CN102586159A - 一种产氨基甲酸乙酯脱氨酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产氨基甲酸乙酯脱氨酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。该菌株命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZJ09，保藏号为CCTCC M 2012012。其在合适的培养条件下可代谢生成氨基甲酸乙酯脱氨酶，以该酶在黄酒冷藏处理后加入黄酒原酒中，能直接酶解黄酒酿造过程中产生的总氨基甲酸乙酯，从而实现快速、高效地降低黄酒产品中氨基甲酸乙酯的含量，显著提高了黄酒产品的安全性。本发明方法操作方便，不受氨基甲酸乙酯形成途径的限制，处理方式简单易行。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全领域，尤其涉及一种产氨基甲酸乙酯脱氨酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术
氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)又名脲烷，属多位点致癌物质，于2007年被WHO认定为2A级致癌物(Baan R，et al.Carcinogenicity ofalcoholic beverages.The Lancet Oncology，2007，8(4)：292-293；E.Dybing，etal.Risk assessment of dietary exposures to compounds that are genotoxic andcarcinogenic-an overview.Toxicology letters，2008，180：110-117)。氨基甲酸乙酯曾作为医药和兽药使用，后因有毒且疗效欠佳而被禁止用于人类医药领域。氨基甲酸乙酯是食品发酵和贮藏过程中的天然产生物，广泛存在于饮品酒类(葡萄酒、黄酒等)、酸乳酪、酱油等发酵制品中，不同的发酵食品中氨基甲酸乙酯含量不一，一般低于650μg/kg(Dirk W.et al.Thecomposition of unrecorded alcohol from eastern Ukraine：Is there atoxicological concern beyond ethanol alone？.Food and chemical toxicology，2010，48：2842-2827；石维妮，等.发酵性食品中的氨基甲酸乙酯含量调研.中国酿造，2009，11：124-126)。其中，酒精饮品是膳食摄入氨基甲酸乙酯的主要来源，其次为谷物类和豆类发酵食品，因此，长期饮酒的消费者是氨基甲酸乙酯受害的高危人群(EFSA.Opinion of the Scientific Panel onContaminants in the Food chain on a request from the European Commissionon ethyl carbamate and hydrocyanic acid in food and beverages.The EFSAJournal 2007，551：1-44)。
现阶段，各类食品中并无统一的氨基甲酸乙酯限量标准，但部分国家已制订出酒精饮品中氨基甲酸乙酯的最高限量，如加拿大对多种酒精饮品的氨基甲酸乙酯限量从30-400μg/L不等；欧盟部分成员国也制订了相应标准；韩国于2008年颁布葡萄酒中氨基甲酸乙酯限量标准为30μg/L(WorldTrade Organization Committee on Sanitary and Phytosanitary MeasuresG/SPS/N/KOR/272.6 February 2008；The Korean Food and DrugAdministration Advance Notice No.2008-25(31 January 2008))。
根据氨基甲酸乙酯的形成机理，针对性地形成了一些相应的控制方法，对降低食品中的氨基甲酸乙酯含量具有一定的作用。
(1)发酵原料中尿素的控制：通过对发酵大米的精制或多次清洗，可以有效地降低原料中50％以上的尿素，但该方法会导致原料营养价值降低，影响发酵产品的质量。
(2)工艺控制：发酵过程中的温度、pH等工艺条件均对氨基甲酸乙酯的形成有较为显著的影响，可以通过控制相关工艺参数降低产品中氨基甲酸乙酯的含量。但由于发酵食品的风味受发酵工艺条件影响较大，该方法在实际应用时的可行性较低。
(3)高性能菌株选育：利用诱变和基因工程手段，获得精氨酸酶缺陷型或表达受阻的酵母突变菌株(Heui-dong Park，et al.Antisense-mediatedinhibition of arginase(CAR1)gene expression in Saccharomyces cerevisiae.J.Biosci.Bioengin.，2001，92(5)：481-484)，或通过对葡萄酒酿造中苹果酸-乳酸发酵阶段酒类酒球菌的选育，获得精氨酸转化能力受阻的突变菌株(王华，等.不同酒类酒球菌苹果酸-乳酸发酵对葡萄酒中氨基酸的影响.中国食品学报，2003，3(4)：51-55)，均能有效地降低产品中氨基甲酸乙酯的含量。高性能基因工程菌株选育曾经也被认为是控制发酵制品中氨基甲酸乙酯形成的最好方法，但由于食品安全和生物安全性原因，基因工程菌株在食品生产过程的应用受到非常严格的规定，尤其是欧盟区的严格法律规定导致该方法在最近几年均未有新的进展。
(4)脲酶对尿素的分解：脲酶可以将尿素分解为氨和CO2，在生产过程中利用脲酶控制成品酒中氨基甲酸乙酯含量是最为常用方法。国际葡萄酒组织、欧盟、美国FDA等均允许脲酶作为食品添加剂使用，因此在脲酶的生产菌株选育、发酵工艺优化、生产应用等方面都有较多研究(Marco Esti，et al.Modeling of urea degradation in white and rose wines byacid urease.J.Agric.Food Chem.，2007，55：2590-2596)。我国出口黄酒均采用该方法控制氨基甲酸乙酯的含量。
黄酒生产以大米为原料，成分复杂。酿造过程包括：原料经蒸煮、冷淋、发酵、过滤得到黄酒原酒，黄酒原酒再经冷藏、去沉淀、勾兑、罐装灭菌等环节得到黄酒成品，整个过程步骤较多，周期较长，因此，黄酒中的氨基甲酸乙酯形成途径较多。利用不同方法控制黄酒酿造过程中氨基甲酸乙酯前体物质的产生，可以在一定程度上降低产品中氨基甲酸乙酯的含量，但不可能将多种不同控制方法同时应用于同一批次的黄酒生产中，因此产品中氨基甲酸乙酯含量通常较高。而采用单一的源头控制方法只能部分降低体系中氨基甲酸乙酯的含量，很难有效降低甚至完全清除产品中的氨基甲酸乙酯。
发明内容
本发明提供了一种产氨基甲酸乙酯脱氨酶的枯草芽孢杆菌菌株，用于制备可快速、高效降解黄酒中氨基甲酸乙酯的氨基甲酸乙酯脱氨酶。
一种产氨基甲酸乙酯脱氨酶的枯草芽孢杆菌菌株，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZJ09，保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2012年2月10日，保藏编号为CCTCC M 2012012。该菌株为从土壤中分离、筛选得到的，经鉴定为枯草芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌ZJ09的生理生化特性为：能分解淀粉，可以利用柠檬酸钠为碳源，可以利用硝酸钠为能源；利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露糖发酵产酸；能水解酪朊和明胶；接触酶反应和V-P反应阳性。细胞直杆状，革兰氏染色阳性，芽孢椭圆；平板培养基上菌落略皱缩。
本发明提供了一种利用上述枯草芽孢杆菌菌株制备氨基甲酸乙酯脱氨酶的方法，包括：将经活化的枯草芽孢杆菌ZJ09接种到含氨基甲酸乙酯的液体培养基中进行发酵培养；发酵完成后，从发酵液中分离纯化得到氨基甲酸乙酯脱氨酶。
所述的氨基甲酸乙酯在液体培养基中的质量百分比浓度优选为0.5-1.5％；更优选为1.0％。采用不添加氨基甲酸乙酯的培养基进行菌株发酵，检测不到氨基甲酸乙酯脱氨酶的产生。在液体培养基中添加适量的氨基甲酸乙酯能诱导菌株代谢生成氨基甲酸乙酯脱氨酶，实验发现，当氨基甲酸乙酯浓度为0.5-1.5％时，单位体积发酵液中氨基甲酸乙酯脱氨酶的酶活较高；特别地，当浓度为1.0％时酶活最高。但过高浓度的氨基甲酸乙酯会引起发酵液体系pH值上升，影响菌体生长，使氨基甲酸乙酯脱氨酶的产生受到影响。
以体积1L计，所述的液体培养基由以下组分组成：葡萄糖14-16g，酵母膏5-6g，蛋白胨7-8g，玉米浆7-9g，磷酸二氢钾1-2g，硫酸镁0.6-1.0g，氨基甲酸乙酯5-15g，余量为水。该配方组分的液体培养基能为枯草芽孢杆菌ZJ09提供菌体生长和氨基甲酸乙酯脱氨酶产生所需要的营养成分，其中葡萄糖是主要的碳源；酵母膏和蛋白胨提供氮源，并含有一定量的生长因子；玉米浆含有丰富的维生素和生长因子；磷酸二氢钾和硫酸镁提供菌体生长所需的磷、硫、钾和镁等元素。
所述的发酵培养温度优选为36-38℃，利于菌体生长。
所述的发酵培养时间优选为45-50h，单位体积发酵液中氨基甲酸乙酯脱氨酶的酶活最高。根据枯草芽孢杆菌ZJ09的生长曲线，发酵培养到36-40h时，菌体含量达到最高；再经9-10h，发酵液中氨基甲酸乙酯脱氨酶产量达到最高。
所述的分离纯化为：对发酵液依次进行盐析、离子交换层析和膜浓缩处理，再经冷冻干燥，制得冻干粉。依序进行多步分离纯化，能得到纯度较高的氨基甲酸乙酯脱氨酶，且在操作过程中氨基甲酸乙酯脱氨酶损失较少，活性保持较好；同时，将氨基甲酸乙酯脱氨酶制成冻干粉，不但能延长甲酸乙酯脱氨酶的保质期，而且也便于在使用时定量控制其用量。
本发明还提供了一种采用上述方法制得的氨基甲酸乙酯脱氨酶，该酶酶活较高，能降解黄酒中的氨基甲酸乙酯。
本发明还提供了上述氨基甲酸乙酯脱氨酶在降解黄酒中氨基甲酸乙酯中的应用，包括：
(1)取经冷藏的黄酒原酒；
(2)将氨基甲酸乙酯脱氨酶加入黄酒原酒中，进行酶解反应；
(3)去除沉淀。
在冷藏后的黄酒原酒中，含有大量的氨基甲酸乙酯，此时加入氨基甲酸乙酯脱氨酶对其进行酶解处理，不需要新增其他设备，操作工艺简单。经过酶解反应，可以降解黄酒中的氨基甲酸乙酯；且处理结束后可继续原有的生产工艺过程，即去沉淀、勾兑、罐装灭菌等，去沉淀时可同时除去酶解过程中产生的部分不溶物，不会影响黄酒产品的风味，同时产品中氨基甲酸乙酯的清除率可达95％以上。
优选地，所述的酶解反应温度为18-25℃，酶解反应时间为11-13h；更优选地，所述的酶解反应温度为25℃，酶解反应时间为12h。根据黄酒原有生产工艺，冷藏结束后，室温放置不能超过24h，否则会影响原有生产方案的运行和产品质量；该酶解条件下，最有利于对黄酒中氨基甲酸乙酯的充分酶解，且符合实际生产的需要。
所述氨基甲酸乙酯脱氨酶的加入量优选为0.05-0.15kg/1吨黄酒原酒；更优选为0.1kg/l吨黄酒原酒。该加量条件下既能保证其与黄酒酿造过程中产生的氨基甲酸乙酯充分反应，又不会浪费氨基甲酸乙酯脱氨酶。
本发明的枯草芽孢杆菌ZJ09在合适的培养条件下可代谢生成氨基甲酸乙酯脱氨酶，以该酶在黄酒冷藏处理后加入黄酒原酒中，能直接酶解黄酒酿造过程中产生的总氨基甲酸乙酯，实现快速、高效地降低黄酒产品中氨基甲酸乙酯的含量。试验证明，采用本发明方法制得的黄酒产品，其氨基甲酸乙酯的含量低于30μg/L，显著提高了黄酒产品的安全性。本发明方法操作方便，不受氨基甲酸乙酯形成途径的限制，处理方式简单易行。
具体实施方式
实施例1 枯草芽孢杆菌ZJ09的分离和鉴定
利用选择性培养基从嘉兴学院校园土壤中分离氨基甲酸乙酯降解菌，该选择性培养基的组分为：葡萄糖10g，氨基甲酸乙酯10g，水1000mL；固体培养基另加酚红1g，琼脂20g。将土壤样品1g加入到1000mL的上述液体选择性培养基中，28℃恒温振荡培养，每隔3d取样一次，涂布于上述选择性培养基的固体平板上，挑取菌落周围变红菌株进行纯化，然后利用其进行氨基甲酸乙酯降解测定。
经分离、筛选，获得1株具有较强氨基甲酸乙酯降解能力的菌株，编号ZJ09。对降解产物进行GC-MS分析，发现该菌降解氨基甲酸乙酯的原因在于其可以产生氨基甲酸乙酯脱氨酶，进而将氨基甲酸乙酯降解为氨和甲酸乙酯。
该菌株的生理生化特性为：能分解淀粉，可以利用柠檬酸钠为碳源，可以利用硝酸钠为能源；利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露糖发酵产酸；能水解酪朊和明胶；接触酶反应和V-P反应阳性。细胞直杆状，革兰氏染色阳性，芽孢椭圆；平板培养基上菌落略皱缩。
经鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株在合适的培养条件下可代谢生成氨基甲酸乙酯脱氨酶。
将该菌株保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2012年2月10日，保藏编号为CCTCC M2012012。
实施例2 氨基甲酸乙酯脱氨酶的发酵
枯草芽孢杆菌ZJ09的种子培养基：牛肉膏7.5g，蛋白胨15g，磷酸二氢钾3.5g，硫酸镁0.5g，氯化钠4.5g，葡萄糖25g，水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌30min。
氨基甲酸乙酯脱氨酶的发酵培养基：葡萄糖15g，酵母膏5.5g，蛋白胨7.5g，玉米浆8.0g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸镁0.8g，氨基甲酸乙酯10g，水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌30min。
将活化好的枯草芽孢杆菌ZJ09斜面菌种适量接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，于37℃恒温培养，摇床转速为200rpm。48h后取上述液体菌种10mL接入新鲜的发酵培养基，培养条件同种子发酵，当单位体积发酵液中氨基甲酸乙酯脱氨酶比活力达到10U/mL以上时中止发酵。将上述发酵液6000rpm离心20min去除菌体，所得上清液即为氨基甲酸乙酯脱氨酶的粗酶液。
氨基甲酸乙酯脱氨酶酶活定义：1min内转化氨基甲酸乙酯1μmol，即酶活单位数为1U。
实施例3 氨基甲酸乙酯脱氨酶的纯化
(1)盐析：取含氨基甲酸乙酯酶的上清液，40％～50％饱和度硫酸铵分级盐析，沉淀经pH 7.2，0.05mol/LTris-HCl缓冲液透析脱盐；酶液的氨基甲酸乙酯脱氨酶比活力为500U/mL，浓缩倍数为50，回收率为85％。
(2)离子交换层析：透析液过Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，先用pH 7.2，10mmol/LTris-HCl缓冲液平衡柱子，再用相同缓冲液配制的0mol/L～0.5mol/L的NaCl梯度洗脱，流速为0.4mL/min，收集含氨基甲酸乙酯脱氨酶的洗脱峰。
(3)膜浓缩：对收集的酶液用截断分子量为5000的膜柱浓缩至氨基甲酸乙酯脱氨酶比活力为10000U/mL，浓缩倍数为20，回收率为90％。
(4)冷冻干燥：对膜浓缩后的酶液进行冷冻干燥，得到高纯度的氨基甲酸乙酯脱氨酶冻干粉。酶粉的氨基甲酸乙酯脱氨酶活力为50000U/g。
实施例4黄酒中氨基甲酸乙酯的酶法降解
(1)原料经蒸煮、冷淋、发酵、过滤、冷藏等工艺过程后，得到黄酒原酒；
(2)向黄酒原酒中加入氨基甲酸乙酯脱氨酶冻干粉，加入后混合均匀，于25℃反应12h；其中，每吨黄酒原酒中加入的酶量为0.1kg；
(3)酶解反应完成后，对黄酒原酒进行去沉淀、勾兑、灌装灭菌等工艺过程，制得黄酒成品酒。
对比例1不进行步骤(2)，按照步骤(1)和(3)的操作酿造黄酒。
采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)检测黄酒成品酒中氨基甲酸乙酯的含量，结果显示，本实施例4制得的成品酒中氨基甲酸乙酯含量为25μg/kg；对比例1制得的成品酒中氨基甲酸乙酯含量为353μg/kg。可见，采用枯草芽孢杆菌ZJ09代谢生成的氨基甲酸乙酯脱氨酶对黄酒原酒进行酶解处理，能有效降低成品酒中氨基甲酸乙酯的含量。
Claims (10)
1.一种产氨基甲酸乙酯脱氨酶的枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ZJ09，保藏号为CCTCC M 2012012。
2.一种利用如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株制备氨基甲酸乙酯脱氨酶的方法，其特征在于，包括：将经活化的枯草芽孢杆菌ZJ09接种到含氨基甲酸乙酯的液体培养基中进行发酵培养；发酵完成后，从发酵液中分离纯化得到氨基甲酸乙酯脱氨酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的氨基甲酸乙酯在液体培养基中的质量百分比浓度为0.5-1.5％。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以体积1L计，所述的液体培养基由以下组分组成：葡萄糖14-16g，酵母膏5-6g，蛋白胨7-8g，玉米浆7-9g，磷酸二氢钾1-2g，硫酸镁0.6-1.0g，氨基甲酸乙酯5-15g，余量为水。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养温度为36-38℃，发酵培养时间为45-50h。
6.一种采用如权利要求2-5任一所述的方法制得的氨基甲酸乙酯脱氨酶。
7.如权利要求6所述的氨基甲酸乙酯脱氨酶在降解黄酒中氨基甲酸乙酯中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括：
(1)取经冷藏的黄酒原酒；
(2)将如权利要求6所述的氨基甲酸乙酯脱氨酶加入黄酒原酒中，进行酶解反应；
(3)去除沉淀。
9.根据权利要求8的所述的应用，其特征在于：所述的酶解反应温度为18-25℃，酶解反应时间为11-13h。
10.根据权利要求8的所述的应用，其特征在于：所述氨基甲酸乙酯脱氨酶的加入量为0.05-0.15kg/l吨黄酒原酒。
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