KR100501864B1 - 사멸화 균체 - Google Patents

사멸화 균체 Download PDF

Info

Publication number
KR100501864B1
KR100501864B1 KR10-2002-7006044A KR20027006044A KR100501864B1 KR 100501864 B1 KR100501864 B1 KR 100501864B1 KR 20027006044 A KR20027006044 A KR 20027006044A KR 100501864 B1 KR100501864 B1 KR 100501864B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
solution
surfactant
cell
killed
Prior art date
Application number
KR10-2002-7006044A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20020059714A (ko
Inventor
후미아끼 와따나베
하나꼬 오까자끼
와따루 미즈나시
마꼬또 가노우
고우조 무라오
야스테루 아베
Original Assignee
미츠비시 레이온 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 미츠비시 레이온 가부시키가이샤 filed Critical 미츠비시 레이온 가부시키가이샤
Publication of KR20020059714A publication Critical patent/KR20020059714A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100501864B1 publication Critical patent/KR100501864B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/005—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor after treatment of microbial biomass not covered by C12N1/02 - C12N1/08
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/16—Enzymes or microbial cells immobilised on or in a biological cell

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 공업적으로 유용한 효소 등을 균체 내에 생산시킨 생균체를 상기 효소 등의 활성을 불활성화시키지 않고 사멸화시키는 공정에 있어서, 계면활성제를 첨가하여 사멸화시킨 사멸화 균체에 관한 것이다.

Description

사멸화 균체 {Sterilized Microbial Cells}
본 발명은 미생물 촉매 중에 포함되는 미생물 균체를 사멸화시켜 얻어지는 사멸화 균체에 관한 것이다.
미생물 균체를 공업적으로 사용하는 경우, 제조 중의 누출, 제품으로의 혼입, 또는 사용 후의 취급 등으로 인하여 2차적으로 미생물 오염이 야기될 가능성이 있다. 통상은 안전성이 높은 균체를 사용하여 폐쇄계에서 반응시키고, 반응액으로부터 규조토 등의 보조제를 사용하여 균체를 여과하여 제거하거나, 균체를 고정화함으로써 균체의 누설을 최소한으로 하는 조치를 취하는 것이 일반적이다. 이 경우, 안전성이 높은 균체를 사용하기 때문에 완전한 사멸화는 중요시되지 않았지만, 최근 제조자 책임에 대한 주목이 집중되고 있는 가운데, 안전성이 높은 균체를 사용하는 경우에 있어서도 생균체를 누설시키지 않을 것이 요구되고 있다.
또한, 유전자 재조합체를 사용하는 경우, 각종 가이드 라인에 의해 폐쇄계 이외에서의 조작인 경우에는 미생물 균체의 완전 사멸화가 요구되고 있다. 사멸화 방법으로서, 예를 들면, 목적으로 하는 효소 등의 불활성화가 일어나지 않는 조건에서 열처리하거나, 또는 균체를 파쇄하여 조효소액으로 사용하는 방법이 일반적이다. 약제 등을 사용하여 미생물을 사멸화하는 방법으로서는, 일반적으로 계면활성제가 사용되며, 계면활성제가 세균의 세포막을 파괴하거나 또는 생명 유지에 중요한 효소 단백질을 변성시키는 것 등에 의해 사멸화가 달성된다. 특히, 양이온 계면활성제, 양쪽성 계면활성제를 사용했을 경우, 높은 살균 효과를 나타낸다.
선행 기술로서 염화벤잘코늄을 첨가함으로써 대장균 재조합체를 사멸화시키는 방법이 개시되어 있다 (일본 특허 공개 (소)61-152276호 참조). 사멸화 방법으로서, 열처리의 경우에는 목적하는 효소 등이 열에 내성을 갖고 있지 못하면 사용이 불가능하다. 또한, 균체를 파쇄하여 조효소액으로 사용하는 경우에는, 번잡한 조작에 의해 조효소액을 제조해야 하며, 반응액으로부터의 효소 분리 조작이 균체를 사용하는 경우와 비교하여 부하가 매우 높아지게 된다. 따라서, 공업적인 이용이라는 관점에 있어서는 많은 문제가 있었다.
이온계 계면활성제에 의한 살균 방법은 공지된 사실이지만, 일반적으로 저농도의 미생물군을 살균하는 제균 효과이며, 본 발명에서 말하는 고농도의 미생물 균체의 사멸화를 달성할 수 있다는 것은 전혀 알려져 있지 않았다.
또한, 선행 기술 (일본 특허 공개 (소)61-152276호)은 대장균에만 실시된 처리법이다. 또한, 생리 활성 물질을 추출하여 정제하는 과정에서 적용되기 때문에 균체의 파괴, 응집 등은 문제가 되지 않았지만, 본 발명에서 얻어지는 사멸화 균체는 그대로 또는 고정화된 후, 물질 생산의 반응 촉매로서 사용되는 것이다. 따라서, 균체의 파괴 및 응집 등은 효소 활성, 반응성 저하 및 고정화시의 문제 발생의 원인이 되어 공업적 이용에 매우 불리하였다.
도 1은 플라스미드 pSJ034의 제조 방법을 나타내는 도면이다.
본 발명자들은 비교적 온화한 조건에서 범용성이 높고 동시에 공업적으로 유용한 효소 등을 균체 내에 생산시킨 생균체를 상기 효소의 활성 등을 불활성화시키지 않고 사멸시키는 방법에 대하여 검토한 결과, 계면활성제의 존재하에서 미생물 균체를 처리함으로써 공업적으로 유용한 효소의 불활성화 등을 수반하지 않고 미생물 균체의 사멸화를 달성할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 본 발명에서 말하는 균체의 사멸화란 비교적 고농도의 균체 현탁액 중의 해당 세균의 생균수를 실질적으로 제로(0)로 하는 것을 말한다. 여기에서, 생균수가 실질적으로 제로란 미생물 균체의 생존율이 1/10-5 이하가 되는 것을 의미한다. 생존율은 균체 현탁액 중의 생균수와 사멸화 처리 후에 균체 현탁액에 생존하는 생균수와의 비율로 표시된다. 생균수는 계측 대상인 균체 현탁액을 소정 농도로 희석한 후, 균체가 생육 가능한 고체 배지 상에 해당 균체 현탁액을 뿌려, 해당 고체 배지 상에 생육된 균체수와 희석 배율로부터 산출된다.
즉, 본 발명은 공업적으로 유용한 효소 등을 균체 내에 생산시킨 생균체를, 상기 효소 등의 활성을 불활성화시키지 않고 사멸화시키는 공정에 있어서, 계면활성제를 첨가하여 사멸화시킨 미생물 균체 및 그의 제조법에 관한 것이다.
본 발명은 이하의 (1) 내지 (14)를 포함한다.
(1) 건조 균체 중량이 5 g/ℓ 내지 200 g/ℓ인 미생물 촉매를 계면활성제를 포함하는 수성 매질 중에서 처리함으로써 사멸시킨 사멸화 균체.
(2) 상기 (1)에 있어서, 계면활성제가 양이온계 계면활성제 또는 양쪽성 계면활성제인 사멸화 균체.
(3) 상기 (2)에 있어서, 양이온계 계면활성제가 염화벤제토늄, 염화세틸피리디늄, 염화메틸스테아로일 및 브롬화세틸트리메틸암모늄의 군에서 선택되는 1종 이상인 사멸화 균체.
(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제를 15％ 이하의 용액으로서 첨가하여 처리함으로써 사멸시킨 사멸화 균체.
(5) 상기 (3) 또는 (4)에 있어서, 염화벤제토늄의 농도가 0.05 내지 5％인 사멸화 균체.
(6) 미생물 촉매를 계면활성제 및 글루타르알데히드를 포함하는 수성 매질 중에서 처리함으로써 사멸시킨 사멸화 균체.
(7) 상기 (6)에 있어서, 미생물 촉매의 건조 균체 중량이 5 g/ℓ 내지 200 g/ℓ인 사멸화 균체.
(8) 상기 (6) 또는 (7)에 있어서, 계면활성제가 양이온계 계면활성제 또는 양쪽성 계면활성제인 사멸화 균체.
(9) 상기 (6) 내지 (8) 중 어느 한 항에 있어서, 양이온계 계면활성제가 염화벤제토늄, 염화세틸피리디늄, 염화메틸스테아로일, 브롬화세틸트리메틸암모늄의 군에서 선택되는 1종 이상인 사멸화 균체.
(10) 상기 (9)에 있어서, 염화벤제토늄의 농도가 0.05 내지 5％인 사멸화 균체.
(11) 상기 (6) 내지 (10) 중 어느 한 항에 있어서, 글루타르알데히드의 농도가 0.05 내지 5％인 사멸화 균체.
(12) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 한 항에 있어서, 미생물 촉매가 니트릴 히드라타제, 니트릴라제, 아미다제, 푸마라제, 아스파르타제 및 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산:에틸렌디아민 리아제로부터 선택되는 1종 이상의 효소 활성을 갖는 것인 사멸화 균체.
(13) 상기 (12)에 있어서, 미생물 촉매가 유전자 재조합체 세균을 포함하는 것인 사멸화 균체.
(14) 상기 (13)에 있어서, 유전자 재조합체 세균이 로도코커스 (Rhodococcus)속 세균인 사멸화 균체.
본 발명에서 대상이 되는 미생물 촉매는 특별히 한정되지 않지만, 화학품 등을 제조할 때 생체 촉매로서 사용하는 미생물 균체, 특히 유전자 재조합체를 포함하는 것이다. 미생물 균체로서는, 예를 들면 아크릴로니트릴을 아크릴아미드로 변환시키는 니트릴 히드라타제 생산균인 로도코커스 로도크러스 (Rhodococcus rhodochrous) J-1, 니트릴 히드라타제 유전자를 도입한 유전자 재조합체 로도코커스 로도크러스 ATCC12674/pKNH2, 아크릴로니트릴을 아크릴산으로 변환시키는 니트릴라제 생산균인 로도코커스 종 (Rhodococcus sp.) SK92, 글리신아미드를 글리신으로 변환시키는 아미다제 생산균인 로도코커스 종 EA4, 푸마르산을 말산으로 변환시키는 푸마라제 생산균인 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) ATCC6051, 바실러스 스테아로테르모필러스 (Bacillus stearothermophilus) ATCC12016 및 로도코커스 로도크러스 ATCC12674, 푸마르산과 암모니아를 L-아스파라긴산으로 변환시키는 아스파르타제 유전자를 도입한 유전자 재조합체 로도코커스 로도크러스 ATCC12674/pAR016, 푸마르산과 디아민류를 폴리아미노카르복실산류로 변환시키는 효소 유전자를 도입한 유전자 재조합체인 로도코커스 로도크러스 ATCC17895/pSE001 등을 들 수 있다.
상기 로도코커스 로도크러스 J-1은 FERM BP-1478로서, 1987년 9월 18일자로 통산성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고)에 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁되어 있다. 상기 로도코커스 로도크러스 ATCC12674/pKNH2는 FERM BP-3733으로서, 1991년 3월 1일자로 통산성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고)에 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁되어 있다. 상기 로도코커스 종 SK92는 FERM BP-3324로서, 1990년 2월 21일자로 통산성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고)에 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁되어 있다. 상기 로도코커스 종 EA4는 FERM BP-6231로서, 1991년 3월 28일자로 통산성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고)에 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁되어 있다. 상기 로도코커스 로도크러스 ATCC17895/pSE001은 FERM BP-6548로서, 1997년 9월 18일자로 통산성 공업 기술원 생명 공학 공업 기술 연구소 (일본 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1방 3고)에 부다페스트 조약에 근거하여 국제 기탁되어 있다.
또한, 기탁 번호의 기재가 없는 재조합체에 대해서는, 그 제조법을 이하에 나타내었다. 그 밖의 균은 공지된 것이며, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 쉽게 입수할 수 있다. 푸마르산과 암모니아로부터 L-아스파라긴산을 제조할 때 사용되는 유전자 재조합체 로도코커스 로도크러스 ATCC12674/pAR016은 일본 특허 공개 (평)10-337185호 명세서에 기재된 방법으로 제조하였다.
푸마르산과 디아민류로부터 폴리아미노카르복실산류를 제조할 때 사용되는 유전자 재조합체 로도코커스 로도크러스 ATCC17895/pSE001 (FERM BP-6548)은 이하와 같이 하여 제조하였다.
플라스미드 pED020 (일본 특허 공개 (평)10-210984호 명세서에 기재) 2 ㎕에 대하여 10배 농도의 제한효소용 완충액 2 ㎕, 멸균수 15 ㎕, 제한효소 XhoI 1 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 2시간 반응시켰다. 에탄올 침전에 의해 플라스미드를 회수하고, 건조한 후 15 ㎕의 멸균수, 2 ㎕의 10배 농도 클레나우 단편(Klenow fragment)용 완충액, 2 ㎕의 10 mM dNTP 용액, 1 ㎕의 클레나우 단편을 첨가하여 37 ℃에서 2시간 반응시켰다. 에탄올 침전에 의해 DNA 단편을 회수하고, 건조한 후 8 ㎕의 멸균수, 1 ㎕의 XbaI 링커(linker) 용액, 16 ㎕의 라이게이션 키트 (Ligation kit)(다까라 슈조 가부시끼 가이샤 제조) 용액 A 및 4 ㎕의 용액 B를 첨가하여 16 ℃에서 4시간 반응시킨 후, JM109로 형질 전환시켰다. 얻어진 재조합체로부터 플라스미드를 제조하고, pED020의 XhoI 부위가 XbaI 부위로 변환된 플라스미드를 얻었다. 얻어진 플라스미드 2 ㎕에 대하여 10배 농도의 제한효소용 완충액 2 ㎕, 멸균수 15 ㎕, 제한효소 EcoRV 1 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 2시간 반응시켰다. 에탄올 침전에 의해 DNA 단편을 회수하고, 건조한 후 8 ㎕의 멸균수, 1 ㎕의 Sse8387I 링커 용액, 16 ㎕의 라이게이션 키트 (다까라 슈조 가부시끼 가이샤 제조) 용액 A 및 4 ㎕의 용액 B를 첨가하여 16 ℃에서 4시간 반응시킨 후, JM109로 형질 전환시켰다. 얻어진 재조합체로부터 플라스미드를 제조하고, EcoRV 부위가 Sse8387I 부위로 변환된 플라스미드를 얻었다. 얻어진 플라스미드 2 ㎕에 대하여 10배 농도의 제한효소용 완충액 2 ㎕, 멸균수 14 ㎕, 제한효소 XbaI 1 ㎕ 및 Sse8387I 1 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 0.7％ 아가로스 전기 영동으로 분리하여 1.7 Kb의 밴드를 회수하고, 로도코커스 세균의 프로모터를 포함하는 플라스미드 pSJ034의 XbaI-Sse8387I 부위에 삽입하여 재조합체 플라스미드 pSE001을 제조하였다.
pSJ034는 플라스미드 pSJ023 (일본 특허 출원 (평)9-65618호 명세서에 기재)으로부터 도 1에 나타낸 공정에 의해 제조하였다.
로도코커스 로도크러스 ATCC17895주의 로그 증식기의 세포를 원심분리기에 의해 집균하여 빙냉한 멸균수로 3회 세정하고, 멸균수에 현탁하였다. 플라스미드 pSE001 1 ㎕와 균체 현탁액 10 ㎕를 혼합하여 빙냉하였다. 큐벳 (cuvette)에 DNA와 균체의 현탁액을 넣고, 유전자 도입 장치 Gene Pulser (BIO RAD)에 의해 2.0 KV, 200 OHMS로 전기 펄스 처리를 행하였다. 전기 펄스 처리액을 빙냉하에서 10분간 정치하고, 37 ℃에서 10분간 열충격을 가하고, MYK 배지 {폴리펩톤 5 g/ℓ, 박토-이스트 엑기스 (bacto-yeast extract) 3 g/ℓ, 박트-몰트 엑기스 (bact-malt extract) 3 g/ℓ, K2HPO4 2 g/ℓ, KH2PO4 2 g/ℓ} 500 ㎕를 첨가하여 30 ℃에서 5시간 정치한 후, 50 mg/ℓ의 카나마이신이 혼입된 MYK 한천 배지에 도포하고, 30 ℃에서 3일간 배양하여 재조합체 로도코커스 로도크러스 ATCC17895/pSE001 (FERM BP-6548)을 제조하였다.
본 발명에 있어서, 사멸화 처리란 미생물 촉매 중에 포함되는 미생물 균체에 대하여 계면활성제 및(또는) 글루타르알데히드를 작용시키는 처리를 말한다. 구체적으로, 사멸화 처리란 미생물 균체 현탁액에 계면활성제 및 필요에 따라 그 밖의 첨가제를 용해시켜 미생물 균체와 계면활성제를, 또는 미생물 균체와 계면활성제와 첨가제를 접촉시키는 처리를 말한다. 이 사멸화 처리시에는 보냉 또는 보온을 유지하면서 행하는 것이 바람직하다. 사멸화 처리를 소정의 온도로 유지한 상태에서 행함으로써 미생물 촉매로서의 능력을 높이 유지할 수 있다. 또한, 사멸화 처리는 교반하면서 행할 수도 있다.
균체를 처리할 때, 배양액, 이 배양액을 적당한 완충액 등으로 세정한 세정 균체, 또는 그의 처리물을 이용할 수 있다. 또한, 사멸화 처리시에는, 예를 들면 세정성 향상, 세포막의 투과성 향상 및 균체의 안정성 향상 등을 목적으로 약제 처리, 균체 파쇄 처리 등을 미리 실시하는 것이 바람직하다.
사멸화 처리시의 균체 농도는 특별히 한정되지 않지만, 배양액의 균 농도 이상이 바람직하다. 공업적인 이용이라는 관점에서는, 건조 균체로 5 g/ℓ 이상인 것이 바람직하다. 또한, 사멸화 처리시의 균체 농도는 건조 균체로 200 g/ℓ 이하인 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 고농도의 미생물 균체 현탁액에 대하여 확실하게 사멸화 처리를 행할 수 있다. 그러나, 건조 균체로 200 g/ℓ를 초과하는 균체 농도의 경우에는, 미생물의 종류 및 성질에 따라 상이하기는 하겠지만, 일반적으로 균체 현탁액의 유동성이 현저히 저하되고, 계면활성제 등의 분산성 및 용해성이 악화되어 미생물 균체의 사멸화를 효율적으로 행하지 못할 우려가 있다. 따라서, 사멸화 처리시의 균체 농도는 5 내지 200 g/ℓ인 것이 바람직하다.
균체를 사멸화 처리할 때의 처리 온도는 빙결 온도 내지 80 ℃, 바람직하게는 0 내지 70 ℃에서 행할 수 있다. 온도는 특별히 한정되지 않지만, 목적으로 하는 효소 등의 안정성에 따라 임의로 설정할 수 있다.
균체를 사멸화 처리할 때 첨가하는 계면활성제로서는 특별히 한정되지 않지만, 양이온계 계면활성제, 음이온계 계면활성제, 비이온계 계면활성제 및 양쪽성 계면활성제 등 중에서 어느 하나를 사용할 수 있다. 비이온계 계면활성제로서는, 예를 들면 KS604 (신에쓰 가가꾸 고교 가부시끼 가이샤 제조), 플루로닉 L61, LG126 (아사히 덴카 고교 가부시끼 가이샤 제조), 에멀겐 109P (카오 가부시끼 가이샤 제조), 트리톤 X-100 등을 들 수 있다. 또한, 양이온계 계면활성제로서는, 예를 들면 염화벤제토늄, 염화세틸피리디늄, 염화메틸스테아로일, 브롬화세틸트리메틸암모늄 등을 들 수 있다. 양쪽성 계면활성제로서는, 카르복시베타인형, 아미노카르복실산염 등을 들 수 있다. 양이온계 계면활성제 및 양쪽성 계면활성제는 살균 효과가 높다고 알려져 있으며, 저농도에서 효과적으로 균체를 사멸화시킬 수 있기 때문에 바람직하다. 또한, 균체의 사멸화 처리에는, 필요에 따라 계면활성제를 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
균체를 사멸화 처리할 때의 계면활성제의 농도는 통상은 0.01 내지 20％이며, 또한 O.O5 내지 10％가 보다 바람직하다. 계면활성제의 농도는 지나치게 낮으면 균체 사멸화에 충분한 효과를 기대할 수 없으며, 또한 지나치게 높으면 처리 후의 폐기물 처리 문제 및 공업적으로 유용한 효소 등의 불활성화 등의 문제가 발생하기 때문에, 사용하는 미생물 균체 및 목적으로 하는 효소 등의 안정성 등을 고려하여 최적의 농도를 선택하는 것이 바람직하다.
또한, 이온계 계면활성제를 사용할 때, 첨가시에 고농도의 용액을 사용하면 사멸화 처리시에 미생물 균체의 용균, 파괴 및 응집을 야기시키는 경우가 있다. 계면활성제는 저농도로 첨가하는 것이 유효하다. 농도는 통상은 0.5 내지 15％이며, 또한 1 내지 8％ 정도로 첨가하는 것이 바람직하다.
사멸화 처리시의 처리액의 pH는 통상은 4 내지 11이며, 또한 5 내지 10이 보다 바람직하다. 처리시의 pH는 목적으로 하는 효소 등의 안정성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하다.
사멸화 처리시에 그 효과를 향상시킬 목적으로 각종 첨가제를 첨가하는 것도 유효하다. 예를 들면, 에탄올 등의 알콜류, 2-머캅토에탄올 등의 티올류, 에틸렌디아민 등의 아민류, 시스테인, 오르니틴 및 시트룰린 등의 아미노산류, 글루타르알데히드 등의 알데히드류를 들 수 있다.
또한, 목적으로 하는 효소 등의 안정성을 향상시킬 목적으로 이 효소 등의 기질, 생성물, 저해제 등을 첨가하는 것도 유효하다. 예를 들면, 각종 니트릴, 각종 아미드, 각종 유기산, 아미노산, 폴리아미노카르복실산 등을 들 수 있다. 이러한 첨가제는 목적으로 하는 효소 등의 안정성을 고려하여 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 최적의 조합 및 최적의 농도를 선택하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예로 그 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
로도코커스 로도크러스 ATCC17895/pSE001 (FERM BP-6548)
1. 배양
MYK-Km 배지 (MYK 배지에 50 mg/ℓ의 카나마이신 함유) 200 ㎖에 접종하여 30 ℃에서 72시간 전배양하였다. 이 배양물을 30 ℓ 용기를 사용하여 글루코스 15 g/ℓ, 글루탐산 나트륨 10 g/ℓ, 박토-이스트 엑기스 1 g/ℓ, KH2PO4 0.5 g/ℓ, K2HPO4 0.5 g/ℓ, 황산마그네슘 0.5 g/ℓ, 50 mg/ℓ 카나마이신을 포함하는 배지 20 ℓ (pH 7.2)에 첨가하여 30 ℃에서 60시간 통기 교반 배양을 행하였다. 얻어진 배양액 20 ℓ를 중공 사막 클로스플로우(clothflow) SF FILTER KL-F-8102 (쿠라레 가부시끼 가이샤 제조)로 모노 펌프 (mohno pump, 1 m/s)에 의해 순환시킴으로써 농축하였다. 배양 여과액이 10 ℓ 배출된 후, 배양 여과액이 2 ℓ 배출될 때마다 100 mM 붕산 완충액 (pH 9.2)을 2 ℓ 첨가하고, 총 20 ℓ의 완충액을 사용해서 연속 세정을 행하여 세정 균체 10 kg을 제조하였다. 얻어진 세정 균체의 균 농도는 건조 균체로 42 g/ℓ였다.
2. 사멸화 처리
상기 세정 균체 50 ㎖를 사용하여 표 1에 나타낸 5％ 계면활성제 용액을 각각 1 ㎖씩 첨가하고, 45 ℃에서 처리하였다.
3. 생균수의 측정
균체 처리 종료 후, 사용한 세정 균체와 동일 용량의 100 mM 붕산 완충액 (pH 9.2)으로 2회 세정하고, 세정 균체와 동일 용량이 되도록 현탁하였다. 각각의 현탁액을 0.1 ㎖ 씩 MYK-Km 한천 배지에 도포하고, 30 ℃에서 3일간 배양하여 생균수를 조사하였다.
4. 효소 활성 측정
각 사멸화 균체 1 ㎖를 342 mM 푸마르산과 171 mM 에틸렌디아민을 포함하는 pH 8.0의 수용액 50 ㎖에 현탁하여 24시간 반응시켰다. 반응액으로부터 원심 분리에 의해 균체를 제거한 후, 상청의 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산량을 HPLC를 사용하여 분석하고, 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산:에틸렌디아민 리아제 (이하, EDDS 아제라고 약칭함) 활성을 조사하였다 {컬럼; WAKOSIL 5C8 (와꼬 쥰야꾸 가부시끼 가이샤 제조), 용출액; 10 mM 수산화테트라-n-부틸암모늄과 0.4 mM CuSO4를 포함하는 50 mM 인산 pH 2.0}. 사멸화 처리를 행하지 않은 세정 균체의 EDDS 아제 활성을 100으로 하여, 처리 후의 EDDS 아제의 활성 잔존율을 구하였다.
<실시예 2>
실시예 1의 방법으로 제조한 세정 균체 50 ㎖를 사용하여 표 2에 나타낸 농도가 되도록 2.5％ 염화벤제토늄 용액을 첨가하고, 10 ℃ 또는 30 ℃에서 8시간 처리하여 처리 후의 생균수 및 EDDS 아제의 활성 잔존율을 구하였다.
<실시예 3>
실시예 1의 방법으로 제조한 세정 균체 50 ㎖를 사용하여 표 3에 나타낸 농도가 되도록 0.6％, 1.5％, 3％의 염화벤제토늄을 포함하는 30％ 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산 용액 (pH 8.5)을 10 ㎖ 첨가하고, 30 ℃ 또는 50 ℃에서 3시간 균체 처리하여 처리 후의 생균수 및 EDDS 아제의 활성 잔존율을 구하였다.
<실시예 4>
실시예 1의 방법으로 제조한 배양액 50 ㎖를 사용하여 표 4에 나타낸 농도가 되도록 각각의 2％ 계면활성제 용액을 첨가하고, 4 ℃ 또는 30 ℃에서 3시간 균체 처리하여 처리 후의 생균수 및 EDDS 아제의 활성 잔존율을 구하였다.
<실시예 5>
(1) 로도코커스 로도크러스 J-1 (FERM BP-1478)
1. 배양
글루코스 10 g/ℓ, K2HPO4 0.5 g/ℓ, KH2PO4 0.5 g/ℓ, MgSO 4ㆍ7H2O 0.5 g/ℓ, 효모 엑기스 1 g/ℓ, 펩톤 7.5 g/ℓ를 포함하는 배지 (pH 7.2)를 제조하고, 이것들을 500 ㎖ 삼각 플라스크에 100 ㎖ 분배하여 120 ℃에서 15분간 오토클레이브에서 멸균하였다. 이 배지에 로도코커스 로도크러스 J-1 (FERM BP-1478)을 접종하여 28 ℃에서 3일간 진탕 배양하였다. 이 배양액 1 ㎖를 동일 배지 (삼각 플라스크 20개)에 접종하고, 동시에 요소 15 g/ℓ, CoCl2 10 mg/ℓ를 첨가하여 28 ℃에서 96시간 진탕 배양하였다. 원심 분리에 의해 회수한 균체를 배양액과 동일량의 50 mM 인산 완충액 (pH 7.7)으로 세정한 후, 100 ㎖의 동일 완충액에 현탁하여 세정 균체를 제조하였다. 얻어진 세정 균체의 균 농도는 건조 균체로 105 g/ℓ였다.
2. 사멸화 처리
상기 세정 균체를 사용하여 표 5에 나타낸 농도가 되도록 1.5％ 염화벤제토늄 용액 및(또는) 0.25％ 글루타르알데히드 용액을 첨가하고, 30 ℃에서 5시간 사멸화 처리를 행하였다. 또한, 비교예로서 1.5％ 염화벤제토늄 용액 및(또는) 0.25％ 글루타르알데히드 용액 대신에 인산 완충액을 첨가하여 동일하게 사멸화 처리도 행하였다.
3. 생균수의 측정
처리 후, 세정 균체를 제조했을 때 사용한 완충액으로 3회 세정하고, 사멸화 처리시와 동일 용량이 되도록 동일 완충액으로 현탁하고, 각각의 현탁액을 0.1 ㎖씩 MYK 한천 배지에 도포하고, 30 ℃에서 3일간 배양하여 생균수를 조사하였다.
4. 효소 활성 측정
니트릴 히드라타제 활성은, 1 M 아크릴로니트릴 1.0 ㎖, 0.1 M 인산 칼륨 완충액 (pH 7.0) 0.5 ㎖ 및 사멸화 처리 후의 세정 균체를 포함하는 반응 혼합액 2 ㎖에 대하여 10 ℃에서 소정 시간 반응을 행하고 나서 0.2 ㎖의 1 N HCl를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 가스 크로마토그래피에 의해 생성된 아크릴아미드의 양을 분석함으로써 측정하였다.
(2) 로도코커스 로도크러스 ATCC12674/pKNH2 (FERM BP-3733)
1. 배양
글리세롤 10 g/ℓ, 폴리펩톤 5 g/ℓ, 효모 엑기스 3 g/ℓ, 말트 엑기스 3 g/ℓ를 포함하는 배지 (pH 7.2)를 제조하고, 이것들을 500 ㎖ 삼각 플라스크에 100 ㎖ 분배하여 120 ℃에서 15분간 오토클레이브에서 멸균하였다. 이 배지에 로도코커스 로도크러스 ATCC12674/pKNH2 (FERM BP-3733)를 접종하여 25 ℃에서 2일간 진탕 배양하였다. 이 배양액 1 ㎖를 동일 배지 (삼각 플라스크 20개)에 접종하고, 동시에 이소부티로니트릴, 이소부틸아미드를 각각 1 g/ℓ가 되도록 첨가하여 25 ℃에서 광조사하에 3일간 배양하였다. 원심 분리에 의해 회수한 균체를 배양액과 동일량의 50 mM 인산 완충액 (pH 7.7)으로 세정한 후, 200 ㎖의 동일 완충액에 현탁하여 세정 균체를 제조하였다. 얻어진 세정 균체의 균 농도는 건조 균체로 32 g/ℓ였다.
2. 사멸화 처리
상기 세정 균체를 사용하여 표 5에 나타낸 농도가 되도록 1.5％ 염화벤제토늄 용액을 첨가하고, 30 ℃에서 5시간 사멸화 처리를 행하였다. 또한, 비교예로서 1.5％ 염화벤제토늄 용액 대신에 인산 완충액을 첨가하여 동일하게 사멸화 처리도 행하였다.
3. 생균수의 측정
처리 후, 세정 균체를 제조했을 때 사용한 완충액으로 3회 세정하고, 사멸화 처리시와 동일 용량이 되도록 동일 완충액으로 현탁하고, 각각의 현탁액을 0.1 ㎖씩 MYK-Km 한천 배지에 도포하고, 30 ℃에서 3일간 배양하여 생균수를 조사하였다.
4. 효소 활성 측정
니트릴 히드라타제 활성은, 1 M 아크릴로니트릴 1.0 ㎖, 0.1 M 인산 칼륨 완충액 (pH 7.0) 0.5 ㎖ 및 사멸화 처리 후의 세정 균체를 포함하는 반응 혼합액 2 ㎖에 대하여 10 ℃에서 소정 시간 반응을 행하고 나서 0.2 ㎖의 1N HCl를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 가스 크로마토그래피에 의해 생성된 아크릴아미드의 양을 분석함으로써 측정하였다.
(3) 로도코커스 종 SK92 (FERM BP-3324)
1. 배양
슈크로스 20 g/ℓ, 폴리펩톤 5 g/ℓ, KH2PO4 1 g/ℓ, K2HPO4 1 g/ℓ, MgSO4ㆍ 7H2O 1 g/ℓ를 포함하는 배지 (pH 7.2)를 제조하고, 이것들을 500 ㎖ 삼각 플라스크에 100 ㎖ 분배하여 120 ℃에서 15분간 오토클레이브에서 멸균하였다. 이 배지에 로도코커스 종 SK92 (FERM BP-3324)를 접종하여 30 ℃에서 3일간 진탕 배양하였다. 이 배양액 1 ㎖를 동일 배지 (삼각 플라스크 20개)에 접종하고, 동시에 에틸렌시안히드린 2 ㎖를 첨가하여 30 ℃에서 20시간 진탕 배양한 후, 에틸렌시안히드린 3 ㎖를 첨가하여 3일간 더 배양하였다.
원심 분리에 의해 회수한 균체를 배양액과 동일량의 50 mM 인산 완충액 (pH 7.7)으로 세정한 후, 200 ㎖의 동일 완충액에 현탁하여 세정 균체를 제조하였다. 얻어진 세정 균체의 균 농도는 건조 균체로 36 g/ℓ였다.
2. 사멸화 처리
상기 세정 균체를 사용하여 표 5에 나타낸 농도가 되도록 1.5％ 염화벤제토늄 용액을 첨가하고, 30 ℃에서 5시간 사멸화 처리를 행하였다. 또한, 비교예로서 15％ 염화벤제토늄 용액 대신에 인산 완충액을 첨가하여 동일하게 사멸화 처리도 행하였다.
3. 생균수의 측정
처리 후, 세정 균체를 제조했을 때 사용한 완충액으로 3회 세정하고, 사멸화 처리시와 동일 용량이 되도록 동일 완충액으로 현탁하고, 각각의 현탁액을 0.1 ㎖씩 MYK-Km 한천 배지에 도포하고, 30 ℃에서 3일간 배양하여 생균수를 조사하였다.
4. 효소 활성 측정
니트릴라제 활성은, 1 M 아크릴로니트릴 1.0 ㎖, 0.1 M 인산 칼륨 완충액 (pH 7.0) 0.5 ㎖ 및 사멸화 처리 후의 세정 균체를 포함하는 반응 혼합액 2 ㎖에 대하여 10 ℃에서 소정 시간 반응을 행하고 나서 0.2 ㎖의 1 N HCl를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 액체 크로마토그래피에 의해 생성된 아크릴산의 양을 분석함으로써 측정하였다.
(4) 로도코커스 종 EA4 (FERM BP-6231)
1. 배양
글리세롤 5 g/ℓ, 효모 엑기스 0.02 g/ℓ, MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g/ℓ, KH2PO 4 1 g/ℓ, K2HPO4 1 g/ℓ를 포함하는 배지 (pH 7.0)를 제조하고, 이것들을 500 ㎖ 삼각 플라스크에 100 ㎖ 분배하여 120 ℃에서 15분간 오토클레이브에서 멸균하였다. 이 배지에 로도코커스 종 EA4 (FERM BP-6231)를 접종하여 30 ℃에서 3일간 진탕 배양하였다. 이 배양액 1 ㎖를 동일 배지 (삼각 플라스크 20개)에 접종하고, 동시에 아세트아미드 5 g/ℓ를 첨가하여 30 ℃에서 48시간 진탕 배양하였다.
원심 분리에 의해 회수한 균체를 배양액과 동일량의 50 mM 인산 완충액 (pH 7.7)으로 세정한 후, 200 ㎖의 동일 완충액에 현탁하여 세정 균체를 제조하였다. 얻어진 세정 균체의 균 농도는 건조 균체로 36 g/ℓ였다.
2. 사멸화 처리
상기 세정 균체를 사용하여 표 5에 나타낸 농도가 되도록 1.5％ 염화벤제토늄 용액을 첨가하고, 30 ℃에서 5시간 사멸화 처리를 행하였다. 또한, 비교예로서 1.5％ 염화벤제토늄 용액 대신에 인산 완충액을 첨가하여 동일하게 사멸화 처리도 행하였다.
3. 생균수의 측정
처리 후, 세정 균체를 제조했을 때 사용한 완충액으로 3회 세정하고, 사멸화 처리시와 동일 용량이 되도록 동일 완충액으로 현탁하고, 각각의 현탁액을 0.1 ㎖씩 MYK 한천 배지에 도포하고, 30 ℃에서 3일간 배양하여 생균수를 조사하였다.
4. 효소 활성 측정
아미다제 활성은, 0.2 M 글리신아미드를 포함하는 0.05 M 인산 칼륨 완충액 (pH 7.7) 0.5 ㎖ 및 사멸화 처리 후의 세정 균체를 포함하는 반응 혼합액 1 ㎖에 대하여 30 ℃에서 소정 시간 반응을 행하고 나서 원심 분리에 의해 균체를 제거한 후, 액체 크로마토그래피에 의해 생성된 글리신의 양을 분석함으로써 측정하였다.
(5) 로도코커스 로도크러스 ATCC12674/pAR016
1. 배양
MYK-Km 배지 100 ㎖에 로도코커스 로도크러스 ATCC12674/pAR016을 접종하여 30 ℃에서 72시간 배양하였다. 본 배양은 동일 배지 5 ℓ(50O ㎖ 삼각 플라스크에 100 ㎖씩 배지를 넣음)에서 행하고, 전배양으로부터 1％ 접종하여 30 ℃에서 96시간 배양하였다. 원심 분리에 의해 회수한 균체를 배양액과 동일량의 100 mM 인산 완충액 (pH 8.0)으로 세정한 후, 500 ㎖의 동일 완충액에 현탁하여 세정 균체를 제조하였다. 얻어진 세정 균체의 균 농도는 건조 균체로 42 g/ℓ였다.
2. 사멸화 처리
상기 세정 균체를 사용하여 표 5에 나타낸 농도가 되도록 1.5％ 염화벤제토늄 용액을 첨가하고, 30 ℃에서 5시간 사멸화 처리를 행하였다. 또한, 비교예로서 1.5％ 염화벤제토늄 용액 대신에 인산 완충액을 첨가하여 동일하게 사멸화 처리도 행하였다.
3. 생균수의 측정
처리 후, 1 mM의 MgCl2를 함유하는 100 mM 인산 완충액 (pH 8.0)으로 3회 세정한 후, 균체 처리시의 용량과 동일해지도록 동일 완충액으로 현탁하였다.
처리 후, 세정 균체를 제조했을 때 사용한 완충액으로 3회 세정하고, 사멸화 처리시와 동일 용량이 되도록 동일 완충액으로 현탁하고, 각각의 현탁액을 0.1 ㎖씩 MYK-Km 한천 배지에 도포하고, 30 ℃에서 3일간 배양하여 생균수를 조사하였다.
4. 효소 활성 측정
아스파르타제 활성은, 1 M 푸마르산 암모늄 및 1 mM MgCl2를 포함하는 0.05 M 인산 칼륨 완충액 (pH 8.0) 0.5 ㎖ 및 사멸화 처리 후의 세정 균체를 포함하는 반응 혼합액 1 ㎖에 대하여 30 ℃에서 소정 시간 반응을 행하고 나서 원심 분리에 의해 균체를 제거한 후, 액체 크로마토그래피에 의해 생성된 아스파라긴산의 양을 분석함으로써 측정하였다.
(6) 로도코커스 로도크러스 ATCC12674
1. 배양
글루코스 5 g/ℓ, 효모 엑기스 0.02 g/ℓ, MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g/ℓ, KH2PO 4 1 g/ℓ, K2HPO4 1 g/ℓ를 포함하는 배지 (pH 7.0)를 제조하고, 이것들을 500 ㎖ 삼각 플라스크에 100 ㎖ 분배하여 120 ℃에서 15분간 오토클레이브에서 멸균하였다. 이 배지에 로도코커스 로도크러스 ATCC12674를 접종하여 30 ℃에서 3일간 진탕 배양하였다. 이 배양액 1 ㎖를 10 g/ℓ의 푸마르산을 포함하는 동일 배지 (삼각 플라스크 20개)에 접종하여 30 ℃에서 48시간 진탕 배양하였다. 원심 분리에 의해 회수한 균체를 배양액과 동일량의 50 mM 인산 완충액 (pH 7.7)으로 세정한 후, 200 ㎖의 동일 완충액에 현탁하여 세정 균체를 제조하였다. 얻어진 세정 균체의 균 농도는 건조 균체로 31 g/ℓ였다.
2. 사멸화 처리
상기 세정 균체를 사용하여 표 5에 나타낸 농도가 되도록 1.5％ 염화벤제토늄 용액을 첨가하고, 30 ℃에서 5시간 사멸화 처리를 행하였다. 또한, 비교예로서 15％ 염화벤제토늄 용액 대신에 인산 완충액을 첨가하여 동일하게 사멸화 처리도 행하였다.
3. 생균수의 측정
처리 후, 1 mM의 MgCl2를 함유하는 100 mM 인산 완충액 (pH 8.0)으로 3회 세정한 후, 균체 처리시의 용량과 동일해지도록 동일 완충액으로 현탁하였다.
처리 후, 세정 균체를 제조했을 때 사용한 완충액으로 3회 세정하고, 사멸화 처리시와 동일 용량이 되도록 동일 완충액으로 현탁한 현탁액을 0.1 ㎖씩 MYK 한천 배지에 도포하고, 30 ℃에서 3일간 배양하여 생균수를 조사하였다.
4. 효소 활성 측정
푸마라제 활성은, 0.2 M 푸마르산을 포함하는 0.05 M 인산 칼륨 완충액 (pH 7.7) 0.5 ㎖ 및 사멸화 처리 후의 세정 균체를 포함하는 반응 혼합액 1 ㎖에 대하여 30 ℃에서 소정 시간 반응을 행하고 나서 원심 분리에 의해 균체를 제거한 후, 액체 크로마토그래피에 의해 생성된 말산의 양을 분석함으로써 측정하였다.
또한, 본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고하여 본 명세서에 도입하기로 한다.
본 발명에 따르면, 공업적으로 유용한 효소 등을 불활성화시키지 않고 사멸시킨 미생물 균체를 제조할 수 있기 때문에, 미생물 균체를 공업적으로 사용하는 경우 생균체 누설에 따른 2차적 오염을 피할 수 있다. 특히, 유전자 재조합체를 사용하는 경우, 본 발명에 의한 사멸화 처리를 행함으로써, 다음 공정에서의 균체 취급이 간편해지고, 특수한 설비를 필요로 하지 않는 등의 공업적으로 유용한 수단을 제공할 수 있다.

Claims (19)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 미생물 촉매, 계면활성제, 글루타르알데히드 및 수성 매질을 포함하고 높은 촉매 활성을 유지하는, 사멸화 균체를 함유하는 용액.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미생물 촉매의 건조 균체 중량이 5 내지 200 g/ℓ인, 사멸화 균체를 함유하는 용액.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 계면활성제가 양이온계 계면활성제 또는 양쪽성 계면활성제인, 사멸화 균체를 함유하는 용액.
  9. 제8항에 있어서, 상기 양이온계 계면활성제가 염화벤제토늄, 염화세틸피리디늄, 염화메틸스테아로일 및 브롬화세틸트리메틸암모늄의 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물인, 사멸화 균체를 함유하는 용액.
  10. 제9항에 있어서, 상기 염화벤제토늄의 농도가 0.05 내지 5％인, 사멸화 균체를 함유하는 용액.
  11. 제6항, 제7항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루타르알데히드의 농도가 0.05 내지 5％인, 사멸화 균체를 함유하는 용액.
  12. 제6항, 제7항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물 촉매가 니트릴 히드라타제, 니트릴라제, 아미다제, 푸마라제, 아스파르타제 및 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산:에틸렌디아민 리아제로부터 선택되는 1종 이상의 효소 활성을 갖는 것인, 사멸화 균체를 함유하는 용액.
  13. 제12항에 있어서, 상기 미생물 촉매가 유전자 재조합체 세균을 포함하는 것인, 사멸화 균체를 함유하는 용액.
  14. 제13항에 있어서, 상기 유전자 재조합체 세균이 로도코커스(Rhodococcus)속 세균인, 사멸화 균체를 함유하는 용액.
  15. 삭제
  16. 제8항에 있어서, 상기 글루타르알데히드의 농도가 0.05 내지 5％인 사멸화 균체를 함유하는 용액.
  17. 삭제
  18. 제8항에 있어서, 상기 미생물 촉매가 니트릴 히드라타제, 니트릴라제, 아미다제, 푸마라제, 아스파르타제 및 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산:에틸렌디아민 리아제로부터 선택되는 1종 이상의 효소 활성을 갖는 것인, 사멸화 균체를 함유하는 용액.
  19. 제11항에 있어서, 상기 미생물 촉매가 니트릴 히드라타제, 니트릴라제, 아미다제, 푸마라제, 아스파르타제 및 에틸렌디아민-N,N'-디숙신산:에틸렌디아민 리아제로부터 선택되는 1종 이상의 효소 활성을 갖는 것인, 사멸화 균체를 함유하는 용액.
KR10-2002-7006044A 1999-11-12 2000-11-10 사멸화 균체 KR100501864B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP32283699 1999-11-12
JPJP-P-1999-00322836 1999-11-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020059714A KR20020059714A (ko) 2002-07-13
KR100501864B1 true KR100501864B1 (ko) 2005-07-20

Family

ID=18148157

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2002-7006044A KR100501864B1 (ko) 1999-11-12 2000-11-10 사멸화 균체

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1233057B1 (ko)
JP (1) JP3973423B2 (ko)
KR (1) KR100501864B1 (ko)
CN (1) CN100334196C (ko)
WO (1) WO2001036592A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013095002A2 (ko) 2011-12-23 2013-06-27 씨제이제일제당(주) 폴리에틸렌 글리콜계 비이온성 계면 활성제를 이용한 균체의 사멸화 방법

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1583822B1 (de) * 2003-01-08 2011-10-05 Basf Se Verfahren zur konservierung und/oder lagerung von zellen mit nitrilase oder nitrilhydratase-aktivität
US7695945B2 (en) * 2007-10-31 2010-04-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Immobilized microbial nitrilase for production of glycolic acid
US7741088B2 (en) 2007-10-31 2010-06-22 E.I. Dupont De Nemours And Company Immobilized microbial nitrilase for production of glycolic acid
US8569012B2 (en) 2008-03-14 2013-10-29 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Method for stabilization of aqueous acrylamide solution
CN101434926B (zh) * 2008-10-31 2010-08-11 云南大学 一株可代谢尼古丁的红球菌及其应用
CN101390969A (zh) * 2008-11-03 2009-03-25 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 降低血液中尿酸浓度的药物
MX2019004698A (es) * 2016-10-26 2019-06-17 Yissum Res Dev Co Of Hebrew Univ Jerusalem Ltd Productos alimenticios bajos en azucar con alto contenido de fibra.
CN109652474A (zh) * 2018-12-26 2019-04-19 安徽巨成精细化工有限公司 生物催化丙烯腈水合反应的方法、产腈菌株的灭活方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1052537A (ko) 1963-05-10
GB1174045A (en) * 1966-12-05 1969-12-10 Bristol Myers Co A Fermentation Process
JPS523833A (en) * 1975-06-27 1977-01-12 Mototaka Ueno Process for preparing powder as raw material oa lotion which removes b ad odor from dusts and is germicidal, insecticipal and cleanable again st it, with fr agrance
DE2643213C2 (de) * 1976-09-25 1985-02-21 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zum Abschwächen oder Inaktivieren von Mikroorganismen
JPS61152276A (ja) * 1984-12-27 1986-07-10 Suntory Ltd 組換え微生物の殺菌法
JPH0728720B2 (ja) * 1984-12-27 1995-04-05 住友電気工業株式会社 細胞培養装置
IT1204845B (it) * 1986-03-25 1989-03-10 Foscama Biomed Chim Farma Procedimento per preservare l'attivita' fosforilante del lievito di birra,applicato alla produzione di fruttosio-1,6-difosfato
EP0338440B1 (en) * 1988-04-18 1992-04-15 Katayama Chemical, Inc. A microbicidal/microbistatic composition for industrial use
JPH0255794A (ja) * 1988-08-22 1990-02-26 Asahi Denka Kogyo Kk 抗菌性潤滑剤組成物
JPH02225794A (ja) * 1989-02-28 1990-09-07 Komatsu Ltd 埋設管の押し込み方法
JPH0952804A (ja) * 1995-06-06 1997-02-25 Takeda Chem Ind Ltd 殺菌方法
US5976462A (en) * 1995-11-03 1999-11-02 Stone; Ralph P. Compositions and method for disinfecting fabric
US5863547A (en) * 1997-02-25 1999-01-26 Healthpoint, Ltd. Glutaraldehyde plus alcohol product

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013095002A2 (ko) 2011-12-23 2013-06-27 씨제이제일제당(주) 폴리에틸렌 글리콜계 비이온성 계면 활성제를 이용한 균체의 사멸화 방법
US9504271B2 (en) 2011-12-23 2016-11-29 Cj Cheiljedang Corporation Method for sterilizing microbial cells using polyethylene glycol-based nonionic surfactant

Also Published As

Publication number Publication date
EP1233057A4 (en) 2004-11-03
CN1409756A (zh) 2003-04-09
KR20020059714A (ko) 2002-07-13
CN100334196C (zh) 2007-08-29
WO2001036592A1 (en) 2001-05-25
JP3973423B2 (ja) 2007-09-12
EP1233057B1 (en) 2015-03-04
EP1233057A1 (en) 2002-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ghani et al. Isolation and characterization of different strains of Bacillus licheniformis for the production of commercially significant enzymes
EP1991659B1 (en) Induction and stabilization of enzymatic activity in microorganisms
Yao et al. Characterization of a fibrinolytic enzyme secreted by Bacillus velezensis BS2 isolated from sea squirt jeotgal
Sharma et al. Production, partial purification and characterization of alkaline protease from Bacillus aryabhattai K3
KR100501864B1 (ko) 사멸화 균체
CN115960928A (zh) 除草剂敌稗特异性降解菌株及降解酰胺酶基因和应用
JPH03501086A (ja) パラチオンヒドロラーゼ類縁体並びにその製造方法及び精製方法
ElMekawy et al. Kinetic properties and role of bacterial chitin deacetylase in the bioconversion of chitin to chitosan
US6251646B1 (en) Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells
Patel et al. Production, partial purification, characterization and detergent compatibility of alkaline protease from soil isolate Bacillus cereus AG1
JPH11243961A (ja) 新規なカタラーゼ、該カタラーゼの遺伝子及び該カタラーゼを含有する組成物、並びに遺伝子工学技術を用いてカタラーゼを調製する方法
JP2011200133A (ja) 遺伝的に改変された微生物の製造方法
Dean et al. The use of EDTA or polymyxin with lysozyme for the recovery of intracellular products from Escherichia. Coli
US4430433A (en) Production of aryl acylamidases
JP4205332B2 (ja) 菌体または菌体処理物を含有する液体の保存方法
Giffhorn et al. Regulation of citrate lyase activity in Rhodopseudomonas gelatinosa
JP2001136958A (ja) 死滅化菌体
JP2005261234A (ja) 新規微生物と微生物によるヒ素類の除去方法
JP3685814B2 (ja) アミノペプチダーゼおよびその生産方法
EP4166663A1 (en) Method for producing target protein
JP4643873B2 (ja) 耐熱性ラッカーゼおよびその製造方法
JP4009677B2 (ja) プロトプラストの再生率を向上させる微生物及びプロトプラストの再生方法
JP4485734B2 (ja) ５置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組み換えｄｎａ、形質転換された細胞および光学活性アミノ酸の製造方法
AU2012202282B2 (en) Induction and stabilization of enzymatic activity in microorganisms
Shafqat et al. Efficient Production, Purification and Characterization of Therapeutically Significant L-Asparaginase from Bacillus licheniformis ASN51.

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130621

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140626

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150618

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160616

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170616

Year of fee payment: 13

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190617

Year of fee payment: 15