CN106282071B - 一株降解氨基甲酸乙酯和尿素的解淀粉芽孢杆菌 - Google Patents

一株降解氨基甲酸乙酯和尿素的解淀粉芽孢杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株降解氨基甲酸乙酯和尿素的解淀粉芽孢杆菌，属于微生物技术领域。本发明的解淀粉芽孢杆菌已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2016499，保藏地址为中国武汉，武汉大学，该菌株能够同时产脲酶和EC水解酶，降解尿素能力为13％，降解EC能力为8％，可直接用于降解发酵食品中的氨基甲酸乙酯。

Description

一株降解氨基甲酸乙酯和尿素的解淀粉芽孢杆菌
技术领域
本发明涉及一株降解氨基甲酸乙酯和尿素的解淀粉芽孢杆菌，属于微生物技术领域。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种致癌物质，被人体持续过量摄入可能会引发肺癌、肝癌等严重肿瘤疾病，并且对人体的免疫系统造成伤害。酿造酒中氨基甲酸乙酯的主要前体物质是尿素与乙醇。因此可通过生物干扰降低酒中氨基甲酸乙酯和尿素的含量是我们降低酒中氨基甲酸乙酯有效措施。但目前报道的微生物均只有单一降低某一种氨基甲酸乙酯前体物或仅能够降解氨基甲酸乙酯的特性。因此，筛选一种同时降解氨基甲酸乙酯前体及氨基甲酸乙酯的微生物有助于从源头上消除EC的产生并能直接减少发酵食品中氨基甲酸乙酯的含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一株降解氨基甲酸乙酯和尿素的解淀粉芽孢杆菌JP21，已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2016499，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
本发明的第二个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌JP21的培养方法，所述方法是将解淀粉芽孢杆菌JP21接种至MRS培养基中，于37℃培养12～30h。
在本发明的一种具体实施方式中，所述方法是于37℃培养24h。
本发明的第三个目的是一种制备脲酶和氨基甲酸乙酯水解酶的方法，是将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌JP21接种至发酵培养基中，37℃培养12～30h，将发酵液离心、收集菌体，破碎细胞，获得脲酶和氨基甲酸乙酯水解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述方法将菌体用pH 4.0-5.5的柠檬酸缓冲液重悬浮，再进行破碎细胞。
本发明的第四个目的是提供所述解淀粉芽孢杆菌JP21的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌JP21在制备发酵食品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌JP21在制备调味品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括：降解发酵食品中存在的氨基甲酸乙酯和其前体物质。
本发明还提供一种降低氨基甲酸乙酯的方法，是将所述解淀粉芽孢杆菌JP21接种至含有氨基甲酸乙酯的液体，或半固体，或固体中。
本发明还提供一种降低尿素的方法，是将所述解淀粉芽孢杆菌JP21接种至含有尿素液体，或半固体，或固体中。
有益效果：本发明提供的解淀粉芽孢杆菌JP21，具有产氨基甲酸乙酯水解酶且产酸性脲酶的特性，脲酶的产量为0.46U/mL，降解尿素能力13％；EC水解酶的产量为0.28U/mL,降解EC能力为8％，能够有效降解氨基甲酸乙酯的前体，减少氨基甲酸乙酯的生成；并可直接降解发酵食品中的氨基甲酸乙酯。
附图说明
图1为氨浓度和OD578的标准曲线。
生物材料保藏
一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JP21，已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2016499，保藏地址为中国武汉，武汉大学。
具体实施方式
脲酶的测定：
(1)标准曲线的绘制：以水为空白对照，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL浓度为4g/L的氯化铵，蒸馏水补至2mL。加入1mL 10％三氯乙酸终止反应。终止反应后加入1mL显色剂I和1mL显色剂II,混匀后在37℃保温20min,反应结束后用超纯水定容10mL，测定578nm吸收度。
(2)发酵液检测：取1mL酶液加入1mL 3％的尿素于37℃反应15min后，加入1mL10％三氯乙酸终止反应。终止反应后加入1mL显色剂I和1mL显色剂II,混匀后在37℃保温20min,反应结束后用超纯水定容至10mL，紫外分光光度计测定578nm吸收值，并通过标准曲线计算菌株的酶活。
显色剂I：苯酚15g和15g亚硝基铁氰化钠15g，超纯水定容至250mL，4℃备用。
显色剂II：NaOH 13.125g和7.5mL次氯酸钠，超纯水定容至250mL.，4℃备用。
氨基甲酸乙酯水解酶的测定：
取1mL酶液加入1mL 3％的尿素于37℃反应15min后，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应。终止反应后加入1mL显色剂I和1mL显色剂II,混匀后在37℃保温20min,反应结束后用超纯水定容至10mL，紫外分光光度计测定578nm吸收值，并通过标准曲线计算菌株的酶活。
酶活计算方法：
A：紫外分光光度值；n：稀释倍数；k：标准曲线斜率
实施例1解淀粉芽孢杆菌JP21的筛选
(1)高通量培养和显色筛选
酒醅中微生物的分离：将新鲜的酒醅与0.85％的生理盐水以1:1.6的比例混合，混合液梯度稀释并涂布于MRS平板及YPD平板上。MRS平板置于37℃，YPD平板培养置于30℃培养24h直至有单菌落出现；
尿素或氨基甲酸乙酯利用菌株的分离：将MRS平板及YPD平板上所分离得到的菌株，分别均匀的转接点种到尿素或氨基甲酸乙酯利用平板上，MRS平板分离的微生物在37℃培养24h，YPD平板中分离的微生物置于30℃培养24h直至得到单菌落。
尿素或氨基甲酸乙酯利用菌株的高通量培养：预先在每个孔板中加入250μLMRS培养基，使用Qpix420自动挑菌仪挑取有紫圈的菌落转接至96孔板，每个菌落转接三个平行；分别在最适培养条件下培养24h后，于4℃6000r/min离心10min，菌泥用生理盐水重悬浮，1％接种量接于尿素或氨基甲酸乙酯显色培养中，分别在最适培养条件下培养24h后显色，培养基颜色由黄色变为紫色的为目的菌株。
(2)鉴定
将初筛菌株划线得单菌，在MRS液体培养基中于37℃静置培养24h，收集菌体，提取基因组，采用通用引物进行16s rDNA扩增，其序列如SEQ ID NO.1所示，在NCBI数据库中进行序列比对，结果显示，与解淀粉芽孢杆菌同源性较高，将菌株命名为解淀粉芽孢杆菌JP21。
实施例2解淀粉芽孢杆菌JP21的产酶能力分析
将初筛菌株进行液体培养37℃，静止培养24h，取50mL菌液4000r/min离心10min，弃上清，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液清洗两遍，最后用50mL缓冲液重悬浮，冰浴30min，机械破壁120s，得粗酶液。
对粗酶液中的脲酶酶活和氨基甲酸乙酯水解酶的酶活进行测定，绘制的脲酶标准曲线如图1所示。结果显示，脲酶酶活为0.46U/mL，氨基甲酸乙酯降解酶活为0.28U/mL。
实施例3解淀粉芽孢杆菌JP21降解尿素
将初筛菌株进行液体培养37℃，静置培养24h，取50mL菌液4000rpm/min,10min.用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液清洗两遍，最后用50mL缓冲液重悬浮，种子液备用。
将种子液(菌浓为6×107CFU/mL)按1％体积比的接种量接种于含终浓度10g/L的尿素及5g/L葡萄糖的培养基中，37℃，静置培养24h，高效液相色谱法测定尿素含量。结果为8.7g/L，降解效果为13％。
实施例4解淀粉芽孢杆菌JP21的降解氨基甲酸乙酯
按实施例3的方法，将解淀粉芽孢杆菌JP21接种至含10g/L的EC及5g/L葡萄糖培养基中，37℃，静置培养24h，测定EC含量，结果显示为9.2g/L，降解效果为8％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株降解氨基甲酸乙酯和尿素的解淀粉芽孢杆菌
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1460
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaatcgggtc caccttcggc ggctggctcc ataaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt 60
acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 120
atgctgatcc gcgattacta gcgattccag cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc 180
cgaactgaga acagatttgt gggattggct taacctcgcg gtttcgctgc cctttgttct 240
gtccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 300
caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca ccttagaggt gcccaactga atgctggcaa 360
ctaagatcaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga 420
cgacrrccat gcaccacctg tcactctgcc cccgaagsgg acgtcctatc tctaggattg 480
tcagaggatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc 540
caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac cgtactcccc 600
aggcggagtg cttaatgcgt tagctgcagc actaaggggc ggaaaccccc taacacttag 660
cactcatcgt ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt 720
cgctcctcag cgtcagttac agaccagaga gtcgccttcg ccactggtgt tcctccacat 780
ctctacgcat ttcaccgcta cacgtggaat tccactctcc tcttctgcac tcaagttccc 840
cagtttccaa tgaccctccc cggttgagcc gggggctttc acatcagact taagaaaccg 900
ccygcgagcc ctttacgccc aataattccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg 960
gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaggta ccgtcaaggt gccgccctat 1020
ttgaacggca cttgttcttc cctaacaaca gagctttacg atccgaaaay cttcatcact 1080
cacgcggcgt tgctccgtcr gactttcgty caattggcgg aagattccct actgctgcct 1140
cccgtaggag tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc 1200
tacgcatcgt cgccttggtg agccgttacc tcaccaacta gctaatgcgc cgcgggtcca 1260
tctgtaagtg gtagccgaag ccacctttta tgtctgaacc atgcggttca gacaaccatc 1320
cggtattagc cccggtttcc cggagttatc ccagtcttac aggcaggtta cccacgtgtt 1380
actcacccgt ccgccgctaa catcagggag caagctccca tctgtccgct cgacttgcat 1440
gtatagcacg ccgccacttc 1460
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgaaggaatc gtggtcggtg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaactgggtc aagaagcgga 20

Claims (8)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JP21，已于2016年9月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2016499，保藏地址为中国,武汉,武汉大学。
2.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌JP21的培养方法，其特征在于，所述方法是将解淀粉芽孢杆菌JP21接种至MRS培养基中，于37℃培养12～30h。
3.一种制备脲酶和氨基甲酸乙酯水解酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌JP21接种至发酵培养基中，37℃培养12～30h，将发酵液离心、收集菌体，破碎细胞，获得脲酶和氨基甲酸乙酯水解酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将菌体用pH4.0-5.5的柠檬酸缓冲液重悬浮，再进行破碎细胞。
5.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌JP21在制备发酵食品中的应用。
6.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌JP21在制备调味品中的应用。
7.一种降低氨基甲酸乙酯的方法，其特征在于，将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌JP21接种至含有氨基甲酸乙酯的液体，或半固体，或固体中。
8.一种降低尿素的方法，其特征在于，将权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌JP21接种至含有尿素的液体，或半固体，或固体中。
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