CN106011118B - 一种Fe3+依赖型食品级酸性脲酶及其在黄酒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶及其在黄酒中的应用，属于生物工程技术领域。本发明采用来自于食品级宿主地衣芽孢杆菌且依赖于Fe³⁺的酶，Fe³⁺依赖性脲酶相对于Ni依赖性脲酶所存在的安全隐患来说，是真正意义上的食品级脲酶。本发明所获得的Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶能够高效的降解黄酒中的尿素和氨基甲酸乙酯(添加酶量为500U/L时，可消除黄酒中90％的尿素及30％左右的EC)，从而实现从源头到终端对氨基甲酸乙酯的控制，为实现脲酶工业化生产奠定了基础，具有巨大的经济及社会效益。

Description

一种Fe3+依赖型食品级酸性脲酶及其在黄酒中的应用

技术领域

本发明涉及一种Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶及其在黄酒中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

脲酶(Urease,EC3.5.1.5)，广泛存在于动物、植物、细菌、真菌等中,其能专一性的催化尿素水解产生两分子氨和一分子碳酸。脲酶是世界上首次成功获得的结晶态的酶，它于1926年由Summer首次从刀豆中提取出。根据脲酶作用的最适pH值,可将脲酶分为酸性脲酶、中性脲酶和碱性脲酶。

氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate或Urethane，简称EC)，具有遗传毒性及致癌性，广泛存在于多种发酵食品(如酱油、食醋、泡菜)和酒精饮料(如黄酒、白酒、葡萄酒等)中。研究证实发酵食品(如黄酒、酱油等)中尿素是EC形成的主要前体物质，它和乙醇自发的反应生成EC，从而严重影响人类的健康。酸性脲酶可以高效消除发酵食品(如酒精类饮料)中的尿素，从而可以有效的减少了EC的形成。

但是，已报道的脲酶均为Ni²⁺依赖性脲酶，Ni²⁺作为重金属，对人类的健康影响也存在隐患。因此，严格来讲，Ni²⁺依赖性脲酶均为非食品酶，应用于食品中时存在安全隐患。而铁是人体含量的必需微量元素，是血红蛋白的重要部分，人全身都需要它，这种矿物质可以存在于向肌肉供给氧气的红细胞中，还是许多酶和免疫系统化合物的成分。铁对人体的功能表现在许多方面，铁参与氧的运输和储存；促进发育；增加对疾病的抵抗力；调节组织呼吸，防止疲劳；构成血红素，预防和治疗因缺铁而引起的贫血；使皮肤恢复良好的血色。鉴于铁对人体有益的功能，可以添加到食品中，因此可以认定Fe³⁺依赖性脲酶为真正的食品酶。

因此，有必要寻找能够真正用于食品的食品级Fe³⁺依赖性脲酶。

发明内容

为了解决上述问题，本发明获得了Fe³⁺依赖型酸性脲酶，且该酶来源于食品级的宿主(地衣芽孢杆菌)，是真正的食品酶，因此可以应用于发酵食品中尿素和EC的消除，且不存在安全隐患。本发明是继Carter于2011年在鼬鼠螺杆菌中发现铁依赖型脲酶后第二个所发现的铁依赖型脲酶，而前者发现在的铁依赖性脲酶受氧的影响，酶氧化后无活性，而本发明所发现的Fe³⁺依赖性脲酶不受氧的影响，从而更加的稳定，更有利于在发酵食品中应用，且能够降解EC，因此更具有应用价值。本发明的Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶能够高效的降解黄酒中的尿素及EC(添加酶量为500U/L时，可消除黄酒中90％及以的尿素及27％左右的EC)。

本发明的第一个目的是提供一种食品级酸性脲酶在发酵食品中的应用，其特征在于，所述应用是采用Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶。

所述Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶原始来源于食品级宿主地衣芽饱杆菌，于重组大肠杆菌 (E.coli BL21DE3/pRSFDuet-ureBL)中表达，重组菌构建过程已于之前所申请的专利 CN201510218597.1中陈述。

所述酸性脲酶含有以下特征之一：

(1)结构亚基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

(2)结构亚基的氨基酸序列是在(1)中氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸得到的，且编码具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由(1)衍生的蛋白质；

(3)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是用于降低或消除发酵食品中的尿素和/或氨基甲酸乙酯。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品包括酒精类饮料、酱油。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵食品为黄酒、白酒、葡萄酒等。

在本发明的一种实施方式中，所述Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶来源于Bacilluslicheniformis 9945A。

在本发明的一种实施方式中，所述Fe³⁺依赖性食品级酸性脲酶是以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或者乳酸菌为生产菌株发酵生产得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述生产菌株在发酵生产过程中添加Fe³⁺。

本发明还提供一种发酵生产酸性脲酶的方法，其特征在于，所述方法，是在生产菌株发酵生产的过程中添加Fe³⁺；所述酸性脲酶为含有以下特征之一：(1)结构亚基UreA、UreB、 UreC的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；(2)结构亚基的氨基酸序列是在(1)中氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸得到的，且编码具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由(1)衍生的蛋白质；(3)具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述生产菌株为食品级生产菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述生产菌株为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或者乳酸菌。

本发明的有益效果：

本发明通过重组菌诱导表达时向培养基中分别添加NiSO₄及FeCl₃，测定所表达的酶活力，确认所获得的酸性脲酶为Fe³⁺依赖型脲酶，是一个真正意义上的食品酶。本发明的Fe³⁺依赖型脲酶应用于发酵食品中尿素和EC的消除时，无因Ni依赖性脲酶而带来的安全隐患。本发明的Fe³⁺依赖性脲酶可以高效的消除黄酒中的尿素和EC(添加酶量为500U/L时，可消除黄酒中90％的尿素及27％左右的EC)，从而实现从源头到终端对氨基甲酸乙酯的控制，具有巨大的应用价值。

附图说明

图1：培养基中添加金属离子(NiCl₂及FeCl₃)时，脲酶及EC酶活力；

图2：地衣芽孢杆菌Fe³⁺依赖性双功能酸性脲酶纯化过程SDS-PAGE电泳图；其中M:标准分子量蛋白，1：粗酶液，2：硫酸氨沉淀，3：DEAE离子交换层析，4：Phenyl疏水作用层析，5：MonoQ离子交换层析，6：凝胶过滤层析。

具体实施方式

材料与方法：

地衣芽孢杆菌发酵培养基：1g/L yeast extract，2g/L(NH₄)₂SO₄，5g/L EC，0.1％的矿物盐混合物，0.24％HEPES，pH 6.0

氯化铵标准曲线的绘制：用超线水配制0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、 0.5mmol/L的NH⁴⁺标准溶液。用移液管准确移取1mL NH⁴⁺标准梯度液分别置于顺序编号的 10mL比色管中。37℃下恒温保温30min，立即用吸1mL终止剂于比色管中，振荡混匀。再依次加入1mL显色剂I和显色剂II，强烈振荡，使之充分混匀，反应20min。超纯水定容至 10mL，在625nm下比色测定OD值，以OD值为纵坐标，NH⁴⁺梯度为横坐标作图，得到标准曲线。

脲酶及氨基甲酸乙酯水解酶酶活测定方法：取两支10mL比色管，分别加入1mL酶液和1mL灭活的酶液。然后在两管中分别加入1mL 3％尿素(用20mM pH 4.5的柠檬酸缓冲液配制)，在37℃恒温水浴箱中反应30min后，在两管各加入1mL终止剂(10％三氯乙酸)，混匀后加入1mL的显色剂I(15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL) 和1mL显色剂II(13.125g NaOH和7.5mLNaClO用超纯水定容至250mL)，强烈震荡，继续在37℃恒温水浴箱中保温20min后取出，用超纯水稀释到10mL，625nm处比色，测定 OD值，计算酶活(采用氯化铵绘制标准曲线)。

脲酶及氨基甲酸乙酯水解酶酶活单位定义：在常压，20mM pH4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及37℃条件下，每分钟降解尿素生成2μmol NH₄ ⁺所需要的酶量为一个酶活力单位。

氨基甲酸乙酯水解酶酶活单位定义：在常压，20mM pH4.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液及 37℃条件下，每分钟降解尿素生成1μmol NH₄ ⁺所需要的酶量为一个酶活力单位。

实施例1：Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶的鉴定

挑取-80℃保藏的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pRSFDuet-ureBL菌株在LB固体培养基(含有50μg/mL卡那霉素)上划线，于37℃培养12h后，取单菌落接种于接种于25mL、含有 50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。第二天按1％接种量转接至含有50μg/mL卡那霉素的TB培养基中，培养至菌浓OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导，同时分别添加终浓度为2mM的NiCl₂及FeCl₃，以不添加金属离子来作为对照。 30℃培养10h，离心收集菌体，用20mM pH4.5柠檬酸-柠檬酸缓冲液重悬细胞，通过超声破壁、离心取上清，测定脲酶及氨基甲酸乙酯水解酶活力。由图1可得，无Ni或Fe添加时，基本上表达的酶无活力，当培养基中添加NiSO₄及FeCl₃时酶活力得到极大的提高，且加Fe 时脲酶活力是加Ni时脲酶活力的1.7倍，因此该酶认定为Fe³⁺依赖性脲酶。

实施例2：地衣芽孢杆菌Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶的纯化

(1)地衣芽孢杆菌粗酶液的制备

挑取-80℃保藏的菌株Bacillus licheniformis 9945A在营养肉汤固体培养基上划线，于30 ℃培养20h后，取单菌落接种于新鲜的地衣芽孢杆菌发酵培养基中在30℃转速为200r·min^-1的摇床上继续培养20h。将菌液4℃10000rpm离心5min，弃上清，冲洗菌体并重悬于50mM pH4.5的柠檬酸缓冲液中，菌体终浓度为0.1g/ml。将菌体置于冰水浴中进行超声破碎，超声破碎的条件为：功率70W，工作2s间隔4s，重复工作30min，至菌体溶液变清澈为止。将破碎液于4℃12000rpm离心10min，转移上清液于干净的离心管中低温保存。

此外，发明人发现，如果再发酵培养基中添加2mM FeCl₃能够显著提高粗酶液中脲酶的酶活。

(2)硫酸铵分级沉淀

将固体硫酸铵研磨至细粉状，在70℃烘箱中烘干至恒重。将固体硫酸铵缓慢加入到粗酶液中，并不断搅拌至饱和度为40％，4℃静置4h，10000rpm离心20min弃沉淀取上清，并向上清中继续加入固体硫酸铵至饱和度为80％，如上述条件进行沉淀离心弃上清取沉淀。然后将蛋白沉淀溶解于适量20mmol·L^-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，用透析袋在相同的缓冲溶液中对蛋白样品透析脱盐。

(3)离子交换层析

起始缓冲液A：20mmol·L^-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。洗脱缓冲液B：含1mol·L^{- 1}NaCl 的20mmol·L^-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。采用HiTrap DEAE HL 5mL阴离子交换柱，先用起始缓冲液平衡柱子，流速为5mL·min^-1，上样后用洗脱缓冲液梯度洗脱蛋白，采用梯度20％， 40％，60％，80％，100％B液。合并活性管并透析除盐。

(4)疏水层析

起始缓冲液C：20mmol·L^-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。洗脱缓冲液D：含1mol·L^-1(NH₄)₂SO₄的20mmol·L^-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。向蛋白样品中缓慢加入固体硫酸铵至终浓度为1mol·L^-1，经0.22μm滤膜过滤，上样于提前经D液平衡的Phenyl HP 5mL疏水柱，采用梯度洗脱100％D，80％D，60％D，40％D，20％D，流速为5mL·min^-1。分别测定收集各管酶活性，合并活性管并透析除盐。

(5)离子交换层析

起始缓冲液E：20mmol·L^-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。洗脱缓冲液F：含1mol·L^{- 1}NaCl 的20mmol·L^-1pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液。经上步纯化的蛋白上样于Mono Q 5/50GL离子柱，采用线性洗脱方式，流速为1mL·min^-1。测定各管收集液酶活，合并有活性各管。

(6)凝胶过滤层析

Superdex-200 prep grade凝胶柱，进样量为0.5mL，柱体积120mL，缓冲液为20mmol·L^-1 pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液，流速1mL·min^-1。收集出峰处，测定不同出峰处酶活，合并有酶活各管，用于后续实验。

纯化相关数据如表1所示(以EC酶酶活为测定依据)，SDS-PAGE如图2所示。

表1：地衣芽孢杆菌Fe³⁺依赖性双功能酸性脲酶纯化过程相关参数

实施例3：地衣芽孢杆菌Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶应用于黄酒中EC及尿素的降解

向煎酒前黄酒酒样中分别添加500U/L终浓度的酶量，于37℃水浴反应，通过HPLC检测尿素降解量，通过GC-MS测定EC解降解量。结果如表2所示，由表2可以看出，本发明的脲酶可有效降解黄酒中的尿素和EC(添加酶量为500U/L时，可消除黄酒中90％的尿素及 27％左右的EC)。

表2：Fe³⁺依赖性双功能酸性脲酶应用于降解黄酒中EC和尿素的结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (1)

1.一种酸性脲酶在生产黄酒中的应用，其特征在于，所述酸性脲酶是通过以表达Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶的食品级生产菌株地衣芽孢杆菌作为生产菌株生产得到的，在利用生产菌株发酵生产酸性脲酶的过程中添加Fe³⁺；

所述食品级生产菌株地衣芽孢杆菌表达的Fe³⁺依赖型食品级酸性脲酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述在利用生产菌株发酵生产酸性脲酶的过程中添加的Fe³⁺的浓度为2mmol/L。