지에서 수화 반응시켜, 상응하는 니트릴로부터 아미드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이후 본원에서, '생물촉매'란 용어는 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164 세포 내에서 합성된 니트릴 하이드라타제를 말하며, 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164 세포 자체를 포함할 수도 있다. 따라서, 생물촉매는 발효 배지 중의 전세포 제제로서, 수성 현탁액으로서, 고정된 세포 제제로서 회수된 세포 페이스트(paste)로서, 또는 본 발명의 요건을 총족시키는 니트릴을 아미드로 전환시키는데 적합한 니트릴 하이드라타제의 모든 다른 형태로서 사용될 수 있다.
상기 방법은 상응하는 니트릴로부터 아미드를 용이하게 제조하는데 특히 적합하다. 특히, 아미드의 수용액은 고 농도로 제조될 수 있다. 당해 방법은 아크릴아미드 또는 메타크릴아미드를 제조하는데 특히 적합하다.
상기 생물촉매는 니트릴로부터 아미드를 제조하기 위한 전세포 촉매로서 사 용될 수 있다. 이는 예를 들어 겔 내에 포획되어 고정될 수 있거나, 또는 이는 바람직하게는 유리 세포 현탁액으로서 사용될 수 있다. 달리, 니트릴 하이드라타제 효소는 추출될 수 있고, 예를 들어 아미드를 제조하는 공정에서 바로 사용될 수 있다.
상기 공정을 수행하는 바람직한 방법으로서, 상기 생물촉매를 미생물의 배양을 수행하는데 적합한 수성 배지 중에 도입한다. 통상적으로, 생물촉매, 예를 들어 미생물의 전세포의 현탁액이 생성될 수 있다. 니트릴, 예를 들면, 아크릴로니트릴 또는 메타크릴로니트릴을, 수성 배지 중의 (메트) 아크릴로니트릴의 농도가 6중량% 이하로 유지되도록 당해 생물촉매를 포함하는 수성 배지 중에 공급한다. 니트릴, 예를 들어 아크릴로니트릴 도는 메타크릴로니트릴이 보다 바람직하게는 반응 배지 중에 공급되며, 아미드, 예를 들어 아크릴아미드 또는 메타크릴아미드의 농도가 목적하는 수준, 특히 30 내지 55중량%에 도달할 때까지, 반응을 지속시킬 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 농도는 약 50중량% 이다.
로도코커스 로도크로스의 신규 균주 (NCIMB 41164)는 아크릴아미드 수용액을 고 농도 (예를 들어 50% 아크릴아미드)로 생산할 수 있다. 바람직하게는, 상기 반응은, 생물촉매 (로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164)가 발효 브로쓰(broth)의 형태로 또는 수거된 바이오매스로서 첨가되어지는 공급-배치(fed-batch) 형 반응기를 사용하여 무세포 공정으로서 수행될 수 있다.
상기 생물촉매 (로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164) 및 이로부터 생산된 니트릴 하이드라타제의 활성은, 니트릴을 상응하는 아미드로 추가로 수화시키는데 재 활용 및 재사용될 수 있을 정도이다.
상기 생물촉매의 재활용은 (메트) 아크릴로니트릴을 (메트) 아크릴아미드로 전환시키는 모든 경우에 특히 적합하다. 따라서, 반응 공정이 완료되고 아크릴아미드가 적당한 농도로 생성되는 아크릴아미드의 제조에서, 상기 촉매는 제거될 수 있으며, 니트릴 하이드라타제 활성의 손실 없이, 아크릴아미드의 또 다른 배치를 제조하는데 재-사용될 수 있다. 이는, 재사용 전에 수일 (예를 들면 3일) 동안 상기 생물촉매를 수 중에서 보관한 후 달성될 수 있다. 추가로 보관한 후 조차도, 제3의 아크릴 배치를 제조하는 것이 가능할 수도 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본원의 발명자들은, 로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164의 미생물 또는 이의 돌연변이체이거나 또는 이로부터 수득될 수 있는 생물촉매를 활발하게 성장하지 않는 유리 세포 미생물의 형태로 포함하는 수성 조성물을 제공한다. 또한, 본원의 발명자들은 상기 생물촉매를 활발하게 성장하지 않는 유리 세포 미생물의 형태로 보관하는 방법을 제공한다.
니트릴을 아미드로 전환시키는데 사용된 생물촉매의 미생물 세포는 활발하게 성장하지 않는 배양물로서 간주될 수 있다. 본원의 발명자들에 의하면, 이는 미생물이 보유된 배지 및 보관 조건이 성장을 촉진시키는 것으로 기대되지 않는다는 것을 의미한다. 보관 배지는 예를 들면, 발효 배지로부터 회수될 수 있는 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164일 수 있다. 또는, 상기 세포들은 발효 배지에서 바로 사용될 수 있거나, 이들은 적당한 현탁 매질, 예를 들어, 물; 생리학적 식염수; 포스페이트 완충제 또는 기타 모든 유사한 완충제와 같은 적당한 완충제 용액 또는 성장 배지 중의 수성 현탁액 (이곳에서 미생물 세포의 대사는, 성장 속도, 바이오매스 농도, 산소 소비 또는 영양물 소비를 측정하거나, 미생물의 성장 및 대사를 모니터하는데 일반적으로 사용되는 다른 형태의 측정수단으로 판단할 때, 거의 제로(0)이다)으로서 존재할 수 있다.
상기 조성물 또는 보관 배지는 임의의 잔존 발효 브로쓰 성분을 포함할 수 있다. 발효 브로쓰는 미생물을 배양하는데 사용되는 통상적인 성분은 모두 포함할 수 있고, 또한 당해 미생물에 의해 생산된 생성물 및 부산물을 포함할 수 있다. 발효 브로쓰의 통상적인 성분으로는, 당(sugar), 다당류, 단백질, 펩티드, 아미노산, 질소원, 무기 염, 비타민, 성장 조절물질 및 효소 유도물질이 포함된다. 구체적으로 이에는 당으로서 단당류 또는 이당류; 암모늄 염 또는 기타 질소원; 인산염, 황산염, 마그네슘, 칼슘, 나트륨 및 칼륨 염과 같은 무기 염; 금속 화합물; 비타민; 복합 발효 배지 성분, 예를 들어 옥수수 침지액; 펩톤; 효모 추출물; 특정 미생물의 성장 요건에 사용될 수 있는 유기 또는 무기 화합물; 특정 효소 유도물질 (예를 들어, 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164의 니트릴 하이드라타제를 유도하는데 사용되는 우레아); 및 시트레이트 또는 피루베이트와 같은 유기산; 및 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164의 성공적인 성장을 보장하는데 요구될 수 있는 기타 유기 또는 무기 화합물이 포함될 수 있다.
통상적으로, 생물촉매, 예컨대 니트릴 하이드라타제를 생산하는 생물촉매가 일정 기간, 심지어 며칠 동안 지속된 성장 없이 보관되는 경우에는, 미생물 세포가 촉매로서 요구되는 세포이든지 또는 효소가 당해 세포 도는 발효 배지로부터 회수 되든지 간에, 발효 브로쓰로부터 미생물 세포를 제거하는 것이 통상적이다. 이는, 발효 브로쓰의 부패를 야기하는 발효 브로쓰 내의 미생물 성장을 방지하고, 요구된 효소의 분해를 야기할 수 있는 프로테아제 활성을 감소시키는 것이다. 따라서, 발효 브로쓰 그 자체를 보존하거나, 또는 세포를 제거하여 미생물 오염과 같은 외인성 생물학적 활성을 통한 생물촉매의 분해를 방지하는 것이 통상적이다. 이것이 수행되지 않는다면, 통상적으로, 생물촉매의 활성은 매우 단기간에, 예를 들면 하루 내에, 확실히 2일 미만에 감소될 것으로 예측된다.
생물촉매의 보관 동안, 심지어 최대 1 주일의 기간 동안 활성을 보존하는 방법은 통상적으로, 발효 브로쓰로부터의 생물촉매의 제거 및/또는 적당한 매트릭스 내의 생물촉매의 고정화 및/또는 안정화 물질을 사용한 안정화 (이 경우에 안정화 물질은 반응 혼합물에서 오염물질이 되며 이는 후속 공정에서 문제가 될 수 있거나 안정화 물질이 생물촉매로서 사용되기 전에 미생물 세포로부터 안정화 화합물 또는 첨가물을 제거하기 위한 추가 공정 단계가 요구된다)를 포함한다.
이러한 보존 조치의 부재시에는, 통상적으로, 주위 온도에서 유지되는 생물촉매들은, 이들이 반응을 촉매시키는데 더 이상 효과적이거나 적합하지 않을 정도로 활성을 상실하는 경향이 있다.
생물촉매로서 사용하기 위한 미생물의 성장은 수 일의 기간 동안 일어날 수 있다. 이 기간 동안, 미생물은 활발하게 성장하는데, 즉 바이오매스가 세포의 전체적인 화학 조성의 증가 및 유지와 함께 증가되는 균형잡힌 성장이 이루어진다.
통상적으로, 미생물의 성장은 영양물의 고갈 또는 대사과정의 독성 산물의 촉적에 의해 제한되고 성장 속도가 감소한다. 성장은 적당한 영양물을 공급하고 성장을 위한 정확한 온도 및 pH를 유지하고, 필요하다면, 산소를 공급함으로써 유지된다.
본원에 기재된 보관 방법은, 생물촉매가 활성의 상당한 손실 없이 용이하게 사용될 수 있도록, 효과적으로 안정성을 증진시킨다. 보관 안정성은, 예를 들면 고정화, 안정화 화합물의 첨가 또는 동결 건조에 의존할 필요 없이 달성된다. 보관 안정성은, 우레아가 공지된 단백질 불활성화제 일지라도 우레아 또는 우레아 유도체와 같은 어떠한 발효 브로쓰 성분의 제거에 의존하지 않고서도 달성될 수 있다.
보관 방법에 사용된 조성물 또는 환경은 산소를 함유하거나 또는 실질적으로 산소가 부존재하는 환경일 수 있다. 본원의 발명자들에 의하면, 산소 부존재는 산소의 농도가 1% 용존 산소 농도 미만이어야 한다는 것을 의미한다. 발효 브로쓰로부터의 산소의 제거는 산소를 제거하는 모든 통상의 방법에 의해 달성될 수 있다. 이에는 불활성 가스를 이용한 일정 기간 동안의 퍼징(purging), 보관 용기 내의 헤드-스페이스(head-space)의 제거, 감압 하의 보관 또는 공지된 산소 스캐빈저, 예를 들어 아스코르브산 또는 하이드라진 및 하이드라지드의 첨가가 포함된다.
2일간의 보관 후, 특히 수일간의 보관 후 니트릴 하이드라타제 활성이 다소 상실될 것이 예견되었다. 이는 산소의 부재시에도 예견되었다. 이는 특히 잔존 발효 브로쓰 성분, 예를 들면 우레아의 존재시 및 0℃ 이상의 온도에서 예견되었다. 이는, 생물촉매 중의 프로테아제 효소가 세포 내의 다른 단백질, 예를 들면 니트릴 하이드라타제를 분해하리라 기대되었기 때문이다. 또한, 우레아 또는 우레아 유도체의 존재는 유해한 것으로 예견되었는데, 이는 우레아가 단백질 불활성화제로서 알려졌기 때문이다. 그러나, 상기 생물촉매는 예견된 단점 중 어느 것도 겪지 않았으며, 따라서 니트릴 하이드라타제 활성이 상당한 상실도 없었다.
대조적으로, 본원의 발명자들은 보관 기간 동안 니트릴 하이드라타제를 포함하는 생물촉매의 활성이 어떤 경우에는 실제로 증가한다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 본원의 발명자들은, 생물촉매를 본 발명의 보관 방법에 따라 보관 배지 중에 보관함으로써 니트릴 하이드라타제를 생성할 수 있는 생물촉매의 니트릴 하이드라타제 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 따라서, 본 방법에 의해, 활성의 증가를 특징으로 하는 새로운 생물촉매 조성물이 생성될 수 있다. 따라서, 생물촉매 조성물의, 특히 생물촉매의 보관 도중에 생성된 니트릴 하이드라타제가 새롭다. 또한, 당해 생물촉매는 보관 기간 중에 부패에 따른 악취를 생성하지 않는다.
바람직하게는, 상기 보관 방법은 생물촉매를 2일 이상 동안, 보다 바람직하게는 일주일 이상 동안 보관할 수 있다. 특히, 생물촉매는 3 내지 28일, 예를 들면 3 내지 14일 동안 보관될 수 있다.
우레아와 같은 발효 브로쓰의 성분의 존재는 본 발명의 상기 양태의 조성물 또는 보관 방법에 필수적인 것은 아니다. 발효 브로쓰 성분이 존재하는 경우에는, 이는 우레아 또는 우레아 유도체일 수 있다. 우레아 유도체는, 예를 들어 우레아의 알킬 유도체일 수 있다.
우레아 또는 우레아 유도체는, 발효 혼합물 중에 이를 포함시킴으로써 생물촉매 조성물 중에 존재할 수 있다. 본 발명의 일 형태로, 생물촉매를 함유하는 조성물 또는 보관 배지는 산소-제거될 수 있고 우레아와 같은 발효 브로쓰 성분을 함유할 수 있다.
본 발명의 이러한 양태의 특히 유리한 특징은, 생물촉매가 배양되어지는 발효 혼합물로부터 더 이상 생물촉매를 분리할 필요가 없다는 것이다. 이는 추가 공정 단계의 요구를 피하기 때문에, 상당히 가치 있는 것이다. 따라서, 상기 조성물은 또한, 추후 보관되어질 발효 혼합물을 포함할 수 있다. 생물촉매를 보관하는 방법에서, 본원의 발명자들은, 효소의 활성에 어떠한 유해한 효과를 주지 않으면서도 발효 혼합물의 존재하에 상기 방법이 달성될 수 있음을 알았다. 이에 따라 반응을 촉매하기 위하여 발효 브로쓰를 즉시 사용할 수 있거나, 또는 이를 수일 또는 심지어 수주 동안 아무런 손상 없이 보관할 수 있으며, 이때 생물전환 단계가 수일의 기간에 걸쳐 수행되므로, 추가적 공정 단계의 필요 없이 손쉽게 구입가능한 생물촉매의 일정한 공급을 보장함으로써, 생물전환 단계를 단순화시키고 이의 비용을 절감할 수 있다.
상기 생물촉매는 이의 빙점 이상의 온도에서 편리하게 보관될 수 있다. 통상적으로, 생물촉매는 주위 온도, 예를 들면 30 또는 40℃ 이하에서 보관될 수 있다. 그러나, 본 방법의 이점은, 온도를 모니터하고 제어하는데 어떠한 특별한 주의를 기울일 필요 없이, 당해 생물촉매를 주위 온도에서 보관할 수 있다는 것이다. 바람직하게는, 당해 생물촉매는 4 내지 30 또는 40℃, 보다 바람직하게는 5 내지 25℃, 예를 들어 10 내지 25℃, 특히 15 내지 25℃의 온도에서 보관된다.
본 발명의 추가 양태에 따르면, 본원의 발명자들은, 생물촉매가 조성물의 일부이거나 또는 활발하게 성장하지 않는 유리 세포 미생물의 형태로 보관 배지에서 보관되며, 이때 상기 조성물 또는 보관 배지는 발효 브로쓰를 포함하며 상기 생물촉매는 미생물 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164 또는 이의 돌연변이체임 (또는 이로부터 수득될 수 있는 것임)을 특징으로 하는, 상응하는 니트릴을 니트릴 하이드라타제와 접촉시켜 아미드를 제조하는 방법을 제공한다.
따라서, 이러한 양태의 본 발명에 따르면, 상기 생물촉매는 산소를 함유하는 환경에 둘 수 있거나 또는 산소-부존재 환경에 둘 수 있었다. 이는 니트릴의 전환이 개시되기 전에, 잔존 발효 브로쓰 성분, 예를 들어 우레아를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 이는 본 발명의 보관 양태에 따른 생물촉매의 보관으로부터 비롯되거나 또는 달리 본 발명에 따른 조성물로서 제공될 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 생물촉매가 제조되어지는 발효 혼합물로부터 생물촉매를 제거하는 것이 필수적인 것은 아니다. 따라서, 바람직한 형태로, 생물촉매를 보유한 환경은 또한 발효 브로쓰의 성분을 함유한다. 따라서, 발효 브로쓰의 성분을 함유하는 생물촉매 조성물은 니트릴과 배합될 수 있으며, 이후 니트릴은 상응하는 아미드로 수화된다. 놀랍게도, 본원의 발명자들은, 이전의 지식, 예를 들면 생물촉매의 고정화가 생물촉매로부터의 불순물이 반응 생성물로 용출되는 것을 방지하는데 바람직하다고 설명하는 문헌[US-A-5,567,608]과는 달리, 반응 혼합물 중에 발효 브로쓰를 포함시키는 것이 최종 생성물의 품질에 영향을 주지 않는다는 것을 발견하였으며, 이러한 양태는 본원 발명자들에 의해 공동-출원된 영국 출원 제0327901.5호 (사건 번호: BT/3-22349/P1)에 기재되어 있다.
발효 혼합물은 미생물의 성장 및 유지에 필수적인 성분들을 포함할 것이다. 일반적으로, 상기 혼합물은 적어도 탄소원, 질소원 및 각종 영양물을 함유할 것이다. 이에는 당류(saccharide), 예를 들어 글루코스 또는 기타 당(sugar)과 같은 일당류 또는 이당류 또는 다당류, 암모늄 염, 복합 배지 성분, 예컨대 효소 추출물 및 펩톤, 아미노산, 비타민, 인산염, 칼륨, 나트륨, 마그네슘 및 칼슘 염, 미량 원소, 예컨대 철, 코발트, 망간, 구리, 아연 등이 포함된다. 이들 및 기타 성분들은 특정 미생물에 적합한 농도로 발효 혼합물 중에 포함될 수 있다. 발효가 생물촉매의 생산성에 변화를 줄 수 있으며 발효 브로쓰가 성장의 상이한 단계에서 사용될 수 있다는 것이 공지되었으므로, 따라서 이러한 방법으로 제조한 후 생물촉매를 보관할 수 있는 것이 중요하다.
본원의 발명자들은, 생물촉매의 활성이 장기간의 반응 동안 현저히 감소하지 않는다는 것을 알았다. 결과적으로, 생물촉매가 덜 자주 교체될 수 있다. 바람직하게는, 2일 이상의 기간 동안 사용되며, 그 기간 동안 활성이 실질적으로 상실되지 않는다.
일반적으로, 니트릴 하이드라타제를 사용하는 반응의 촉매화는 단일 단계로 니트릴을 상응하는 아미드로 전환시킬 수 있다. 이 공정은, 니트릴이 아크릴로니트릴이고 아미드가 아크릴아미드일 때, 특히 가치있다. 이러한 전환 단계를 단일 배치의 생물촉매를 사용하여 수 회 수행하는 것이 바람직하며, 이때 상기 생물촉매 로부터 조금씩 수일의 기간에 걸쳐 제거하여 여러 반응을 수행하며, 이때 니트릴이 아미드로 전환된다. 따라서, 생물전환 단계를 동시에 수행하며, 생물촉매에 손상을 주지 않으면서 가능한 한 저렴하게 생물촉매를 보관할 수 있는 것이 중요하다. 따라서, 사실상, 1 배치의 생물촉매가 예를 들어 아크릴아미드의 여러 배치를 제조하는데 사용하기 위하여 보관될 수 있다. 여러 배치는 5 내지 10 또는 그 이상의 배치, 심지어 15 내지 20 배치일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로, 본원의 발명자들은 미생물의 생물촉매의 활성을 개선하는 방법을 밝혀내었다. 미생물은 우레아 또는 우레아의 유도체를 포함하는 배양 배지에서 배양될 것이다. 그러나, 우레아 또는 우레아의 유도체는, 미생물의 성장 개시 후 6시간 이상 지난 다음 배양 배지 속에 도입된다. 통상적으로, 배양 배지에는 미생물 배양의 적어도 처음 6시간 동안 우레아 또는 우레아 유도체가 실질적으로 부존재하며, 이후 우레아 또는 우레아 유도체가 배양 배지에 첨가된다. 앞서 지적한 바와 같이, 본원의 발명자들은 실질적으로 부존재하다는 것이, 배양 배지가 우레아 또는 우레아 유도체를 0.2 g/l 미만, 통상적으로 0.1 g/l 미만으로 함유하거나 전혀 함유하지 않는 것을 의미한다. 바람직하게는, 배양 배지에는 12 시간 이상 동안, 때로는 24 시간 이상 동안 우레아 또는 우레아 유도체가 실질적으로 부존재한다. 그러나, 생물촉매 활성을 최대화하기 위하여, 배양 48 시간 이내에 우레아 또는 우레아 유도체를 도입하는 것이 바람직하다.
생물촉매의 활성은 본원에 기재된 효소 활성의 관점에서 정립될 수 있다.
바람직하게는, 미생물은 니트릴 하이드라타제를 생산할 수 있다. 적합하게 는, 이러한 미생물을 포함하는 생물촉매는, 니트릴 하이드라타제가 반응을 촉매하는 수화 반응에 의해 상응하는 니트릴로부터 아미드를 제조하는데 사용될 수 있다. 우레아 또는 우레아 유도체의 도입을 지연시킨 미생물의 배양은, 상기 반응에 특히 적합한 증가된 니트릴 하이드라타제 활성을 제공한다. 상기 공정은 (메트) 아크릴로니트릴로부터 (메트) 아크릴아미드의 제조에 특히 적합하다. 이러한 공정은 본원에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 추가로, 생물촉매는 재활용 및 재사용될 수 있다.
상기 미생물은 로도코커스 속, 바람직하게는 로도코커스 로도크로스 종, 특히 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164인 것이 특히 바람직하다.
아래의 실시예는 본 발명을 수행하는 방법에 관한 예시를 제공한다.
실시예 1
로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를 농후 배양(enrichment culture ) 기법을 사용하여 토양으로부터 분리하고, 이를 아래의 성분들(g/l)을 함유하는 배지에서 성장시켰다: KH2PO4, 7.0; KH2PO4, 3.0; 펩톤, 5.0; 효모 추출물, 3.0; 글루코스, 5.0; MgSO4, 0.5; 미량 금속 용액, 5 ml; 아세토니트릴, 20 ml. pH를 7.2로 조정하였다. 니트릴 하이드라타제 활성은, 28℃에서 3일간의 성장 후, 15℃에서 4,000 μmol min-1/g(건조 세포) 였다.
실시예 2
(1) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 하기 성분들 (g/L)을 함유하는 400 mL 배양 배지를 함유하는 2L 배플식(baffled) 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 성장시켰다: 인산수소이칼륨 0.7; 인산수소칼륨 0.3; 글루코스 10.0; 펩톤, 1.0; 효모 추출물 3.0; 황산마그네슘 7수화물 0.5; 우레아 5.0; 염화코발트 6수화물 0.01; 수도물 최대 1L. 배지의 pH를 7.2로 조정하였다. 배양물을 5일 동안 28℃에서 성장시켰으며, 이후 니트릴 하이드라타제 활성은 15℃에서 47,900 μmol min-1/g 이였다.
(2) (a) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 펩톤이 빠진 점을 제외하고는 (1)에 기재된 바와 동일한 배지에서 성장시켰다.
(b) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 펩톤 및 우레아가 빠진 점을 제외하고는 (2a)에 기재된 바와 동일한 배지에서 성장시켰다. 당해 생물체를 24 시간 동안 배양하였으며, 이어서, 5 g/L 우레아를 배양물에 첨가하고, 추가로 5일 동안 성장시켰다.
(C) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 우레아가 배지 중에 포함되지 않은 점을 제외하고는 (2a)에 기재된 바와 동일한 배지에서 성장시켰다. 당해 생물체를 48 시간 동안 배양하였으며, 이어서, 5 g/L 우레아를 배양물에 첨가하고, 추가로 4일 동안 성장시켰다.
(d) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 우레아가 배지 중에 포함되지 않은 점을 제외하고는 (2a)에 기재된 바와 동일한 배지에서 성장시켰다. 당해 생물체를 6일 동안 배양하였다.
샘플을 성장이 개시된지 1, 2, 3 및 6일째에 상기 4종의 배양물로부터 취하였다. 니트릴 하이드라타제 활성을 15℃에서 측정하였다 (표 1 참조).
Figure 112006039332011-pct00001
실시예 3
(1) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 하기의 성분들 (g/L)을 함유하는 180 L 배양 배지를 함유하는 280L 발효조에서 성장시켰다: 인산수소이칼륨 0.7; 이인산수소칼륨 0.3; 글루코스 2.0; 효모 추출물 3.0; 황산마그네슘 7수화물 0.5; 염화코발트 7수화물 0.01. 배지의 pH를 pH 7.2로 조정하였다. 배양물을 30℃에서 3일 동안 성장시켰다. 우레아를 17 시간 후에 배양물에 첨가하였다. 니트릴 하이드라타제 활성을 정기적으로 (30℃)에서 측정하였다. 우레아를 첨가한지 22 시간 후, 활성이 30℃에서 약 176,000 μmol min-1/g이였으며, 추가로 9 시간 후에 활성이 323,000 μmol min-1/g로 증가하였다.
(2) 625 g의 물을 상기 반응기에 충전시키고, 이에 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를 첨가하였다. 당해 혼합물을 25℃로 가열하였다. 아크릴로니트릴 375 g을 2% (w/w)의 농도를 유지하는 속도로 반응기에 공급하였다. 175 분 후, 모든 아크릴로니트릴이 아크릴아미드로 전환되었으며, 최종 농도는 약 50% (w/w)이였다.
(3) 2로부터의 세포를 원심분리에 의해 회수하고 이들을 625 g의 물 중에 현탁시켰다. 이러한 현탁액을, 반응기에 재-충전시키기 전에, 3일 동안 40℃에서 보관하였다. 5에 기재된 방법을 이후에 수행하였으며, 다시 175 분 후 모든 아크릴로니트릴은 아크릴아미드로 전환되었다.
(4) 3으로부터의 세포를, 재-사용 전에 2일 동안 보관하는 점을 제외하고는, 상기 3에 기재된 바와 같이 처리하였다. 다시 50% 아크릴아미드가 합성되었다. 실시예 3의 2-4)(5-7)에서 생성된 아크릴아미드의 배치에 대해 측정된 아크릴산 농도는 표 2에 제시되어 있다.
각각의 아크릴아미드 배치에서 측정된 아크릴산 농도
실시예 번호 아크릴산 농도 (ppm)
3-2 5650
3-3 102
3-4 아무것도 검출되지 않음(< 10 ppm)
실시예 4
(1) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 하기의 성분들 (g/L)을 함유하는 180 L 배양 배지를 함유하는 280L 발효조에서 성장시켰다: 인산수소이칼륨 0.7; 인산수소칼륨 0.3; 글루코스 1.0; 효모 추출물 3.0; 황산마그네슘 7수화물 0.5; 염화코발트 6수화물 0.01; 우레아, 5.0. 배지의 pH를 pH 7.2로 조정하였다. 배양물을 3일 동안 30℃에서 배양하였다.
25L의 발효 브로쓰를, 약 5℃인 주위 온도에서 3½일 동안 보관하기 전에, 20분 동안 질소로 탈기시켰다. 수거한 지 15 시간 후에, 니트릴 하이드라타제 활성을 측정하였으며, 이는 25℃에서 242,000 U/g인 것으로 밝혀졌다. 3일 후에 NH 활성을 재측정하였을 때, 이는 293,000 U/g인 것으로 밝혀졌다.
실시예 5
로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 하기 성분들 (g/L)을 함유하는 배양 배지에서 180 rpm으로 진탕시키면서 5일 동안 28℃에서 2L의 삼각 플라스크 내에서 성장시켰다: 인산수소이칼륨 0.7; 인산수소칼륨 0.3; 글루코스 10.0; 효모 추출물 3.0; 우레아 5.0; 황산마그네슘 7수화물 0.5; 염화코발트 6수화물 0.01. 배지의 pH를 pH 7.2로 조정하였다. 배양 브로쓰를 두 분획으로 나누고, 이 중 반을 질소를 사용하여 산소를 제거시켰다. 산소-제거된 배양 브로쓰 및 산소처리된 배양 브로쓰 두 분획 모두를 1 주일 동안 4, 15 및 25℃에서 항온배양하였다. 상기 분획들의 니트릴 하이드라타제 활성을 정기적으로 측정하였다. 니트릴 하이드라타제 분석의 결과는 표 3에 제시되어 있다. 결과는 U/mg (건조 세포)의 단위로 주어진다.
Figure 112006039332011-pct00002
생물촉매가 주위 온도에서 효과적으로 보관될 수 있다는 것이 실시예 5의 결과로부터 알 수 있다. 또한, 이 경우에 니트릴 하이드라타제 활성이 0일에 비해 보관시에 증가한다는 것을 알 수 있다.
실시예 6
로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164의 해동된 세포를 물에 재현탁시켰다. 니트릴 하이드라타제 활성을 1 주일의 기간에 걸쳐 측정하였다. 측정된 니트릴 하이드라타제 활성의 상대적 활성은 표 4에 제시되어 있다.
Figure 112006039332011-pct00003
표 4의 결과는, 활성이 1 내지 7일의 항온배양 기간의 모든 보관 온도에서 감소되지 않았음을 보여준다.
실시예 7
(1) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 하기 성분들 (g/L)을 함유하는 100 mL 배양 배지를 함유하는 0.5 L의 배플식 삼각 플라스크에서 성장시켰다: 인산수소이칼륨 0.7; 인산수소칼륨 0.3; 글루코스 10.0; 효모 추출물 3.0; 황산마그네슘 7수화물 0.5; 우레아 5.0; 염화코발트 6수화물 0.01; 수도물 최대 1L. 배지의 pH를 pH 7.2로 조정하였다. 배양물을 4일 동안 30℃에서 성장시켰다. 2, 3 및 4일간의 성장 후, 니트릴 하이드라타제 활성을 25℃에서 측정하였다.
(2) (a) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 우레아를 디메틸우레아로 대체한 점을 제외하고는 상기 (1)에 기재된 바와 동일한 배지에서 성장시켰다.
(b) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 우레아를 에틸우레아로 대체한 점을 제외하고는 상기 (1)에 기재된 바와 동일한 배지에서 성장시켰다.
(c) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 5 g/l의 우레아를 대신하여 2.5 g/l의 우레아 및 2.5 g/l의 디메틸우레아를 배지에 첨가하는 점을 제외하고는 상기 (1)에 기재된 바와 동일한 배지에서 성장시켰다.
(d) 로도코커스 로도크로스 NCIMB 41164를, 5 g/l의 우레아를 대신하여 2.5 g/l의 우레아 및 2.5 g/l의 에틸우레아를 첨가하는 점을 제외하고는 상기 (1)에 기재된 바와 동일한 배지에서 성장시켰다.
니트릴 하이드라타제 활성은 표 5에 제시되어 있다.
Figure 112006039332011-pct00004

Claims (33)

  1. 로도코커스 로도크로스(Rhodococcus rhodochrous) 균주 NCIMB 41164인 미생물.
  2. 로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164 미생물을 우레아 또는 우레아의 유도체를 함유하는 배양 배지에서 배양하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 우레아 또는 우레아 유도체를, 미생물의 성장을 개시한 후 6시간 내지 48시간이 지나기 전에 배양 배지 내로 도입하는 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 배양 배지가 미생물을 배양한 지 6 시간 내지 48시간이 지나기 전까지는 우레아 또는 우레아 유도체를 0.2 g/l 미만으로 함유하고, 이후 우레아 또는 우레아 유도체를 배양 배지에 첨가하는 방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 배양 배지가 미생물을 배양한 지 12 시간 내지 48시간이 지나기 전까지는 우레아 또는 우레아 유도체를 0.2 g/l 미만으로 함유하고, 이후 우레아 또는 우레아 유도체를 배양 배지에 첨가하는 방법.
  6. 삭제
  7. 로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164인 미생물로부터 수득가능한 니트릴 하이드라타제.
  8. 상응하는 니트릴로부터 아미드를 제조하는 방법으로서, 상기 니트릴을, 로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164인 미생물 및 로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164로부터 수득가능한 니트릴 하이드라타제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생물촉매의 존재하에, 수성 배지에서 수화 반응시킴을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 아미드가 (메트)아크릴아미드인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 생물촉매를 수성 배지에 도입하고, (메트)아크릴로니트릴을 수성 배지 중의 (메트)아크릴로니트릴의 농도가 6중량% 이하로 유지되도록 수성 배지 중에 공급하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 아크릴아미드의 농도가 30 내지 55중량%가 될 때까지 반응을 지속하는 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 생물촉매를 재활용 및 재사용하는 방법.
  13. 제1항에 따른 미생물을 우레아 또는 우레아의 유도체를 포함하는 배양 배지에서 배양하며, 이때 우레아 또는 우레아의 유도체를 미생물의 성장을 개시한 후 6 시간 내지 48시간이 지나기 전에 배양 배지에 도입함을 특징으로 하여, 제1항에 따른 미생물의 생물촉매 활성을 개선하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 배양 배지가 미생물을 배양한 지 6시간 내지 48시간이 지나기 전까지는 우레아 또는 우레아의 유도체를 0.2 g/l 미만으로 함유하고, 이후 우레아 또는 우레아 유도체를 배양 배지에 첨가하는 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 배양 배지가 미생물을 배양한 지 12시간 내지 48시간이 지나기 전까지는 우레아 또는 우레아의 유도체를 0.2 g/l 미만으로 함유하고, 이후 우레아 또는 우레아 유도체를 배양 배지에 첨가하는 방법.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164인 미생물이거나 또는 이로부터 수득가능한 생물촉매를 활발하게 성장하지 않는 유리 세포(free cell) 미생물의 형태로 포함하는 수성 조성물.
  25. 로도코커스 로도크로스 균주 NCIMB 41164인 미생물이거나 또는 이로부터 수득가능한 생물촉매를, 활발하게 성장하지 않는 유리 세포 미생물의 형태로, 수성 보관 배지에서 보관하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 생물촉매를 0 내지 30℃의 온도에서 보관하는 방법.
  27. 삭제
  28. 제25항 또는 제26항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 조성물.
  29. 제24항에 따른 조성물로부터 수득되거나 또는 제25항 또는 제26항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 니트릴 하이드라타제.
  30. 제24항에 따른 조성물로부터 수득되거나 또는 제25항 또는 제26항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 니트릴 하이드라타제와 상응하는 니트릴을 접촉시켜 아미드를 제조하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 아미드가 (메트)아크릴아미드인 방법.
  32. 제25항에 있어서, 생물촉매를 4 내지 30℃의 온도에서 보관하는 방법.
  33. 제25항에 있어서, 생물촉매를 3 내지 28일의 기간 동안 보관하는 방법.
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