CN102329744B - 异养型硝化细菌、包含其的生物传感器、及检测水体毒性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体地，本发明涉及异养型硝化细菌、包含其的生物传感器、及检测水体毒性的方法。根据本发明的异养型硝化细菌，分别是紫红红球菌，保藏编号为CGMCC No.3890、马红球菌，保藏编号为CGMCC No.3901、产碱假单胞菌，保藏编号为CGMCC No.3902、藤黄微球菌，保藏编号为CGMCC No.3903。本发明采用原位多点采样法筛选得到的四种异养型硝化细菌组合成复合菌剂指示剂，固定于载体上制成生物传感器用于水体毒性的检测。根据本发明的检测水体毒性的方法，解决了生物毒性检测连续在线监测的难题，实现了快速检测水体毒性，从而完成对重大环境污染事件风险源识别与监控以及对饮用水、污水、河流、湖泊等水体的生物毒性检测。

Description

异养型硝化细菌、包含其的生物传感器、及检测水体毒性的方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地，本发明涉及异养型硝化细菌、包含其的生物传感器、及检测水体毒性的方法。
背景技术
随着我国现代化进程的加快，诸多领域会产生如工业污水、农业污水、生活污水，这些污水通常含有有机污染物、重金属等直接排放会对环境造成严重污染。其中工业污水和农业污水含有大量合成有毒有机物，一般难以被微生物所降解或完全去除，生活污水中也存在多种有毒物质，如合成洗涤剂、药品、内分泌干扰物质等。因此水环境中不可避免地存在毒性物质。尽管这些污染物在水中浓度低，但毒性危害大，有的还具有致癌、致畸和致突变特性。由于技术和经济原因，国内很少有对环境水中的有毒有害污染物进行生物毒性监测。而在国外，对出流的城市污水进行生物毒性监测已有不少的报道。如在美国北卡罗来纳州，掺杂了纺织厂废水的城市污水出流受到了急性毒性和慢性毒性的指标限制。
目前的毒性测试方法都是基于测定化学品毒性发展起来的。生物毒性监测不仅能直接反映有毒物质联合作用对环境和生态的综合影响，还可以直接检测多种有毒物质共存时水质的综合毒性。近年来国内外一直在致力于生物毒性试验新方法的探索。用于毒性检测的生物传感器有酶传感器、微生物传感器、DNA传感器和免疫传感器等。酶、DNA和抗原/抗体的专一性强，只能特异地检测某种有毒物质的毒性，而微生物传感器是一类用完整细胞作为识别元件的传感器，其体内的各种酶系及代谢系统可以检测和识别相应底物，从而达到测试多种有毒物质综合毒性的目的。因此，微生物传感器是目前具有很好发展前途的毒性检测生物传感器。
硝化菌是专性好氧菌，易受到外界环境因素的影响，重金属、农药、有机污染物等可以通过抑制硝化作用的酶类(如氨单加氧酶、羟氨氧化酶、亚硝酸氧化酶)而影响这一过程的进行，这一特点常被用作毒性测试中。开发硝化菌毒性检测系统技术关键在于硝化菌的选择，因为硝化菌的有氧呼吸和底物氨的利用是硝化作用的两个特征。当毒性污染物存在时，其硝化作用因而受到毒性抑制，因此，将硝化菌制成传感器，该传感器使用溶解氧探头，可以通过测试水样中溶解氧的变化来评价水样毒性的大小。
异养型硝化菌在水体毒性检测生物传感器上的应用关键在于如何筛选、分离、选优、组合培养以及生物膜固定化等几大难点。
发明内容
为了解决上述难点，本发明经过长期的科学研究与科学实验，对异养型硝化菌的筛选、培育、应用新技术等进行了研究，并将筛选、培育出的异养型硝化复合菌。本法明采用原位多点采样法，采集鱼塘、小溪、湖泊等水体中泥样品，并将其进行富集、分离，从而得到的异养型硝化菌菌株，经固定化后组合于生物传感器上，用于水体毒性检测的目的。
本发明的目的是提供一种能够用于检测水体毒性的异养型硝化细菌，紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)。
本发明的再一目的是提供一种能够用于检测水体毒性的异养型硝化细菌，马红球菌(Rhodococcus equi)。
本发明的再一目的是提供一种能够用于检测水体毒性的异养型硝化细菌，产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)。
本发明的再一目的是提供一种能够用于检测水体毒性的异养型硝化细菌，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)。
本发明的再一目的是提供一种异养型硝化菌复合菌指示剂。
本发明的再一目的是提供用于水体毒性检测的生物传感器。
本发明的另一目的是提供一种检测水体毒性的方法。
本发明从筛选到能够效检测毒性的微生物的目的出发，采用原位多点采样法从鱼塘、小溪、湖泊等水体中泥样品，通过用于富集、分离的方法成功的筛选到四株能够检测水体中溶解氧的变化，从而检测水体毒性的异养型硝化细菌，建立了一种简单、快速，高效的筛选方法。
采用Sherlock微生物鉴定系统(Sherlock Microbial Identification System，SherlockMIS)对所筛选得到菌种进行鉴定。经鉴定，筛选到的菌株分别是紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、马红球菌(Rhodococcus equi)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，其保藏编号分别是CGMCC No.3890、CGMCC No.3901、CGMCC No.3902、CGMCC No.3903。(中国科学院微生物研究所，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101保藏日期为2010年6月2日)。
根据本发明的四种异养型硝化细菌，其形态学特征分别是，紫红红球菌CGMCCNo.3890(Rhodococcus rhodochrous)菌落形态为圆形，表面粘稠，中间凸起，不透明，边缘不平整，橙红色；马红球菌CGMCC No.3901(Rhodococcus equi)菌落形态为圆形，表面粘稠，扁平，不透明，边缘平整，乳白色；产碱假单胞菌CGMCC No.3902(Pseudomonas alcaligenes)菌落形态为圆形，表面粘稠，扁平，半透明，边缘平整，黄褐色；藤黄微球菌CGMCC No.3903(Micrococcus luteus)菌落形态为圆形，表面粘稠，扁平，不透明，边缘平整，亮黄色。
根据本发明提供的异养型硝化菌复合菌剂指示剂，其包含了上述四种异养型硝化细菌之一或多种。优选紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、马红球菌(Rhodococcus equi)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)按1∶1∶1∶1的比例混合制成复合菌剂指示剂。
根据本发明提供的检测水体毒性的方法包括以下步骤：
1)扩大培养上述异养型硝化细菌；
2)将上述异养型硝化细菌固定于载体上，加入培养基，使异养型硝化细菌生长形成生物膜；
3)将上述生物膜固定于溶解氧电极，然后检测水体毒性。
根据本发明提供的方法，其中，异养型硝化菌复合菌剂经扩大培养后，固定在改进了的溶解氧电极上组成传感器，同时加入复合菌剂培养基，将此生物体系投放于待测的水体中，以KCN为毒性参照物，通过检测硝化细菌呼吸速率的变化来达到检测水体中化学成分毒性的目的。其中，投加异养型硝化菌复合菌剂和复合菌剂培养基的比例是1∶10，复合菌剂培养基的成分是：牛肉蛋白胨15g/L，NaCL 5g/L，pH 7.0。另外，还要定期补加复合菌剂培养基，使菌剂在生物系统能良好的生长并形成生物膜，该复合菌剂生物膜具有稳定毒性检测功能，从而完成对重大环境污染事件风险源识别与监控以及饮用水、污水、河流、湖泊等水体的生物毒性检测。
本发明筛选到了能有效检测毒性的微生物，其可用于重大环境污染事件风险源识别与监控技术及饮用水、污水、河流、湖泊等水体的生物毒性检测。
本法明的优势在于：
1)原位多点采样法筛选出多株微生物，克服了单点采样培养成的菌液稳定性差的难点：
2)通过大量的单因素以及正交实验，实现了菌株的选优并掌握了复合菌剂最佳的生长条件；
3)异养型硝化菌生物传感器上的成功运用解决了生物毒性检测连续在线监测的难题，实现了快速检测水体毒性，从而完成对重大环境污染事件风险源识别与监控以及对饮用水、污水、河流、湖泊等水体的生物毒性检测。
附图说明
图1本发明的流程图。
图2红球菌属F1(CGMCC No.3890)全细胞脂肪酸气相色谱分析色谱图。
图3红球菌属F4(CGMCC No.3901)全细胞脂肪酸气相色谱分析色谱图。
图4假单胞菌属Y2(CGMCC No.3902)全细胞脂肪酸气相色谱分析色谱图。
图5微球菌属Z1(CGMCC No.3903)全细胞脂肪酸气相色谱分析色谱图。
图6硝化菌传感器对不同浓度HgCl2溶液的响应。
图7硝化菌传感器对不同浓度苯酚溶液的响应。
具体实施方式
实施例1、异养型硝化细菌的筛选
1、异养型硝化细菌菌株的分离
原位多点采集异养型硝化菌样品，鱼塘8个点、小溪10个点、湖泊10个点等水体中的泥样品，在富集培养基中经过3-10天的富集培养，将富集培养的培养液在分离培养基中进行分离培养，则得到分离单菌株。再将分离得到的单菌株进行2-6次纯化分离培养，从而得到的异养型硝化菌10株。
其中，富集培养基的成分是：牛肉蛋白胨15g/L，NaCL 5g/L，pH 7.0，在25-35℃条件下培养。
分离培养基的成分是：牛肉蛋白胨15g/L，NaCL 5g/L，pH 7.0，琼脂20g/L，在25-35℃条件下培养。
2、异养型硝化细菌菌株的筛选及异养型硝化细菌复合菌剂的制备
将分离得到的异养型硝化菌单一菌10株进行逐一筛选，即将每一个单菌株进行硝化速率的测定，并鉴定硝化速率在3.4mg/(L·d)以上的菌株。硝化速率的测定方法是，将菌株分别接种在液体培养基中，35℃，黑暗培养21d，并设立零对照即不加任何细菌的培养液对照。采用纳氏试剂比色法测量培养基中氨氮的量，在420nm下测量其吸光度，按下列公式计算其硝化速率：硝化速率[mg/(L·d)]＝(零对照氨氮浓度-实验组氨氮浓度)/时间。
经过21天的培养，菌株F1、F4、Y2、Z1的硝化速率[mg/(L·d)]分别达到：3.51、3.43、3.46、3.52。四株菌按照1∶1∶1∶1的比例组合后，处理效果为3.93，组合后产生了协同增效的效果。在温度为35℃，pH值为8.5，装瓶量为20mL/250mL，投菌量25％为时，复合菌NH4 +-N的降解率最高，达到70.02％。因此在本研究中最终使用的是由上述四株菌按照1∶1∶1∶1的比例组合而成的复合菌剂检测水体毒性，即异养型硝化菌复合菌剂。
采用Sherlock微生物鉴定系统(Sherlock Microbial Identification System，SherlockMIS)对上述四株菌所筛选得到菌种进行鉴定，具体鉴定方法如下：
1)获菌用无菌接种环将待分析的微生物从培养皿中取出，放入一个干净、干燥13mm×100mm旋转培养试管底部，灼烧接种环重复上一动作，使得菌量不少于40mg。
2)皂化向旋转培养试验管中加入1.0±0.1ml的试剂1，拧紧试管的Telfon-lined盖子，在涡旋仪上震荡试管5-10秒，然后将样品试管放入95-100℃的水浴中。5分钟之后，从沸腾的水中取出试管并轻微的冷却，此时不要打开盖子，震荡试管5-10秒后再次将试管放回沸水浴中，继续加热25分钟。皂化在沸水浴中时间是30min，可根据实际需要设置两部分的加热时间。
3)甲基化向经历过上述步骤的试管中加入2.0±0.1ml的试剂2，拧紧盖子震荡液体5-10秒。于80℃水浴加热试管10min，完成水浴加热后取出冷却。
4)萃取向冷却的旋转培养试管中加入1.25±0.1ml的试剂3，盖紧盖子，将试管温和的混合旋转10min。打开管盖，利用干净的胶头滴管取出每个样品的下层似水部分丢弃。
5)基本洗涤最后向完成萃取的旋转培养试管中加入3.0±0.21ml试剂4，拧紧盖子温和旋转试管5min，静置待分层。打开每个试管的盖子，利用干净的胶头滴管吸取上层有机样到干净的GC样品小瓶。两层的液面有时会不易看见，必须小心不可取出任何似水部份(下面)部份进入自动的样品小瓶。
Sherlock Microbial Identification System为美国MIDI公司依据自20世纪60年代以来对微生物细胞脂肪酸的研究经验，开发的一套根据微生物中特定短链脂肪酸(C9-C20)的种类和含量进行鉴定和分析的软件。按照Sherlock MicrobialIdentification System的程序要求，检测任何样品必须将标准品连续进样两次，只有两次全部合格，系统才会自动运行所测样品，否则测样程序就会停止运行。
经鉴定，本发明筛选得到的菌株，分别为F1(Rhodococcus-rhodochrous)CGMCCNo.3890、F4(Rhodococcus-equi)CGMCC No.3901属于红球菌属，Y2(Pseudomonasalcaligenes)CGMCC No.3902属于假单胞菌属、Zl(Micrococcus luteus)CGMCCNo.3903属于微球菌属，其全细胞脂肪酸气相色谱分析色谱图分别是图2-5。
实施例2、使用本发明的硝化细菌检测水体毒性
1、异养型硝化菌复合菌剂的扩大培养
扩大培养实施例1筛选得到的四株菌，采用复合菌剂培养基(四株菌按照1∶1∶1∶1的比例组合)，按所需要的量进行扩大培养。
复合菌剂培养基的成分是：牛肉蛋白胨15g/L，NaCL 5g/L，pH 7.0，在25-35℃条件下培养。
2、水体中毒性的检测
将复合菌剂固定于聚乙烯醇-海藻酸钠(PVA-CA)载体上，将900mL复合菌剂7000rpm，4℃离心10min，然后加入3mL缓冲液。将聚乙烯醇(PVA)4.8g和海藻酸钠(CA)0.36g用30mL无氨水溶解，在电炉上加热，要不断搅拌。当PVA-CA混合液冷却到室温时，将混合液和细胞浓缩液等体积混合，然后倒入模具，晾干1h，把膜浸入50％w/v NaNO3和2％w/v CaCl2中，凝固1h，再把膜用无氨水洗两次。按照1∶10的比例投加复合菌剂培养基，同时，定期补加复合菌剂培养基，使菌剂在该系统能良好的生长形成生物膜，将生物膜固定在溶氧电极上，然后投入待测的水体中，检测水体中的毒性。
本实验以HgCl2和苯酚作为标准毒性物质，通过溶氧仪测定水样中氧浓度的变化分别测试不同毒性物质浓度对硝化菌硝化作用的抑制程度。用哈希HQ40d溶氧测定仪来测定由于硝化菌的呼吸而消耗的溶氧量，设定每5s自动读取并存贮DO的数值。HgCl2浓度梯度设置为0.01mmol/L、0.03mmol/L、0.05mmol/L、0.07mmol/L、0.09mmol/L。实验结果见图6。苯酚浓度梯度设置为0.003mmol/L、0.006mmol/L、0.009mmol/L、0.012mmol/L，实验结果见图7。结果表明，随着毒性物质的浓度的提高，对硝化菌的硝化作用的抑制程度增强，说明本发明提供的硝化菌测定水体毒性的方法具有可行性。

Claims (5)

1.一种异养型硝化菌复合菌剂指示剂，其特征在于，包含异养型硝化细菌紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)，其保藏编号为CGMCC No.3890；异养型硝化细菌马红球菌(Rhodococcus equi)，其保藏编号为CGMCC No.3901；异养型硝化细菌产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)，其保藏编号为CGMCC No.3902；以及异养型硝化细菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，其保藏编号为CGMCC No.3903，
其中，四种菌株的比例为1：1：1：1。
2.权利要求1所述的异养型硝化菌复合菌剂指示剂用于检测水体毒性的应用。
3.一种用于检测水体毒性的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括溶解氧电极和其上固定的异养型硝化细菌生物膜，其中，所述异养型硝化细菌为1：1：1：1比例混合的异养型硝化细菌紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)，其保藏编号为CGMCC No.3890；异养型硝化细菌马红球菌(Rhodococcus equi)，其保藏编号为CGMCC No.3901；异养型硝化细菌产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)，其保藏编号为CGMCC No.3902；以及异养型硝化细菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，其保藏编号为CGMCC No.3903。
4.一种检测水体毒性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)扩大培养1：1：1：1比例混合的异养型硝化细菌紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)，其保藏编号为CGMCC No.3890；异养型硝化细菌马红球菌(Rhodococcus equi)，其保藏编号为CGMCC No.3901；异养型硝化细菌产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)，其保藏编号为CGMCC No.3902；以及异养型硝化细菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，其保藏编号为CGMCC No.3903；
2)将上述异养型硝化细菌固定于载体上，加入培养基，使异养型硝化细菌生长形成生物膜；
3)将上述生物膜固定于溶解氧电极，然后检测水体毒性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基成分是：牛肉蛋白胨15g/L，NaCL5g/L，pH7.0。
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