JPH01300892A - ウレタナーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はウレタナーゼおよびその製造方法、さらに詳し
くは微生物を培養して新規ウレタナーゼを製造する方法
に関する。

〔従来の技術〕

カルバミン酸エチルは従来、日本では麻酔薬や医薬品の
溶解剤等とし【使用され【いたが、その変異原性、およ
び発癌性が問題とな９、その使用が禁止になった経緯が
あり、また力μバミン酸エチルが醗酵食品中にも存在す
ることが判明し、その生成経過はたとえば、醗酵食品中
ではエチｆｉ／７１ｖコールと尿素が共存する際、その
食品の過酷な加熱殺菌を行なったり、長期間の貯蔵にお
ける条件にて両者がエステル結合してカルバミン酸エチ
ルが生成する。このカルバミン酸エチルに関して食品衛
生上上述した如き問題がおきておや、たとえばカナダの
オンタリオ州にては、酒類中のカルバミン酸エチμの規
制値が定められ、人類の健康のために、規制値以下にす
るよう義務づけられている、またアメリカにおいてもＦ
ＤＡは、Ｂｕｒｅａｕ　ｏｆ　Ａｌｃｏｈｏｌ。

Ｔｏｂａｃｃｏ　ａｎｄ　Ｆｉｒａｒｍｓ　（ＢＡＴＦ
　）および米国内の酒類の生産者団体等と協議しつつそ
の対応策を検討しつつある。

上記醗酵食品中のカルバミン酸エチルの除去それ自体は
従来から実際には行なわれておらず、その生成を防止す
る方法、たとえば酸性ウレ７−ゼ（特願昭６２−２６１
３７号、特願昭６２−２６１３８号）の使用による尿素
の低減によるカルバミン酸エチルの生成の抑制、食品の
低温保存にふけるカルバミン酸エチルの抑制のごとく、
カルバミン酸エチルの生成を防ぐ方法が実施されている
にすぎない。

醗酵食品、特に酒類の中に含まれるカルバミン酸エチル
を定量するには、たとえばガスクロマトグラフィ、マス
スペクトル等が使用されるが、このとき酒類の前処理に
【多大の抽出、精製、たとえば酒からのクロロホルム抽
出、クーデルナ・ダニツシュ装置による濃縮、カラム吸
着等非常に複雑な操作が行なわれている。これらの問題
を回避するには、ウレタンを分解する酵素即ちウレタナ
ーゼが存在すれば醗酵食品中のカルバミン酸エチルを酵
素的に分解すること、およびカルバミン酸エチルを定量
するに当っても酵素的にカルバミン酸エチルを分解し、
その生成物を定量することにより、簡単に改良定量出来
得る点に有効な技術的手段とし【挙げられろ。しかしな
がらかかるウレタンを分解する酵素、即ちウレタナーゼ
の存在は従来知られておらず、醗酵食品中のカルバミン
酸エチルを分解することによるカルバミン酸エチルの消
失の試みすら実施されていなかった。またカルバミン酸
エチルの定量においてもウレタナーゼを利用した方法は
試みられたことはない。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記醗酵食品あるいは食品中に含まれるウレタンの分解
によるカルバミン酸エチルの消失により、その作用によ
る悪影響を防止し、またその作用によりカルバミン酸エ
チルの定量においても生成物であるアンモニア等を測定
することにより、従来のカルバミン酸エチルの定量を簡
略化出来るため、ウレタナーゼの発見が望まれていた。

そこで本発明者らは醗酵食品等に存在する力μバミン酸
エチルをその酵素作用にて分解する能力を有するウレタ
ナーゼを自然界から得るべ（検索を鋭意進めＣきた。従
来ウレタナーゼの存在すら判明していなかった、従って
本発明はウレタナーゼの存在を明らかにし１容易にまた
は安価にウレタナーゼを製造、利用する方法を提供する
ことにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明はＮ１１．Ｃ０ＯＲ（Ｒはアル中ル基を示す）で
示される構造式を持つ、ウレタンを分解する能力を有す
るウレタナーゼ、およびその製造法にある。

本発明によるウレタナーゼを生産する微生物は、ウレタ
ナーゼを生産しうる微生物であれば、いかなる微生物を
使用してもよく、ウレタナーゼの作用は ＮＨ＊Ｃ００Ｒ−ｊＬ−リ１１．　＋　Ｃｏ、　＋　Ｒ
・ＯＲウレタナーゼ （Ｒはアル中ル基を示す） で示す如く、カルバミン酸エステルを分解してＮＲ，と
ＣＯｌとアルコールを生成する。

本発明においてはウレタナーゼを生産しうる能力を有す
る微生物およびその変異株、細胞徹合株も使用すること
が出来る上記ウレタナーゼを生産しうる菌株は公知の菌
株であり、列記すると、たとえばバチラス・ライケニホ
ルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈａｎｉｆｏｒｍｉ
ｓ　）　ＩＦＯ１２１９６、バチラス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｌｌｌｓ　）ＩＡＭｌ　１８
６、バチラス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍａｃｅ
ｒａｎｓ　）　ＩＡＭ　１２２７、バチラス・チアミノ
リティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙ
ｔｉｃｕｓ　）　ＩＡＭ１０３４等のバチラス属に属す
る微生物およびチトロバクター・デイバーサス（ＣＬｔ
ｒｏｂａｃｔｅｒｄｉｖｅｒｓｕｓ　）　ＡＴＣＣ２７
１５６、チトロバクター・アマロナチカス（Ｃ１ｔｒｏ
ｂａｃｔｅｒ　ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ２
５４０５等のチトロパクター属に属する微生物、および
ペニシリウム・アイガサ中エンゼ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｕｍ　ａａ＋ａｇａｓａｋｉｅｎｚｅ　）　ＡＴＣＣ２
８６８６等のペニシリウム属に属する微生物がウレタナ
ーゼを生産することが出来る。なお、本発明は上記菌株
に必ずしも限定するものではない。

これらの微生物は通常用いられ【いる栄養物、例えば肉
エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、コーンス
チーブリカー、カザミノ酸等を窒素源として、グルコー
ス、シュクロース、マルトース、ラクトース、澱粉等を
炭素源として、第１リン酸カリウム、第２リン酸カリウ
ム、その他、硝酸アンモン、塩化アンモン、硝酸ソーダ
等を無機塩として加え、更には所望により微量金属とし
て、マグネシウム塩、第一鉄塩、マンガン塩、モリブデ
ン酸塩、銅塩、亜鉛塩、ホウ酸等を加えた培地にて２０
℃〜４５℃、好ましくは３０〜３７℃にて好気的に良好
に増殖し、培養６〜２４時間でウレタナーゼを生産する
。

本発明で用いる菌の培養により生産されたウレタナーゼ
は通常菌体内に存在するため、その採取に当っては菌体
からの抽出を行う。なお本発明はウレタナーゼであれば
、菌体内に限定するものではなく、菌体外酵素でも当然
利用出来る。

抽出は公知の有機溶媒抽出法によることもできるが、ビ
ーズや超音波を用いた細胞破砕法、界面活性剤溶液によ
る抽出法等、公知の方法が用いられる。

所望によりウレタナーゼは有機溶媒沈澱、塩析、クロマ
トグラフィー、膜濃縮、膜除菌等の公つレタナーゼは上
記の粗酵素液、精製酵素液、それらの乾燥物、固定化物
または細胞懸濁液、細胞の固定化物等任意適当な形で使
用することができる。

本発明において、たとえばバチラス番チアミノリティカ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｉａｍｉｎｏｌｙｔｉｃｕ
ｓ　）ＩＡＭ　１０３４の培養により得られるウレタナ
ーゼの酵素化学的および理化学的性質を示す。

（１）作用： カルバミン酸エチルを基質として反応させた時、カルバ
ミン酸エチルの分解生成物であるアンモニア、エタノ−
μが確認された。

（２）基質特異性： 基　質　　　　　　相対活性（％） 尿素　　　　０ メチル尿素　　　　　　　Ｏ エチル尿素　　　　　　　０ アリル尿素　　　　　　　Ｏ ｎ−ブチル尿素　　　　　０ メチルカルバメート　　　　　　６５　゛エチルカルバ
メート　　　　　　１００ｎ−ブチルカルバメート　　
　　６９ （３）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 ｐＨ４〜８．３付近に至適ｐ）Ｉを示す（第１図参照鬼
ｐＨ３〜８付近にて安定（第２図参照）。

（４）至適温度および熱安定性： 至適温度は６０℃付近である（第３図参照）。

熱安定性はｐＨ６，５で３７℃付近である（第４図参照
）。

（５）阻害および活性化； エチレンジアミンテトラアセテート　ＩＩＩＩＭ　　　
１０４β−メルカプトエタノール　　　　　　１ｍＭ　
　　１０２グリセリン　　　　　　　２５％　５５ソジ
ウムドデシルベンゼンサルフア一ト１％　　　１６Ｎ−
ソジウムラウロイルザルコシン　　１％　　　１６トリ
ト：／Ｘ−１００１％　　１０３ 無添加　　　　−１００ （６）安定化（５５℃、１５分処理） エチレンジアミンテトラ７セテー）１ｍＭ１０４β−メ
ルカプトエタノール　　　　　　　１ｍＭ　　　　　１
０２グリセリン　　　　　　２．５％　　５５ドデシル
ベンゼンサ〜フアート　　　　　１％　　　　　１６Ｎ
−ソジウムラウロイルザルコシン　　１％　　　　１６
トリトンＸ−１００１％　　　１０３ （７）分子ｆｆ１＝ ゲ／Ｌ’濾過法により約２０万と測定された。

（８）酵素活性測定法 ウレタンとの反応により生成したアンモニアを比色定量
またはエチ〃ア／Ｌ’プールを定量する。

（ａ）反応液の組成 ウレタン（０，５Ｍ水溶液）　　　　　０．０５１１１
１Ｏ０ＩＭリン酸バツツアー（１）Ｈ６，５）　　ｏ、
ｓｄ酵素液　　　　　０．１− （ｂ）反応条件 ３７℃、１時間〜３時間反応させ、１．ＯＮ−硫酸０．
２１１Ｌｔを添加して反応を停止し、反応液の１部をと
９、インドフェノール試液により発色させ６３０ｎａ＋
の吸光度を測定し、生成したアンモニア量を定量するこ
とにより分解されたウレタン量を測定する。

なお、生成したエチルアルコ−μを定量する時は、反応
液の１部をとり、ベーリンガー社製エチルアルコール定
量用キットにより紫外部吸収（アルコール脱水素酵素−
アルデヒド脱水素酵素系）の増加（ＮＡＤＨ）を測定す
ることにより実施した。

（ｃ）酵素活性 ウレタナーゼ１単位（ＩＵ　）は一定ｐＨ，３７℃の条
件で１分間にウレタン１μｍｏｌｅを分解する酵素量と
する。

〔実施例〕

以下に本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本
発明はかかる特定の実施例の記載によって限定されるも
のではない。％は他に特記せぬ限りｖ／ｖ％である。

実施例　１ 第一リン酸カリウム０．５％、ペプトン１．５％、肉エ
キス０．５％、食塩０．５％、ウレタン０．２％を含有
する培地（ｐｕｓ、ｓ　）　１０ｄを試験管に入れ、１
２０℃で２０分間オートクレーブ殺菌する。公知のバチ
ラス働チプミノリテイカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｉ
ａｍｉａｏｌｙｔｉｃｕｓ　）　ＩＡＭ　１０３４の１
白金耳を上記培地に接種し、３０℃で２４時間振とり培
養し、種培養液とする。

同条件で殺菌した培地１１を含む３ノ容三角フラスコへ
上記種培養液１０−を接種し、３０℃で２４時間培養す
る。集菌した菌体を超音波破砕機にて水冷下５分間処理
した。次いで遠心分離にかけ、ウレタナーゼ活性３０Ｘ
１０−“ＩＵ／ｓｌ（培養炉液換算）を得た。

実施例　２ 実施例１と同様に培養し１菌体を集菌し、超音波破砕し
、遠心分離した上澄液５０ｍ（６Ｘ１０−”ＩＵ／ｍ）
に硫安３０ｇを投入溶解し１沈澱物を遠心分離し、その
ケーキを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）５−に溶
解し、その後々１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析し１
凍結乾燥し１０．３ＩＵ／ｇ６００■（６０％収率）酵
素粉末を得た。

実施例　３ 日本酒にウレタン０．１％（１ｏ　ＯＯｐｐｍ　）添加
り、ｐＨを苛性ソーダにて６．５に調整し、そのｌＯ−
を実施例２の方法に・より得たウレタナーゼ酵素粉末１
００１’ｌｉＰを添加し、数日間１５℃にて反応させた
。アンモニア増加量にてウレタン減少速度を測定した結
果、１２０ｐｐｍ／日の速度でウレタンを分解した。

実施例　４ 清酒５２０ｗＬｔをｐｉｔ　６．５に調整し、クロロホ
ルム抽出した溶液をクーデルナ・ダニツシュ装置にて濃
１１ｉ１Ｌ、クロロホルム層に窒素ガスを導入しながら
水置換し、ｌ−とする。この未知検体の０．２　ｄをと
りカルバミン酸エチ／Ｉ／θ〜１０ｐｐｍの範囲で添加
し、実施例２で得たウレタナーゼ５■（ウレアーゼｆｒ
ｅｅ　）を添加し、３７℃で１時間反応後、生成したア
ンモニア量をインドフェノール試薬で発色、測定し、未
知検体中のカルバミン酸エチル量を内挿定量し、清酒中
２０ｐｐｂ相当のカルバミン酸エチμが定量出来た。

実施例　５ 塩化アンモニウム０．１％、ウレタン０．５％、ヘペス
０．２３８％、ハーバ−配合ミ庫う／Ｉ／（オリエンタ
ル酵母工業■製）０．１％、ビタミンミックス０．１％
（ビオチン４■、プリン１．２ｍ９、葉酸２０ダ、ナイ
アシン４００〜、パントテン酸１０（１’、ピリドキシ
ン３１１９、リボフラビン５０ｍ９、チアミン１００１
ｎ９、ｐ−７ミ）安息昏酸２４ダを２００１１蒸留水に
溶かしたもの）を含有する培地（ｐＨ５，０）　１０−
を試験管に入れ、１２０℃で２０分間オートクレーブ殺
菌する。公知のチトロバクタ−・デイバーサスＡＴＣＣ
２７１５６の１白金耳を上記培地に接種し、３０’Ｃ２
４時間振どう培養し、種培養液とする。

同条件で殺菌した培地１ノを含む３１容三角フラスコへ
上記種培養液１０ＷＬｔを接種し、３０℃、２４−時間
培養する集菌した菌体を超音波破砕機にて水冷下５分間
処理した。次いで遠心分離し１上澄液のウレタナーゼ活
性（ｐｉ（７，０）５０ｘｉｏ−”ＩＵ／ｄ（培養炉液
換算）を得た。

実施例　６ 第一リン酸カリウム０．５％、ペプトン１．５％、肉エ
キス０．５％、食塩０．５％、ウレタン０．２％を含有
する培地（ｐＨ５，８）　１ｏｙｄを試験管に入れ、１
２０℃、２０分間オートクレーブ殺菌する。公知のペニ
シリウム・アマガサキエンゼＡＴＣＣ２８６８６の１白
金耳を上記培地に接種し、３０℃、４８時間振とう培養
し、種培養液とする。同条件で殺菌した培地１ノを含む
３ノ容三角フラスコへ上記種培養液１０１Ｒ１を接種し
、３０℃、４８時間培養する。集菌した菌体を超音波破
砕機にて水冷下５分間処理した。次いで遠心分離し、ウ
レタナーゼ活性２０　Ｘ　１０−’ＩＵ　／ｄ（ｐＨ３
）（’培養炉液換算）を得た。

〔発明の効果〕

以上詳述したとｊや、本発明によりウレタナーゼの生産
が可能になった。これにより、問題になっている際酵食
品中のカルバミン酸エチルの分解により、無害化するこ
とにより、醗酵食品業界の食品の保健衛生面に寄与する
ことが可能となった。またカルバミン酸エステルの定量
も可能になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法で得られたウレタナーゼの各ｐＨ
における活性（３７℃）を表わすグラフ、第２図は各ｐ
ｌ（における３０℃、３０分間処理によるｐＨ安定性を
表わすグラフ、第３図は各温度における活性を表わすグ
ラフ、第４図はｐＨ６，５で各温度における１５分間処
理による熱安定性を示すグラフである。 特許出願人　　小　　橋　　恭　　− 同　　　　　ナガセ生化学工業株式会社第１図 ｐＨ 第２図 Ｈ 第３図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＮＨ＿２ＣＯＯＲ（Ｒはアルキル基を示す）で示さ
   れる構造式を持つウレタンを分解する作用を有するウレ
   タナーゼ。 ２、下記式を触媒するウレタナーゼを生産しうる微生物
   を培養してウレタナーゼを得ることを特徴とするウレタ
   ナーゼの製造法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｒ；アルキル基を示す）