CN100334196C - 灭活的微生物细胞 - Google Patents

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Abstract

在灭活包含已产生工业用酶等的活细胞的方法中，通过添加表面活性剂而进行不使酶等失活的灭菌得到的灭活的微生物细胞。

Description

灭活的微生物细胞
技术领域
本发明涉及通过灭活含在微生物催化剂中的微生物细胞获得的灭活的微生物细胞。
背景知识
在微生物细胞的工业使用中，由于生产时的泄漏、在产品中的混合或使用后的不正确操作所可能引起的微生物二次污染是很烦人的事。通常，反应使用高安全性的微生物细胞在密闭系统中进行，并且通过用辅助试剂(例如硅藻土)过滤的方法从反应溶液中去除该微生物细胞。通常采取的替代方法是将微生物细胞固定化，以最低限度地减少该微生物细胞的泄漏。此时，考虑到使用的是高安全性的微生物细胞，就没有把微生物细胞的完全灭活放在第一位。然而，随着最近几年对生产者责任的关注，即使在使用高安全性微生物细胞的时候也要求要防止活细胞的泄漏。
此外在各种指导条例中规定，在使用重组细胞时，在除密闭系统以外的系统中对这些微生物细胞进行操作需要这些微生物细胞是完全灭活的。普通灭活方法的例子包括在不使目标酶失活的条件进行热处理，或使用通过破碎细胞获得的粗酶液。作为通过使用药物或此类物质灭菌的方法通常用表面活性剂。通过用表面活性剂使微生物细胞的细胞膜破碎、使生存必需的酶蛋白变性或此类方法可达到灭菌的目的。具体地说，使用阳离子表面活性剂或两性表面活性剂可收到很好的灭菌效果。
现有技术中，公开了一种通过添加氯苄烷铵灭活重组大肠杆菌(E.coli)的方法(参考日本专利申请公开第61-152276号)。
在用热处理作为灭活方法的时候，目标酶或此类酶应该是耐热的。否则就不能用热处理。在通过破碎细胞制备粗酶溶液的时候，为制备此粗酶液要进行许多复杂的操作。另外，与使用细胞的情况相比，使用粗酶液在从反应溶液中分离该酶的步骤上会有更重的负担。因此，从工业的角度来看，其有许多缺点。
虽然使用离子表面活性剂灭菌的方法是已知的，但一般来说它对灭活低浓度的微生物具有细菌消除的效果，而本发明所公开的高浓度微生物细胞的灭活成果还未被完全知晓。
现有技术(日本专利申请公开第61-152276号)为仅适用于大肠杆菌的方法。因为该方法用于抽提和纯化生理活性物质，所以细胞的破碎和凝集并不是其缺点。然而，通过本发明获得的或固定化后的灭活微生物细胞被用来作为材料生产的活性催化剂。因此，细胞的破碎或凝集会使酶活性或反应性下降及给固定化带来麻烦，并且其对工业应用极为不利。
发明内容
本发明人致力于在相对温和的条件下灭活在其中产生高通用和工业用酶的微生物活细胞而不使该酶失活的研究。他们发现微生物细胞的灭活可通过在有表面活性剂存在时处理此微生物细胞来完成，而不会使工业用途的酶减活，并因此完成本发明。在本发明中，“微生物细胞的灭活”是指在相对高浓度的微生物细胞悬浮液中，活细胞的数量基本为零。其中，活细胞数量基本为零是指微生物细胞的存活率为1/10-5或更少。存活率是指微生物悬浮液中的活细胞数与仍存在于灭活处理过的微生物悬浮液中的活细胞数之比。活细胞数按以下方法计算：将作为测量对象的微生物细胞悬浮液稀释至预定浓度；在可生长的固体培养基上接种此微生物细胞悬浮液；并通过稀释倍数和在此固体培养基上生长的微生物细胞数进行计算。
也就是说，本发明提供了通过添加表面活性剂灭活了的灭活微生物细胞及其生产方法，在加工过程中可灭活已于其中产生了工业用酶或此类物质的微生物活细胞而又不使该酶或此类物质失活。
本发明包括以下(1)到(14)点。
(1)通过在含有表面活性剂的液体培养基中处理干细胞重为5到200g/L的微生物催化剂得到的灭活的微生物细胞。
(2)(1)中描述的灭活的微生物细胞，其中该表面活性剂为阳离子表面活性剂或两性表面活性剂。
(3)(2)中描述的灭活微生物细胞，其中该阳离子表面活性剂选自下组中的至少一种：苯索氯铵、西吡氯铵、甲基硬脂酰氯和十六烷基三甲基溴化铵选自下组中的至少一种：
(4)(1)到(3)中任何一项所描述的灭活微生物细胞，其中灭活处理通过添加浓度不超过15％的表面活性剂进行。
(5)(3)或(4)中描述的灭活微生物细胞，其中苯索氯铵的浓度为0.05％到5％。
(6)通过在含有表面活性剂和戊二醛的含水培养基中处理微生物催化剂得到的灭活的微生物细胞。
(7)(6)中描述的灭活微生物细胞，其中该微生物催化剂的干细胞重为5到200g/L。
(8)(6)或(7)中描述的灭活微生物细胞，其中该表面活性剂为阳离子表面活性剂或两性表面活性剂。
(9)(6)到(8)中任何一项所描述的灭活微生物细胞，其中该阳离子表面活性剂是选自苯索氨铵、西吡氯铵、甲基硬脂酰氯和十六烷基三甲基溴化铵中的至少一种。
(10)(9)中描述的灭活微生物细胞，其中苯索氯铵的浓度为0.05％到5％。
(11)(6)到(10)中任何一项所描述的灭活微生物细胞，其中戊二醛的浓度为0.05％到5％。
(12)(1)到(11)中任何一项所描述的灭活微生物细胞，其中该微生物催化剂具有腈水合酶、腈水解酶、酰胺酶、延胡索酸酶、天冬氨酸酶和乙二胺-N，N’-二琥珀酸：乙二胺裂解酶中的至少一种的酶活性。
(13)(12)中描述的灭活微生物细胞，其中该微生物催化剂含有基因重组细菌。
(14)(13)中描述的灭活微生物细胞，其中该基因重组细菌为红球菌属(Rhodococcus)的细菌。
虽然对本发明的目标微生物催化剂无具体限制，其可以是用作生物催化剂以产生化学品或此类物质的微生物细胞，尤其是含有基因重组体的微生物细胞。该微生物细胞的例子包括紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)J-1(其产生可将丙烯腈转化成丙烯酰胺的腈水合酶)、引入腈水合酶基因的重组紫红红球菌ATCC 12674/pKNH2、红球菌菌株SK92(其产生可将丙烯腈转化成丙烯酸的腈水解酶)、红球菌菌株EA4(其产生可将甘氨酰胺转化成甘氨酸的酰胺酶)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ATCC 6051、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacilluss tearothermophilus)ATCC 12016和紫红红球菌ATCC 12674(其产生可将延胡索酸转化成苹果酸的延胡索酸酶)、引入天冬氨酸酶(其可将延胡索酸和铵转化成L-天冬氨酸)基因的重组紫红红球菌ATCC 12674/pAR016和重组紫红红球菌ATCC17895/pSE001(含有可将延胡索酸和肼转化成聚氨羧酸的酶基因)。
根据布达佩斯条约之规定，上述紫红红球菌J-1于1987年9月18日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，工业科技处，国际贸易与工业部(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号：FERM BP-1478。根据布达佩斯条约之规定，上述紫红红球菌ATCC 12674/pKNH2于1991年3月1日保藏在国立生命科学和人类技术研究所，工业科技处，国际贸易与工业部(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号：FERM BP-3733。根据布达佩斯条约之规定，上述红球菌菌株SK92于1990年2月21日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，工业科技处，国际贸易与工业部(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号：FERM BP-3324。根据布达佩斯条约之规定，上述红球菌菌株EA4于1991年3月28日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，工业科技处，国际贸易与工业部(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号：FERM BP-6231。根据布达佩斯条约之规定，上述紫红红球菌ATCC17895/pSE001于1997年9月18日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，工业科技处，国际贸易与工业部(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba，Ibaraki，日本)，保藏号：FERM BP-6548。
此外，考虑到有些微生物重组体的保藏号没有在此列出，我们将其制备方法描述如下。除它们之外的其它微生物是已知的，并且很容易从美国典型培养物保藏中心(ATCC)得到。被用来由延胡索酸和铵产生L-天冬氨酸的重组紫红红球菌ATCC 12674/pAR016以日本专利申请公开第10-337185号描述的方法进行。
被用来由延胡索酸和肼产生聚氨羧酸的重组紫红红球菌ATCC17895/pSE001(FERM BP-6548)按以下方法制备。
向2μl质粒pED020(在日本专利申请公开第10-210984号中有述)中加入2μl 10 X限制酶缓冲液、15μl无菌水和1μl限制酶XhoI，然后该混合物在37℃反应2小时。该质粒以乙醇沉淀进行收集并晾干，然后加入15μl无菌水、2μl 10 X克列诺(Klenow)片断缓冲液、2μl 10mM dNTP溶液和1μl克列诺片断，该混合物在37℃反应2小时。以乙醇沉淀收集DNA片断，晾干后加入8μl无菌水、1μl XbaI接头溶液、16μl连接试剂盒的溶液A(购自TaKaRa Shuzo有限公司)和4μl连接试剂盒的溶液B，该混合物在16℃反应4小时。然后用此DNA片断转化JM109。所得到的重组子为pED020的XhoI位点换成了XbaI位点的质粒。在2μl所获得的质粒中加入2μl 10 X限制酶缓冲液、15μl无菌水和1μl限制酶EcoRV，然后该混合物在37℃反应2小时。以乙醇沉淀收集DNA片断并晾干，然后加入8μl无菌水、1μl Sse8387I接头溶液、16μl连接试剂盒的溶液A(购自TaKaRaShuzo有限公司)和4μl连接试剂盒的溶液B，该混合物在16℃反应4小时。然后用此DNA片断转化JM109。所得到的重组子为EcoRV位点换成了Sse8387I位点的质粒。在2μl所获得的质粒中加入2μl 10 X限制酶缓冲液、14μl无菌水、1μl限制酶XbaI和1μl限制酶Sse8387I，该混合物在37℃反应2小时。然后反应混合物以0.7％琼脂糖凝胶电泳分开，并收集1.7 Kb的条带。将该条带插入含红球菌启动子的质粒pSJ034的XbaI-Sse8387I位点中，从而制备得到重组质粒pSE001。
pSJ034用质粒pSJ023(在日本专利申请第9-65618号中有述)按图1所示的方法制备。
离心收集对数中期的紫红红球菌ATCC 17895菌株细胞用冰冷的无菌水洗涤三次，然后以无菌水悬浮。将1μl质粒pSE001和10μl此细胞悬液混合并冰浴。将此细胞悬液和DNA倒入杯中，然后用基因转移设备GenePluser(BIO RAD)进行电脉冲处理(2.0KV，200 OHMS)。将电子脉冲处理液冰浴10分钟，然后于37℃热休克10分钟。之后在其中加入500μl MYK培养基(含5g/L的多聚蛋白胨，3g/L的细菌用酵母抽提物，3g/L的细菌用麦芽抽提物，2g/L的K2HPO4，2g/L的KH2PO4)，该混合物置30℃保温5小时。然后将该混合物涂于含50mg/L卡那霉素的MYK琼脂培养基上，30℃培养3天。从而制得重组紫红红球菌ATCC 17895/pSE001(FERMBP-6548)。
在本发明中，灭活处理是指表面活性剂和/或戊二醛被应用于包含在微生物催化剂中的微生物细胞。具体地说，该灭活处理是指将其中的表面活性剂和其它添加剂(假如需要的话)溶于此微生物细胞悬液以使该微生物细胞与该表面活性剂或与该表面活性剂和该添加剂相接触的处理方法。灭活处理优选在恒冷或恒热的条件下进行。在预定温度下进行灭活处理可以保持微生物催化剂的高活性。此外，此灭活处理可以振荡进行。
在处理微生物细胞时，可以使用培养物溶液，通过用适当的缓冲液或此类溶液洗涤该培养物溶液所制备的微生物细胞，或其处理过的物质。另外，在进行灭活处理时，优选事先进行例如药物处理、细胞破碎处理或此类处理以提高洗涤能力、细胞膜通透性和微生物细胞的稳定性等。
虽然在灭活处理中对微生物细胞的浓度没有限制，但以不低于培养物溶液的细胞浓度为佳。为进行工业使用，优选5g/L或更多的干细胞重。另外，灭活处理中的细胞浓度优选200g/L干细胞重或更少。按本发明所述，可在高浓度的微生物细胞悬液中进行可信的灭活处理。然而，当细胞浓度超过200g/L干细胞重时，虽然要看所用微生物的种类和性质，但一般来说，细胞悬液的可流动性会明显下降，其使该表面活性剂或此类物质的分散性和溶解性下降。从而导致对妨碍微生物细胞灭活的有效处理的担心。因此，灭活处理的细胞浓度优选5到200g/L。
微生物细胞灭活处理的处理温度可以从冷冻温度到80℃，优选0到70℃。该处理温度并无具体限制，但其可按目标酶的稳定性进行设置。
对在微生物细胞灭活处理中加入的表面活性剂并无具体限制，任何表面活性剂，例如阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性表面活性剂都可以使用。非离子表面活性剂的例子包括KS604(Shin-Etsu化学有限公司生产)、PLURONIC L61、LG126(Asahi Denka KogyoK.K.生产)、EMULGEN 109P(Kao公司生产)和Triton X-100。另外，阳离子表面活性剂的例子包括苯索氯铵、西吡氯铵、甲基硬脂酰氯和十六烷基三甲基溴化铵。两性表面活性剂的例子包括羧基甜菜碱和甲酰胺。已知，阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的灭菌效果非常好。因为其在低浓度都能有效地杀灭微生物细胞，故优选它们。此外，为进行微生物细胞的灭活处理，这些表面活性剂可以单独使用或，如果需要的话，将其中两或多个组合在一起混合使用。
为进行微生物细胞的灭活处理，表面活性剂的浓度为0.01％到20％，优选0.05％到10％。当表面活性剂的浓度太低时，就无法达到预期的灭活微生物细胞的有效效果。另一方面，如果其浓度太高就会引起例如处理后的废液处理、工业用酶的失活等问题，因此考虑到所使用的微生物细胞和目标酶的稳定性，我们需要对表面活性剂的最适浓度进行测定。
而且，在使用离子表面活性剂的时候，在灭活处理时添加高浓度的该溶液可能会引起微生物细胞的细菌裂解、破裂和聚集。添加低浓度的该表面活性剂是有效的。其浓度可以是0.5％到15％，优选约1％到8％。
在灭活处理中，处理液的pH可以为4到11，优选5到10。考虑到目标酶的稳定性等，我们需要对处理的pH值进行测定。
在灭活处理时，添加多种以增强处理效率为目的的添加剂也是有效的。添加剂的例子包括醇类(如乙醇)、硫醇类(如2-巯基乙醇)、胺类(如乙二胺)、氨基酸类(如半胱氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸)及醛类(如戊二醛)。
另外，为增强目标酶的稳定性，添加目标酶的底物、产物、抑制剂等也是有效的。其例子包括多种腈、多种胺、多种有机酸、氨基酸和多氨基羧酸。考虑目标酶的稳定性，这些添加剂可能要单独使用或两个或多个最适组合混合使用，并且需要测定这些添加剂的最适浓度。
附图简述
图1以图例的方式显示了产生质粒pSJ034的方法。
执行本发明的最佳模式
本发明将参考实施例于以下进行更详细的描述。但这些实施例并不对本发明的技术范围构成任何限制。
实施例1
紫红红球菌ATCC 17895/pSE001(FERM BP-6548)
1.培养
在200ml MYK-Km培养基(含50mg/L卡那霉素的MYK培养基)中接种紫红红球菌ATCC 17895/pSE001(FERM BP-6548)，并于30℃培养72小时。用30 L的罐子，将所得培养物加到20 L含15g/L葡萄糖、10g/L谷氨酸钠、1g/L细菌用酵母抽提物、0.5g/L KH2PO4、0.5g/L K2HPO4、0.5g/L硫酸镁和50mg/L卡那霉素的培养基中(pH 7.2)，并于30℃通气、振荡培养60小时。然后，将所得的20 L培养液在中空纤维膜clothflowSF FILTER KL-F-8102(Kuraray有限公司)中用mohno泵(1m/s)循环，以进行浓缩。在放出10 L培养滤过物后(每次放出2 L后，向其中加入2L 100mM的硼酸缓冲液(pH 9.2))，并以总体积为20 L的该缓冲液进行连续洗涤，从而制得10kg的已洗涤的细胞。所获得的洗过细胞的浓度(以细胞干重表示)为42g/L。
2.灭活处理
向50ml该洗过细胞中，每份分别加入1ml表1中所示的5％表面活性剂溶液，在45℃进行处理。
3.活细胞数测定
细胞处理完以后，用与所用的洗过细胞等体积的100mM硼酸缓冲液(pH 9.2)洗涤两次，并悬浮至与洗过细胞同样的体积。每种悬液中取0.1ml加到MYK-Km琼脂培养基上，30℃培养3天。然后测定活细胞数。
4.酶活性测定
将1ml含灭活细胞的每种悬液悬浮于50ml含342mM延胡索酸和171mM乙二胺、pH 8.0的水溶液中，并反应24小时。通过离心的方法将细胞从反应液中除去，然后用HPLC分析所获上清中乙二胺-N，N’-二丁二酸的量，从而检测乙二胺-N，N’-二丁二酸的活性：乙二胺裂解酶(以下缩写为EDDS-ase)。(柱；WAKOSIL 5C8(Wako纯化学工业有限公司)，洗脱液；50mN磷酸(pH 2.0)，其含10mM四-正丁基氢氧化铵和0.4mMCuSO4)。将非灭活洗过细胞的EDDS-ase活性定为100，以得到处理过细胞EDDS-ase活性的剩余活性比率。
表1
表面活性剂 处理时间(h)     活细胞数(细胞/ml) 剩余活性(％)
    1     无  8     ＞103     98
    2     无  96     ＞102     33
    3     KS602  72     0     56
    4     LG126  72     0     62
    5     PLURONIC L61  96     0     41
    6     EMULGEN109P  48     0     84
    7     ToritonX-100  48     0     87
    8     西吡氯铵  24     0     65
    9     甲基硬脂酰氯  24     0     64
    10     苯索氯铵  24     0     67
实施例2
向50ml按实施例1方法制备的洗过细胞中加入2.5％的苯索氯铵溶液，以达到表2所示的浓度，并在10℃或30℃处理8小时。处理后，得到活细胞数和EDDS-ase的剩余活性比率。
表2
苯索氯铵浓度 处理时间(h)    活细胞数(细胞/ml) 剩余活性(％)
    1     无  10    ＞107   100
    2     无  30    ＞106   100
    3     0.1％  10    125   98
    4     0.1％  30    10   74
    5     0.25％  10    0   96
    6     0.25％  30    0   57
    7     0.5％  10    0   94
    8     0.5％  30    0   12
实施例3
向50ml按实施例1方法制备的洗过细胞中加入10ml含0.6％、1.5％和3％苯索氯铵的30％乙二胺-N，N’-二丁二酸溶液(pH 8.5)，以达到表3所示的浓度，并在30℃或50℃处理3小时。处理后，得到活细胞数和EDDS-酶的剩余活性比率。
表3
苯索氯铵浓度     处理温度(℃)     活细胞数(细胞/ml) 剩余活性(％)
    1   无     30     ＞106     98
    2   无     50     ＞103     106
    3   0.1％     30     142     92
    4   0.1％     50     10     98
    5   0.25％     30     0     89
    6   0.25％     50     0     98
    7   0.5％     30     0     91
    8   0.5％     50     0     0
实施例4
向50ml按实施例1方法制备的培养物溶液中分别加入2％表4所列的表面活性剂溶液，以达到表4所示的浓度，并在4℃或30℃处理3小时。处理后，得到活细胞数和EDDS-ase的剩余活性比率。
表4
表面活性剂     处理温度(℃)     活细胞数(细胞/ml) 剩余活性(％)
    1    无     4     ＞109   100
    2    无     30     ＞106   68
    3    0.1％西吡氯铵     4     0   114
    4    0.1％西吡氯铵     30     0   106
    5    0.05％西吡氯铵     4     ＞102   115
    6    0.05％西吡氯铵     30     0   100
    7    0.1％甲基硬脂酰氯     4     0   120
    8    0.1％甲基硬脂酰氯     30     0   102
    9    0.1％苯索氯铵     4     0   98
    10    0.1％苯索氯铵     30     0   96
    11    0.05％苯索氯铵     4     0   102
    12    0.05％苯索氯铵     30     0   103
实施例5
(1)紫红红球菌J-1(FERM BP-1478)
1.培养
制备含10g/L葡萄糖、0.5g/L K2HPO4、0.5g/L KH2PO4、0.5g/LMgSO4·7H2O、1g/L酵母抽提物和7.5mg/L蛋白胨的培养基(pH 7.2)。将此培养基分装至500ml三角瓶中，每瓶100ml，并用高压灭菌锅于120℃灭菌15分钟。将紫红红球菌J-1(FERM BP-1478)接种至该培养基中并于28℃振荡培养3天。然后将1ml所得培养物溶液接种至相同培养基中(20个三角瓶)，同时加入15g/L尿素和10mg/L CoCl2，并于28℃振荡培养96小时。然后离心收集细胞，并用与培养物溶液体积相同的50mM的磷酸缓冲液(pH 7.7)洗涤。之后将所得的细胞悬浮于100ml该缓冲液中，从而制备得到洗涤过的细胞。所获得的洗过细胞浓度(以细胞干重表示)为105g/L。
2.灭活处理
向该洗过细胞中分别加入1.5％苯索氯铵溶液和/或0.25％戊二醛溶液，以达到表5所示的浓度，并于30℃灭活处理5小时。附带进行对比试验，加入磷酸缓冲液代替1.5％苯索氯铵溶液和/或0.25％戊二醛溶液，并进行同样的灭活处理。
3.活细胞数测定
处理完以后，细胞用制备洗过细胞的缓冲液洗涤三次，并以同样的缓冲液悬浮使体积与灭活处理时的体积相等。然后，每种悬液取0.1ml加到MYK琼脂培养基上，30℃培养3天，然后测定活细胞数。
4.酶活性测定
为测定腈水合酶活性，将2ml含1.0ml 1M丙烯腈、0.5ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)和已灭活处理的洗过细胞的反应混合物，在10℃、规定时间内进行反应，然后加入0.2ml 1N HCL以终止反应，之后以气相色谱分析产生的丙烯酰胺的量以测定腈水合酶活性。
(2)紫红红球菌ATCC 12674/pKNH2(FERM BP-3733)
1.培养
制备含10g/L甘油、5g/L多聚蛋白胨、3g/L酵母抽提物和3g/L麦芽抽提物的培养基(pH 7.2)。将此培养基分装至500ml三角瓶中，每瓶100ml，并用高压灭菌锅于120℃灭菌15分钟。将紫红红球菌ATCC12674/pKNH2(FERM BP-3733)接种至此培养基中并于25℃振荡培养2天。然后将1ml所得培养物溶液接种至相同培养基中(20个三角瓶)，同时加入异丁腈和异丁酰胺，使其浓度分别为1g/L，并在光照条件下25℃培养3天。然后离心收集细胞，并用与培养物溶液体积相同的50mM的磷酸缓冲液(pH 7.7)洗涤。之后将所得的细胞悬浮于200ml该缓冲液中，从而制备得到洗涤过的细胞。所获得的洗过细胞浓度(以细胞干重表示)为32g/L。
2.灭活处理
向该洗过细胞中加入1.5％苯索氯铵溶液以达到表5所示的浓度，并于30℃灭活处理5小时。附带进行对比试验，加入磷酸缓冲液代替1.5％苯索氯铵溶液，并进行同样的灭活处理。
3.活细胞数测定
处理完以后，细胞用制备洗过细胞的缓冲液洗涤三次，并以同样的缓冲液悬浮使体积与灭活处理时的体积相等。然后，每种悬液中取0.1ml加到MYK琼脂培养基上，30℃培养3天，然后测定活细胞数。
4.酶活性测定
为测定腈水合酶活性，将1.0ml 1M丙烯腈、0.5ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)和已灭活处理的洗过细胞的2ml反应混合物，彼此在10℃、规定时间内进行反应，加入0.2ml 1N HCL以终止反应，之后以气相色谱分析产生的丙烯酰胺的量以测定腈水合酶活性。
(3)红球菌菌株SK92(FERM BP-3324)
1.培养
制备含20g/L蔗糖、5g/L多聚蛋白胨、1g/L KH2PO4、1g/L K2HPO4和1g/L MgSO4·7H2O的培养基(pH 7.2)。将此培养基分装至500ml三角瓶中，每瓶100ml，并用高压灭菌锅于120℃灭菌15分钟。将红球菌菌株SK92(FERM BP-3324)接种至此培养基中并于30℃振荡培养3天。然后将1ml所得培养物接种至相同培养基中(20个三角瓶)，同时加入2ml 3-羟基丙腈，并于30℃振荡培养20小时。然后加入3ml 3-羟基丙腈，再培养培养3天。
然后离心收集细胞，并用与培养物溶液体积相同的50mM的磷酸缓冲液(pH 7.7)洗涤。之后将所得的细胞悬浮于200ml缓冲液中，从而制备得到洗涤过的细胞。所获得的洗过细胞浓度(以细胞干重表示)为36g/L。
2.灭活处理
向该洗过细胞中加入1.5％苯索氯铵溶液以达到表5所示的浓度，并于30℃灭活处理5小时。附带进行对比试验，加入磷酸缓冲液代替1.5％苯索氯铵溶液，并进行同样的灭活处理。
3.活细胞数测定
处理完以后，细胞用制备洗过细胞的缓冲液洗涤三次，并以同样的缓冲液悬浮使体积与灭活处理时的体积相等。然后，每种悬液中取0.1ml加到MYK-Km琼脂培养基上，30℃培养3天，然后测定活细胞数。
4.酶活性测定
为测定腈水解酶活性，将2ml含1.0ml 1M丙烯腈、0.5ml 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)和已灭活处理的洗过细胞的反应混合物，在10℃、规定时间内进行反应，然后加入0.2ml 1N HCL以终止反应，之后以液相色谱分析产生的丙烯酸的量以测定腈水解酶活性。
(4)红球菌菌株EA4(FERM BP-6231)
1.培养
制备含5g/L甘油、0.02g/L酵母抽提物、0.5g/L MgSO4·7H2O、1g/L KH2PO4、1g/L K2HPO4的培养基(pH 7.0)。将此培养基分装至500ml三角瓶中，每瓶100ml，并用高压灭菌锅于120℃灭菌15分钟。将红球菌菌株EA4(FERM BP-6231)接种至此培养基中并于30℃振荡培养3天。然后将1ml所得培养物接种至相同培养基中(20个三角瓶)，同时加入5g/L乙酰胺，并于30℃振荡培养48小时。
然后离心收集细胞，并用与培养物溶液体积相同的50mM的磷酸缓冲液(pH 7.7)洗涤。之后将所得的细胞悬浮于200ml缓冲液中，从而制备得到洗涤过的细胞。所获得的洗过细胞浓度(以细胞干重表示)为36g/L。
2.灭活处理
向该洗过细胞中加入1.5％苯索氯铵溶液以达到表5所示的浓度，并于30℃灭活处理5小时。附带进行对比试验，加入磷酸缓冲液代替1.5％苯索氯铵溶液，并进行同样的灭活处理。
3.活细胞数测定
处理完以后，细胞用制备洗过细胞的缓冲液洗涤三次，并以同样的缓冲液悬浮使体积与灭活处理时的体积相等。然后，每种悬液中取0.1ml加到MYK琼脂培养基上，30℃培养3天，然后测定活细胞数。
4.酶活性测定
为测定酰胺酶活性，将1ml含0.5ml 0.05 M磷酸钾缓冲液(pH 7.7)(含0.2 M甘氨酰胺)和已灭活处理的洗过细胞的反应混合物在30℃、规定时间内进行反应，然后离心除去细胞。之后以液相色谱分析产生的甘氨酸的量以测定酰胺酶活性。
(5)紫红红球菌ATCC 12674/pAR016
 1.培养
将紫红红球菌ATCC 12674/pAR016接种至100ml MYK-Km培养基中，并于30℃培养72小时。用5 L相同的培养基进行主培养(每个500ml三角瓶中分装100ml培养基)，接种1％的上述预培养物并于30℃培养96小时。然后离心收集细胞，并用与培养物溶液体积相同的100mM的磷酸缓冲液(pH 8.0)洗涤。之后将所得的细胞悬浮于500ml缓冲液中，从而制备得到洗涤过的细胞。所获得的洗过细胞浓度(以细胞干重表示)为42g/L。
2.灭活处理
向该洗过细胞中加入1.5％苯索氯铵溶液以达到表5所示的浓度，并于30℃灭活处理5小时。附带进行对比试验，加入磷酸缓冲液代替1.5％苯索氯铵溶液，并进行同样的灭活处理。
3.活细胞数测定
处理完以后，细胞用含1mM MgCl2的100mM磷酸缓冲液(pH 8.0)洗涤三次，并以同样的缓冲液悬浮使体积与灭活处理时的体积相等。
上述处理之后，该处理后的细胞再用制备洗过细胞的缓冲液洗涤三次，并以同样的缓冲液悬浮使体积与灭活处理时的体积相等。然后，每种悬液中取0.1ml加到MYK-Km琼脂培养基上，30℃培养3天，然后测定活细胞数。
4.酶活性测定
为测定天冬氨酸酶活性，将1ml含0.5ml 0.05M磷酸钾缓冲液(pH8.0)(含1M延胡索酸铵和1mM MgCl2)和已灭活处理的洗过细胞的反应混合物在30℃、规定时间内进行反应，然后离心除去细胞。之后以液相色谱分析产生的天冬氨酸的量以测定天冬氨酸酶活性。
(6)紫红红球菌ATCC 12674
1.培养
制备含5g/L葡萄糖、0.02g/L酵母抽提物、0.5g/L MgSO4·7H2O、1g/L KH2PO4和1g/L K2HPO4的培养基(pH7.0)。将此培养基分装至500ml三角瓶中，每瓶100ml，并用高压灭菌锅于120℃灭菌15分钟。将紫红红球菌ATCC 12674接种至此培养基中并于30℃振荡培养3天。然后将1ml所得培养物接种至相同培养基(另含10g/L延胡索酸)中(20个三角瓶)，并于30℃振荡培养48小时。然后离心收集细胞，并用与培养物溶液体积相同的50mM的磷酸缓冲液(pH 7.7)洗涤。之后将所得的细胞悬浮于200ml缓冲液中，从而制备得到洗涤过的细胞。所获得的洗过细胞浓度(以细胞干重表示)为31g/L。
2.灭活处理
向该洗过细胞中加入1.5％苯索氯铵溶液以达到表5所示的浓度，并于30℃灭活处理5小时。附带进行对比试验，加入磷酸缓冲液代替1.5％苯索氯铵溶液，并进行同样的灭活处理。
3.活细胞数测定
处理完以后，细胞用含1mM MgCl2的100mM磷酸缓冲液(pH 8.0)洗涤三次，并以同样的缓冲液悬浮使体积与灭活处理时的体积相等。
上述处理之后，该处理后的细胞再用制备洗过细胞的缓冲液洗涤三次，并以同样的缓冲液悬浮使体积与灭活处理时的体积相等。然后，每种悬液中取0.1ml加到MYK琼脂培养基上，30℃培养3天，然后测定活细胞数。
4.酶活性测定
为测定延胡索酸酶活性，将1ml含0.5ml 0.05M磷酸钾缓冲液(pH7.7)(含0.2M延胡索酸)和已灭活处理的洗过细胞的反应混合物在30℃、规定时间内进行反应，然后离心除去细胞。之后以液相色谱分析产生的苹果酸的量以测定延胡索酸酶活性。
表5
受检微生物细胞 酶 处理条件     活细胞数(细胞/ml)     剩余活性(％)
    1     J-1 腈水合酶   磷酸缓冲液     ＞105     100
    2     J-1 腈水合酶   1.5％苯索氯铵     0     95
    3     J-1 腈水合酶   1.5％苯索氯铵     25     97
    4     J-1 腈水合酶   0.25％戊二醛     1200     98
5 J-1 腈水合酶   0.2％苯索氯铵+0.25％戊二醛 0 98
    6     ATCC12674/pKNH2 腈水合酶   磷酸缓冲液     ＞105     120
    7     ATCC12674/pKNH2 腈水合酶   0.25％苯索氯铵     0     94
    8     SK-92 腈水解酶   磷酸缓冲液     ＞105     98
    9     SK-92 腈水解酶   0.25％苯索氯铵     0     84
    10     EA-4 酰胺酶   磷酸缓冲液     ＞105     99
    11     EA-4 酰胺酶   0.25％苯索氯铵     0     91
    12     ATCC12674/pAR016 天冬氨酸酶   磷酸缓冲液     ＞105     100
    13     ATCC12674/pAR016 天冬氨酸酶   0.25％苯索氯铵     0     94
    14     ATCC12674 延胡索酸酶   磷酸缓冲液     ＞105     100
    15     ATCC12674 延胡索酸酶   0.25％苯索氯铵     0     98
此处引用的所有的出版物、专利和专利申请都以整体形式并入本文以供参考。
工业适用性
依照本发明，灭活的微生物细胞可在不使工业用酶或此类酶失活的条件下产生，因此当微生物细胞在工业上使用时可以避免由于活细胞泄漏引起的二次污染。具体地说，当使用基因重组细胞时，执行本发明所述的灭活处理可使微生物细胞的后期处理变得容易并且不需要专门的设备。因此，本发明可以提供一种工业上有用的方法。

Claims (9)

1.含有经灭活的微生物细胞的溶液，其包含微生物催化剂中的微生物细胞、表面活性剂、戊二醛和液体培养基。
2.权利要求1所述的含有经灭活的微生物细胞的溶液，其中该微生物催化剂中的微生物细胞的干细胞重为5到200g/L。
3.权利要求1所述的含有经灭活的微生物细胞的溶液，其中该表面活性剂为阳离子表面活性剂或两性表面活性剂。
4.权利要求3所述的含有经灭活的微生物细胞的溶液，其中该阳离子表面活性剂选自下组中的至少一种：苯索氯铵、西吡氯铵、甲基硬脂酰氯和十六烷基三甲基溴化铵。
5.权利要求4所述的含有经灭活的微生物细胞的溶液，其中苯索氯铵的浓度为0.05％到5％。
6.权利要求1到5中任何一项所述的含有经灭活的微生物细胞的溶液，其中戊二醛的浓度为0.05到5％。
7.权利要求1到5中任何一项所述的含有经灭活的微生物细胞的溶液，其中该微生物催化剂具有选自腈水合酶、腈水解酶、酰胺酶、延胡索酸酶、天冬氨酸酶和乙二胺-N，N’-二琥珀酸：乙二胺裂解酶中的至少一种的酶活性。
8.权利要求7中所述的含有经灭活的微生物细胞的溶液，其中该微生物催化剂含有基因重组细菌。
9.权利要求8中所述的含有经灭活的微生物细胞的溶液，其中该基因重组细菌为红球菌属的细菌。
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