CN103013948A - 一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯酶的方法 - Google Patents
一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯酶的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯酶的方法，所述赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus fusiformis）SC02，于2012年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012414，将所述梭形赖氨酸芽孢杆菌活化发酵后破壁，使用硫酸铵将氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后获得粗酶液，将所述粗酶液经强阴离子柱、疏水柱、高分辨率离子柱、凝胶柱，纯化获得氨基甲酸乙酯水解酶，本方法可高效的具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株赖氨酸芽孢杆菌所产氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质研究。
背景技术
氨基甲酸乙酯（英文名：urethane或ethyl carbamate，简称EC）又名乌拉坦、尿烷，是一种医药、农药、香料的中间体，或用于生产安眠药、镇静剂、注射剂的助溶剂和印染工业着色剂，也可用于生物化学研究。此外，尿烷本身可作成药使用，具有抗癌性能，用于治疗多发性骨髓瘤和慢性白血病等。
20世纪40年代，Nettleship实验证明了氨基甲酸乙酯具有致癌作用。主要可以引起肺肿瘤、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等。氨基甲酸乙酯作为副产物广泛存在于发酵食品（如面包、酸牛奶、乳酪、酱油等）和酒精饮料（如葡萄酒、黄酒、苹果酒和日本清酒等）中。人体摄取氨基甲酸乙酯主要是通过饮用酒精饮料和食物。氨基甲酸乙酯已成为影响人类健康的一个不可忽视的因素。
目前各国政府对发酵食品中EC的含量已出台相应的限量标准。
我国生产的白酒、葡萄酒、酱油等中也广泛存在着氨基甲酸乙酯，这不仅制约我国相关产品的出口，更影响普通消费者的健康。因此采取有效的方法控制或消除发酵食品或饮料中的氨基甲酸乙酯迫在眉睫。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯酶的方法，其特征在于将所述梭形赖氨酸芽孢杆菌活化发酵后破壁，使用硫酸铵将氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后获得粗酶液，将所述粗酶液经强阴离子柱、疏水柱、高分辨率离子柱、凝胶柱，纯化获得氨基甲酸乙酯水解酶；所述梭形赖氨酸芽孢杆菌SC02（Lysinibacillus fusiformis），于2012年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012414。
所述离子柱为Q XL1mL强阴离子柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；洗脱缓冲液为含有1M NaCl的起始缓冲液，调节pH值为7.0；洗脱条件为：20%B、100%B液线性洗脱，收集有酶活的部分，进行下一步纯化。
所述疏水柱采用Phenyl HP1mL疏水柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；B液为含有1M(NH4)2SO4的起始缓冲液，调节pH为7.0；洗脱条件为：100%B、80%B和0%B液梯度洗脱，收集阶段洗脱峰，经10kDa透析袋透析36h并测酶活，得到用80%B液洗脱时的蛋白质组分，用于进一步纯化。
所述离子柱使用Mono Q5/50GL高分辨率离子柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；洗脱缓冲液为含有1M NaCl的起始缓冲液，调节pH值为7.0；洗脱条件为：采用线性洗脱，30个柱体积由0%-100%B分别收集各峰并测定酶活。
所述凝胶柱采用Superdex-200prep grade，收集有酶活的峰，经截留分子量10kDa超滤离心管超滤浓缩后，蛋白经SDS-PAGE分离。
所述梭形赖氨酸芽孢杆菌应用于氨基甲酸乙酯水解酶的生产或氨基甲酸乙酯的降解也属于本发明要保护的范围。
氨基甲酸乙酯水解酶活力测定方法
1.原理
在一定条件下，氨基甲酸乙酯水解酶将氨基甲酸乙酯分解生成乙醇、氨气和二氧化碳。氨与苯酚－次氯酸钠反应形成靛酚蓝，用分光光度计在625nm处测其OD值，分析氨的生成量。从而得到氨基甲酸乙酯水解酶的酶活。
2、试剂
底物：称取3g氨基甲酸乙酯溶于100mL超纯水中，得到含量为3%EC的底物。
显色剂I：称取15g苯酚和0.625g亚硝基铁氰化钠用超纯水定容至250mL。
显色剂II：称取13.125g氢氧化钠和7.5mL次氯酸钠用超纯水定容至250mL。
终止剂：称取10g三氯乙酸用超纯水定容至100mL。
3、酶活测定
取两支10mL比色管，分别加入1mL酶液和超纯水。然后在两管中分别加入1mL底物溶液，在37℃恒温水浴箱中反应15min后，在两管各加入1mL终止剂，混匀后加入1mL的显色剂I和1mL显色剂Ⅱ，强烈震荡，继续在37℃恒温水浴箱中保温20min后取出，用超纯水稀释到10mL，625nm处比色，并记录OD值。
4、酶活计算
酶活计算公式：酶活力＝ΔOD625×n×k×10/15
式中：ΔOD625：酶反应后样品测定与空白试验光密度值之差
n：酶活测定液稀释倍数
k：标准曲线斜率的倒数
10：1mL样品液稀释至10mL的倍数
15：酶反应的时间(min)
5.酶活定义
酶活力定义：在常压、37℃条件下每分钟分解底物产生1μmol氨为一个酶活力单位。
本发明还提供了一种分离纯化所述氨基甲酸乙酯水解酶的方法，将所述菌种活化发酵后破壁，使用硫酸铵将所述氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后获得粗酶液，将所述粗酶液经强阴离子柱、疏水柱、高分辨率离子柱、凝胶柱，纯化获得氨基甲酸乙酯水解酶。
附图说明
图1氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化
图2氨基甲酸乙酯水解酶的耐盐稳定性
图3氨基甲酸乙酯水解酶的耐乙醇特性
实施例1菌株的获得
将25g每只5周大雌性昆明小鼠进行五天的强饲氨基甲酸乙酯溶液（200mg/kg body weight/d）后解剖，并用浓度为0.9%的生理盐水冲洗小鼠胃肠道组织，取组织悬浮液1mL于1000×g下离心10分钟，取上清液接种于富集培养基中（牛肉浸膏10g,蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯10g，水1000mL，pH7.0），30℃下通气培养20h。培养液于2000xg离心5分钟，取上清涂布于筛选培养基（牛肉浸膏10g,蛋白胨10g，NaCl5g,氨基甲酸乙酯40g，琼脂20g,水1000mL pH5.0）中培养三天。挑选菌落形态较大的菌株转移到营养肉汤培养基中培养20h后进行保藏。
挑取-80℃保藏的菌株在营养肉汤琼脂固体培养基上划线，于37℃培养24h后，挑取单菌落接种于营养肉汤液体培养基中，37℃在转速为200rpm的摇床培养24h，离心5min（12000rpm，4℃）后收集菌体，再用pH7.0的磷酸盐缓冲液重悬浮菌体至0.1g/mL。通过超声破碎进行酶粗提液的提取，对粗酶液进行氨基甲酸乙酯水解酶酶活测定检测到一株具有氨基甲酸乙酯水解酶的活性的菌株，通过16S rDNA序列分析可知该菌株为一株梭形赖氨酸芽孢杆菌，于2012年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012414，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例2粗酶液的准备
将-80℃保藏的梭形赖氨酸芽孢杆菌菌种，在营养肉汤固体培养基上划线，30℃过夜培养，第二天挑取单菌落接入装有50mL营养肉汤液体培养基的250mL三角瓶，置于30℃摇床（200rpm）培养24h，4℃收集菌体。
收集到的菌体溶于预冷至4℃的20mM K2HPO4-KH2PO4，pH7.0缓冲液中，将菌体充分悬浮，在冰浴条件下，超声破壁功率设定为30W，破1s停1s，破壁1h后，在4℃条件下10000rpm离心20min，去掉沉淀，上清液即为粗酶液。
在冰浴条件下，边搅拌边向粗酶液中不断加入固体硫酸铵，至溶解度为30%，静置1h后，10000rpm离心20min，收集上清液。在同样条件下，继续向上清液中加入固体硫酸铵至溶解度为80%，在4℃冰箱中静置过夜，第二天4℃条件下10000rpm离心20min，去掉上清液，收集到的沉淀溶解在预冷的20mM PBS，pH7.0中。装入截留分子量为10kDa的透析袋中，在4℃条件下，透析48h，其间更换5次20mM PBS，pH7.0缓冲液。
实施例3氨基甲酸乙酯水解酶的纯化
将准备好的粗酶液经强阴离子柱、疏水柱、高分辨率离子柱、凝胶柱，纯化得到单一条带，纯度达到95%。
1.离子柱
过Q XL1mL强阴离子柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；洗脱缓冲液为含有1MNaCl的起始缓冲液，调节pH值为7.0。
洗脱条件为：20%B、100%B液线性洗脱，收集有酶活的部分，进行下一步纯化。
2.疏水柱
分离采用Phenyl HP1mL疏水柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；B液为含有1M(NH4)2SO4的起始缓冲液，调节pH为7.0。
洗脱条件为：100%B、80%B和0%B液梯度洗脱，收集阶段洗脱峰，经10kDa透析袋透析36h并测酶活，得到用80%B液洗脱时的蛋白质组分，用于进一步纯化。
3.离子柱
分离使用Mono Q5/50GL高分辨率离子柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；洗脱缓冲液为含有1M NaCl的起始缓冲液，调节pH值为7.0。
洗脱条件为：采用线性洗脱，30个柱体积由0%-100%B分别收集各峰并测定酶活。
4.凝胶柱
收集Mono Q柱纯化酶活集中区，过Superdex-200prep grade，收集有酶活的峰，经截留分子量10kDa超滤离心管超滤浓缩后，蛋白经SDS-PAGE分离，如图1显示为单一条带。从 而纯化得到电泳纯的氨基甲酸乙酯水解酶。
经以上纯化步骤，得到电泳纯的氨基甲酸乙酯水解酶，对纯化得到的酶进行酶学性质研究。
实施例4氨基甲酸乙酯水解酶酶学性质研究
1.温度对酶活性及稳定性的影响
将纯化得到的氨基甲酸乙酯水解酶与底物在不同温度下反应，并测定相应条件下的酶活，确定酶的最适反应温度。将酶液在不同温度下保温1h后，调整酶液至最适温度并测定残余酶活力，确定酶的温度稳定性。
由以上实验过程确定此酶的最适反应温度为35℃。在15℃—45℃条件下保温1h，酶活仍保留80%以上，酶活保持相对稳定。
2.pH对酶活性及稳定性的影响
将纯化得到的氨基甲酸乙酯水解酶与底物在pH3.0-8.0的相应的缓冲液中反应，并测定酶活，确定最适反应pH。将酶液在不同pH缓冲液中保温1h，保温完成并调节pH至最适条件下，测定残余酶活，确定pH稳定性。
在pH为3.0和8.0条件下，酶活性几乎完全消失，在4.0-7.0之间，随着pH升高，酶活性逐渐升高。在pH为7.0时，酶活力最高，为最适反应pH。超过pH7.0后，酶活性急剧下降。酶活在pH6.0、7.0、7.5保温1h后酶活仍保留70%以上，能保持酶活相对稳定。
3.耐盐性的研究
将纯化得到的氨基甲酸乙酯水解酶在不同NaCl浓度的缓冲液中保温1h，测定相应条件下的酶活，绘制盐浓度-残余酶活的关系曲线，确定酶的耐盐稳定性。
由盐浓度与酶活关系曲线（图2）所示，在盐浓度为10%，保温1h后，酶活保留10%，在盐浓度为15%时，酶活仍保留8%。
4.耐乙醇性研究
将纯化得到的氨基甲酸乙酯水解酶在含有不同乙醇浓度缓冲液中保温1h，测定相应条件下的酶活，绘制乙醇浓度-残余酶活的关系曲线，确定酶的耐乙醇稳定性。
由乙醇浓度与酶活力曲线（图3）可知，在乙醇浓度为2.5%时，酶活保持在65%以上，在18%时，酶活仍保留5%。
5.多种金属离子与EDTA对酶活力的影响
将酶液与含有1mM相应金属离子的缓冲液混合，在温度稳定条件下保温5min，测定酶活力，以未添加金属离子测得酶活为100%，估计金属离子对酶活力的影响。结果如表1.
由表1可以看出，Cu2+对酶活影响最大，保温5min，酶活保留为原酶活的28%，Fe2+和Ni2+对酶活同样有抑制作用，保温后使酶活下降一半。加入EDTA后酶活反而略有升高。说明此氨基甲酸乙酯水解酶为非金属依赖型酶。
表1金属离子与EDTA对酶活力的影响
6.底物特异性研究
在相同条件下，将纯酶液分别与氨基甲酸乙酯、氨基甲酸甲酯、氨基甲酸丁酯、乙酰胺、尿素、L-谷氨酰胺、苯甲酰胺反应，测定相应酶活，以酶液对氨基甲酸乙酯的酶活为100%，估计底物特异性。
由表2可以看出，纯酶液对尿素、苯甲酰胺、L-谷氨酰胺没有作用，对氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯的酶活最高，对乙酰胺有82%的酶活。
表2底物特异性研究
7.动力学参数的确定
以氨基甲酸乙酯为底物，配成不同浓度1mM--30mM，分别测定在相应浓度条件下的反应速度，根据底物浓度与反应速度之间的关系，确定动力学参数Km与Vmax。
当以EC为底物时，根据Lineweaver-Burk双倒数方程y=10.265x+0.2736（R2=0.999），该氨基甲酸乙酯水解酶的Km值为37.5mM，最大反应速率Vmax为3655umol/min/mgprotein。
8.蛋白N端测序
经Edman降解法对蛋白N端进行测序，得到N端12个氨基酸序列： NH2-Thr-Leu-Asp-Ile-Gln-Leu-Lys-Ser-Glu-Asn-Lys-Leu。
Claims (6)
1.一种纯化梭形赖氨酸芽孢杆菌产氨基甲酸乙酯酶的方法，其特征在于将所述梭形赖氨酸芽孢杆菌活化发酵后破壁，使用硫酸铵将氨基甲酸乙酯水解酶沉淀，透析后获得粗酶液，将所述粗酶液经强阴离子柱、疏水柱、高分辨率离子柱、凝胶柱，纯化获得氨基甲酸乙酯水解酶；所述梭形赖氨酸芽孢杆菌SC02（Lysinibacillus fusiformis），于2012年10月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2012414。
2.权利要求2所述的方法，其特征在于所述离子柱为Q XL1mL强阴离子柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；洗脱缓冲液为含有1M NaCl的起始缓冲液，调节pH值为7.0；洗脱条件为：20%B、100%B液线性洗脱，收集有酶活的部分，进行下一步纯化。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述疏水柱采用Phenyl HP1mL疏水柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；B液为含有1M(NH4)2SO4的起始缓冲液，调节pH为7.0；
洗脱条件为：100%B、80%B和0%B液梯度洗脱，收集阶段洗脱峰，经10kDa透析袋透析36h并测酶活，得到用80%B液洗脱时的蛋白质组分，用于进一步纯化。
4.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述离子柱使用Mono Q5/50GL高分辨率离子柱，起始缓冲液为20mM PBS，pH7.0；洗脱缓冲液为含有1M NaCl的起始缓冲液，调节pH值为7.0；
洗脱条件为：采用线性洗脱，30个柱体积由0%-100%B分别收集各峰并测定酶活。
5.权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述凝胶柱采用Superdex-200prep grade，收集有酶活的峰，经截留分子量10kDa超滤离心管超滤浓缩后，蛋白经SDS-PAGE分离。
6.权利要求1-5任一所述的梭形赖氨酸芽孢杆菌应用于氨基甲酸乙酯的降解。
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