JPH0154998B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、醗酵によるセフアロスポリンの製法
に関する。多数の準合成セフアロスポリン系抗生
物質の製造に多量のセフアロスポリン核が使用さ
れているが、その主な供給源はセフアロスポリン
Ｃ醗酵である。この種の醗酵は一般に数日かかる
が、β−ラクタム加水分解によつて、セフアロス
ポリンＣ自体が非酵素的に分解する。その結果、
代表的な工業的醗酵によつてさえも、セフアロス
ポリンの力価が約25％も失なわれる。また醗酵間
に生産されたセフアロスポリン核の約15％は、デ
アセチル・セフアロスポリンとして存在すること
も認められている。この化合物はセフアロスポリ
ン核の源泉として有用ではあるが、生成されたデ
アセチル・セフアロスポリンＣを単離するため
に、別の技術と設備とを必要とするので、一般に
不便で、不経済である。従つて、デアセチル・セ
フアロスポリンＣの形態をなすセフアロスポリン
核の15％も損失であるから、セフアロスポリンＣ
の抽出という観点において、合計約40％のセフア
ロスポリン核が失なわれることになる。 従来の知見（Konecny等、J.Antib.，XXVI，
３，p.140）とは反対に、培養物中のデアセチ
ル・セフアロスポリンＣ（以下DACという）は、
セフアロスポリンＣよりも、非酵素的β−ラクタ
ム分解に対して、はるかに安定であることが、意
外にも判明した。厳格な検定法を用いた場合に
も、水溶液および醗酵条件下の培養物中のDAC
の分解は認められなかつた。 上記の知見に基いて、醗酵間に生産されたセフ
アロスポリンＣを、できるだけ速やかにDACに
変換する方法が開発された。この方法の利点は、
たとえば次の二点である。第１に、DACは極め
て安定であるから、生産されたセフアロスポリン
系生産物の分解による損失は実際に生じない。第
２に、通常の醗酵法によつて生産されたDACを
回収することもできる。従つて、セフアロスポリ
ン系生産物の回収量を著しく増加することができ
る。代表的な増加率は約40％であるが、この数値
は、通常のセフアロスポリンＣ醗酵のDAC含量
およびセフアロスポリンＣ蓄積の状態に左右され
る。 次に、通常のセフアロスポリンＣ醗酵の所要時
間よりも、はるかに長時間の醗酵を続行すると、
DACの蓄積も続行することが分かつた。一般的
な標準として、セフアロスポリンＣの蓄積は醗酵
６日間後に低下し始めるが、アセチルエステラー
ゼの存在下に醗酵期間を、たとえば２日間または
期間の約1/3だけ延長すると、利用可能なセフア
ロスポリン核の量をさらに50％まで増加できるこ
とが分つた。従つて、醗酵期間を延長すると、
DAC生産によつて得られる利用可能なセフアロ
スポリン核の全収量を、通常のセフアロスポリン
Ｃ醗酵で生産される量の90％以上とすることがで
きる。 この発明によつて、利用可能なセフアロスポリ
ン核の収量を著しく増加することができるので、
経済的な非常に有利である。次に、セフアロスポ
リン核の醗酵法による生産の将来の増加発展を妨
げていたセフアロスポリンＣの不安定性という問
題が著しく改善される。DACから、セフアロチ
ンやセフアロリジンのような薬学的に有用な誘導
体を容易に得ることができる。 本発明により、醗酵法によるDACの製法が提
供される。この方法は、セフアロスポリンＣの非
酵素的分解が発生する前に、生産されたセフアロ
スポリンＣの実質的に全部の量をDACに変換す
るための有効量のアセチルエステラーゼの存在下
に、セフアロスポリンＣ生産能を有する微生物の
醗酵を行なう工程からなる。 アセチルエステラーゼを醗酵開始直前に加えて
もよいし、またはセフアロスポリンＣの分解の開
始前あるいは醗酵の途中に加えてもよい。全期間
を通じて加えてもよい。使用されるエステラーゼ
の起源はとくに制限されない。たとえば高等植
物、細菌、酵母または真菌から得られたエステラ
ーゼでもよい。適当な高等植物の例は、かんきつ
類（Citrus）の果実（英国特許明細書966222号）
や小麦のハイガ（同1121308号）である。適当な
細菌の例はリゾビウムに属するもの（同1121308
号）である。担子菌に属する微生物（同1531212
号）やバチルス・スブチリスに属する細菌
（App.Microbiol.vol.30，３，p.413）も適してい
るが、とくに良いのはロドスポリジウムに属する
微生物である。その例は、本出願人による英国特
許明細書1531212号記載のロドスポリジウム・ト
ルロイデスCBS349である。 適当なエステラーゼの起源を選び出す方法は上
記1531212号に記載されている。この明細書には、
担子菌に属する微生物によつて生産されたエステ
ラーゼの検定が例示されているが、他の起源によ
るエステラーゼの選び方に、これを応用すること
は容易である。 この発明の方法によれば、公知のセフアロスポ
リンＣ生産能を有する微生物を、アセチルエステ
ラーゼ酵素の存在下に通気条件、とくに液面下で
培養し、空気または酸素を通して、かくはんする
と良い。使用する培地は、この種の醗酵に通常利
用されるものでよく、同化可能な炭素源および窒
素源を含み、所望により、生長促進剤や無機物を
含んでもよい。 適当な炭素源の例は、グルコース、シユークロ
ース、でん粉、可溶性でん粉、ノルマルパラフイ
ン、植物油または動物油、酢酸、メタノール、グ
リセロール、ソルビトールおよびエタノールであ
る。適当な窒素源の例は、天然の窒素含有物また
はその加工品、とくに肉エキス、ペプトン、カゼ
イン、コーン・スチープリカー、酵母エキス、大
豆粉、トリプトン、綿実粕および小麦のフスマで
ある。尿素、硝酸塩、酢酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモニウ
ムのようなアンモニウム塩類等の窒素含有無機物
または有機物も使用される。適当な無機塩類の例
は、カリウム、マグネシウムまたはカルシウムの
硫塩酸、硝酸塩、塩化物、炭酸塩または燐酸塩で
ある。適当な生長促進剤の例は、システイン、シ
スチン、チオ硫酸塩、オレイン酸メチル、および
とくにメチオニンである。微量の鉄、亜鉛、銅ま
たはマンガンを含んでもよい。 温度、PHおよび時間のような醗酵条件は、使用
微生物が所望のセフアロスポリンの最大量を培養
物に蓄積するように選ばれる。たとえば、温度15
−45℃（とくに約25℃）、PH４−９（とくに５−
８、中でも約６）で１−20日（とくに４−10日）
間培養するとよい。 適当にセフアロスポリンＣ生産能を有する微生
物の例は、アクレモニウム・クリソゲヌム（前の
セフアロスポリウム・アクレモニウム）で、その
変異株のいくつかは醗酵期間を通じて多量のアセ
チルエステラーゼを生産することができる。セフ
アロスポリウムに属する他の微生物（例、セフア
ロスポリウム・ポリアレウルム）やエメリセロプ
シスおよびストレプトミセスに属するいくつかの
微生物（例、エメリセロプシス・グラブラ、エメ
リセロプセス・ミクロスポラおよびストレプトミ
セス・ラクタムドランス）もセフアロスポリンＣ
生産能を有している。 醗酵中に生成されたセフアロスポリンＣを
DACに変換するために必要なエステラーゼまた
はエステラーゼ含有材料の量を、事前の簡単な酵
素活性の測定または小規模試験によつて簡単に決
定することができる。この量はエステラーゼの種
類と反応条件に左右される。反応の進行状況を高
速液体クロマトグラフイーまたは薄層もしくはペ
ーパークロマトグラフイーによつて調べることが
できる（例えば英国特許明細書1531212号参照）。
一般に、エステラーゼの量は過剰の方がよい。 生産されたDACを常法によつて単離する（例
えば英国特許明細書1433528号参照）。たとえば、
培養物を遠心処理または過（たとえば板状けい
藻土を使用）し、活性炭で溶液を処理して脱塩
し、次にアセトンおよび水で溶出後、アニオン・
イオン交換樹脂（例、アセテート型アンバーライ
トIRA−68、商品名）を用いて吸着し、酢酸カリ
ウム溶液で樹脂からDACを溶出し、アセトンで
沈澱させる。 一般的に、エステラーゼは醗酵液に容易に分布
し、セフアロスポリンＣを加水分解し得る状態に
ある。従つて、他の微生物起源のエステラーゼを
用いる場合、全培養物または分離された細胞を、
好ましくは殺した後、用いることができる。所望
により、超音波、細胞溶解性酵素、適当な薬剤等
で細胞を破砕する。アセトン処理のように、エス
テラーゼ活性を保持しながら細胞を保存できる処
置をしてもよい。 また細胞を含まない状態のエステラーゼを用い
てもよい。従つて、培養物の液または上澄液を
用いることができる。所望により、上記の方法で
細胞を破砕した後に、細胞を過または遠心処理
してもよい。細胞のないエステラーゼをさらに精
製してもよい。このために、たとえば、塩または
有機溶剤（例えばアセトン）を用いる酵素沈殿
法、イオン交換樹脂または酵素に特に親和力を有
する物質を用いるクロマトグラフイーおよびゲル
過または透析による脱塩を行なつてもよい。細
胞のないエステラーゼは溶液、沈殿または適当に
不動態化された製品の形でもよい。 高等植物起源のエステラーゼの場合、酵素を含
有する植物の抽出物を用いると有利である。この
種の抽出物を常法によつて得ることができる。た
とえば、磨砕またはプレスのような物理的方法で
植物から酵素を解放する方法（英国許特許明細書
966222号）や石油エーテルのような炭化水素溶剤
で植物を処理する方法（同1121308号）がある。
こうして得られた抽出物から細胞残渣を除去しま
たは除去しないで、直接に加水分解液に添加する
ことができる。所望により、上記の微生物起源酵
素の処理法に準じて、抽出物をさらに精製し、細
胞を含まないエステラーゼを得た後に、微生物起
源酵素のように使用してもよい。 上記の方法によると、アセチルエステラーゼは
醗酵液に直接に添加される。しかし、セフアロス
ポリン生産能を有する微生物とエステラーゼ生産
能を有する微生物とを混合培養することによつ
て、いわば本質的に原位置において酵素を生産す
ることができる。あるいは、アクレモニウム・ク
リソゲヌムの変異株を用いてもよい。この変異株
は醗酵期間を通じて、セフアロスポリンＣの他
に、多量のエステラーゼを生産するもので、従来
知られていない。 この種の変異株を得る各種の方法が、たとえば
H.I.アドラーの「工業用微生物のための照射とラ
ジオアイソトープ」（国際原子力機構、ウイーン
シンポジウム（1973年）報告、241頁に記載され
ているが、たとえば、８−メトキシプソラレンの
ような感光性物質、酸化窒素、ヒドロキシアミ
ン、５−ブロモウラシルのようなピリミジンベー
ス類縁物質、アクリジン、エチル・メタン・スル
ホネート、マスタードガス、フエノール、ホルム
アルデヒド、熱等の存在下にＸ線、ガンマ線、紫
外線等を照射する方法や遺伝子工学的方法があ
る。本変異株の生産には紫外線照射が適している
ことが分つた。 本発明による変異株の存在は適当なスクリニン
グ法によつて確認される。たとえば、始めに、標
準的同定法によつて、蓄量のDACと微量のセフ
アロスポリンＣを全醗酵期間を通じて生産する変
異株が同定される。次に、標準的同定法によつ
て、添加されたセフアロスポリンＣからデアセチ
ル体をつくる変異株が同定される。本発明による
変異株は、これらの二つの方法によつて同定され
る。 下記の非限定的実施例において使用された菌株
アクレモニウム・クリソゲヌムC0728／１
（IMI237183）は、1979年４月９日にイギリス国
のコンモンウエルス・マイコロジカル・インスチ
チユートに寄託され、入手可能である。この種の
菌株のことは、とくに“Cephalosprium−artige
Schimmelpilze（Hyphomycets）”Walter Gams
（Verlag，W.Germany）1971，pp.109−111に記
載されている。また本菌株Ｃ 0728／１は出願前
に、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている（微生物受託番号第5650号）。また実施例
記載のロドスポリジウム・トルロイデスCBS349
は、CBSカタログ、1972年、28版（オランダ国）
に記載された公知の微生物で自由に入手できる。 実施例 １ (a) アセチルエステラーゼの製造 グルコース（２％）、酵母エキス（１％）、ペプ
トン（１％）、リン酸二水素カリウム（0.5％）、
およびポリプロピレン・グリコール（0.1％）を
含有する液体培地（２フラスコ中）を用いて、
ロドスポリジウム・トルロイデスCBS349を72時
間培養した。酵母浮遊液（100ml）を滅菌された
フラスコに移し４℃に冷却した後、−10℃に冷却
されたアセトン量（30ml）を加え、短時間かくは
んした。次に階段的に冷アセトンを加え、アセト
ン濃度を75％ｖ／ｖとした。酵母細胞を取出し、
上澄液を傾注し、新しいアセトンを加えた。充分
にかくはんし、過剰アセトンを傾注した。処理ず
み細胞を滅菌水を用いて２回遠心処理した後、滅
菌水を用いて再び浮遊液をつくつた。液中のエス
テラーゼ活性は3.5iu／mlであつた。 (b) デアセチルセフアロスポリンＣ（DAC）の醗
酵 下記組成の培地（9.5ml）を用いて振盪培養し
た。滅菌後、上記のエステラーゼ浮遊液0.4mlを
培地に加えた。 培地組成 コーンスチープ・リカー窒素分 0.5％ ラクトース 46ｇ／ グルコース ２ｇ／ メチオニン 2.3ｇ／ フエニルアセチルエタノールアミン 1.5ｇ／ 炭素カルシウム 16ｇ／ 尿素 0.8ｇ／ 硫酸アンモニウム 3.4ｇ／ とうもろこし油 １フラスコ当り ６滴 （滅菌前カセイソーダでPH6.6に調整） フラスコにアクレモニウム・クリソゲヌム
IMI237183（0.5ml）を移植した。この菌株は事前
に、コーンスチープ・リカー（窒素分0.1％）、酢
酸アンモニウム（5.5ｇ／）、シユクロース（25
ｇ／）および炭酸カルシウム（10ｇ／）を含
有する培地で48時間培養されたものであつた。フ
ラスコを25℃で５日間振盪培養し、DACの力価
を高速液体クロマトグラフイで測定した（第１
表）。数値は三つのフラスコで培養したものの平
均値である。対照フラスコは培地と微生物とを含
有するがエステラーゼは含まなかつた。

【表】 実施例 ２ 植菌の例 凍結乾燥したアクレモニウム・クリソゲヌム
IMI237183を液体培地（下記組成のサブロー培
地）２mlで処理し、得られた細胞浮遊液を固体サ
ブロー培地（250mlのブレーク・ボルト中）に移
し、25℃で14日間培養した。 培地組成 マルトース 4.0％ｗ／ｖ 麦芽エキス 2.4％ ペプトン 1.0％ 寒天 2.5％ （水を加えて100％とし、滅菌前PHを7.5に調
製）滅菌水約50mlとガラス玉とで培地表面を洗浄
した。次に細胞浮遊液（各約４ml）を500mlのル
ー・ボトル中の固形サブロー培地に移し、25℃で
12日間培養した。滅菌水40mlとガラス玉で培地表
面を洗浄し、細胞浮遊液をつくり、下記組成のペ
プトン／麦芽エキス培地600mlを入れたバツフル
付き平底フラスコ（２）に移した。 培地組成 ペプトン 1.0％ｗ／ｖ 麦芽エキス 2.4％ 粒状イーテツクス（Yeatex） 2.68％ チヨーク 0.5％ 大豆油 1.96％ （水を加えて100％とし、滅菌前PH7.5に調整）
この液体種培地に、ルー・ボトルから細胞浮遊液
各６mlを移し、25℃で72時間振盪培養した（毎分
110回転、振幅4.9cm）。２個の種培地で培養し、
本培養に用いた。二つの培養はそれぞれ７フア
ーメンター中、25℃で実施例１(b)記載の培地を用
いたが、とうもろこし油の量を3.0％ｖ／ｖとし
た。1M硫酸と8M水酸化アンモニウムでPHを6.0
±0.1に調整し、培養中の溶存酸素張力を30％飽
和以上に保ち、また培養の一時期に24％硫酸アン
モニウムを補助的に加え、遊離アンモニアを
500ppm以上に保つた。約72時間で炭素源が不足
したので、残りの培養期間の持続のために55％セ
レロース（グルコース・モノハイドレート）約15
ml／時を加えた。 DACを生産する醗酵の有利性を示すために、
実施例１(a)記載のロドスポリジウム・トルロイデ
スCBS349からのアセチルエステラーゼ（酵母培
養液400ml相当量）を48時間目（セフアロスポリ
ン蓄積の開始時期）に培地の一つに加えた。 ８日間培養を続け、セフアロスポリンＣと
DACとを高速液体クロマトグラフイーで毎日測
定した。第３表は、セフアロスポリンＣ生産培地
(A)とエステラーゼで処理されたDAC生産培地(B)
との比較である。

【表】 第４表は141時間と189時間培養後のDACの力
価をセフアロスポリンＣ当量で示す。 （Ａ，Ｂは第３表と同意義）

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ セフアロスポリンＣの非酵素的分解が発生す
   る前に、生産されたセフアロスポリンＣの実質的
   に全部の量をデアセチル・セフアロスポリンＣに
   変換するための有効量のアセチルエステラーゼの
   存在下に、セフアロスポリンＣ生産能を有する微
   生物の醗酵を行なう工程からなる、デアセチル・
   セフアロスポリンＣの醗酵による製法。 ２ 温度15−45℃、PH４−９で１−20日間培養す
   る特許請求の範囲１による製法。 ３ 温度約25℃、PH５−８で４−10日間培養する
   特許請求の範囲２による製法。 ４ セフアロスポリンＣ生産能を有する微生物が
   アクレモニウム・クリソゲヌムに属する微生物で
   ある特許請求の範囲１，２または３による製法。 ５ セフアロスポリンＣ生産能を有する微生物
   が、セフアロスポリウム、エメリセロプシスまた
   はストレプトミセスに属する微生物である特許請
   求の範囲１，２または３による製法。 ６ 微生物がセフアロスポリウム・ポリアレウル
   ム、エメリセロプシス・グラブラ、エメリセロプ
   シス・ミクロスポラまたはストレプトミセス・ラ
   クタムドランスに属する特許請求の範囲５による
   製法。 ７ 過剰量のアセチルエステラーゼ酵素が、セフ
   アロスポリンＣ蓄積開始前に添加される特許請求
   の範囲１から６までのいずれかによる製法。 ８ アセチルエステラーゼ酵素の起源が、高等植
   物、細菌、酵母または真菌である特許請求の範囲
   １から７までのいずれかによる製法。 ９ アセチルエステラーゼの起源が、リゾビウム
   に属する細菌、ロドトルラに属する酵母、または
   担子菌もしくはバチルス・スブチリスに属する特
   許請求の範囲１から８までのいずれかによる製
   法。 １０ アセチルエステラーゼの起源がロドスポリ
   ジウム・トルロイデスである特許請求の範囲１か
   ら９までのいずれかによる製法。 １１ アセチルエステラーゼの起源がロドスポリ
   ジウム・トルロイデスCBS 349である特許請求
   の範囲１から１０までのいずれかによる製法。 １２ エステラーゼが細胞を含有しない材料の形
   態である特許請求の範囲１から１１までのいずれ
   かによる製法。 １３ アセチルエステラーゼが、本質的に、エス
   テラーゼ生産能を有する微生物の醗酵によつて生
   産されたものである特許請求の範囲１から７まで
   のいずれかによる製法。 １４ アセチルエステラーゼが、本質的に、培養
   中にセフアロスポリンＣ生産能を有する微生物に
   よつて生産されたものである特許請求の範囲１か
   ら７までのいずれかもしくは１３による製法。