WO2012096361A1 - 微生物菌体の輸送方法 - Google Patents

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microbial cells
cells
suspension
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竹内　雅人
文昭 渡辺
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ダイヤニトリックス株式会社
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    • C12Y305/05—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in nitriles (3.5.5)
    • C12Y305/05001—Nitrilase (3.5.5.1)
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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)

Definitions

  • the present invention stabilizes the nitrile hydratase activity stably by setting the gas phase inside the sealed container to 20% or less of the total volume when the microbial cells having the nitrile hydratase activity are packed and transported in the sealed container. It relates to the method of transport with keeping.
  • Enzymes produced by microorganisms are used in many situations as catalysts for chemical conversion reactions.
  • nitrile hydratase, nitrilase and the like having hydration or hydrolyzability of nitrile group, it becomes possible to inexpensively produce amide, carboxylic acid, ⁇ -hydroxy carboxylic acid and the like important in the chemical industry.
  • enzymes having optically specific hydration or optically specific hydrolysis it is possible to produce optically active carboxylic acids, amino acids, ⁇ -hydroxy carboxylic acids etc. which are important as raw materials for producing pharmaceuticals and agrochemicals. Become.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-305066 discloses a method of preserving microbial cells by the addition of a stabilizer such as nitriles, amides, carboxylic acids and the like
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-295815 discloses a method of preserving microbial cells by the addition of a metabolic inhibitor such as an azide compound
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-149065 discloses a culture solution component of microbial cells. A method of preserving microbial cells by adding to a suspension is disclosed.
  • Patent Document 4 Japanese Patent No.
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-219870
  • Patent Document 6 Japanese Patent Application Laid-open No. 2003-144144
  • the method using an additive such as a stabilizer is likely to affect the quality of the product because it is necessary to separate the additive etc in a later step. Furthermore, the manufacturing method becomes complicated.
  • the suspension of the microbial cells stored by the method of freezing the cells has problems in handling such as freezing and thawing operations are complicated, and the enzyme activity is lost along with the operation, There is a risk of decline.
  • storage by refrigeration is preferable from the viewpoint of preventing growth of various bacteria and stabilization of bacterial cells, equipment and power for maintaining a low temperature are required, and the burden on cooling cost is large.
  • the present inventors found that the gas phase inside the container used for transportation is 20 It has been found that by setting the percentage or less to stably store and transport the cells having the nitrile hydratase activity, the present invention has been completed.
  • the present invention is a method of storing microbial cells having nitrile hydratase activity in a sealable container, wherein the gas phase in the container filled with the suspension containing the microbial cells is The above method is characterized in that 2% or more and 20% or less of the total volume inside the container. Further, the present invention is a method of transporting a microbial cell having nitrile hydratase activity using a sealable container, wherein a gas phase portion in the container filled with a suspension containing the microbial cell is contained. Is 2% or more and 20% or less of the total volume inside the container. In the method of the present invention, the proportion of the gas phase part in the container is preferably 5% or more and 20% or less. Further, the storage or transport temperature is, for example, a temperature of freezing point to 35 ° C. Furthermore, the dispersion medium of the cell suspension is an organic acid aqueous solution, and examples of the organic acid include acrylic acid.
  • the present invention by filling the cell suspension so that the gas phase inside the container is 2% or more and 20% or less, a large amount of cells can be treated with nitrile hydratase etc. without stirring at room temperature. Can be stored and transported while maintaining the enzyme activity of Furthermore, according to the present invention, the labor and cooling costs required for conventional storage methods can be significantly reduced, and an industrially satisfactory method for preserving microbial cells is provided.
  • the present invention relates to a method of storing microbial cells having nitrile hydratase activity in a sealable container, and a method of transporting microbial cells using a sealable container.
  • the suspension containing the microbial cells is filled so that the gas phase in the container is 2% or more and 20% or less of the total volume in the container.
  • the microbial cells having nitrile hydratase activity have the property of producing the desired enzyme catalyst and accumulating in the cells or secreting them out of the cells.
  • the microorganisms include microorganisms isolated from nature and genetically modified microorganisms. Representative examples of such microorganisms include, for example, Rhodococcus having the nitrile hydratase activity, Gordona, Pseudomonas, Pseudomonas, Pseudonocardia, Geobacillus, and the like. Microbial cells to which it belongs can be mentioned. Furthermore, recombinant microbial cells into which the nitrile hydratase gene of these microorganisms has been introduced can be mentioned.
  • Rhodococcus As a specific example of the Rhodococcus genus microorganism, Rhodococcus rhodochrous J-1 strain (Rhodococcus rhodochrous J-1) described in Japanese Examined Patent Publication No. 6-55148 can be mentioned.
  • the relevant strain is designated as the accession number “FERM BP-1478” on September 18, 1987, at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary Center (1-1-1 Tsukuba East, Ibaraki Pref. Central No. 6 The same applies in the description)).
  • the nitrile hydratase refers to an enzyme having the ability to hydrolyze a nitrile compound to form a corresponding amide compound.
  • Examples of the nucleic acid encoding nitrile hydrolase and the sequence thereof include those described in Patent Document 2 mentioned above.
  • Such nucleic acids can be introduced into microbial cells by conventional molecular biological techniques (see below for these molecular techniques: Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • a "sealable container” is a container that can be sealed after being filled with a microbial suspension for transportation and / or storage.
  • the container may be in any form as long as the container does not move its contents inside and outside the container during transportation, but for industrial purposes, drums, containers, tank trucks, etc. are used.
  • the volume of the container is not particularly limited, but 200 L is preferable for use for industrial purposes.
  • the material of the container is also not particularly limited, but for industrial purposes, plastic containers such as polyethylene and polypropylene and metal containers such as iron and stainless steel are preferable.
  • the container used in the present invention is referred to as a "sealed container".
  • the proportion of the gas phase inside the container is 2% or more and 20% or less. In “2% or more and 20% or less", the ratio of the volume of the gas phase portion in which no bacterial fluid is present in the container is 2% or more and 20% or less of the total volume when the closed container is allowed to stand.
  • Point to The gas composition of the gas phase part is not particularly limited, but air is generally introduced for industrial reasons. Also, the gas phase part is usually the upper part in the container.
  • the gas phase part is 20% or less of the container volume.
  • the gas phase inside the sealed container during transportation can be 2 to 20%, 3 to 20%, 4 to 20%, 5 to 20%, etc. with respect to the container volume, and more preferably 3 to It is 15%, more preferably 4 to 10%.
  • preserving means filling the cell suspension in a closed container and then sealing and leaving it to stand.
  • leaving in storage before actual use after transportation is also included in “storage”.
  • the storage period is the time from filling the suspension to the start of transportation (storage 1), and the time from the end of transportation to the start of on-site use (storage 2).
  • storage 1 is 1 hour to 180 days
  • storage 2 is 1 hour to 180 days, but the invention is not limited to these periods.
  • transport means moving the cell suspension using a closed container. In general, trucks, forklifts, tank lorries, and vessels are loaded with moving containers.
  • the temperature during storage and transport is more preferably low temperature to suppress rot and degradation of bacterial cells and enzymes.
  • the reaction is carried out at an freezing point to 35 ° C., preferably at an freezing point to 30 ° C., more preferably at an freezing point to 20 ° C., still more preferably at an freezing point to 10 ° C.
  • the "freezing point” means the equilibrium temperature between the solid state and the liquid state of the cell suspension, and is a temperature which changes depending on the composition of the suspension and the pressure in the storage container.
  • the nitrile hydratase activity is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more, most preferably 90% or more before the start of transport. It remains 100%.
  • the residual rate of the nitrile hydratase activity can be measured by any method known in the art, for example, by comparing the reaction rate of acrylamide formation to the substrate (eg, acrylonitrile) before the start of storage and after the storage, etc. It is possible to measure.
  • the dispersion medium of the suspension means a solution used for suspending the microbial cells to be stored.
  • the dispersion medium is preferably an organic acid aqueous solution.
  • concentration of the organic acid in the organic acid aqueous solution is arbitrary, but if it is too low, the enzyme activity will be reduced, while if it is too high, the work becomes complicated when removing it in a later step. It is preferable that it is 100 mmol / L.
  • the composition of the immersion liquid is not particularly limited as long as it is an organic acid aqueous solution which does not inhibit the enzyme activity.
  • the organic acid include acrylic acid, formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, oxalic acid and carboxylic acid. Among them, acrylic acid is preferable in terms of maintaining the quality of acrylamide.
  • the microbial cells having nitrile hydratase activity may be concentrated by any concentration method known in the art, but is preferably concentrated by membrane separation or centrifugation Ru.
  • concentration is carried out by membrane separation, it is preferable to use a membrane having a pore size of 0.02 to 0.45 ⁇ m.
  • Such membranes are commercially available and include, for example, hollow fiber membrane modules (Kuraray, pore diameter 0.05 ⁇ m, surface area 39000 m 2 ) and the like.
  • a separation plate type continuous centrifuge it is preferable to use a separation plate type continuous centrifuge.
  • bacterial cell suspension 115 mL of the bacterial cell suspension (Example 1) and 70 mL (Comparative Example 1) prepared by the above method were put in a polyethylene container with a total volume of 120 mL and sealed, and 30 as a transportation model. Shake at 120 rpm for 3 weeks. Further, 190 L of the bacterial cell suspension (Example 2) prepared by the above method was put in a polyethylene drum having a volume of 200 L, sealed, and allowed to stand at room temperature for 3 months.
  • Nitrile Hydratase activity is determined by using the bacterial cell suspension immediately after preparation according to the above method and those which have been shaken or allowed to stand for 3 weeks after preparation. It was calculated from the reaction rate of acrylamide formation by the body. The reaction is started by adding an aqueous solution of acrylonitrile as a substrate to the cell suspension, shaken at 10 ° C. for 10 minutes, and then the reaction is stopped by filtration separation of cells and addition of phosphoric acid, gas chromatography (GC -14B, analyzed by Shimadzu Corporation).
  • GC -14B gas chromatography
  • the analysis conditions were using a 1 m glass column packed with Porapack PS (Waters), a column temperature of 210 ° C., and a detector of 230 ° C. FID.
  • the relative reaction rates are shown in Table 1 below assuming that the reaction rate at day 0 is 1.
  • Example 3 Preparation of a transformant having a nitrile hydratase derived from Rhodococcus rhodochrous strain M8
  • M8 strain M8 strain (SU1731814) is a strain of Russian strain center IBFM (VKPM S-). 926).
  • the M8 strain was shake cultured at 30 ° C. for 72 hours in 100 mL of MYK (0.5% polypeptone, 0.3% bacto yeast extract, 0.3% bactomolt extract, 0.2% K2 HPO4, 0.2% KH2 PO4) medium (pH 7.0).
  • the culture solution was centrifuged, and the collected cells were suspended in 4 mL of Saline-EDTA solution (0.1 M EDTA, 0.15 M NaCl (pH 8.0)). After 8 mg of lysozyme was added to the suspension and shaken at 37 ° C. for 1 to 2 hours, it was frozen at -20 ° C. Next, 10 mL of Tris-SDS solution (1% SDS, 0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-HCl (pH 9.0)) was added to the suspension while gently shaking. Further, proteinase K (Merck) (final concentration 0.1 mg) was added to the suspension and shaken at 37 ° C. for 1 hour.
  • Tris-SDS solution 1% SDS, 0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-HCl (pH 9.0)
  • TE-saturated phenol was added and stirred (TE: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)) and centrifuged. The upper layer was collected, 2 volumes of ethanol were added, and the DNA was wound up with a glass rod. Thereafter, it was sequentially centrifuged with 90%, 80% and 70% ethanol to remove phenol.
  • the DNA was dissolved in 3 mL of TE buffer, ribonuclease A solution (heated at 100 ° C. for 15 minutes) was added to 10 ⁇ g / mL and shaken at 37 ° C. for 30 minutes. Furthermore, proteinase K (Merck) was added and shaken at 37 ° C.
  • nitrile hydratase gene from M8 strain chromosomal DNA using PCR
  • the nitrile hydratase derived from M8 strain is non-patent document (Veiko, VP et al, Cloning, nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8, Biotekhnologia ( Mosc.) 5, 3-5 (1995)), and the nucleotide and amino acid sequences of the ⁇ subunit, ⁇ subunit and activator are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, SEQ ID NOs: 3 and 4, and sequences, respectively. It shows to the numbers 5 and 6.
  • reaction solution is 0.7% agarose gel (Agarose I manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd .; agarose concentration 0.7% by weight)
  • the mixture was subjected to electrophoresis to detect a 1.6 kb amplified fragment.
  • the reaction mixture was purified using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up Syste (Promega Corp.).
  • the recovered PCR product was ligated to a vector (pUC118 / HincII site) using Ligation Kit (Takara Shuzo), and competent cells of E. coli JM109 were transformed with the reaction solution.
  • the obtained plasmid DNA is digested with restriction enzymes XbaI and Sse8387I and electrophoresed on a 0.7% agarose gel to recover a nitrile hydratase gene fragment (1.6 kb) and introduce it into the XbaI-Sse8387I site of plasmid pSJ042. did.
  • the resulting plasmid was named pSJ-N01A.
  • pSJ042 was prepared by the method shown in JP 2008-154552 A as a plasmid that expresses the J1 strain nitrile hydratase in Rhodococcus bacteria, and pSJ023 used for preparation of pSJ042 is a transformant ATCC 12674 / pSJ023 ( FERM BP-6232) has been deposited on March 4, 1997 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • Rhodococcus rhodochrous strain ATCC 12674 (hereinafter referred to as ATCC 12674 strain) is cultured in MYK medium to the early log phase growth stage, cells are collected by a centrifugal separator, and ice cold sterile water The cells were washed 3 times and suspended in sterile water to prepare competent cells.
  • Rhodococcus genus recombinant strain ATCC 12674 / pSJ-N01A having nitrile hydratase derived from the M8 strain.
  • the obtained recombinant bacteria were aerobically cultured in a medium (pH 7.0) containing 2% by mass of glucose, 1% by mass of urea, 0.5% by mass of peptone, 0.3% of yeast extract and 0.05% by mass of cobalt chloride. Cultured.
  • Example 3 Storage of bacterial cell suspension 100 mL of the bacterial cell suspension (Example 3) and 80 mL (Comparative Example 2) prepared by the above method were put in a polyethylene container with a total volume of 120 mL and sealed, and 30 ° C., 120 rpm Shake for 3 weeks.
  • nitrile hydratase activity was measured in the same manner as in Example 1 using the cell suspension immediately after preparation according to the above method and those shaken for 7 days and 21 days after preparation. did.
  • the relative reaction rates are shown in Table 2 below, where the reaction rate at day 0 is 1.
  • Example 4 Culture Pseudomonas marginalis DSM 16275 strain (Pseudomonas marginalis DSM 16275) having nitrile hydratase activity, glycerol 0.2% by mass, citric acid 0.05% by mass, yeast extract 0.15%, potassium dihydrogenphosphate 0.3% by mass A medium containing 0.7% by mass of dipotassium hydrogen phosphate, 0.0004% by mass of iron sulfate, 0.01% by mass of manganese sulfate, 1.25% by mass of methyl urea, and 0.001% by mass of cobalt hydrochloride (pH 7.0) Cultured aerobically.
  • Example 4 100 mL (Example 4) and 80 mL (Comparative Example 3) of the bacterial cell suspension prepared by the above method were put into a polyethylene container having a total volume of 120 mL and sealed, and shaken at 30 ° C. and 120 rpm for 1 week.
  • Nitrile Hydratase activity was measured in the same manner as in Example 1 using the cell suspension immediately after preparation according to the above method and those shaken for 7 days after preparation. The relative reaction rates are shown in Table 3 below assuming that the reaction rate at day 0 is 1.
  • the present invention provides an industrially satisfactory method for preserving microbial cells. According to the present invention, it is possible to store and transport a large amount of cells at room temperature without stirring and maintaining enzyme activity such as nitrile hydratase, etc., and the labor and effort required by conventional storage methods and The method of the present invention is extremely useful because the cost of cooling can be significantly reduced.
  • Rhodococcus rhodochros J-1 strain (Rhodococcus rhodochrous J-1): Accession No. “FERM BP-1478”, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary on September 18, 1987 (Ibaraki prefecture Tsukuba East 1 -1-1 Central Deposit No. 6).
  • Pseudomonas marginalis DSM 16 275 (Pseudomonas marginalis DSM 16 275): Accession No. “DSM 16275”, deposited on March 4, 2004 in Deutsche Zammulunk von Microorganismen und Zellkle Turen Geembecher (DSMZ).
  • Sequence number 7 Synthetic DNA Sequence number 8: Synthetic DNA

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Abstract

　ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を密閉可能な容器内に保存する方法、及び該容器を用いて輸送する方法であって、前記微生物菌体を含む懸濁液が充填された前記容器内の気相部を容器内部の全容積の２％以上２０％以下とすることを特徴とする前記方法。

Description

微生物菌体の輸送方法
　本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を密閉容器に充填し輸送する際に、密閉容器内部の気相部を全容積の20%以下とすることにより、ニトリルヒドラターゼ活性を安定に保持したまま輸送する方法に関する。
　微生物の産生する酵素は、化学変換反応の触媒として多くの場面で使用されている。とりわけ、ニトリル基の水和又は加水分解能を有するニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ等を利用することにより、化学工業上重要なアミド、カルボン酸、α-ヒドロキシカルボン酸等を安価に製造することが可能になる。更に、光学特異的水和又は光学特異的加水分解能を持つ上記酵素を利用することにより、医薬、農薬の製造原料として重要な光学活性カルボン酸、アミノ酸、α-ヒドロキシカルボン酸等の製造も可能になる。
　微生物酵素を触媒とする化学変換反応においては、培養及び集菌した微生物菌体の酵素の活性を使用時まで安定に維持しておく必要がある。すなわち、保管または輸送時に雑菌が混入して、腐敗し、あるいは溶菌することで、微生物酵素の触媒能が失われたり、低下したりしないように酵素の活性を維持しなければならない。そこで一般的には、安定剤、代謝阻害剤、高濃度塩類の存在下で保存することにより微生物菌体保存時の微生物酵素の失活や腐敗、溶菌を抑制し、化学変換反応に使用している。上記安定剤等を添加しない場合には、凍結や冷蔵、或いは通期撹拌により酵素の活性を維持しながら保管または輸送する。
　特許文献１（特開２００４-３０５０６６号公報）には、ニトリル類、アミド類、カルボン酸類等の安定剤の添加による微生物菌体の保存方法が開示され、特許文献２（特開２００５-２９５８１５号公報）には、アジ化化合物等の代謝阻害剤の添加による微生物菌体の保存方法が開示され、特許文献３（特開２００１-１４９０６５号公報）には、微生物菌体の培養液成分を懸濁液に添加することによる微生物菌体の保存方法が開示されている。また、特許文献４（特許第３１６３２２４号）には高濃度の無機塩類の添加による保存方法が開示されている。更に、凍結により保存する方法については、特許文献５（特開２００３-２１９８７０号公報）が知られており、通気撹拌により保存する方法については、特許文献６（特開２００３-１４４１４４号公報）が知られている。
特開２００４-３０５０６６号公報 特開２００５-２９５８１５号公報 特開２００１-１４９０６５号公報 特許第３１６３２２４号 特開２００３-２１９８７０号公報 特開２００３-１４４１４４号公報
　これまでに知られている保存方法のうち、安定剤等の添加剤を使用する方法は、後の工程で添加剤等を分離する必要があるため、製品の品質に影響を与える恐れがあり、更に製造方法が煩雑になる。菌体を凍結させる方法で保存された微生物菌体の懸濁液は、凍結、融解操作が煩雑であるなど、その取り扱い性に問題があり、またその操作に伴って酵素活性が失われたり、低下したりする恐れがある。また冷蔵による保存では、雑菌の増殖防止と菌体細胞の安定化の観点から好ましいが、低温を保つ設備や電力が必要になり、冷却コスト面での負担が大きい。微生物菌体を高濃度の無機塩類水溶液中に保存する方法では、使用時に菌体を十分に洗浄する必要があり、添加する無機塩類や廃水処理にコストが掛かるというデメリットがある。通気撹拌等により微生物菌体の酵素活性がある程度維持されることも報告されているが、酵素によりその効果は一様ではなく、また通気及び撹拌に動力を必要としコスト面での負担も大きい。そこで、従来技術に加えて、さらに安定的はニトリルヒドラターゼ活性を有した菌体の保存方法が望まれる。
　本発明者らは、培養、集菌して得られた微生物菌体の懸濁液を、安価でしかも安定的に輸送する条件について鋭意検討した結果、輸送に使用する容器内部の気相を２０％以下とすることで安定的にニトリルヒドラターゼ活性を有した菌体の保存及び輸送ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を密閉可能な容器内に保存する方法であって、前記微生物菌体を含む懸濁液が充填された前記容器内の気相部を容器内部の全容積の２％以上２０％以下とすることを特徴とする前記方法である。
  また、本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を密閉可能な容器を用いて輸送する方法であって、前記微生物菌体を含む懸濁液が充填された前記容器内の気相部を容器内部の全容積の２％以上２０％以下とすることを特徴とする前記方法である。
　本発明の方法において、前記容器内の気相部の割合は、５％以上２０％以下とすることが好ましい。また、前記保存又は輸送温度は、例えば氷点～35℃の温度である。さらに、前記菌体懸濁液の分散媒は、有機酸水溶液であり、有機酸としては例えばアクリル酸が挙げられる。
　本発明によれば、容器内部の気相部を２％以上２０％以下となるように菌体懸濁液を充填することにより、多量の菌体を、室温下、無撹拌でもニトリルヒドラターゼ等の酵素活性を維持したまま保存及び輸送することが可能となる。更に、本発明によれば、従来の保存方法で必要とされてきた労力や冷却コストを大幅に削減することができ、工業的に満足し得る微生物菌体の保存方法が提供される。
  本発明は、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を密閉可能な容器内に保存する方法、及び微生物菌体を密閉可能な容器を用いて輸送する方法に関する。本発明の方法は、前記微生物菌体を含む懸濁液を、容器内の気相部が容器内部の全容積の２％以上２０％以下となるように充填するものである。
  なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、2011年1月14日に出願し、本願優先権主張の基礎となる特願2011-005780号(JP2011-005780)の特許請求の範囲、明細書、図面および要約書の開示内容は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
　本発明においてニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体は、目的とする酵素触媒を生産し菌体内に蓄積又は菌体外に分泌する性質を有するものである。この微生物には自然界より単離された微生物及び遺伝子組換え微生物が含まれる。このような微生物の代表例としては、例えば、ニトリルヒドラターゼ活性を持つロドコッカス（Rhodococcus）属、ゴルドナ（Gordona）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュードノカルディア（Pseudonocardia）属、ジオバチルス（Geobacillus）属に属する微生物菌体が挙げられる。更に、これらの微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え微生物菌体が挙げられる。中でも工業的には、ロドコッカス属、ゴルドナ属並びにこれらの微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した組換え大腸菌及び組換えロドコッカス属細菌が好ましい。例えば、ロドコッカス属の微生物の具体例としては、特公平６-５５１４８号公報に記載されるロドコッカス・ロドクロスＪ-１株（Rhodococcus rhodochrous J-1）が挙げられる。当該株は、受託番号「ＦＥＲＭ　ＢＰ－１４７８」として、１９８７年９月１８日
に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１－１－１ 中央第６（以下、本明細書において同様））に寄託されている。
　ニトリルヒドラターゼとは、ニトリル化合物を加水分解して、対応するアミド化合物を生成する能力を持つ酵素をいうものである。ニトリルヒドラーゼをコードする核酸及びその配列の例としては、前記特許文献２に記載されるものが挙げられる。このような核酸は、通常の分子生物学的手法によって、微生物細胞内に導入可能である（これらの分子学的手法については、以下を参照：Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
　本発明において、「密閉可能な容器」とは、輸送及び/又は保存に供するために微生物懸濁液を充填した後に密閉できる容器である。輸送時に容器内外で内容物の移動が行われない容器であれば、如何なる形態のものでも構わないが、工業的目的に供するためには、ドラム缶、コンテナ、タンクローリー車等が使われる。本容器の容量は、特に限定されないが、工業的目的に供するためには、２００Ｌのものが好ましい。容器の材質も特に限定されないが、工業的目的に供するためには、ポリエチレン、ポリプロピレンなどプラスチック容器や、鉄・ステンレスなど金属製の容器が好ましい。以下、本発明において使用する容器を「密閉容器」という。
　本発明において、容器内部の気相部の割合は２％以上２０％以下とする。「２％以上２０％以下」とは、密閉容器を静置した状態で該容器中の菌体液の存在していない気相部の容積の割合が、全容積の２％以上２０％以下であることを指す。本気相部のガス組成は特に限定されないが、工業的な理由から空気が入ることが一般的である。また、気相部は、通常は容器内の上部である。
　通常、密閉容器で液体を保存又は運搬する場合、状況に応じて液体の充填率を自由に設定するが、本発明においては、気相部が容器容積に対して２０％以下である。但し、２％を下回ると、内容物の温度変化による膨張・収縮が起こる際、容器の変形を引き起こすおそれがある。従って、輸送時の密閉容器内部の気相部は、容器容積に対して２～２０％、３～２０％、４～２０％、５～２０％などとすることができ、より好ましくは３～１５％、さらに好ましくは４～１０％である。
　本発明において、「保存」とは、菌体懸濁液を密閉容器内に充填した後に密閉し、静置しておくことをいう。また、輸送後に実際に使用されるまでに静置しておくことも「保存」に含まれる。保存期間は、懸濁液を充填してから輸送開始までの時間（保存１）、及び輸送終了から現場での使用開始までの時間（保存２）である。例えば保存１の場合は１時間～１８０日であり、保存２の場合は１時間～１８０日であるが、これらの期間に限定されるものではない。また、本発明において、「輸送」とは、密閉容器を用いて菌体懸濁液を移動することを意味する。一般的には、トラックやフォークリフト、タンクローリー、船に密閉容器を積載して移動する。
　保存中及び輸送中の温度に関しては、菌体及び酵素の腐敗・分解を抑制するため低温であることがより好ましい。具体的には氷点～35℃、好ましくは氷点～30℃、より好ましくは氷点～20℃、さらに好ましくは氷点～10℃で行われる。ここで、「氷点」とは、菌体懸濁液の固体状態と液体状態の平衡温度を意味し、懸濁液の組成や保存容器内の圧力によって変化する温度である。
　本発明に於いては、前記保存期間の後にニトリルヒドラターゼ活性が輸送開始前の９０%以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは、９８％以上、更に好ましくは、９９％以上、最も好ましくは１００％残存する。ニトリルヒドラターゼ活性の残存率は、当該技術分野で公知のいずれかの方法により測定できるが、例えば、保存開始前と保存後の基質（例えば、アクリロニトリル）に対するアクリルアミド生成反応速度を比較すること等により測定することが可能である。
　本発明において、懸濁液の分散媒とは、保存対象となる微生物菌体の懸濁に使用する溶液を意味する。該分散媒は、好ましくは、有機酸水溶液である。当該有機酸水溶液の有機酸の濃度は任意であるが、低過ぎると酵素活性の低下を招き、一方で、高過ぎると後の工程でこれを除去する際に作業が煩雑になるため、１０～１００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
　本発明に於いて浸漬液の組成は、酵素活性を阻害しない有機酸水溶液であれば特に限定されない。有機酸としては、例えば、アクリル酸、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、シュウ酸、カルボン酸が挙げられ、中でもアクリルアミドの品質を維持する点で、アクリル酸が好ましい。
　本発明の懸濁液の調製では、ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体は、当該技術分野で公知のいずれの濃縮方法で濃縮してもよいが、好ましくは、膜分離又は遠心分離によって濃縮される。濃縮を膜分離で行う場合、０.０２～０.４５μmの孔径を有する膜を用いることが好ましい。このような膜は、市販されており、例えば、中空糸膜モジュール（クラレ社、細孔径０.０５μm、表面積３９０００m２）等が挙げられる。また、濃縮を遠心分離で行う場合、分離板型連続遠心分離機を用いることが好ましい。
　以下、実施例により本発明の実施方法を更に詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、本発明を限定するものではない。以下の実施例及び比較例に於ける%表示は特に記載のない限り、質量%である。
実施例１および２、比較例１
培養
　ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス・ロドクロスＪ－１株（Rhodococcus rhodochrous J-1：FERM BP-1478）をグルコース２質量％、尿素１質量％、ペプトン０．５質量質量％、酵母エキス０．３％、塩化コバルト０．０５質量％を含む培地（ｐＨ７．０）により好気的に培養した。
保存用菌体懸濁液の調製
　培養後の微生物菌体を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）により回収後、０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）で洗浄した。洗浄した菌体に上記水溶液を添加し菌体懸濁液(乾燥菌体換算１０質量％)を得た。
菌体懸濁液の保存
　上記の方法で調製した菌体懸濁液１１５mL（実施例１）および７０mL（比較例１）を総容積１２０mLのポリエチレン製容器に入れて密封し、輸送のモデルとして３０℃、１２０ｒｐｍで３週間振盪した。また、上記の方法で調製した菌体懸濁液１９０L（実施例２）を容積２００Lのポリエチレン製ドラムに入れて密封し、室温で３カ月間静置した。
ニトリルヒドラターゼ活性の測定
　ニトリルヒドラターゼ活性は、上記の方法で調製した直後の菌体懸濁液と、調製後３週間振盪または静置したものを用いて、これらの懸濁液に含まれる菌体によるアクリルアミド生成反応速度から算出した。基質であるアクリロニトリルの水溶液を菌体懸濁液に添加することで反応を開始し、１０℃で１０分間振盪した後、菌体の濾過分離とリン酸添加により反応を停止させ、ガスクロマトグラフィ（GC-14B、島津製作所）で分析した。分析条件は、Ｐｏｒａｐａｃｋ　ＰＳ（ウォーターズ社）を充填した１ｍガラスカラムを用い、カラム温度２１０℃、検出器は２３０℃のＦＩＤを使用した。以下、０日に於ける反応速度を１とした相対反応速度を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例３、比較例２
ロドコッカス ロドクロウス M8株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
（１）ロドコッカス ロドクロウス M8株（以下、Ｍ８株という。）からの染色体ＤＮＡ調製
  Ｍ８株(SU1731814)は、ロシア菌株センターIBFM（VKPM S-926）から入手することができる。
  Ｍ８株を100mLのMYK（0.5％ ポリペプトン、0.3％ バクトイーストエキス、0.3％バクトモルトエキス、0.2％K2HPO4、0.2％ KH2PO4）培地(pH7.0)中、30℃にて７２時間振盪培養した。培養液を遠心分離し、集菌した菌体をSaline-EDTA溶液（0.1M EDTA、0.15M NaCl(pH8.0)）4mLに懸濁した。懸濁液にリゾチーム8mgを加えて37℃で1～2時間振盪した後、－20℃で凍結した。
  次に、当該懸濁液に10mLのTris-SDS液（１％SDS、0.1M NaCl、0.1M Tris-HCl(pH9.0)）を穏やかに振盪しながら加えた。さらに、当該懸濁液にプロテイナーゼＫ（メルク社）（終濃度0.1mg）を加え37℃で１時間振盪した。次に、等量のＴＥ飽和フェノールを加え攪拌後（TE：10mM Tris-HCl、1mM EDTA(pH8.0)）遠心した。上層を採取し、2倍量のエタノールを加えて、ガラス棒でDNAを巻きとった。その後、これを順次90％、80％、70％のエタノールで遠心分離しフェノールを取り除いた。
  次に、DNAを3mLのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（100℃、15分間の加熱処理済）を10μg/mLになるよう加え37℃で30分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫ（メルク社）を加え37℃で30分間振盪した。これに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。
  上層をさらに等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心分離後、上層と下層に分離した。この操作を再度繰り返した。その後、上層に同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加えて遠心分離し、上層を回収した。次いで、上層に２倍量のエタノールを加えガラス棒でDNAを巻きとって回収し、染色体DNAを得た。
（２）ＰＣＲを用いたＭ８株染色体ＤＮＡからのニトリルヒドラターゼ遺伝子の調製
Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼは非特許文献（Veiko,V.P.et al, Cloning,nucleotide sequence of nitrile hydratase gene from Rhodococcus rhodochrous M8, Biotekhnologiia (Mosc.) 5, 3-5 (1995)）に記載されており、βサブユニット、αサブユニット、アクチベーターの塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び２、配列番号３及び４、並びに配列番号５及び６に示す。配列情報に基づいて、配列表の配列番号７及び８記載のプライマーを合成し、（１）にて調製した染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
 
＜PCR反応溶液組成＞
鋳型DNA（染色体DNA） 200ng
PrimeSTAR Max Premix（宝酒造社製） 25μl
プライマーM8-1  10pmol
プライマーM8-2   10pmol
＜プライマー＞
M8-1： GGTCTAGAATGGATGGTATCCACGACACAGGC（配列番号７）
M8-2：cccctgcaggtcagtcgatgatggccatcgattc （配列番号８）
＜反応条件＞
（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃で30秒）×30サイクル
  PCR終了後、反応液5μlを0.7％アガロースゲル（同仁化学社製アガロースＩ使用；アガロース濃度０．７重量％）電気泳動に供し、1.6kbの増幅断片の検出を行った。反応終了液をＷｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅ(プロメガ株式会社)を用いて精製した。
  回収したPCR産物はLigation Kit(宝酒造)を用いてベクター（pUC118/HincII部位）に連結し、反応液により大腸菌JM109のコンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体コロニーより数クローンをLB-Amp培地1.5mLに接種し、37℃で12時間振盪培養した。培養後、この培養物を遠心分離により集菌した。QIAprep Spin Miniprep Kit (アマシャムバイオサイエンス社)を用いることにより、集菌した菌体からプラスミドDNAを抽出した。得られたプラスミドDNAに対し、シークエンシングキットとオートシークエンサーCEQ 8000
（ベックマンコールター社）を用いて、ニトリルヒドラターゼの塩基配列を確認した。
  次に、得られたプラスミドDNAを制限酵素XbaIとSse8387Iで切断後、0.7％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ニトリルヒドラターゼ遺伝子断片（1.6kb）を回収し、プラスミドpSJ042のXbaI-Sse8387Iサイトに導入した。
  得られたプラスミドをpSJ-N01Aと命名した。
  尚、ｐSJ042はロドコッカス菌においてＪ１株ニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドとして特開２００８－１５４５５２号公報に示す方法で作製されたものであり、ｐＳＪ０４２の作製に使用したpSJ023は形質転換体ATCC12674/pSJ023（FERM BP-6232）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に平成9年3月4日付けで寄託されている。
（３）コンピテントセルの作製
　ロドコッカス・ロドクロウスATCC 12674株（以下、ATCC 12674株）をMYK培地で対数増殖期前期まで培養し、細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁し、コンピテントセルを作製した。
（４）Ｍ８株由来ニトリルヒドラターゼを有する形質転換体の作製
得られたプラスミドpSJ-N01A0.1μgとATCC12674株のコンピテントセルの菌体懸濁液各20μｌとを混合し、各々氷冷した。キュベットに各混合液を入れ、遺伝子導入装置 Gene Pulser（BIO RAD）により20 KV/cm、200 OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下10分静置し、37℃で10分間ヒートショックを行った。その後、キュベットにMYK培地500μlを加え、30 ℃、5時間静置した後、50μg/mLカナマイシン入りMYK寒天培地に塗布し、30℃、3日間培養した。
  得られた形質転換体コロニーに含まれるプラスミドDNAを確認し、この組換え菌をＭ８株由来ニトリルヒドラターゼを有するロドコッカス属組換え菌（ATCC12674／pSJ-N01A）とした。
培養
　得られた組み換え菌をグルコース２質量％、尿素１質量％、ペプトン０．５質量質量％、酵母エキス０．３％、塩化コバルト０．０５質量％を含む培地（ｐＨ７．０）により好気的に培養した。
保存用菌体懸濁液の調製
　培養後の微生物菌体を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）により回収後、０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）で洗浄した。洗浄した菌体に上記水溶液を添加し菌体懸濁液(乾燥菌体換算１０質量％)を得た。
菌体懸濁液の保存
　上記の方法で調製した菌体懸濁液１００mL（実施例３）および８０mL（比較例２）を総容積１２０mLのポリエチレン製容器に入れて密封し、３０℃、１２０ｒｐｍで３週間振盪した。
ニトリルヒドラターゼ活性の測定
　ニトリルヒドラターゼ活性は、上記の方法で調製した直後の菌体懸濁液と、調製後７日間および２１日間振盪したものを用いて、実施例１と同様の方法で測定した。以下、０日に於ける反応速度を１とした相対反応速度を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例４、比較例３
培養
　ニトリルヒドラターゼ活性を有するシュードモナス・マージナリスＤＳＭ１６２７５株（Pseudomonas marginalis DSM16275）をグリセロール０．２質量％、クエン酸０．０５質量％、酵母エキス０．１５％、リン酸二水素カリウム０．３質量％、リン酸水素二カリウム０．７質量％、硫酸鉄０．０００４質量％、硫酸マンガン０．０１質量％、メチル尿素１．２５質量％、塩酸コバルト０．００１質量％を含む培地（ｐＨ７．０）により好気的に培養した。
保存用菌体懸濁液の調製
　培養後の微生物菌体を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、２０分）により回収後、０．１％アクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）で洗浄した。洗浄した菌体に上記水溶液を添加し菌体懸濁液(乾燥菌体換算１０質量％)を得た。
　上記の方法で調製した菌体懸濁液１００mL（実施例４）および８０mL（比較例３）を総容積１２０mLのポリエチレン製容器に入れて密封し、３０℃、１２０ｒｐｍで１週間振盪した。
ニトリルヒドラターゼ活性の測定
　ニトリルヒドラターゼ活性は、上記の方法で調製した直後の菌体懸濁液と、調製後７日間振盪したものを用いて、実施例１と同様の方法で測定した。以下、０日に於ける反応速度を１とした相対反応速度を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　上記実施例１、２、３及び４の結果から、本発明の輸送方法を用いてニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を輸送した場合には、微生物菌体がニトリルヒドラターゼ活性を保存前と同程度に維持した状態で保存されることが示される。
　本発明により、工業的に満足し得る微生物菌体の保存方法が提供される。本発明によれば、多量の菌体を、室温下、無撹拌でもニトリルヒドラターゼ等の酵素活性を維持したまま保存及び輸送することが可能となり、従来の保存方法で必要とされてきた労力や冷却コストを大幅に削減することができるため、本発明の方法は極めて有用である。
　ロドコッカス・ロドクロスＪ-１株（Rhodococcus rhodochrous J-1）：受託番号「ＦＥＲＭ　ＢＰ－１４７８」として、１９８７年９月１８日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１－１－１ 中央第６）に寄託されている。
　シュードモナス・マージナリスＤＳＭ１６２７５株（Pseudomonas marginalis DSM16275）：受託番号「DSM16275」として、2004年3月4日にドイチェ ザンムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクル　トゥレン ゲーエムベーハー（DSMZ）に寄託されている。
配列番号７：合成DNA
配列番号８：合成DNA
[規則26に基づく補充 20.02.2012]　
Figure WO-DOC-RO134

Claims (6)

  1. 　ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を密閉可能な容器内に保存する方法であって、前記微生物菌体を含む懸濁液が充填された前記容器内の気相部を容器内部の全容積の２％以上２０％以下とすることを特徴とする前記方法。
  2. 　ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物菌体を密閉可能な容器を用いて輸送する方法であって、前記微生物菌体を含む懸濁液が充填された前記容器内の気相部を容器内部の全容積の２％以上２０％以下とすることを特徴とする前記方法。
  3. 　前記容器内の気相部の割合が５％以上２０％以下である請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記保存又は輸送温度は、氷点～35℃の温度である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記菌体懸濁液の分散媒が有機酸水溶液である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記有機酸がアクリル酸である、請求項５に記載の方法。
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