JPH022396A - セファロスポリンｃ及び類似体の一段階酵素反応による７‐アミノセファロスポラン酸及びその類似体への変換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はセファロスポリンＣ及び類似体をそれらに対応
する７−アミノセファロスポラン酸（７Ａ　ＣＡ　）及
びその類似体に一段階で変換する方法に関するものであ
り当該セファロスポリンＣ及び類似体とバチラスメガテ
リウムＡＴＣＣ５３６６７由来、あるいはセファロスポ
リンＣアミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有し
ている、それらの派生物由来、あるいは当該バチラスメ
ガテリウムＡＴＣＣ５３６６７、あるいはセファロスポ
リンＣアミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有し
ているそれらの派生物の遺伝子的物質による発現操作に
よって得られるセファロスポリンＣアミダーゼとの処理
を含むものである。従って、本発明はセファロスポリン
Ｃの７−アミノアジポイル側鎖の酵素的開裂（脱アシル
化）を含むものである。

７−アミノアジポイル側鎖はアミド結合の開裂により除
去されるので、変換をさせうる特定の酵素はここに示し
であるアミダーゼの様な物である。

セファロスポリンＣ１それ自体は発酵産物であるが出発
材料はほぼすべて、現在市販されているセファロスポリ
ン類である。しかしながら、本質的には、これら種々の
商業的セファロスポリン類の製法に対する合成操作は７
−アミノセファロスポラン酸によって開始される。そし
て、それは７−アミノアジポイル側鎖が開裂されている
セファロスポリンＣに由来している。

現在、公知の方法として使用されている７−アミノアジ
ポイル側鎖開裂の方法は化学的反応による方法である。

基本的にイミノ−ハライド方法には７−アミノアジポイ
ル側鎖のアミン基、カルボキシル基の保護操作が必要で
あり、目下、種々の方法がこの方法遂行に際して使用さ
れている。ところが現在用いられている方法である化学
的開裂方法には多数の不都合な面が存在している。つま
り、これらの方法には、多段階的、複合操作法や、操作
中での極度の低温保持、高価な試薬、廃棄物処理問題を
引きおこす大量の副産物の産生、及び化学的反応操作開
始前の不純物を多く含む出発材料の精製などといった、
操作及び配慮が必要なのである。従がって、現在用いら
れている化学的方法よりも、より経済的な方法という面
で、７−アミノセファロスポラン酸を提供しうる、セフ
ァロスポリンＣの酵素的脱アシル化を目的とした、微生
物あるいは発酵的方法を用いた方法が目下開発中である
。

しかしながら、この好結果をもたらす微生物学的方法に
おいても、かなりのむだな操作も含まれている事が示さ
れた。これは文献などによりセファロスポリンＣ分子の
アミノアジポイル側鎖の構造、特にその立体構造が明ら
かにされた結果であり、よって、ペニシリンなどは、種
々の微生物によって作り出されるペニシリンアシラーゼ
の使用による酵素的開裂の結果、脱アシル化された成功
例である。一方、文献に示されているセファロスポリン
Ｃの一段階酵素的脱アシル化反応に対する成功例の報告
は、再現性の乏しい、製産量にかなりの制限がある事を
証明していた。

更に、反応産物としての７−ＡＣＡの単離には、ただ一
つの酵素的転換方法による方法でセファロスポリンＣか
ら７−ＡＣＡに変換するという、つまり真の意味での一
段階変換というものが必要なのではない。他の酵素でも
あるいはセファロスポリンＣを、セファロスポリンＣア
ミダーゼ酵素による開裂に十分に反応しうる他の化合物
へ転換しうるであろう。

例えば日本特許出願５３−９４０９３　（以下参照）の
メイン（Ｍｅｉｊ　ｉ）はセファロスポリンＣアミダー
ゼと考えているところの物についての単離に関して記載
し、セファロスポリンＣの７−ＡＣＡへの転換には、そ
れに先立ってＤ−アミノ酸オキシダーゼによるセファロ
スポリンＣからグルタリル７−ＡＣＡへの酵素的変換の
ある事が唯一、示されている。

シプヤ（Ｓｈｉｂｕｙａ）等、アグリク、パイオル、ケ
ム。

（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）　、第４５
巻、第１５６１〜１５６７頁（１９８１）、参照。

このように、セファロスポリンＣの効率的な一段階酵素
脱アシル化反応による７−アミノセファロスポラン酸の
大量産生をもたらすバチラスメガチリウム株の獲得が可
能であるという事は意外な結果であった。更にこの後に
記載しである様に、一段階開裂が行なわれているという
明らかな証拠は、バチラスメガテリウム由来の酵素と伴
にインキュベーションしたセファロスポリンＣより単離
された産生物、つまり７−ＡＣＡとアミノアジピン酸の
モル比がｌ：ｌであった事に示されている。

セファロスポリンＣの酵素的開裂を遂行するためのこれ
ら開発中の内容について記述しである文献についてまと
めた物を以下に詳しく記載した。

１、−１　　　アシル　、ＣｅｈＣ→７−ΔＣＡデブ、
インド、ミクロバイアル、（Ｄｅｖ、　Ｉｎｄ。

Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、）　、第５巻、第３４９頁（１９
６４）米国特許番号３，２３９，３９４ ウオルトン（Ｗａｌｔｏｎ）　（メルク（Ｍｅｒｃｋ）
　）微生物のスクリーニング及び 選択における土壌栄養法 アクロモバクタ ブレビバクテリウム、 フラボバクテリウム 日本特許公報　５３−９４０９３　（１９７８）ゴイ　
（Ｇｏｉ）等、（メイン（Ｍｅｉｊｉ））シュードモナ
ス種 ＢＮ−１８８ 日本特許公報　５２−１４３２８９　（１９７７）米国
特許番号４，１４１，７９０ （メイン（Ｍｅｉｊｉ））　　　　　アスペルギラス種
アルテルナリア種 日本特許公ｆ１　６１−２１０９７　（１９８６）イチ
カワ（Ｉｃｈｉｋａｉｖａ）等、（アサヒ（Ａｓａｈｉ
））シュードモナス種 ５Ｅ−８３（新種） フランス特許２，２４１，５５７（１９７５）（アリー
ス（Ａｒｉｅｓ））　　　ハチラスセレウス変異株 フルオレセンス 西ドイツ特許３，４４７，０２３（１９８６）（ホーエ
クスト　（Ｈｏｅｃｈｓ　ｔ）　）α−ケト酸存在下、
酵素は Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ バチラスリケニホルミス ２、−　　　　　　アシルし、ペニシリン−６−へＰＡ
日本特許公報　５８−１９０３９９ （ジオツギ（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ））　　バチラスメガテ
リウム変異株 ペニシリテカム ３、　ニ　　　　　　アシルヒ、Ｃｅ　ｈ　Ｃ”　７−
へＣＡ米国特許３，９６０，６６２ アグリク、パイオル、ケム、　　（Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉ
ｏｌＣｈｅｍ、）、第４５巻、第１５６１−６７頁（１
９８１）フジイ（Ｆｕｊｉｉ）等、（トーヨージョーゾ
ー（Ｔｏｙｏ　Ｊｏｚｏ）） Ｄ−アミノ酸オキシグーゼによる脱アミン化の後に脱ア
シル化　　　シュードモナス種４、　　　　　アシル　
、ＧＬ−７−ＡＣＡ”→７−八〇へ日へ特許公報　５２
−１２８２９３　（１９７７）（トーヨージョーゾ−（
Ｔｏｙｏ　Ｊｏｚｏ））ハ゛チラス、 アルスロバクタ− アルカリゲネス ５、　−　　アシル　、その　→７−ＡＣＡプロセスバ
イオケム、　（Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、
第１１巻、第２１頁（１９７６） フジイ　（Ｆｕｊｉｉ）等、（トーヨージョーゾー（Ｔ
ｏｙｏ　Ｊｏｚｏ）） フェニルアセチル７− スメガテリウム 米国特許番号３，５２２，２５０ ケルウィン（Ｋｅｒｗｉｎ）等、（アメリカンホームプ
ロダクツ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｔｌｏｍｅ　Ｐｒｏｄｕ
ｃｔｓ）セファロシン→７ーＡＣへ　工・ソセリ・ンヒ
ア　コリー日本特許公報　５０　−　１０７１８６（ト
ーヨープレウイング（Ｔｏｙｏ　Ｂｒｅｗｉｎｇ））フ
ェニルアセトアミド７−ＡｃＡ３３導体の脱アシル化 アルスロバクタ− パ°チラス、 エッセリソヒア、 クロイベラ、 ミクロコツカス、 ノカルジア、 プロテウス、 キサンソモナス ６、　　　　アシル　、７−ＡＣ八へその日本特許公報
　５４−１１０３９４ （ハンユー（Ｂａｎｙｕ）　） ７−ＡＣＡ　　セファピリン アルスロバクタ− ビスコサス ”ＧＬ−’１−ＡＣＡ＝グルタリル７−ＡＣＡあるいは
脱アミノされたｃｅｐｈ　Ｃ 本発明に従かい以下の方法を提供する。

次の構造式を持つセファロスポリンＣ及びその類似体を
一段階変換反応によって （１，）　　　　　　ＣＯＯＭ （式中 びＲ″は独立的にそれぞれ水素あるいは、たやすく除去
しうるカルボキシルあるいはアミン保８Ｉ基であり、あ
るいは抗菌性物質として７位の側鎖はセファロスポリン
として公知されている。

Ｒ２は一■］である。

Ｒ３は−Ｈあるいは一〇ＣＭＨｚあるいはＣＩｌ□Ｒ４
であり Ｒ４は−Ｈ１−０Ｈ１あるいは−０−ＣＣＩ＋３である
。

またＭは〇　　−Ｈ、アルカリ金属、あるいはその他の
薬理的に許容される塩あるいはエステル、あるいはたや
すく除去しうるカルボキシル保護基である。） 次の構造式を持つ７−アミノセファロスポラン酸へ変換
する方法であり 構造式Ｉなる化合物を、構造式Ｉから構造式ＩＩなる化
合物へと、一段階で変換しうる酵素、つまりセファロス
ポリンＣアミダーゼと、伴に処理する方法であり、当該
酵素は、バチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７、あ
るいはセファロスポリンＣアミダーゼ産生またはその産
生を潜在的に保有しているそれらの派生物由来、あるい
は当該バチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７、また
はセファロスポリンＣアミダーゼ産生またはその産生を
潜在的に保有しているそれらの派生物の遺伝子的物質に
よる発現操作によって、獲得られたと特徴づけられてい
る酵素である。

また本発明に従がい、同様に微生物バチラスメガテリウ
ムＡＴＣＣ５３６６７、あるいはセファロスポリンＣア
ミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有しているそ
れらの派生物をも提供する。

また本発明に従がい、更に、当該セフプロスポリンＣア
ミダーゼを発現しうるバチラスメガテリウムＡＴＣＣ５
３６６７、あるいはセファロスポリンＣアミダーゼ産生
あるいはその産生を潜在的に保有しているその派生物か
らのゲノム及び当該ゲノムの一部分である、これらゲノ
ムをも提供する。

また本発明に従かい更にまた、構造式１なる化合物を構
造式ＩＩなる化合物へと一段階で変換しうる酵素、つま
りセフブロスボリンＣアミダーゼを提供するものであり
、当該酵素とはバチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６
７、あるいはセファロスポリンＣアミダーゼ産生または
その産生を潜在的に保有しているそれらの派生物由来あ
るいは当該バチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７、
またはセファロスポリンＣアミダーゼ産生またはその産
生を潜在的に保有しているそれらの派生物の遺伝子的材
料物質による発現操作によって獲得されたと特徴づけら
れている酵素のことである。

上記構造式Ｉの化合物に関して、セファロスボリンＣ７
−アミノアジポイル側鎖としてのＲ１基が、好ましい一
つの具体例として １１０□Ｃ−Ｃｔｌ（ＣＨｚ）　ｚｃＯ−であることを
明らかにしていＮ＋ｈ る。このアミノアジポイル側鎖のカルボキシル及びアミ
ノ基両者に対する一般的な保護基はよく知られているの
で、Ｒ′及びＲ“は、それぞれたやすく除去しうるカル
ボキシルあるいはアミノ保護基を含む事が同様に定義さ
れている。

“容易に除去しうるカルボキシルあるいはアミノ保護基
“という表現は、カルボキシルあるいはアミン基の水素
を別の一般的な置換基に代えてそれによって、その後に
引き続き行なわれる合成反応において使用される試薬と
当該基との反応を阻止する事を意味するものである。こ
の様なカルボキシルあるいはアミノ基の保護は時おり必
要なものであり、当該基も含めて、置換により望ましく
ない拮抗反応を阻止するものである。従がって、これら
化合物はすべて中間生成物とされている。

また同様に一般的な保護置換基は“容易に除去しうる”
という物でなければならず、それは選択的な除去を意味
するものである。すなわらセファロスポリン母核及び側
鎖において遂行されている一般的な操作過程に際しては
除去されにくい状態になっており、一方、反対にその結
果としてセファロスポリン母核の基本的環状構造や無保
護置換基に障害をもたらすことのない様な、おだやかな
操作方法により除去されうるちのであることを意味して
いる。

Ｒ１はその上７位の側鎖はセファロスポリン抗菌性物質
として公知されている。本発明のセファロスポリンＣア
ミダーゼはアミド結合を認識し、かつセファロスポリン
Ｃ分子の部分を全体として残すので、セファロスポリン
抗菌性物質として公知であるその他の側鎖つまりアミド
結合、及び共通にセファロスポリンＣ分子の部分を保有
しているすべての側鎖は、本質的には酵素的開裂に障害
を与えず、また、このようにして、セファロスポリンＣ
の７−アミノアジポイル側鎖の除去とある意味で類似し
た様な方法で除去されると予期されている。７位側鎖に
おいて知られているこの様な開裂は、セファロスポリン
抗菌性物質として知られているその他の誘導体において
も価値あるものである。

Ｒ３基は代表的発酵産生物特有の種々の置ｔＡ基を含む
ものとされている。たとえば、セファロスポリンＣに対
してＲ３はＣＨ，Ｒ’であり、Ｒ４とは０ＣＣ１ｈであ
る。Ｒ３として限定されている置換基はいずれも本発明
のセファロスポリンＣアミダーゼの酵素的反応をいかな
る点においても阻害するものではないと予期され、十分
に上記において検討されている理由に基づくものである
。

本発明に関する、セファロスポリンＣ及び類似体から７
−アミノ−セファロスポラン酸及びその類似体への一段
階酵素的変換方法の略図を以下に示す。

Ｒ３基は代表的発酵産生物特有の種々の置換を含むもの
とされている。たとえばセファロスポリンＣに対してＲ
３はＣＩｈＲ’であり、Ｒ１とは０ＣＣＨ３である。Ｒ
３として限定されている置換基はいずれも本発明のセフ
ァロスポリンＣアミダーゼの酵素的反応を、いかなる点
においても阻害するものではないと予期され、十分に上
記において検討されている理由に基づくものである。

このようにして、本発明の方法に従ってデスアセトキシ
セファロスポリンＣ（Ｒ’＝ＣＩＩ□Ｒ’　、Ｒ’＝Ｈ
）についても、本質的にはセファロスポリンＣから７−
アミノセファロスポランｉｌｌ　（７−ＡＣＡ）への変
換と、同様の範囲で７−アミノデスアセトキシセファロ
スポラン酸（７−ＡＤＣＡ）へと、変換されるであろう
。これは、３位における官能基が酵素と基質との結合に
は重要な要素ではないという事実に起因するものである
。本発明にかかる、セファロスポリンＣ及び類似体から
７−アミノ−セファロスポラン酸及びその類似体への、
一段階酵素的変換方法の略図を以下に示す。

Ｃ００門 更に詳細に、このセファロスポリンＣから７アミノセフ
アロスボラン酸への変換を図示すると以下の様になる。

本発明におけるセファロスポリンＣアミダーゼを効果的
にもたらす本発明の方法は、構造式Ｉなる化合物との反
応においては、あらゆる点で遂行され、構造式■なる化
合物の構造式ＩＩなる化合物への酵素的変換を誘起する
ものである。これはその広義の情況において“処理する
”という用語を定義するものである。通常、粗セファロ
スポリンＣあるいは類似体の無細胞系培養液はその培地
を流動的供給方法において使用され、粗セファロスポリ
ンＣアミダーゼ培養液と伴にバーチ方式によって処理す
るのが好ましい。この操作方法は、反応物のどの様な本
質的な精製も始めは必要のないことよりとても効率的な
アプローチの方法であると思われる。もち論、改良も可
能である。例えば、互いに反応させる前に必要な範囲に
おいて、いくらでも精製されるものである。同様に、パ
ッチ方式ではなく、連続方式によりこの方法を遂行する
ことも可能である。これら反応物の混合は方法の技術の
発展を考えながら種々の方法をもって改良されるもので
ある。従って、固定化酵素カラムは構造式Ｉなる化合物
を含むセファロスポリンＣと、そのカラムに通すという
面において使用されるであろう。この様な方法の技術の
他の実施例には、膜リアクターに関するものがある。更
に反応物の混合に対する別の方法として、セファロスポ
リンＣあるいは類似反応物産生時に用いた、同様の発酵
用培地におけるバチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６
７あるいはその派生物の培養がある。また、−度セファ
ロスポリンＣあるいは類似体を産生じた発酵用培地を更
にバチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７あるいはそ
の派生物に用いて、それらを培養してセファロスポリン
Ｃアミダーゼを産生させるという改良も可能である。し
かしながらこの操作方法はその産生量において、最適な
方法ではないようである。反応物の混合方法は上記記載
にあるとおり、固定化酵素カラムを用いた方が好ましい
。

更に以下記載の操作実施例は、酵素の濃度を増大し、か
つ、それによって７−アミノセファロスポラン酸の獲得
量をより増進する目的には十分な方法で、セファロスポ
リンＣアミダーゼの予備実験的な精製方法をも含む、セ
ファロスポリンＣの酵素的脱アシル化を説明する為の、
現在用いられている方法を、記載したものである。それ
ゆえ、実施例中における方法について商業的製造に対す
る有用性という面では必ずしも示唆されるものではない
であろう。

微生物の種々の株より作り出される期待しうる産生物の
量の増進に対しては、発酵業者間では公知の技術がかな
りある。例えば、与えられた産生株を、放射あるいは照
射する事により微生物の遺伝子的材料物質の段階におけ
る変異株作成をより強く増進すると知られている、その
他の刺激株とする事。敏感な選択方法の使用により期待
すべき産生物の産生量を増大しうる株を、数多くの変異
株中より選択する事が可能である。この方法においても
、引き続き、種々の選択されてきた派生物からの産生株
の取り出しに対する改良も可能である。本発明に関して
、選択されたバチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７
の派生物によるセファロスポリンＣアミダーゼの取り出
しに対する同様の改良がなされている。この目的にあっ
た満足のいく選択方法は、低濃度のレベルでも酵素的開
裂産生の検出が可能であり、それによりセファロスポリ
ンＣアミダーゼがいかなる特定の派生物から作り出され
ているかという問題をはっきりと確定する高速流体クロ
マトグラフィーの使用である。同様に、この選択方法は
更に効率よくセファロスポリンＣアミダーゼを産生ずる
派生物を提供し、それによってセファロスポリンＣから
７−アミノセファロスポラン酸への酵素的変換における
高い産生量をもたらす可能性を持っている。

この様なバチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７のす
べての派生物は、ここに記載されているとおり、そのす
べてがより効率のいいセファロスポリンＣアミダーゼを
作るものであることより、本発明の範囲の中に入れであ
る。

また遺伝子的材料物質の処理を可能にするところの技術
も、今は、有効な手段となっている。すなわち、微生物
の表面にそれらのすべて、あるいは選択された部分が発
現させられる微生物のゲノムを用いる事であり、例えば
他の微生物としたら大腸菌の様な物である。エンドヌク
レアーゼ制限酵素の使用はバチラスメガテリウムＡＴＣ
Ｃ５３６６７、あるいはセファロスポリンＣ産生または
その産生を潜在的に保有しているそれらの派生物などの
遺伝子的材料物質を切断し、ある種の別な微生物あるい
は遺伝子物質を発現しうる様な生体系の遺伝子と伴に、
それらを組換える事を可能にした。すなわち、セファロ
スポリンＣアミダーゼ産生をツー１゛シているメツセン
ジャーＲＮＡに串じたタンパク質を形成するという事で
ある。公知されている様に、この方法においては、種々
のイントロンや他の遺伝子コートも含まれている。

実際、この技術の進歩は、その様な発現という面におい
ても、すぐに適応されるものである。例えば半ビボ（ｅ
ｘ　ｖｉｖｏ）において、細胞部分及びｍＲＮＡを用い
て生体系の外部へ発現させうる事が可能である。しかし
ながら上記記載の発現系のタイプにおける基本的な目的
はどれでも同じで、与えられたバチラスメガテリウムＡ
ＴＣＣ５３６６７、あるいは特定の派生物由来の遺伝子
的材料物質により産生されうるセファロスポリンＣアミ
ダーゼの量を増大させることにある。また同様に、その
様な酵素の総合的な期待される結合特性についての明ら
かにされた知識に従って、より効果的なセファロスポリ
ンＣアミダーゼを産生ずる為に遺伝子的材料物質を交換
しうる可能性もある。よって本発明のセファロスポリン
Ｃアミダーゼを産生ずるバチラスメガテリウムＡＴＣＣ
５３６６７、あるいはセファロスポリンＣアミダーゼ産
生またはその産生を潜在的に保有しているその派生物に
おける遺伝子的材料物質のいかなる発現も本発明の範囲
の中に入れられる。

本明細書中で用いられている“セファロスポリンＣアミ
ダーゼ産生、あるいは、またはその産生を潜在的に保有
している派生物”という表現は、すべての派生物がセフ
ァロスポリンＣアミダーゼを産生ずるのではなく、また
これらの非産生派生物が本発明の一部分を構成するもの
ではなく、反対にこの非産生派生物が発現した時にセフ
ァロスポリンＣアミダーゼを作り出すことの出来る遺伝
子的材料物質を保有しているという事、また、遺伝子的
物質がある種の別な特徴をコードしているならば、発現
は起こらないといった、これら事実を、単純に表わした
表現である。その様な派生物は“産生を潜在的に保有し
ている”派生物であり明らかに本発明の一部分を構成し
ているものである。

上記記載の株はアメリカン　タイプ　カルテャコレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）に寄託されたものであり、寄託番号は
５３６６７である。

セファロスポリンＣの酵素的脱アシル化により７−アミ
ノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）を獲得する手順を
説明するために、以下に一般的な方法を用いて示した。

↓ 液体シード培地に植菌 ↓　　２４時間、３０℃ プロダクション培地に移植 ↓　　４１時間、３０℃ 細胞懸濁液をハーベスト、次に遠心により細胞を除去 ↓ ６０％から８０％の飽和硫安（Ｎ　ＩＩ　４）２　ＳＯ
ａによる濃縮及び部分精製活性物の分画 孟牲少別足 酸素０．９ｍｊ？を２０ｍｇ／ｍ／セファロスポリンＣ
０，１ｍ６と伴にインキュベート、３７℃、３時間後に
ＨＰ　Ｌ　Ｃアッセイにより？−ＡＣＡを測定更に詳細
な、この−船釣方法を以下に示す。

夫枢桝上 バチラスメガテリウム培養由来のセフプロスポリ１、株
を以下の成分よりなる０Ｍ寒天プレートあるいは傾斜寒
天中において保持する。

成分　　　ｇ／ｌ ビーフエキス　　　　　１．５ イーストエキス　　　３．０ カシトン　　　　　　４．０　　　培地は滅菌前にペプ
トン　　　　　　　６．ＯｐＨ６，４に調整するグルコ
ース　　　　　　１．０ 可溶性スターチ　　　２０．０ 寒天　　　　　　　　１５・０ ２、ＣＭプレート上でストリークしたコロニーより再単
離して更に１〜３日、３０℃で培養する、単離したコロ
ニーをＣＭ斜面培養（８＋ｎｊ！／１８酊チユーブ）に
植菌し、集密的になるまで増殖させる。

斜面培養菌を滅菌蒸留水５ｍ！！で洗浄し、細胞懸濁液
を得る。以下の成分（ＡあるいはＢ）を含むシード培地
（２０ｍｌ／２５０ｍｌエーレンマイヤーフラスコ）に
その菌液１ｍｌを植菌する。

成分　　　Ａ（ｇ／　Ｉ！　）　Ｂ（ｇ／　ｌ　）ビー
フエキス　　　　　　１．５　　　１．５イーストエキ
ス　　　　３．０　　　３．０カントン　　　　　　　
４．０　　　４．０　　滅菌前にｐＨ７，０デキストロ
ース　　　　　１．０　　　０．５　　に調整する可ン
容１生スターチ　　　　２０．０　　　２０．０力ゼイ
ン加水分解産物　４．０ ４、　回転振とう機（２２Ｏｒｐｍ）で３０℃、２４時
間、培養後、そのシード培養菌０．５ｍｌを以下の成分
（ＣあるいはＤ）を含むプロダクション培地に移植する
。

３゜ 成分　　　Ｃ（ｇ／　１　）　Ｄ（ｇ／　ｅ　）ビーフ
エキス　　　　　４．５　　　−４．５カシトン　　　
　　　　９．８　　　９．０大豆ミール　　　　　　９
．０　　　９．０デキストロース　　　　　３．０　　
　３．０可溶性スターチ　　　　６０．０ マルトース　　　　　　　　　　　６０，０フエニル酢
酸　　　　　１．５　　　１．５両培地とも、培地のｐ
Ｈは７に調整し、２５０ｍ１のフラスコへ３０ｍＡずつ
分注する。培地はオートクレーブにかけて滅菌する。シ
ード培養菌を植菌した後、フラスコを回転振とう機（２
２０ｒｐｍ）で４８〜６０時間、３０℃で培養する。

５、同様に同相培地による発酵操作も可能である。

この場合は、上記Ｃ培地に２％の寒天を加えて固定化す
る。そして、細胞は培地表面より５０１のＴ　Ｅ　Ｓ　
／ＮａＯＨ，ｐ）ｌ　７．５を用いて、洗浄しながら取
り出す。以下にその過程を示す。

群素少皿双 １、　すべての培地（あるいは同相産生培地の時の細胞
洗浄懸濁液）に対して、固体硫酸アンモニウムを６０％
会包和になるまで、０“Ｃにおいて、徐々に加えて行く
。得られたスラリーを０℃、１時間、放置しておく。

２６混合物を遠心（９２００ｘｇ、２０分、４℃）にか
けペレットを除去する。上清液の容量を測り、更に、０
°ＣＴ：攪拌しながら８０％飽和に達するまで固体硫酸
アンモニウムを加え、得られたスラリーを０　’ｃ、１
時間、放置しておく。

３、　９２００Ｘｇ、２０分、４℃の遠心によるペレッ
トを集め、以下の成分より成る緩衝液で、このペレット
を１１５０容量（培養上清の最初の容量に対する容量）
に再懸濁する、５０ｍＦ′ＩＴＥＳ／Ｎａ０１１、ｐｌ
＋８．０及び５％（ｗ／ｖ）グリセロール。

もし必要があれば、得られた混合物を短時間の遠心にか
け、清浄化した後、その上清液を０．４５μｍナイロン
−６６のメンプランで濾過し、活性をアッセイする。ま
た、もし活性のアッセイが酵素調製時に同時に行なえな
いのならばサンプルは一３０℃で少なくとも３週間は保
存可能であろう。

孟几皿定 １、基質保存溶液は１ｍｊ２緩衝液（成分、上述）に２
０ｍｇのセファロスポリンＣカリウム塩を？容量して調
製し、０．４５μｍナイロン−６６メンプランで濾過す
る。

２、回収された酵素（０，９ｍ６）にセファロスポリン
Ｃ保存溶液（０，１ｍ／りを加え、この混合物を３７℃
の湯浴中に置き、３〜６時間のインキュベーション後、
７−ＡＣＡの形成を１１　Ｐ　Ｌ　Ｃで追跡する。以下
の条件でクロマトグラフィーを行なった。

移動相　５０ｍＭ　　ＫＨ２ＰＯ４ＫＯｆｔ　、　ｐＨ
４，７流速　　２．Ｏｍｊ！／分 カラム　ヌクレオシル１０　　Ｃｌ８（マチエリ−（Ｍ
ａｃｈｅｒｙ）−ナケル（Ｎａｇｅｌ）０、４　Ｘ　２
５　ｃｍ 温度　　室温 検出　　２６０ｎｍ サンプルサイズ　　２０μ！ 装置　　スペクトル（Ｓｐｅｃｔｒａ）−フィジイクス
（Ｐｈｙｓ　１ｃｓ）あるいは等価型 ７−ＡＣＡの標準保持時間は、この条件下で約６．０分
。

盾性至■定猪来 １、上記記載の操作により、２■／　ｍ　１のセファロ
スポリンＣ存在下での、３時間、３７℃、インキュベー
ション後では、その酵素調製物は３１９ｃｒｇ／ｍｊ＋
の７−ＡＣＡを産生じた。

２、　より高レベルの７−ＡＣＡは、硫酸アンモニウム
の沈澱形成ステップでの酵素の溶解容量をより少量にす
ることで、酵素を更に濃縮して獲得する事ができる。同
様に、液体培地におけるよりも、更に高い細胞濃度を与
える固相培地での産生発酵に対しても操作可能である（
上述、パート■参照）。

災止尉１ セファロスポリンＣから７−アミノセファロスポラン酸
への一段階酵素的変換：開裂産生物の直接本発明に関す
るセファロスポリンＣから７−アミノセファロスポラン
酸（７−ＡＣＡ）への変換は実際に、一つの酵素（つま
りセファロスポリンＣアミダーゼ）、により行なわれた
、一段階方法によるものであるという更にはっきりとし
た証拠を提供するために、実施例１に記載されているＨ
　Ｐ　Ｌ　Ｃによる７−ＡＣＡ形成の測定に関して以外
は、実施例１に記載のある方法で開裂を行なってみると
、その他の開裂産生物、アミノアジピン酸の存在も同様
に測定された。この測定は、ベックマン６３００高速分
析機を用いて行なった。酵素をセファロスポリンＣ（最
終温度２ｎｗ／ｍｌ）と伴に、２．８時間、３７°Ｃで
インキュベーションした。結果を以下に数値表として示
した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、セファロスポリンＣ及びその類似体を一段階変換反
   応によりそれぞれ対応する７−アミノセファロスポラン
   酸及びその類似体に変換する方法において、当該セファ
   ロスポリンＣ及び類似体をバチラスメガテリウムＡＴＣ
   Ｃ５３６６７由来、あるいはセファロスポリンＣアミダ
   ーゼ産生、またはその産生を潜在的に保有しているそれ
   らの派生物由来、あるいは当該バチラスメガテリウムＡ
   ＴＴＣＣ　５３６６７、またはセファロスポリンＣアミ
   ダーゼ産生、またはその産生を潜在的に保有しているそ
   れらの派生物の遺伝子的物質による発現操作によって得
   られたセファロスポリンＣアミダーゼによって処理する
   ことよりなる一段階変換方法。 ２、次の構造式を持つセファロスポリンＣ及びその類似
   体を一段階変換反応によって ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中 Ｒ＾１は▲数式、化学式、表等があります▼、であり Ｒ′及びＲ″は独立的にそれぞれ水素あるいは、たやす
   く除去しうるカルボキシルあるいはアミノ保護基であり
   、あるいは７位の側鎖はセファロスポリン抗菌性物質と
   して公知されている。 Ｒ＾２は−Ｈである。 Ｒ＾３は−Ｈあるいは▲数式、化学式、表等があります
   ▼あるいはＣＨ＿２Ｒ＾４であり、 Ｒ＾４は−Ｈ、−ＯＨ、あるいは▲数式、化学式、表等
   があります▼である。 またＭは＾■、−Ｈ、アルカリ金属、あるいはその他の
   薬理的に許容される塩あるいはエステルあるいは容易に
   除去しうるカルボキシル保護基である。） 次の構造式をもつ７−アミノセファロスポラン酸へ変換
   する方法であり ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 構造式 I なる化合物を、構造式 I から構造式IIなる化
   合物へと一段階で変換しうる酵素、つまりセファロスポ
   リンＣアミダーゼとともに処理する方法であって、当該
   酵素は、バチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７、あ
   るいはセファロスポリンＣアミダーゼ産生またはその産
   生を潜在的に保有しているそれらの派生物由来、あるい
   は当該バチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７、また
   はセファロスポリンＣアミダーゼ産生またはその産生を
   潜在的に保有しているそれらの派生物の遺伝子的物質に
   よる発現操作によって、獲得されることにより特徴づけ
   られている酵素である、一段階変換方法。 ３、構造式 I なる化合物がセファロスポリンＣであり
   、構造式IIなる化合物が７−アミノセファロスポラン酸
   である請求項２記載の方法。 ４、微生物バチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７、
   あるいはセファロスポリンＣアミダーゼ産生、あるいは
   その産生を潜在的に保有しているその派生物。 ５、バチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７。 ６、当該セファロスポリンＣアミダーゼを発現しうる、
   バチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７、あるいはセ
   ファロスポリンＣアミダーゼ産生あるいはその産生を潜
   在的に保有しているその派生物からのゲノム及び当該ゲ
   ノムの一部分よりなるこれらゲノム。 ７、ゲノムがバチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７
   のものである請求項６記載のゲノム。 ８、請求項２において限定されている構造式 I なる化
   合物を請求項２において限定されている構造式IIなる化
   合物へ、一段階で変換しうる酵素、つまりセファロスポ
   リンＣアミダーゼであり、当該酵素とはバチラスメガテ
   リウムＡＴＣＣ５３６６７、あるいはセファロスポリン
   Ｃアミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有してい
   るそれらの派生物由来、あるいは当該バチラスメガテリ
   ウムＡＴＣＣ５３６６７、またはセファロスポリンＣア
   ミダーゼ産生またはその産生を潜在的に保有しているそ
   れらの派生物の遺伝子的物質による発現操作によって獲
   得されたと特徴づけられている酵素。 ９、酵素がバチラスメガテリウムＡＴＣＣ５３６６７に
   より産生されたものである請求項８記載の酵素。