JP3973423B2 - 死滅化菌体 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、微生物触媒中に含まれる微生物菌体を死滅化させてなる死滅化菌体に関する。
背景技術
微生物菌体を工業的に使用する場合、製造中の漏出、製品への混入、あるいは使用後の取り扱い等で二次的に微生物汚染を引き起こす可能性が危惧される。通常は安全性の高い菌体を用いて閉鎖系で反応を行い、反応液から珪藻土等の助剤を用い、菌体をろ過により除去するか、菌体を固定化することにより菌体の漏洩を最小限にする措置を取るのが一般的である。この場合、安全性の高い菌体を用いるために完全な死滅化は重要視されていなかったが、近年、製造者責任について注目を集める中、安全性の高い菌体を用いる場合においても生菌体の漏洩をなくすことが求められている。
また、遺伝子組換え体を使用する場合には、各種ガイドラインにより閉鎖系以外での操作の場合には、微生物菌体の完全死滅化が要求されている。死滅化法として、例えば、目的とする酵素等の失活が起こらない条件での熱処理、あるいは菌体を破砕して粗酵素液として使用するのが一般的である。薬剤等を用いて、微生物を死滅化する方法としては、一般に界面活性剤が用いられ、界面活性剤が細菌の細胞膜を破壊する、あるいは生命維持に重要な酵素タンパク質を変性させる等により死滅化が達成される。特に陽イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤を用いた場合、高い殺菌効果を発揮する。
先行技術として、塩化ベンザルコニウムを添加することにより、大腸菌組換え体を死滅化させる方法が開示されている。（特開昭６１−１５２２７６号参照） 死滅化法として、熱処理の場合は、目的の酵素等が熱に耐性を有していないと使用できない。また、菌体を破砕して粗酵素液とする場合には、煩雑な操作により粗酵素液を製造しなければならず、反応液からの酵素の分離操作が菌体を用いる場合に比べて非常に負荷の高いものとなる。よって、工業的な利用の観点からは多くの問題がある。
イオン系界面活性剤による殺菌方法は、周知であるが、一般に低濃度の微生物群を殺菌する除菌効果であり、本発明でいう高濃度の微生物菌体の死滅化を達成できることは全く知られていなかった。
また、先行技術（特開昭６１−１５２２７６号）は、大腸菌のみに実施された処理法である。また、生理活性物質を抽出、精製過程において適用されることから、菌体の破壊、凝集等は問題にならないが、本発明で得られる死滅化菌体は、そのまま、あるいは固定化した後、物質生産の反応触媒として用いるものである。したがって、菌体の破壊や凝集等は、酵素活性、反応性の低下及び固定化時のトラブルの原因となり、工業的利用に極めて不利である。
発明の開示
本発明者らは、比較的穏和な条件で、汎用性が高く、且つ工業的に有用な酵素等を菌体内に生産させた生菌体を、該酵素活性等を失活させることなしに死滅させる手法に関して検討したところ、界面活性剤の存在下で微生物菌体を処理することにより、工業的に有用な酵素失活等を伴うことなく、微生物菌体の死滅化を達成できることを見いだし本発明を完成するに至った。本発明でいう菌体の死滅化とは、比較的高濃度の菌体懸濁中の当該細菌の生菌数を実質的に零にすることである。ここで、生菌数が実質的に零とは、微生物菌体の生存率が１／１０−５以下となることを意味する。生存率は、菌体懸濁液中の生菌数と死滅化処理後に菌体懸濁液に生存する生菌数との比で表される。生菌数は、計測対象の菌体懸濁液を所定の濃度に希釈した後、菌体が生育可能な固体培地上に当該菌体懸濁液を撒き、当該固体培地上に生育した菌体数と希釈倍率とから算出される。
すなわち、本発明は、工業的に有用な酵素等を菌体内に生産させた生菌体を、該酵素等の活性を失活させることなしに死滅化させる工程において、界面活性剤を添加することにより死滅化させた微生物菌体及びその製造法である。
本発明は、以下の（１）〜（１４）を包含する。
（１）乾燥菌体重量が５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌである微生物触媒を界面活性剤を含む水性媒体中で処理することにより死滅させた死滅化菌体。
（２）界面活性剤が陽イオン系界面活性剤又は両性イオン性界面活性剤である（１）記載の死滅化菌体。
（３）陽イオン系界面活性剤が、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル及び臭化セチルトリメチルアンモニウムの群から選択される少なくとも１つである（２）記載の死滅化菌体。
（４）界面活性剤を１５％以下の溶液として添加し、処理することにより死滅させた（１）〜（３）いずれか１に記載の死滅化菌体。
（５）塩化ベンゼトニウムの濃度が、０．０５〜５％である（３）又は（４）に記載の死滅化菌体。
（６）微生物触媒を界面活性剤及びグルタルアルデヒドを含む水性媒体中で処理することにより死滅させた死滅化菌体。
（７）微生物触媒の乾燥菌体重量が５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌである（６）記載の死滅化菌体。
（８）界面活性剤が陽イオン系界面活性剤又は両性イオン性界面活性剤である（６）又は（７）に記載の死滅化菌体。
（９）陽イオン系界面活性剤が、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル、臭化セチルトリメチルアンモニウムの群から選択される少なくとも１つである（６）〜（８）いずれか１に記載の死滅化菌体。
（１０）塩化ベンゼトニウムの濃度が、０．０５〜５％である（９）記載の死滅化菌体。
（１１）グルタルアルデヒドの濃度が、０．０５〜５％である（６）〜（１０）いずれか１に記載の死滅化菌体。
（１２）微生物触媒が、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、アミダーゼ、フマラーゼ、アスパルターゼ及びエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼから選ばれる少なくとも１の酵素活性を有するものである（１）〜（１１）いずれか１に記載の死滅化菌体。
（１３）微生物触媒が、遺伝子組換え体細菌を含むものである（１２）記載の死滅化菌体。
（１４）遺伝子組換え体細菌が、ロドコッカス（Ｒｏｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌である（１３）記載の死滅化菌体。
本発明で対象となる微生物触媒は、特に限定されないが、化学品等を製造する際に生体触媒として使用する微生物菌体、特に遺伝子組換え体を含むものである。微生物菌体としては、例えば、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換するニトリルヒドラターゼ生産菌であるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ−１、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した遺伝子組換え体Ｒ． ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＫＮＨ２、アクリロニトリルをアクリル酸に変換するニトリラーゼ生産菌であるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＳＫ９２、グリシンアミドをグリシンに変換するアミダーゼ生産菌であるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＥＡ４、フマル酸をリンゴ酸に変換するフマラーゼ生産菌であるバチルス サチルスＡＴＣＣ ６０５１、バチルス ステアロサーモフィルスＡＴＣＣ １２０１６及びロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ １２６７４、フマル酸とアンモニアをＬ−アスパラギン酸に変換するアスパルターゼ遺伝子を導入した遺伝子組換え体ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＡＲ０１６、フマル酸とジアミン類をポリアミノカルボン酸類に変換する酵素遺伝子を導入した遺伝子組換え体である、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１等が挙げられる。
上記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ−１は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として、昭和６２年９月１８日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。上記Ｒ． ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＫＮＨ２は、ＦＥＲＭ ＢＰ−３７３３として、平成３年３月１日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。上記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＳＫ９２は、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３２４として、平成２年２月２１日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。上記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＥＡ４は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３１として、平成３年３月２８日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。上記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４８として、平成９年９月１８日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
また、寄託番号の記載のない組換え体に関しては、その作成法を以下に示した。その他の菌は公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から容易に入手することができる。フマル酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸を製造する際に使用される遺伝子組換え体ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＡＲ０１６は、特開平１０−３３７１８５号明細書記載の方法で作製した。
フマル酸とジアミン類からポリアミノカルボン酸類を製造する際に使用される遺伝子組換え体、ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４８）は、以下のようにして作製した。
プラスミドｐＥＤ０２０（特開平１０−２１０９８４号明細書記載）、２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液２μｌ、滅菌水１５μｌ、制限酵素ＸｈｏＩ １μｌを添加し、３７℃にて２時間反応させた。エタノール沈殿によりプラスミドを回収し、乾燥後１５μｌの滅菌水、２μｌの１０倍濃度Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ用緩衝液、２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ溶液、１μｌのＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを添加して３７℃にて２時間反応させた。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収し、乾燥後８μｌの滅菌水、１μｌのＸｂａＩリンカー溶液、１６μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ酒造株式会社製）溶液Ａ及び４μｌの溶液Ｂを添加して１６℃にて４時間反応させた後，ＪＭ１０９に形質転換させた。得られた組換え体よりプラスミドを調製して、ｐＥＤ０２０のＸｈｏＩ部位がＸｂａＩ部位に変換されたプラスミドを得た。得られたプラスミド２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液２μｌ、滅菌水１５μｌ、制限酵素ＥｃｏＲＶ １μｌを添加し、３７℃にて２時間反応させた。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収し、乾燥後８μｌの滅菌水、１μｌのＳｓｅ８３８７Ｉリンカー溶液、１６μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ酒造株式会社製）溶液Ａ及び４μｌの溶液Ｂを添加して１６℃にて４時間反応させた後ＪＭ１０９に形質転換させた。得られた組換え体よりプラスミドを調製し、ＥｃｏＲＶ部位がＳｓｅ８３８７Ｉ部位に変換されたプラスミドを得た。得られたプラスミド２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液２μｌ、滅菌水１４μｌ、制限酵素ＸｂａＩ １μｌ及びＳｓｅ８３８７Ｉ １μｌを添加し、３７℃にて２時間反応させた。その後、０．７％アガロース電気泳動で分離し１．７Ｋｂのバンドを回収しロドコッカス細菌のプロモーターを有するプラスミドｐＳＪ０３４のＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ部位に挿入し、組換え体プラスミドｐＳＥ００１を作成した。
ｐＳＪ０３４はプラスミドｐＳＪ０２３（特願平９−６５６１８号明細書記載）より図１に示した工程により作成した。
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５株の対数増殖期の細胞を遠心分離機により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。プラスミドｐＳＥ００１ １μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し氷冷した。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）により２．０ＫＶ、２００ ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下、１０分間静置し、３７℃で１０分間ヒートショックを行い、ＭＹＫ培地（ポリペプトン ５ｇ／Ｌ、バクトイーストエキス ３ｇ／Ｌ、バクトモルトエキス ３ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ／Ｌ）５００μｌを加え、３０℃、５時間静置した後、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養して組換え体Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４８）を作製した。
本発明において、死滅化処理とは、微生物触媒中に含まれる微生物菌体に対して界面活性剤及び／又はグルタルアルデヒドを作用させる処理を意味する。具体的に、死滅化処理とは、微生物菌体懸濁液に界面活性剤及び必要に応じてその他の添加剤を溶解し、微生物菌体と界面活性剤とを、又は微生物菌体と界面活性剤と添加剤とを接触させる処理である。この死滅化処理に際しては、保冷或いは保温しながら行うことが好ましい。死滅化処理を所定の温度に維持した状態で行うことによって、微生物触媒としての能力を高く維持することができる。さらに、死滅化処理は、攪拌しながら行っても良い。
菌体を処理する際、培養液、該培養液を適当な緩衝液等で洗浄した洗浄菌体、又はその処理物を用いることができる。また、死滅化処理に際しては、例えば、洗浄性向上、細胞膜の透過性向上及び菌体の安定性向上等を目的として、薬剤処理、菌体破砕処理等を予め施すことが好ましい。
死滅化処理時の菌体濃度は、特に限定されないが、培養液の菌濃度以上が望ましい。工業的な利用の観点からは、乾燥菌体で５ｇ／Ｌ以上が良い。また、死滅化処理時の菌体濃度は、乾燥菌体で２００ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。本発明によれば、高濃度の微生物菌体懸濁液に対して確実に死滅化処理を行うことができる。しかしながら、乾燥菌体で２００ｇ／Ｌを越える菌体濃度である場合には、微生物の種類及び性質によるが、一般的に菌体懸濁液の流動性が著しく低下し、界面活性剤等の分散性及び溶解性が悪くなり、微生物菌体の死滅化を効率よく行えない虞がある。したがって、死滅化処理時の菌体濃度は、５〜２００ｇ／Ｌであることが好ましい。
菌体を死滅化処理する際の処理温度は氷結温度から８０℃、好ましくは０〜７０℃で行うことができる。温度に関しては、特に限定されないが、目的とする酵素等の安定性に応じて任意に設定することができる。
菌体を死滅化処理する際に添加する界面活性剤としては、特に限定されないが
陽イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、非イオン系界面活性剤及び両性イオン性界面活性剤等何でも用いることができる。非イオン系界面活性剤として、例えば、ＫＳ６０４（信越化学工業株式会社製）、プルロニックＬ６１、ＬＧ１２６（旭電化工業株式会社製）、エマルゲン１０９Ｐ（花王株式会社製）、トリトンＸ−１００等が挙げられる。また、陽イオン系界面活性剤としては、例えば、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル、臭化セチルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。両性イオン性界面活性剤としては、カルボキシベタイン型、アミノカルボン酸塩等が挙げられる。陽イオン系界面活性剤や両性イオン性界面活性剤は殺菌効果が高いことが知られており、低濃度で効果的に菌体を死滅化させることができるので好ましい。また、菌体の死滅化処理には、必要に応じて単独あるいは２種類以上の界面活性剤を混合して用いることができる。
菌体を死滅化処理する際の界面活性剤の濃度は、０．０１〜２０％好ましくは０．０５〜１０％が良い。界面活性剤の濃度は、低すぎると菌体の死滅化に充分な効果が期待されず、また、高すぎると処理後の廃液の処理の問題や工業的に有用な酵素等の失活等の問題が生じるため使用する微生物菌体及び目的とする酵素等の安定性等を考慮して最適な濃度を選択することが望ましい。
また、イオン系界面活性剤を使用する際、添加時に高濃度溶液を使用すると、死滅化処理時に微生物菌体の溶菌、破壊及び凝集を引き起こす場合がある。界面活性剤は、低濃度で添加することが有効である。濃度としては、０．５〜１５％、好ましくは１〜８％程度で添加するのが良い。
死滅化処理する際、処理液のｐＨは４〜１１、好ましくは５〜１０が良い。処理の際のｐＨは、目的とする酵素等の安定性を考慮して選択するのが望ましい。
死滅化処理の際に、その効果を向上させる目的で各種の添加剤を添加することも有効である。例えば、エタノール等のアルコール類、２−メルカプトエタノール等のチオール類、エチレンジアミン等のアミン類、システイン、オルニチン及びシトルリン等のアミノ酸類、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類が挙げられる。
また、目的とする酵素等の安定性を向上させる目的で該酵素等の基質、生成物、阻害剤等を添加することも有効である。例えば、各種ニトリル、各種アミド、各種有機酸、アミノ酸、ポリアミノカルボン酸等が挙げられる。これらの添加剤は、目的とする酵素等の安定性を考慮して単独であるいは２種類以上混合して最適な組み合わせ及び最適な濃度を選択するのが望ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４８）
１．培養
ＭＹＫ−Ｋｍ培地（ＭＹＫ培地に５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン含有）２００ｍｌに接種し、３０℃、７２時間前培養した。この培養物を３０Ｌジャーを用いて、グルコース １５ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム １０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキス １ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシンからなる培地２０Ｌ（ｐＨ７．２）に加え、３０℃、６０時間通気撹拌培養を行った。得られた培養液２０Ｌを中空糸膜クロスフローＳＦ ＦＩＬＴＥＲ ＫＬ−Ｆ−８１０２（クラレ株式会社製）中をモーノポンプ（１ｍ／ｓ）で循環することにより濃縮を行った。培養ろ液が１０Ｌ排出された後、培養ろ液が２Ｌ排出されるごとに１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）を２Ｌ添加し、合計２０Ｌの緩衝液を用いて連続洗浄を行い、洗浄菌体１０ｋｇを作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で４２ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体５０ｍｌを用いて、表１に示す５％界面活性剤溶液をそれぞれ１ｍｌ添加して４５℃で処理を行った。
３．生菌数の測定
菌体処理終了後、使用した洗浄菌体と同容量の１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）で２回洗浄を行い、洗浄菌体と同容量になるよう懸濁した。各々の懸濁液を０．１ｍｌずつＭＹＫ−Ｋｍ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
各死滅化菌体１ｍｌを３４２ｍＭフマル酸と１７１ｍＭエチレンジアミンを含むｐＨ８．０の水溶液５０ｍｌに懸濁し２４時間反応させた。反応液から遠心分離により菌体を除いた後、上清のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸量をＨＰＬＣを用いて分析し、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ（以下、ＥＤＤＳアーゼと略す）活性を調べた。（カラム；ＷＡＫＯＳＩＬ ５Ｃ８（和光純薬株式会社製）、溶出液；１０ｍＭ水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭ ＣｕＳＯ４を含む５０ｍＭ燐酸ｐＨ２．０）死滅化処理を行っていない洗浄菌体のＥＤＤＳアーゼ活性を１００として、処理後のＥＤＤＳアーゼ活性残存率を求めた。
〔実施例２〕
実施例１の方法で作製した洗浄菌体５０ｍｌを用いて、表２に示す濃度となるように、２．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、１０℃又は３０℃で８時間、処理を行い、処理後の生菌数及びＥＤＤＳアーゼの活性残存率を求めた。
〔実施例３〕
実施例１の方法で作製した洗浄菌体５０ｍｌを用いて表３に示す濃度となるように、０．６％、１．５％、３％の塩化ベンゼトニウムを含む３０％エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸溶液（ｐＨ８．５）を１０ｍｌ添加し、３０℃又は５０℃で３時間菌体処理を行い、処理後の生菌数及びＥＤＤＳアーゼの活性残存率を求めた。
〔実施例４〕
実施例１の方法で作製した培養液５０ｍｌを用いて表４に示す濃度になるように、それぞれの２％界面活性剤溶液を添加し、４℃又は３０℃にて３時間菌体処理を行い、処理後の生菌数及びＥＤＤＳアーゼの活性残存率を求めた。
〔実施例５〕
（１）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）
１．培養
グルコース １０ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、酵母エキス １ｇ／Ｌ、ペプトン ７．５ｇ／Ｌからなる培地（ｐＨ７．２）を調製し、これらを５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注し、１２０℃にて１５分間オートクレープで滅菌した。この培地にＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）を接種して２８℃で３日間振盪培養を行った。この培養液１ｍｌを同じ培地（三角フラスコ２０本）に接種し、同時に尿素１５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２ １０ｍｇ／Ｌを添加して２８℃で９６時間振盪培養した。遠心分離によって回収した菌体を培養液と同量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄後、１００ｍｌの同緩衝液に懸濁し、洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で１０５ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液及び／又は０．２５％グルタルアルデヒド溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液及び／又は０．２５％グルタルアルデヒド溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁し、各々の懸濁液を０．１ｍｌずつＭＹＫ寒天培地に塗布し３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
ニトリルヒドラターゼ活性は、１Ｍアクリロニトリル１．０ｍｌ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液２ｍｌについて１０℃で所定時間反応を行わせてから０．２ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させた後、ガスクロマトグラフィーにより生成したアクリルアミドの量を分析することにより測定した。
（２）Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＫＮＨ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７３３）
１．培養
グリセロール １０ｇ／Ｌ、ポリペプトン ５ｇ／Ｌ、酵母エキス ３ｇ／Ｌ、マルツエキス ３ｇ／Ｌからなる培地（ｐＨ７．２）を調製し、これらを５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注して１２０℃にて１５分間オートクレープで滅菌した。この培地にＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＫＮＨ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７３３）を接種して２５℃で２日間振盪培養を行った。この培養液１ｍｌを同じ培地（三角フラスコ２０本）に接種し、同時にイソブチロニトリル、イソブチルアミドをそれぞれ１ｇ／Ｌとなるように添加して２５℃で光照射下、３日間培養を行った。遠心分離によって回収した菌体を、培養液と同量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄後、２００ｍｌの同緩衝液に懸濁し、洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で３２ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁し、各々の懸濁液を０．１ｍｌずつ、ＭＹＫ−Ｋｍ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
ニトリルヒドラターゼ活性は、１Ｍアクリロニトリル１．０ｍｌ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液２ｍｌについて１０℃で所定時間反応を行わせてから０．２ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させた後、ガスクロマトグラフィーにより生成したアクリルアミドの量を分析することにより測定した。
（３）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＳＫ９２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３２４）
１．培養
シュークロース ２０ｇ／Ｌ、ポリペプトン ５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌからなる培地（ｐＨ７．２）を調製し、これらを５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注して１２０℃にて１５分間オートクレープで滅菌した。この培地にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＳＫ９２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３２４）を接種して３０℃で３日間振盪培養を行った。この培養液１ｍｌを同じ培地（三角フラスコ２０本）に接種し、同時にエチレンシアンヒドリン２ｍｌを添加して３０℃で２０時間振盪培養した後、エチレンシアンヒドリンを３ｍｌ添加してさらに３日間培養を行った。
遠心分離によって回収した菌体を、培養液と同量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄後、２００ｍｌの同緩衝液に懸濁し、洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で３６ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁し、それぞれの懸濁液を０．１ｍｌずつ、ＭＹＫ−Ｋｍ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
ニトリラーゼ活性は、１Ｍアクリロニトリル１．０ｍｌ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液２ｍｌについて１０℃で所定時間反応を行わせてから０．２ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させた後、液体クロマトグラフィーにより生成したアクリル酸の量を分析することにより測定した。
（４）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＥＡ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３１） １．培養
グリセロール ５ｇ／Ｌ、酵母エキス ０．０２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／Ｌからなる培地（ｐＨ７．０）を調製し、これらを５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注して１２０℃にて１５分間オートクレープで滅菌した。この培地にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＥＡ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３１）を接種して３０℃で３日間振盪培養を行った。この培養液１ｍｌを同じ培地（三角フラスコ２０本）に接種し、同時にアセトアミド５ｇ／Ｌを添加して３０℃で４８時間振盪培養した。
遠心分離によって回収した菌体を、培養液と同量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄後、２００ｍｌの同緩衝液に懸濁し、洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で３６ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁し、それぞれの懸濁液を０．１ｍｌずつＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
アミダーゼ活性は、０．２Ｍグリシンアミドを含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液１ｍｌについて３０℃で所定時間反応を行わせてから遠心分離により菌体を除去した後、液体クロマトグラフィーにより生成したグリシンの量を分析することにより測定した。
（５）Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＡＲ０１６
１．培養
ＭＹＫ−Ｋｍ培地１００ｍｌにＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＡＲ０１６を接種し、３０℃で７２時間培養した。本培養は、同培地５Ｌ（５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ培地を入れた）で行い、前培養から１％接種し、３０℃で９６時間培養した。遠心分離によって回収した菌体を、培養液と同量の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、５００ｍｌの同緩衝液に懸濁して洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で４２ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で３回洗浄後、菌体処理時の容量と同じになるように同緩衝液で懸濁した。
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁し、それぞれの懸濁液を０．１ｍｌずつＭＹＫ−Ｋｍ寒天培地に塗布し３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
アスパルターゼ活性は、１Ｍフマル酸アンモニウム及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液１ｍｌについて３０℃で所定時間反応を行わせてから遠心分離により菌体を除去した後、液体クロマトグラフィーにより生成したアスパラギン酸の量を分析することにより測定した。
（６）ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４
１．培養
グルコース ５ｇ／Ｌ、酵母エキス ０．０２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／Ｌからなる培地（ｐＨ７．０）を調製し、これらを５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注して１２０℃にて１５分間オートクレープで滅菌した。この培地にロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４を接種して３０℃で３日間振盪培養を行った。この培養液１ｍｌを１０ｇ／Ｌのフマル酸を含む同じ培地（三角フラスコ２０本）に接種し、３０℃で４８時間振盪培養した。遠心分離によって回収した菌体を、培養液と同量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄後、２００ｍｌの同緩衝液に懸濁し、洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で３１ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で３回洗浄後、菌体処理時の容量と同じになるように同緩衝液で懸濁した。
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁した懸濁液を０．１ｍｌずつＭＹＫ寒天培地に塗布し３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
フマラーゼ活性は、０．２Ｍフマル酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液１ｍｌについて３０℃で所定時間反応を行わせてから遠心分離により菌体を除去した後、液体クロマトグラフィーにより生成したリンゴ酸の量を分析することにより測定した。
なお、本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、工業的に有用な酵素等を失活させることなしに死滅させた微生物菌体を製造することができるため、微生物菌体を工業的に用いる場合、生菌体の漏洩による二次的汚染を回避することができる。特に遺伝子組換え体を使用する場合、本発明による死滅化処理を行うことにより、後の工程での菌体の取り扱いが簡便化されて、特殊な設備を必要としない等の工業的に有用な手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＳＪ０３４の作製方法を示す図である。
本発明は、微生物触媒中に含まれる微生物菌体を死滅化させてなる死滅化菌体に関する。
背景技術
微生物菌体を工業的に使用する場合、製造中の漏出、製品への混入、あるいは使用後の取り扱い等で二次的に微生物汚染を引き起こす可能性が危惧される。通常は安全性の高い菌体を用いて閉鎖系で反応を行い、反応液から珪藻土等の助剤を用い、菌体をろ過により除去するか、菌体を固定化することにより菌体の漏洩を最小限にする措置を取るのが一般的である。この場合、安全性の高い菌体を用いるために完全な死滅化は重要視されていなかったが、近年、製造者責任について注目を集める中、安全性の高い菌体を用いる場合においても生菌体の漏洩をなくすことが求められている。
また、遺伝子組換え体を使用する場合には、各種ガイドラインにより閉鎖系以外での操作の場合には、微生物菌体の完全死滅化が要求されている。死滅化法として、例えば、目的とする酵素等の失活が起こらない条件での熱処理、あるいは菌体を破砕して粗酵素液として使用するのが一般的である。薬剤等を用いて、微生物を死滅化する方法としては、一般に界面活性剤が用いられ、界面活性剤が細菌の細胞膜を破壊する、あるいは生命維持に重要な酵素タンパク質を変性させる等により死滅化が達成される。特に陽イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤を用いた場合、高い殺菌効果を発揮する。
先行技術として、塩化ベンザルコニウムを添加することにより、大腸菌組換え体を死滅化させる方法が開示されている。（特開昭６１−１５２２７６号参照） 死滅化法として、熱処理の場合は、目的の酵素等が熱に耐性を有していないと使用できない。また、菌体を破砕して粗酵素液とする場合には、煩雑な操作により粗酵素液を製造しなければならず、反応液からの酵素の分離操作が菌体を用いる場合に比べて非常に負荷の高いものとなる。よって、工業的な利用の観点からは多くの問題がある。
イオン系界面活性剤による殺菌方法は、周知であるが、一般に低濃度の微生物群を殺菌する除菌効果であり、本発明でいう高濃度の微生物菌体の死滅化を達成できることは全く知られていなかった。
また、先行技術（特開昭６１−１５２２７６号）は、大腸菌のみに実施された処理法である。また、生理活性物質を抽出、精製過程において適用されることから、菌体の破壊、凝集等は問題にならないが、本発明で得られる死滅化菌体は、そのまま、あるいは固定化した後、物質生産の反応触媒として用いるものである。したがって、菌体の破壊や凝集等は、酵素活性、反応性の低下及び固定化時のトラブルの原因となり、工業的利用に極めて不利である。
発明の開示
本発明者らは、比較的穏和な条件で、汎用性が高く、且つ工業的に有用な酵素等を菌体内に生産させた生菌体を、該酵素活性等を失活させることなしに死滅させる手法に関して検討したところ、界面活性剤の存在下で微生物菌体を処理することにより、工業的に有用な酵素失活等を伴うことなく、微生物菌体の死滅化を達成できることを見いだし本発明を完成するに至った。本発明でいう菌体の死滅化とは、比較的高濃度の菌体懸濁中の当該細菌の生菌数を実質的に零にすることである。ここで、生菌数が実質的に零とは、微生物菌体の生存率が１／１０−５以下となることを意味する。生存率は、菌体懸濁液中の生菌数と死滅化処理後に菌体懸濁液に生存する生菌数との比で表される。生菌数は、計測対象の菌体懸濁液を所定の濃度に希釈した後、菌体が生育可能な固体培地上に当該菌体懸濁液を撒き、当該固体培地上に生育した菌体数と希釈倍率とから算出される。
すなわち、本発明は、工業的に有用な酵素等を菌体内に生産させた生菌体を、該酵素等の活性を失活させることなしに死滅化させる工程において、界面活性剤を添加することにより死滅化させた微生物菌体及びその製造法である。
本発明は、以下の（１）〜（１４）を包含する。
（１）乾燥菌体重量が５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌである微生物触媒を界面活性剤を含む水性媒体中で処理することにより死滅させた死滅化菌体。
（２）界面活性剤が陽イオン系界面活性剤又は両性イオン性界面活性剤である（１）記載の死滅化菌体。
（３）陽イオン系界面活性剤が、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル及び臭化セチルトリメチルアンモニウムの群から選択される少なくとも１つである（２）記載の死滅化菌体。
（４）界面活性剤を１５％以下の溶液として添加し、処理することにより死滅させた（１）〜（３）いずれか１に記載の死滅化菌体。
（５）塩化ベンゼトニウムの濃度が、０．０５〜５％である（３）又は（４）に記載の死滅化菌体。
（６）微生物触媒を界面活性剤及びグルタルアルデヒドを含む水性媒体中で処理することにより死滅させた死滅化菌体。
（７）微生物触媒の乾燥菌体重量が５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌである（６）記載の死滅化菌体。
（８）界面活性剤が陽イオン系界面活性剤又は両性イオン性界面活性剤である（６）又は（７）に記載の死滅化菌体。
（９）陽イオン系界面活性剤が、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル、臭化セチルトリメチルアンモニウムの群から選択される少なくとも１つである（６）〜（８）いずれか１に記載の死滅化菌体。
（１０）塩化ベンゼトニウムの濃度が、０．０５〜５％である（９）記載の死滅化菌体。
（１１）グルタルアルデヒドの濃度が、０．０５〜５％である（６）〜（１０）いずれか１に記載の死滅化菌体。
（１２）微生物触媒が、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、アミダーゼ、フマラーゼ、アスパルターゼ及びエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼから選ばれる少なくとも１の酵素活性を有するものである（１）〜（１１）いずれか１に記載の死滅化菌体。
（１３）微生物触媒が、遺伝子組換え体細菌を含むものである（１２）記載の死滅化菌体。
（１４）遺伝子組換え体細菌が、ロドコッカス（Ｒｏｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌である（１３）記載の死滅化菌体。
本発明で対象となる微生物触媒は、特に限定されないが、化学品等を製造する際に生体触媒として使用する微生物菌体、特に遺伝子組換え体を含むものである。微生物菌体としては、例えば、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換するニトリルヒドラターゼ生産菌であるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ−１、ニトリルヒドラターゼ遺伝子を導入した遺伝子組換え体Ｒ． ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＫＮＨ２、アクリロニトリルをアクリル酸に変換するニトリラーゼ生産菌であるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＳＫ９２、グリシンアミドをグリシンに変換するアミダーゼ生産菌であるＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＥＡ４、フマル酸をリンゴ酸に変換するフマラーゼ生産菌であるバチルス サチルスＡＴＣＣ ６０５１、バチルス ステアロサーモフィルスＡＴＣＣ １２０１６及びロドコッカス ロドクロウスＡＴＣＣ １２６７４、フマル酸とアンモニアをＬ−アスパラギン酸に変換するアスパルターゼ遺伝子を導入した遺伝子組換え体ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＡＲ０１６、フマル酸とジアミン類をポリアミノカルボン酸類に変換する酵素遺伝子を導入した遺伝子組換え体である、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１等が挙げられる。
上記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ−１は、ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８として、昭和６２年９月１８日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。上記Ｒ． ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＫＮＨ２は、ＦＥＲＭ ＢＰ−３７３３として、平成３年３月１日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。上記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＳＫ９２は、ＦＥＲＭ ＢＰ−３３２４として、平成２年２月２１日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。上記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＥＡ４は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３１として、平成３年３月２８日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。上記Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１は、ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４８として、平成９年９月１８日付けで通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）にブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
また、寄託番号の記載のない組換え体に関しては、その作成法を以下に示した。その他の菌は公知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から容易に入手することができる。フマル酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸を製造する際に使用される遺伝子組換え体ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＡＲ０１６は、特開平１０−３３７１８５号明細書記載の方法で作製した。
フマル酸とジアミン類からポリアミノカルボン酸類を製造する際に使用される遺伝子組換え体、ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４８）は、以下のようにして作製した。
プラスミドｐＥＤ０２０（特開平１０−２１０９８４号明細書記載）、２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液２μｌ、滅菌水１５μｌ、制限酵素ＸｈｏＩ １μｌを添加し、３７℃にて２時間反応させた。エタノール沈殿によりプラスミドを回収し、乾燥後１５μｌの滅菌水、２μｌの１０倍濃度Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ用緩衝液、２μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ溶液、１μｌのＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔを添加して３７℃にて２時間反応させた。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収し、乾燥後８μｌの滅菌水、１μｌのＸｂａＩリンカー溶液、１６μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ酒造株式会社製）溶液Ａ及び４μｌの溶液Ｂを添加して１６℃にて４時間反応させた後，ＪＭ１０９に形質転換させた。得られた組換え体よりプラスミドを調製して、ｐＥＤ０２０のＸｈｏＩ部位がＸｂａＩ部位に変換されたプラスミドを得た。得られたプラスミド２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液２μｌ、滅菌水１５μｌ、制限酵素ＥｃｏＲＶ １μｌを添加し、３７℃にて２時間反応させた。エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収し、乾燥後８μｌの滅菌水、１μｌのＳｓｅ８３８７Ｉリンカー溶液、１６μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ酒造株式会社製）溶液Ａ及び４μｌの溶液Ｂを添加して１６℃にて４時間反応させた後ＪＭ１０９に形質転換させた。得られた組換え体よりプラスミドを調製し、ＥｃｏＲＶ部位がＳｓｅ８３８７Ｉ部位に変換されたプラスミドを得た。得られたプラスミド２μｌに対し、１０倍濃度制限酵素用緩衝液２μｌ、滅菌水１４μｌ、制限酵素ＸｂａＩ １μｌ及びＳｓｅ８３８７Ｉ １μｌを添加し、３７℃にて２時間反応させた。その後、０．７％アガロース電気泳動で分離し１．７Ｋｂのバンドを回収しロドコッカス細菌のプロモーターを有するプラスミドｐＳＪ０３４のＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ部位に挿入し、組換え体プラスミドｐＳＥ００１を作成した。
ｐＳＪ０３４はプラスミドｐＳＪ０２３（特願平９−６５６１８号明細書記載）より図１に示した工程により作成した。
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５株の対数増殖期の細胞を遠心分離機により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回洗浄し、滅菌水に懸濁した。プラスミドｐＳＥ００１ １μｌと菌体懸濁液１０μｌを混合し氷冷した。キュベットにＤＮＡと菌体の懸濁液を入れ、遺伝子導入装置Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ）により２．０ＫＶ、２００ ＯＨＭＳで電気パルス処理を行った。電気パルス処理液を氷冷下、１０分間静置し、３７℃で１０分間ヒートショックを行い、ＭＹＫ培地（ポリペプトン ５ｇ／Ｌ、バクトイーストエキス ３ｇ／Ｌ、バクトモルトエキス ３ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ／Ｌ）５００μｌを加え、３０℃、５時間静置した後、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン入りＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養して組換え体Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４８）を作製した。
本発明において、死滅化処理とは、微生物触媒中に含まれる微生物菌体に対して界面活性剤及び／又はグルタルアルデヒドを作用させる処理を意味する。具体的に、死滅化処理とは、微生物菌体懸濁液に界面活性剤及び必要に応じてその他の添加剤を溶解し、微生物菌体と界面活性剤とを、又は微生物菌体と界面活性剤と添加剤とを接触させる処理である。この死滅化処理に際しては、保冷或いは保温しながら行うことが好ましい。死滅化処理を所定の温度に維持した状態で行うことによって、微生物触媒としての能力を高く維持することができる。さらに、死滅化処理は、攪拌しながら行っても良い。
菌体を処理する際、培養液、該培養液を適当な緩衝液等で洗浄した洗浄菌体、又はその処理物を用いることができる。また、死滅化処理に際しては、例えば、洗浄性向上、細胞膜の透過性向上及び菌体の安定性向上等を目的として、薬剤処理、菌体破砕処理等を予め施すことが好ましい。
死滅化処理時の菌体濃度は、特に限定されないが、培養液の菌濃度以上が望ましい。工業的な利用の観点からは、乾燥菌体で５ｇ／Ｌ以上が良い。また、死滅化処理時の菌体濃度は、乾燥菌体で２００ｇ／Ｌ以下であることが好ましい。本発明によれば、高濃度の微生物菌体懸濁液に対して確実に死滅化処理を行うことができる。しかしながら、乾燥菌体で２００ｇ／Ｌを越える菌体濃度である場合には、微生物の種類及び性質によるが、一般的に菌体懸濁液の流動性が著しく低下し、界面活性剤等の分散性及び溶解性が悪くなり、微生物菌体の死滅化を効率よく行えない虞がある。したがって、死滅化処理時の菌体濃度は、５〜２００ｇ／Ｌであることが好ましい。
菌体を死滅化処理する際の処理温度は氷結温度から８０℃、好ましくは０〜７０℃で行うことができる。温度に関しては、特に限定されないが、目的とする酵素等の安定性に応じて任意に設定することができる。
菌体を死滅化処理する際に添加する界面活性剤としては、特に限定されないが
陽イオン系界面活性剤、陰イオン系界面活性剤、非イオン系界面活性剤及び両性イオン性界面活性剤等何でも用いることができる。非イオン系界面活性剤として、例えば、ＫＳ６０４（信越化学工業株式会社製）、プルロニックＬ６１、ＬＧ１２６（旭電化工業株式会社製）、エマルゲン１０９Ｐ（花王株式会社製）、トリトンＸ−１００等が挙げられる。また、陽イオン系界面活性剤としては、例えば、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル、臭化セチルトリメチルアンモニウム等が挙げられる。両性イオン性界面活性剤としては、カルボキシベタイン型、アミノカルボン酸塩等が挙げられる。陽イオン系界面活性剤や両性イオン性界面活性剤は殺菌効果が高いことが知られており、低濃度で効果的に菌体を死滅化させることができるので好ましい。また、菌体の死滅化処理には、必要に応じて単独あるいは２種類以上の界面活性剤を混合して用いることができる。
菌体を死滅化処理する際の界面活性剤の濃度は、０．０１〜２０％好ましくは０．０５〜１０％が良い。界面活性剤の濃度は、低すぎると菌体の死滅化に充分な効果が期待されず、また、高すぎると処理後の廃液の処理の問題や工業的に有用な酵素等の失活等の問題が生じるため使用する微生物菌体及び目的とする酵素等の安定性等を考慮して最適な濃度を選択することが望ましい。
また、イオン系界面活性剤を使用する際、添加時に高濃度溶液を使用すると、死滅化処理時に微生物菌体の溶菌、破壊及び凝集を引き起こす場合がある。界面活性剤は、低濃度で添加することが有効である。濃度としては、０．５〜１５％、好ましくは１〜８％程度で添加するのが良い。
死滅化処理する際、処理液のｐＨは４〜１１、好ましくは５〜１０が良い。処理の際のｐＨは、目的とする酵素等の安定性を考慮して選択するのが望ましい。
死滅化処理の際に、その効果を向上させる目的で各種の添加剤を添加することも有効である。例えば、エタノール等のアルコール類、２−メルカプトエタノール等のチオール類、エチレンジアミン等のアミン類、システイン、オルニチン及びシトルリン等のアミノ酸類、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類が挙げられる。
また、目的とする酵素等の安定性を向上させる目的で該酵素等の基質、生成物、阻害剤等を添加することも有効である。例えば、各種ニトリル、各種アミド、各種有機酸、アミノ酸、ポリアミノカルボン酸等が挙げられる。これらの添加剤は、目的とする酵素等の安定性を考慮して単独であるいは２種類以上混合して最適な組み合わせ及び最適な濃度を選択するのが望ましい。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的範囲を限定するものではない。
〔実施例１〕
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１７８９５／ｐＳＥ００１（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５４８）
１．培養
ＭＹＫ−Ｋｍ培地（ＭＹＫ培地に５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン含有）２００ｍｌに接種し、３０℃、７２時間前培養した。この培養物を３０Ｌジャーを用いて、グルコース １５ｇ／Ｌ、グルタミン酸ナトリウム １０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキス １ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム ０．５ｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ カナマイシンからなる培地２０Ｌ（ｐＨ７．２）に加え、３０℃、６０時間通気撹拌培養を行った。得られた培養液２０Ｌを中空糸膜クロスフローＳＦ ＦＩＬＴＥＲ ＫＬ−Ｆ−８１０２（クラレ株式会社製）中をモーノポンプ（１ｍ／ｓ）で循環することにより濃縮を行った。培養ろ液が１０Ｌ排出された後、培養ろ液が２Ｌ排出されるごとに１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）を２Ｌ添加し、合計２０Ｌの緩衝液を用いて連続洗浄を行い、洗浄菌体１０ｋｇを作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で４２ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体５０ｍｌを用いて、表１に示す５％界面活性剤溶液をそれぞれ１ｍｌ添加して４５℃で処理を行った。
３．生菌数の測定
菌体処理終了後、使用した洗浄菌体と同容量の１００ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）で２回洗浄を行い、洗浄菌体と同容量になるよう懸濁した。各々の懸濁液を０．１ｍｌずつＭＹＫ−Ｋｍ寒天培地に塗布し、３０℃、３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
各死滅化菌体１ｍｌを３４２ｍＭフマル酸と１７１ｍＭエチレンジアミンを含むｐＨ８．０の水溶液５０ｍｌに懸濁し２４時間反応させた。反応液から遠心分離により菌体を除いた後、上清のエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸量をＨＰＬＣを用いて分析し、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸：エチレンジアミンリアーゼ（以下、ＥＤＤＳアーゼと略す）活性を調べた。（カラム；ＷＡＫＯＳＩＬ ５Ｃ８（和光純薬株式会社製）、溶出液；１０ｍＭ水酸化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭ ＣｕＳＯ４を含む５０ｍＭ燐酸ｐＨ２．０）死滅化処理を行っていない洗浄菌体のＥＤＤＳアーゼ活性を１００として、処理後のＥＤＤＳアーゼ活性残存率を求めた。
実施例１の方法で作製した洗浄菌体５０ｍｌを用いて、表２に示す濃度となるように、２．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、１０℃又は３０℃で８時間、処理を行い、処理後の生菌数及びＥＤＤＳアーゼの活性残存率を求めた。
実施例１の方法で作製した洗浄菌体５０ｍｌを用いて表３に示す濃度となるように、０．６％、１．５％、３％の塩化ベンゼトニウムを含む３０％エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸溶液（ｐＨ８．５）を１０ｍｌ添加し、３０℃又は５０℃で３時間菌体処理を行い、処理後の生菌数及びＥＤＤＳアーゼの活性残存率を求めた。
実施例１の方法で作製した培養液５０ｍｌを用いて表４に示す濃度になるように、それぞれの２％界面活性剤溶液を添加し、４℃又は３０℃にて３時間菌体処理を行い、処理後の生菌数及びＥＤＤＳアーゼの活性残存率を求めた。
（１）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）
１．培養
グルコース １０ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、酵母エキス １ｇ／Ｌ、ペプトン ７．５ｇ／Ｌからなる培地（ｐＨ７．２）を調製し、これらを５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注し、１２０℃にて１５分間オートクレープで滅菌した。この培地にＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ Ｊ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４７８）を接種して２８℃で３日間振盪培養を行った。この培養液１ｍｌを同じ培地（三角フラスコ２０本）に接種し、同時に尿素１５ｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２ １０ｍｇ／Ｌを添加して２８℃で９６時間振盪培養した。遠心分離によって回収した菌体を培養液と同量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄後、１００ｍｌの同緩衝液に懸濁し、洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で１０５ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液及び／又は０．２５％グルタルアルデヒド溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液及び／又は０．２５％グルタルアルデヒド溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁し、各々の懸濁液を０．１ｍｌずつＭＹＫ寒天培地に塗布し３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
ニトリルヒドラターゼ活性は、１Ｍアクリロニトリル１．０ｍｌ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液２ｍｌについて１０℃で所定時間反応を行わせてから０．２ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させた後、ガスクロマトグラフィーにより生成したアクリルアミドの量を分析することにより測定した。
（２）Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＫＮＨ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７３３）
１．培養
グリセロール １０ｇ／Ｌ、ポリペプトン ５ｇ／Ｌ、酵母エキス ３ｇ／Ｌ、マルツエキス ３ｇ／Ｌからなる培地（ｐＨ７．２）を調製し、これらを５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注して１２０℃にて１５分間オートクレープで滅菌した。この培地にＲ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＫＮＨ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７３３）を接種して２５℃で２日間振盪培養を行った。この培養液１ｍｌを同じ培地（三角フラスコ２０本）に接種し、同時にイソブチロニトリル、イソブチルアミドをそれぞれ１ｇ／Ｌとなるように添加して２５℃で光照射下、３日間培養を行った。遠心分離によって回収した菌体を、培養液と同量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄後、２００ｍｌの同緩衝液に懸濁し、洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で３２ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁し、各々の懸濁液を０．１ｍｌずつ、ＭＹＫ−Ｋｍ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
ニトリルヒドラターゼ活性は、１Ｍアクリロニトリル１．０ｍｌ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液２ｍｌについて１０℃で所定時間反応を行わせてから０．２ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させた後、ガスクロマトグラフィーにより生成したアクリルアミドの量を分析することにより測定した。
（３）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＳＫ９２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３２４）
１．培養
シュークロース ２０ｇ／Ｌ、ポリペプトン ５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌからなる培地（ｐＨ７．２）を調製し、これらを５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注して１２０℃にて１５分間オートクレープで滅菌した。この培地にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＳＫ９２（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３２４）を接種して３０℃で３日間振盪培養を行った。この培養液１ｍｌを同じ培地（三角フラスコ２０本）に接種し、同時にエチレンシアンヒドリン２ｍｌを添加して３０℃で２０時間振盪培養した後、エチレンシアンヒドリンを３ｍｌ添加してさらに３日間培養を行った。
遠心分離によって回収した菌体を、培養液と同量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄後、２００ｍｌの同緩衝液に懸濁し、洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で３６ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁し、それぞれの懸濁液を０．１ｍｌずつ、ＭＹＫ−Ｋｍ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
ニトリラーゼ活性は、１Ｍアクリロニトリル１．０ｍｌ、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液２ｍｌについて１０℃で所定時間反応を行わせてから０．２ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させた後、液体クロマトグラフィーにより生成したアクリル酸の量を分析することにより測定した。
（４）Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＥＡ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３１） １．培養
グリセロール ５ｇ／Ｌ、酵母エキス ０．０２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／Ｌからなる培地（ｐＨ７．０）を調製し、これらを５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注して１２０℃にて１５分間オートクレープで滅菌した。この培地にＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＥＡ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２３１）を接種して３０℃で３日間振盪培養を行った。この培養液１ｍｌを同じ培地（三角フラスコ２０本）に接種し、同時にアセトアミド５ｇ／Ｌを添加して３０℃で４８時間振盪培養した。
遠心分離によって回収した菌体を、培養液と同量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄後、２００ｍｌの同緩衝液に懸濁し、洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で３６ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁し、それぞれの懸濁液を０．１ｍｌずつＭＹＫ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
アミダーゼ活性は、０．２Ｍグリシンアミドを含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液１ｍｌについて３０℃で所定時間反応を行わせてから遠心分離により菌体を除去した後、液体クロマトグラフィーにより生成したグリシンの量を分析することにより測定した。
（５）Ｒ．ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＡＲ０１６
１．培養
ＭＹＫ−Ｋｍ培地１００ｍｌにＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ ＡＴＣＣ１２６７４／ｐＡＲ０１６を接種し、３０℃で７２時間培養した。本培養は、同培地５Ｌ（５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ培地を入れた）で行い、前培養から１％接種し、３０℃で９６時間培養した。遠心分離によって回収した菌体を、培養液と同量の１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、５００ｍｌの同緩衝液に懸濁して洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で４２ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で３回洗浄後、菌体処理時の容量と同じになるように同緩衝液で懸濁した。
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁し、それぞれの懸濁液を０．１ｍｌずつＭＹＫ−Ｋｍ寒天培地に塗布し３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
アスパルターゼ活性は、１Ｍフマル酸アンモニウム及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液１ｍｌについて３０℃で所定時間反応を行わせてから遠心分離により菌体を除去した後、液体クロマトグラフィーにより生成したアスパラギン酸の量を分析することにより測定した。
（６）ロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４
１．培養
グルコース ５ｇ／Ｌ、酵母エキス ０．０２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １ｇ／Ｌからなる培地（ｐＨ７．０）を調製し、これらを５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注して１２０℃にて１５分間オートクレープで滅菌した。この培地にロドコッカス ロドクロウス ＡＴＣＣ１２６７４を接種して３０℃で３日間振盪培養を行った。この培養液１ｍｌを１０ｇ／Ｌのフマル酸を含む同じ培地（三角フラスコ２０本）に接種し、３０℃で４８時間振盪培養した。遠心分離によって回収した菌体を、培養液と同量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄後、２００ｍｌの同緩衝液に懸濁し、洗浄菌体を作製した。得られた洗浄菌体の菌濃度は、乾燥菌体で３１ｇ／Ｌであった。
２．死滅化処理
該洗浄菌体を用いて、表５に示す濃度となるように１．５％塩化ベンゼトニウム溶液を添加し、３０℃、５時間、死滅化処理を行った。また、比較として、１．５％塩化ベンゼトニウム溶液に代えて、リン酸緩衝液を添加し、同様な死滅化処理も行った。
３．生菌数の測定
処理後、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で３回洗浄後、菌体処理時の容量と同じになるように同緩衝液で懸濁した。
処理後、洗浄菌体を作製した際に用いた緩衝液で３回洗浄し、死滅化処理時と同じ容量になるよう同緩衝液で懸濁した懸濁液を０．１ｍｌずつＭＹＫ寒天培地に塗布し３０℃で３日間培養して生菌数を調べた。
４．酵素活性測定
フマラーゼ活性は、０．２Ｍフマル酸を含む０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．７）０．５ｍｌ及び死滅化処理後の洗浄菌体を含む反応混合液１ｍｌについて３０℃で所定時間反応を行わせてから遠心分離により菌体を除去した後、液体クロマトグラフィーにより生成したリンゴ酸の量を分析することにより測定した。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、工業的に有用な酵素等を失活させることなしに死滅させた微生物菌体を製造することができるため、微生物菌体を工業的に用いる場合、生菌体の漏洩による二次的汚染を回避することができる。特に遺伝子組換え体を使用する場合、本発明による死滅化処理を行うことにより、後の工程での菌体の取り扱いが簡便化されて、特殊な設備を必要としない等の工業的に有用な手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、プラスミドｐＳＪ０３４の作製方法を示す図である。
Claims (8)
- Rhodococcus rhodochrous J-1（FERM BP-1478）を、濃度０．０５〜５％の塩化ベンゼトニウム及びグルタルアルデヒドを含む水性媒体中で処理することにより死滅させた死滅化菌体。
- Rhodococcus rhodochrous J-1（FERM BP-1478）の乾燥菌体重量が５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌである、請求項１記載の死滅化菌体。
- グルタルアルデヒドの濃度が０．０５〜５％である、請求項１記載の死滅化菌体。
- ニトリルヒドラターゼ酵素活性を有するものである、請求項１記載の死滅化菌体。
- Rhodococcus rhodochrous J-1（FERM BP-1478）を、濃度０．０５〜５％の塩化ベンゼトニウム及びグルタルアルデヒドを含む水性媒体中で処理することを特徴とする死滅化菌体の製造方法。
- Rhodococcus rhodochrous J-1（FERM BP-1478）の乾燥菌体重量が５ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌである、請求項５記載の死滅化菌体の製造方法。
- グルタルアルデヒドの濃度が０．０５〜５％である、請求項５記載の死滅化菌体の製造方法。
- 死滅化菌体がニトリルヒドラターゼ酵素活性を有するものである、請求項５記載の死滅化菌体の製造方法。
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