JPH03175985A - 酸性ウレタナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酸性ウレタナーゼおよびその製造方法、さらに
詳しくは微生物を培養して新規ウレタナーセを製造する
方法、及びその応用に関するＯ 〔従来の技術〕 カルバミン酸エチルは従来、日本では麻酔薬や医薬品の
溶解剤として使用されていたが、その変異原性、および
発癌性が問題となり、その使用が禁止になった経緯があ
り、またカルバミン酸エチルが醗酵食品中にも存在する
ことが判明し、その生成経過はたとえば醗酵食品中では
エチルアルコールと尿素が共存する際、その食品の過酷
な加熱殺菌を行ったり、長期間の貯蔵における条件にて
両者がエステル結合してカルバミン酸エチルが生成する
。このカルバミン酸エチルに関して食品衛生上上述した
如き問題がおきており、たとえばカナダのオンタリオ州
にては、酒類中のカルバミン酸エチルを規制値以下にす
るよう義務づけられている。亥たアメリカにおいても？
ＤＡは、Ｂｕｒｅ＆ｕ　ｏｆ　Ａｌｃｏｈｏｌ　。

Ｔｏｂａｃｏｏ　ａｎｄ　Ｆｉｒａｒｍｓ　（ＢＡＴ？
　）および米国内の酒類の生産者団体等と協駆しつつそ
の対応策を検討しつつある。

上記醗酵食品中のカルバミン酸エチルの除去それ自体は
従来から実際には行われておらず、その生成を防止する
方法、たとえば酸性ウレア−ゼ（特願昭６２−２６１３
７号、特願昭６２−２６１３８号）の使用による尿素の
低減によるカルバミン酸エチルの生産の抑制、食品の低
温保存におけるカルバミン酸エチルのｕ　制（７）　コ
とく、カルバミン酸エチルの生産を防ぐ方法が実施され
ているにすぎない。

又、ウレタナーゼの製造法が特願昭６３−１３１１３９
号にて出願されている。これはあく亥でも反応ｐＨが中
性領域のウレタナーゼであり、酸性飲料のごと＜　ｐＨ
２，６〜６．０に液ｐＨのあるものに対しては、そのウ
レタナーゼの作用ｐＨの特性により、反応しないか、反
応しても非常に反応速度が低い欠点があった。

以上のごとく、すでにウレタナーセの存在は知られてい
たが、酸性領域に至適ｐＨを持つウレタナーセは従来知
られておらず、酸性（ｐＨ２，６〜５．５）である醗酵
食品中のカルバミン酸エチルを分解する試みすら実施さ
れていなかった。

（発明が解決しようとする課題） 上記酸性領域にある醗酵食品あるいは食品中に含まれる
ウレタンの分解によるカルバミン酸エチルの消失により
、その作用による悪影響を防止する為に、酸性ウレタナ
ーゼの発見が望まれていた。

そこで本発明者らは醗酵食品等に存在するカルバミン酸
エチルをその酵素作用にて分解する能力を有する酸性ウ
レタナーゼを自然界から得るべく検索を鋭意進めてきた
。従来酸性ウレタナーゼの存在する判明していなかった
。従って本発明は、酸性ウレタナーゼの存在を明らかに
し、容易にまたは安価にウレタナーゼを製造、利用する
方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明はＮＨ！０ＯＯＲ（Ｒはアルキル基、７エ二ル基
、又はベンジル基）で示される構造式を持つウレタンを
、酸性領域（ｐＨ２，６〜６．０）で分解する能力を有
する酸性ウレタナーゼ、およびその製造法にある。

本発明による酸性ウレタナーゼを生産する微生物は、酸
性ウレタナーゼを生産しうる微生物であれば、いかなる
微生物を使用してもよく、酸性ウレタナーゼの作用は （Ｒはアルキル基、フェニル基、又はベンジル基を示す
）で示す如く、カルバミン酸エステルを分解してＨＨ−
とＣＯ−とアルコールを生成する。

本発明においては酸性ウレタナーゼを生産しうる能力を
有する微生物およびその変異株、細胞融合株も使用する
ことができる。１例として上記酸性ウレタナーゼを生産
しうる菌株としてバチラス・リケニフオルミスｓｅｐ、
ｆ０１３（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｌｉｏｈｅｎｉｆｏｒｍ
ｉｓ　ａｓｐ、　１０１３　）をあげることができる。

バチラス・リケニ７オルミスｓｓｐ、１０１３はラット
消化管内容物より分離されたものであり、その菌学的性
質は次のとおりである。

＆）形態的性質 顕微鏡的観察（普通寒天培地で３７℃にて培養）（１）
細胞の形および大きさ 短かん菌　通常の細胞の大きさ ０．６１〜０．６６μ九×１．２〜１．４μ扉（２）　
＊胞の多形成の有無：無 （３）運動性の有無：有 （４）胞子の有無：有 （ねグラム染色性：陽性 （ｂ）各培地における生育状態 （１）普通寒天平板培養：３７°Ｃ１２４時間の培養で
、やや光沢のある淡黄白色のわずかにいびつな形のコロ
ニーを形成する。

（力普通寒天斜面培養：３７°Ｃ１２４時間の培養で、
上記のごとく生育する。

（３）普通液体培養：３７°Ｃ１２４時間の培養で、生
産は普通。

（４）ア七ドアミド寒天平板培地：３７°Ｃ１２４時間
の培養で、Ｒｏｕｇｈ型の透明なコロニーを形成する。

（ａ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：還元あり （２）　ＶＰテスト：陽性 （３）インドールの生成：生成せず ＜４）クエン酸の利用：有り （ωウレアーゼテスト：陰性 （６）カタラーセテスト：陽性 （刀オキシダーゼテスト：陽性 （８）生育１）Ｈ：　４．　ｓ〜７．５＜９）生育温度
：１５°Ｃ〜４５°Ｃ Ｏ■酸素に対する態度：好気的かつ嫌気的（１１）糖類
からのガスの生成：陽性 Ｑつ糖類からの酸の生成 陽性：　グルコース、アラビノース、マンニトール、キ
シロース、リボース、マンノース、フルクトース、ガラ
クトース、ソルビトール、ラクトース 陰性：セルビオース、マルトース、シュクロース、テレ
ハロース、ラフトノース、でンぷン以上の諸性質をＳ、
Ｔ、　Ｏｏｙ＆ｎ監修による「Ｍａｎｕ＆１ｏｆ　　ｔ
ｈｅ　　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｍ
ｅｄｉｃａｌ　　Ｂａａｔｅｒｉａ２ｎｄｅｄ、Ｊに準
じて行った。その結果、バチラス・リケニフオルミスと
類似していることが判り、バチラス・リケニ７オルミス
ｓｅｐ、　１０１３と命名した。なお本菌株は工業技術
院微生物工業技術研究所に微生物受託番号微工研菌寄第
１１１０４号として受託されている。

本菌は微生物の培養に通常用いられている栄養物例えば
、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、コー
ンスチープリカー、カザミノ酸、尿素、グルタミン酸ア
セトアミド、ウレタン等を窒素源として、グルコース、
アセトアミド等のアミド類、ウレタン等を＃ｊ素源とし
て、第１リン酸カリウム、第２リン酸カリウム、その他
、硝酸アンモン、塩化アンモン、硝酸ソーダ等を無機塩
として加え、更には所梁により６１ｍ金属として、マグ
ネシウム塩、第−鉄環、マンガン塩、モリブデン酸塩、
銅塩、葬鉛塩、ホウ酸等を加えた培地にて２０’Ｃ〜４
５℃、好ましくは３０〜３７℃にて好気的に良好に増殖
し、培！！６〜２４時間でウレタナーセを生産する。

本発明で°用いる菌の培養によシ生産されたウレタナー
ゼは通常菌体内に存在するため、その採取に当っては菌
体からの抽出を行う。なか本発明は酸性ウレタナーゼで
あれば、菌体内に限定するものではなく、菌体外酵素で
も当然利用できる。

抽出は公知の有機溶媒抽出法によることもできるが、ビ
ーズや超音波を用いた細胞破砕法、界面活性剤溶液によ
る抽出法等、公知の方法が用いられる。

所望によシ酸性つレタナーゼは有機溶媒沈澱、塩析、ク
ロマトグラフィー、膜濃縮、膜除菌等の公知の方法で精
製することができる。なか、この酸性ウレタナーゼは上
記の粗酵素液、精製酵素液、それらの乾燥物、固定化物
または細胞懸濁液、細胞の固定化物等任意適当な形で使
用することができる。

本発明にかいてバチラス・リケンフオ〃ミスｓｅｐ、ｌ
　Ｑ　ｌ　３（Ｂａｏｉｌｌｕｓ　Ｌｌａｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉａ　Ｂｓｐ。

１０１３）の培養によυ得られた酸性ウレタナーゼの酵
素化学的シよび理化学的性質を示す。

田作　用 カルバミン酸エチルを基質として反応させた時、力μバ
ミン酸エチ〃の分解生成物であるアンモニア、エタノ−
〃が確認された。

（２）基質特異性 メチルカルバメート エチルカルバメート ｎ−ブチｐカ、ル′バメート フェニルカルバメート ベンジルカルバメート アセトアミド プロピオンアミド ｎ−ブチルアミド ベンズアミド ウレア メチルウレア エチルウレア フェニルＯレテ ５ ００ ３３ ９９ １ ２１ ４ ０８ ０９ 　Ｇ （３）至適ｐＨ卦よび安定ｐＨ範囲 ｐｕ２．６〜７．５付近に至適ｐＨを示す（第１図参照
〕 ｐＨ４，０〜７．５付近にて安定（第２図参照）【４）
至適温度および熱安定性 至適温度は４０℃付近である（第３図参照）。

熱安定性はＰＨ４，５で３０℃付近である（第４図参照
）。

（５）阻害公よび活性化 エタノール ２０％　　　　　５４ エチレンジアミンテトファ　　５　ｍＭ　　　　　　７
０セテート β−メルカプトエタノール　　５ＩＩＩＩＭ５０無添加 ００ 活性化物なし く６）酵素活性測定法 ウレタンとの反応によシ生成したアンモニア金比色定ａ
ｔたはエチルアルコ−／Ｌ’を定量する。

（＆）反応液の組成 酵素液　　　　　　　　Ｑ、　ｌ　ｍｅ（ｂ）反応条件 ３７℃、１時間〜３時間反応させ、１．Ｑ　ｒＪ−硫酸
０．２　ｒｎｌヲ添加して反応を停止し、反応液の１５
１とや、インドフェノール試液により発色させ６３０ｎ
ｍの吸光度を測定し、生成したアンモニア量′ｆｆ：定
量することによう分解さｔ′したウレタン量金測定する
。

なお、生成したエチルアルコール乞定遺する時は、反応
液の１邪會とり、パーリンガ−社製エチルアルコール定
量用キットにより紫外部吸収（アルコール脱水率酵素−
アルデヒド脱水素＃素系）の増加（ＮＡＤＨ）　ｋ測定
することによシ実施した。

（Ｃ）酵素活性 ウレタナーゼ１単位（工Ｕ）はｐＨ４，５，３７℃の条
件で１分間にウレタン１　／１ｍｄｅ金分解する酵素量
とする。

〔実施例〕

以下に本発明を実施例金あげて具体的に説明するが、本
発明はかかる特定の実施例の記載によって限定されるも
のではない、％は特記せぬ限りｗ／ｖ％であるｄ 実施例　１ ヘベス０．２３８％、アセトアミド（東京化ｊｆｆｌ製
）０．２％、ビタミン混合液０．１％（ビオチン４”９
．コリン１．２η、葉＃！２０η、ナイアシン４００１
ｖ、モ ン３０ｗ１ｉ１リポフヲビン５０町、チアミン１００η
、ｐ−アミノ安息香酸２４Ｍ９を２００−蒸留水に溶か
したもの）、ハーバ−配合ミネラ／Ｌ／（オリエンタル
酵母工業（株）製）　０．０２％、１０ｍＭ塩化ニッケ
ルと１０　ｍＭ塩化コバルト混合液０．００２％を含有
する培地（ｐＨ７，０）　１０　ｒｎｅｆ試験管に入れ
、１２０℃で２０分間オートクレプ殺菌する。

＋Ｊに一叩蟲■ルー叫↓ｌ１７二ツ７０，１八１つハ１
白金耳金上記培地に接種し、３７℃、２４時時間上う培
養し、種培養液とする。

同条件で殺菌した培地ｉｚｔ含む３Ｌｇ三角フフスコヘ
上記種培養液１ｏｖｅ金接種し、３７℃、５日間培養す
る。集菌した菌体上超音波破砕機にて水冷下５分間処理
した。次いで遠心分離し、上澄液の酸性ウレタナーゼ活
性（ｐＨ４，５）５０　Ｘ　１０−’工Ｕ／ｒｒＩ！（
培！ＩＦ３液換算）を得た。

実施例　２ 塩化アンモニウム０．１％、ウレタン０．５％、ヘベス
０．２３８％、ハーバ−配合ミネラル（オリエンタル酵
母工業（株〕製）０．１％、酵母エキス０．５％、１０
ｍＭ塩化ニッケルと１０１！ＩＭ塩化コバルト混合液０
．００２％を含有する培地（ｐＨ７，０）１０ｍｊ＝に
試験管に入れ、１２０℃で２０分間オートクレーブ殺菌
する。バチラス・リケニフオルミスｓｅｐ、１０１３の
１白金耳全上記培地に接種し、３７℃、２４時時間上う
培養し、種培養液とする。同条件で殺菌した培地１ｔ？
含む３を究：台７リスコヘト制湘嬉羞怖１ｎＪをゐ龍ト
一３７℃、５日間培養する。集菌した菌体會超音波破砕
機にて水冷下５分間処理した。次いで遠心分離し、上澄
液の酸性ウレタナーゼ活性（ｐＨ４，５）４５Ｘ１０−
工Ｕ　／　ｍｅ　（培養炉液換算）を得た。

実施例　３ 実施例１と同様に培養し、菌体を集菌し、超音波破砕し
、遠心分離した上澄液５Ｏ−（７Ｘ１０−３工Ｕ／ｍｆ
　）　’に脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥し、０
３２工Ｕ／ｆ、６２０町（５７％収率）の酵素粉末金得
た。

実施例　４ 日本酒（ｐＨ４，５〕にウレタン０．１％（１００ｐｐ
ｍ）添加し、その１０−１＆：実施例３０方法によシ得
７を酸性ウレタナーゼ酵素粉末ｉｏｏ＋＋ｖｔ”添加し
、数日間１５℃にて反応させた。アンモニア増加量にて
ウレタン減少速度を測定した結ｉ１０ｐｐｍ／日の速度
でウレタンを分解した。

＊施例　５ ウィスキー（ｐＨ４，Ｏ）にウレタン０．１％（１００
ｐｐｍ　）添加し、その１０ｒｎｅｋ冥施例３の方法に
よシ得た酸性ウレタナーゼ酵素粉末１００ηを添加し、
数日間１５℃にて反応させた。アンモニア増加ｉｔにて
ウレタン減少速度音測定した結果７ｐｐｍ／日の速度で
ウレタンを分解した。

〔発明の効果〕

以上詳述したとレジ、本発明によシ、酸性ウレタナーゼ
の生産が可能になった。これによシ、問題になっている
醗酵食品業界（酸性）中のカルバミン酸エチルの分解に
よυ、無害化するこによう、醗酵食品業界の食品の保健
衛生面に寄与することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法で得られた酸性ウレタナーゼの各
ｐＨにおける活性（３７℃）を表わすグラフ、第２図は
各ｐＨ１ｃ＞ける３７℃、１時間処理によるｐＨ安定性
を表わすグラフ、第３図は各温度にかける活性上表わす
グラフ、第４図はＰＨ４，５で各温度で１時間保温後、
３７℃で活性を測定したグラフである。 第 図 ｐＨ 第 図 Ｈ 第 ３ 図 １屋 １０Ｃノ 第 図 ３及 （０Ｃ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＮＨ＿２ＣＯＯＲ（Ｒはアルキル基又はフェニル基
   、ベンジル基）で示される構造を持つウレタンを分解す
   る能力を有する酸性ウレタナーゼ。 ２、下記式を触媒とするウレタナーゼを生産しうる微生
   物を培養してウレタナーゼを得ることを特徴とする酸性
   ウレタナーゼの製造法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｂはアルキル基、フェニル基又はベンジル基である）