JPH07108222B2 - ウレア−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酸性ウレアーゼの製造方法、さらに詳しくは微
生物を培養して酸性ウレアーゼを製造する方法に関す
る。

〔背 景〕

ウレアーゼは尿素をアンモニアと炭酸ガスに加水分解す
る酵素として知られている。

近年臨床検査部門においては各種血清成分を酵素を用い
て定量する酵素分析法が発達し、ウレアーゼの利用によ
り少量の血清を用いて尿素の定量が行なわれたり、さら
に固定化ウレアーゼによる人工腎臓において尿素の分解
にも用いられている（特公昭60−36751号、特公昭61−1
7467号）。これらの用途においてはナタマメ等のマメ科
植物種子あるいはオイバクテリウム・エアロフアシエン
ス（Eubacterium aerofaciens）、プロテウス・ミラビ
リス（Proteus mirabilis）等の微生物から生産される
中性領域にて作用する公知の中性ウレアーゼが実用化さ
れ好結果が得られている。

一方、食品業界では、特に醗酵食品中に存在する尿素が
不要成分として注目を浴びつつある。醗酵食品のうち酒
類に関しては尿素のその含有量が多い場合には官能的に
苦味を与え、また加熱殺菌や長期貯蔵を行うと着色増加
ならびに香味劣化を引き起す原因となり、嗜好性を低下
させる一因となり得る。

また酒類に限らずエチルアルコールと尿素が共存する多
くの醗酵食品中では両者がエステル結合したカルバミン
酸エチルエステルが生成し、特に過酷な加熱殺菌を行つ
たり長期間の貯蔵の後には食品衛生面の安全性低下をき
たす怖れがある。

これらの問題を回避するには醗酵食品中の尿素を分解す
ることが最も有効な技術的手段として挙げられる。

〔従来の技術〕

尿素の分解のためにウレアーゼが工業的に生産され利用
されているが、いずれも前述の如く中性ウレアーゼに属
するものに限られていた。

またこれらの中性ウレアーゼを用いた醗酵食品中の尿素
の分解も試みられたが、清酒、ビール、ワイン、醤油な
どをはじめとする多くの醗酵食品が属する酸性領域では
中性ウレアーゼは十分な活性を示さず工業的な実用化に
は至らなかつた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

そこで本発明者らは醗酵食品の如き酸性領域にて作用の
強い、いわゆる酸性ウレアーゼの自然界からの検索を鋭
意進めてきた。

酸性ウレアーゲを生産する微生物としてはラクトバチラ
ス・フアーメンタムII b4061（Lactobacillus Fermentu
m II b4061）等が知られている（Applied and Environm
ental Microbiology,Mar.1979、p.379〜382;医学と生物
学第93巻、第４号、1976年10月10日；最新医学第33巻、
第10号p.1973〜1977;1978年）。

しかしながらこれらの微生物は酸性ウレアーゼの生産能
が低く、このため工業的な規模での酵素生産は行いえな
い。

従つて本発明の目的は酸性ウレアーゼを工業的に容易か
つ安価に製造しうる方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明はラクトバチラス・フアーメンタムTK1214（Lact
obacillus Fermentum TK1214）を培養し、培養物より酸
性ウレアーゼを採取することを特徴とするものである。

本発明において酸性ウレアーゼ生産能の高いラクトバチ
ラス・フアーメンタムTK1214を用いるのであるが、勿論
その変異株を使用することもできる。

ラクトバチラス・フアーメンタムTK1214はラツト消化管
内容物より分離されたものであり、その菌学的性質は次
のとおりである。

（ａ）形態的性質 顕微鏡的観察（肉汁培地で37℃にて培養） （１）細胞の形および大きさ 通常細胞の大きさ0.5〜1.0μｍ×3.0〜15.0μｍ、短桿
菌で菌列は柵状構造を示す。

（２）細胞の多形成の有無：有 （３）運動性の有無：無 （４）胞子の有無：無 （５）グラム染色性：陽性 （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養： 37℃、24時間の培養で、直径0.5〜1mmのフラツト円形コ
ロニーを形成する。表面は滑らかで白色。

（２）肉汁寒天斜面培養： 37℃の培養で糸状、周縁は滑らかで光沢が有り、生育は
普通。

（３）肉汁液体培養： 37℃の培養で24時間で生育し、生育は普通。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 37℃の培養で24時間で生育し、生育は普通。液化はしな
い。

（５）リトマスミルク培養： 37℃の培養で凝固せず色調変化なし。

（ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：還元せず （２）MRテスト：陽性 （３）VPテスト：陰性 （４）インドールの生成：生成せず （５）硫化水素の生成：陰性 （６）澱粉の加水分解：陰性 （７）栄養要求性：チアミン、パントテン酸カルシウ
ム、ナイアチン （８）クエン酸の利用：陰性 （９）無機窒素源の利用：陽性 （10）ウレアーゼ：陽性 （11）オキシターゼ：陰性 （12）カタラーゼ：陰性 （13）生育pH:4.5〜7.5 （14）生育温度:18〜45゜ （15）酸素に対する態度：嫌気的ないし微好気的 （16）Ｏ−Ｆテスト：発酵的 （17）糖類からのガスの生成：陽性 （18）糖類からの酸の生成 陽性；リボース、グルコース、ガラクトース、シユクロ
ース、マルトース、ラクトース、メリビオース、ラフイ
ノース 陰性；アラビノース、キシロース、ラムノース、マンノ
ース、フラクトース、セロビオース、トレハロース、メ
レジトース、澱粉、マンニツト、ソルビツト、エスクリ
ン、サリシン、ソルボース 以上の諸性質を「バージーズ・マニユアル・オブ・デタ
ミネイテイブ・バクテリオロジー」第８版（1974年）よ
り検索すると、この菌はラクトバチラス・フアーメンタ
ムと類似していることが判つたが、糖類からの酸の生成
などにおいて異なつているのでラクトバチラス・フアー
メンタムTK1214と命名した。なお本菌株は工業技術院微
生物工業技術研究所に微生物受託番号微工研菌寄第9136
号として寄託されている。

本菌は微生物の培養に通常用いられている栄養物例え
ば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、コ
ーンスチープリカー、カザミノ酸、尿素、グルタミン酸
等に炭素源としてグルコース、シユクロース、マルトー
ス、ラクトース等、無機塩として、第１リン酸カリウ
ム、第２リン酸カリウム、その他硝酸アンモン、塩化ア
ンモン、硝酸ソーダ、クエン酸アンモン等、および緩衝
作用を維持するため酢酸ソーダを0.01〜10％、好ましく
は１〜４％を加え、微量金属として、マグネシウム塩、
第一鉄塩、マンガン塩、ニツケル塩等を加えた培地にて
18〜45℃、好ましくは30〜40℃にて静置条件で良好に増
殖し、培養で６〜48時間で酸性ウレアーゼを生産する。
またウレアーゼ誘導のために尿素、各種ヒドロキサム酸
等も培地に添加しうる。

本発明で用いる菌の培養により生産された酸性ウレアー
ゼは菌体内に存在するためその採取に当つては菌体から
の抽出を行う。抽出は公知の有機溶媒抽出法によること
もできるが、ビーズや超音波を用いた細胞破砕法、界面
活性剤溶液による抽出法等を用いるのが好ましい。

例えば培養後の酸性ウレアーゼが内部に蓄積された菌体
を遠心分離等によつて集め緩衝液に分散させた液または
菌体を含んだ培養液に界面活性剤（例えばトリトンＸ−
100、スパン20、スパン80、トウイーン20等）を0.01〜
５％、好ましくは0.05〜２％加える。この時リゾチーム
を0.001〜10mg/ml、好ましくは0.01〜1mg/ml加えると抽
出効果は向上する。処理後、添加量や菌体濃度によつて
も異なるが５〜120時間、好ましくは48〜72時間抽出し
たのち凝集剤による凝集、遠心分離などにより菌体残渣
を除去すると粗酵素液をうることができる。所望により
酸性ウレアーゼは有機溶媒沈澱、塩析、クロマトグラフ
イーなどの公知の方法で精製することができる。なお、
この酸性ウレアーゼは上記の粗酵素液、精製酵素液、そ
れらの乾燥物、固定化物または細胞懸濁液等任意適当な
形で使用することができる。

本発明においてラクトバチラス・フアーメンタムTK1214
の培養により得られる酸性ウレアーゼの酵素化学的およ
び理化学的性質は次のとおりである。

（１）作用： 尿素を基質として反応させた時ウレアーゼの反応生成物
であるアンモニアと二酸化炭素が確認された。

（２）基質特異性： 基 質 相対活性（％） 尿素 100 カプリロヒドロキサム酸 ０ ニコチノヒドロキサム酸 ０ ヒドロキシルアミン ０ ベンゾヒドロキサム酸 ０ アリル尿素 ０ チオ尿素 ０ ハイドロキシ尿素 ０ メチル尿素 ０ エチル尿素 ０ （３）至適pHおよび安定pH範囲： pH2.8〜4.0付近に至適pHを示す（第１図参照） pH3.5〜7.8付近にて安定（第２図参照） （４）至適温度および熱安定性： 至適温度は60℃付近である（第３図参照） 熱安定性は60℃付近まで安定（第４図参照） （５）阻害および活性化： （６）安定化（65℃、10分処理）： （７）分子量： ゲル過法により約37,26,18,12万の４個の分子種（何
れも等電点4.2）が観察された。

（８）酵素活性測定法： 尿素との反応により生成したアンモニアを比色定量す
る。

（ａ）反応液の組成： 5M尿素 0.05ml 0.1Mアセテートバツフアー（pH4.0） 0.6ml 酵素液 0.1ml （ｂ）反応条件： 37℃、10分間反応させ1.0N・H₂SO₄0.2mlを添加して反応
を停止し、反応液の１部をとりインドフエノール試薬に
より発色させ630nmの吸光度を測定し、生成したアンモ
ニア量を定量することにより分解された尿素量を測定す
る。

（ｃ）酵素活性： 酸性ウレアーゼ１単位（IU）はpH4.0、37℃の条件で１
分間に尿素を１μmole分解する酵素量とする。

〔実施例〕

以下に本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本
発明はかかる特定の実施例の記載によつて限定されるも
のではない。

実施例 １ 酵母エキス0.5％、第１リン酸カリウム0.6％、クエン酸
アンモン0.2％、酢酸ナトリウム４％、グルコース１
％、ポリペプトン１％、肉エキス１％、硫酸マグネシウ
ム0.0575％、硫酸マンガン0.012％、硫酸第一鉄0.0034
％およびトウイーン80 0.1％を含有する培地（pH5.3）
10mlを試験管に入れ、120℃で20分間オートクレーブ殺
菌する。ラクトバチラス・フアーメンタムTK1214（微工
研菌寄第9136号）の１白金耳を上記培地に接種し、37℃
で20時間振とう培養し、種培養液とする。同条件で殺菌
した培地１を含む、３容三角フラスコへ上記種培養
液10mlを接種し、静置、37℃で30時間培養する。集菌し
た菌体を超音波破砕機にて氷冷下10分間処理した。次い
で遠心分離にかけ、酸性ウレアーゼ活性1.0IU/mlの培養
液を得た。

実施例 ２ 実施例１と同様に培養して得た培養液１を遠心分離
し、湿菌体1.4gを得た。これを10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）に懸濁し、10mlとする。この液にトリトンＸ−100
0.02gとリゾチーム2mgを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）を加え、撹拌した後、30℃で３日間放置する。この
処理液を遠心分離し、菌体残渣を取り除き粗酵素液を得
た。酸性ウレアーゼの活性は49.2IU/mlであつた。この
粗酵素液20mlに氷冷エタノールを最終濃度が60％になる
ように添加撹拌し、遠心分離した。得られたケーキを10
mMリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、凍結乾燥し、酵素
活性600IU/gの酸性ウレアーゼ粉末1.5gを得た。（収率9
0％）。

比較例 実施例１と同条件にて公知のラクトバチラス・フアーメ
ンタムIFO3956、IFO3959およびIFO3071を37℃で30時間
培養した。得られた培養液中の酸性ウレアーゼの活性は
それぞれ0.03IU/ml、0.01IU/mlおよび0.02IU/mlと著し
く低かつた。

〔発明の効果〕

以上詳述したとおり、本発明により、酸性ウレアーゼの
工業的生産が可能となつた。これにより、酸性ウレアー
ゼの醗酵食品業界等への安価な供給およびその用途の拡
大に寄与することが可能となつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法で得られた酸性ウレアーゼの各pH
における活性を表わすグラフ、第２図は各pHにおける30
℃、30分間処理によるpH安定性を表わすグラフ、第３図
は各温度における活性を表わすグラフ、第４図は各温度
における10分間処理による熱安定性を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小橋 恭一 富山県富山市千原崎２の４ (72)発明者 竹部 幸子 富山県富山市新庄町117の１ (72)発明者 小林 健文 兵庫県宝塚市安倉南１丁目1361−２ (72)発明者 本田 末広 兵庫県宝塚市光ガ丘１丁目18番19号 (72)発明者 草井 清 大阪府豊中市紫原町１丁目６番７号 (56)参考文献 特開 平１−104155（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ラクトバチラス・フアーメンタムTK1214
   （Lactobacillus Fermentum TK1214）を培養し、培養物
   から酸性ウレアーゼを採取することを特徴とする酸性ウ
   レアーゼの製造方法。