JP2004524006A - シュードモナス・ディミヌタｂｓ−２０３からのグルタリルセファロスポリンアミダーゼ - Google Patents

Abstract

本発明は、７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸から７−アミノセファロスポラニン酸およびグルタル酸への加水分解を触媒する、シュードモナス・ディミヌタ株ＢＳ−２０３からのグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを提供する。本発明はまた、該酵素の産生に有用な核酸配列、ベクター、および宿主細胞をも提供する。グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼは、７−アミノセファロスポラニン酸の調製に用いることができる。

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、７−（４−カルボキシブタンアミド）−３−アセトキシメチル−３−セフェム−４−カルボン酸（グルタリル７−ＡＣＡ）の加水分解を触媒して７−アミノセファロスポラニン酸（７−ＡＣＡ）およびグルタル酸を生成する、シュードモナス・ディミヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）ＢＳ−２０３からの新規なグルタリルセファロスポリンアミダーゼ（グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ）酵素に関する。本発明はまた、シュードモナス・ディミヌタＢＳ−２０３からのグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ遺伝子の核酸配列を含む、グルタリル７−ＡＣＡ酵素をコードする配列を有する核酸、およびそれから得られる核酸配列に関する。本発明はまた、これら核酸配列を含むベクターおよび宿主細胞、およびこれらベクターおよび宿主細胞を用いたグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼの製造方法に関する。本発明はまた、シュードモナス・ディミヌタＢＳ−２０３からのグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを用いることによる７−ＡＣＡの製造方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
７−アミノ−３−セフェム−４−カルボン酸３−アセトキシメチル（７−アミノセファロスポラニン酸、７−ＡＣＡ）は、多くの半合成セファロスポリン抗生物質の合成の出発物質である。７−ＡＣＡは、セファロスポリンＣ（容易に入手できる発酵産物）から２工程の酵素的プロセス（スキーム１）により、まずＤ−アミノ酸オキシダーゼを酸化的脱カルボキシル反応とともに用いてグルタリル７−ＡＣＡを生成し（工程Ａ）、ついでグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼを用いてグルタリル基を除去して７−ＡＣＡを生成する（工程Ｂ）ことで生成できる。
【０００３】
スキーム１
【化１】

【０００４】
工程ＡおよびＢはまた化学的プロセスによっても行うことができる。化学的プロセスは大量の有機溶媒および毒性の化学物質を使用するため、安全性および環境の観点で不利である。一方、酵素的プロセスを用いることにより、７−ＡＣＡが穏やかな条件下、水性溶媒系で得られる。グルタリル７−ＡＣＡの７−ＡＣＡへの加水分解（工程Ａ）を触媒する酵素は容易に入手できるが、セファロスポリンＣの７−ＡＣＡへの直接加水分解（工程Ｃ）を有効に触媒する酵素は容易に入手できない。その結果、２工程プロセスが一般に用いられており、その際、工程Ａは化学的または酵素的に行い、工程Ｂは酵素的に行う。たとえば、Ｃａｍｂｉａｇｈｉら、米国特許第５，４２４，１９６号およびその引用文献を参照。
【０００５】
工程Ａは、通常、Ｄ−アミノ酸側鎖のアミノ基をケト基に酸化するためにＤ−アミノ酸トランスアミナーゼ（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ＥＣ−１．４．３．３としても知られる）（Ａｒｅｔｚら、米国特許第４，７４５，０６１号）を用いて行い、ついで過酸化水素で処理して脱カルボキシル化を行ってグルタリル７−ＡＣＡを得る。
【０００６】
多くの努力が工程Ｂを行う効率的な方法の開発に導いている。Ｃｒａｗｆｏｒｄらは米国特許第５，１０４，８００号において７−ＡＣＡ合成の分野における初期の業績の概要を提供している。Ｍａｔｓｕｄａらは米国特許第３，９６０，６６２号において、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ種およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｖａｌｉｓの培養液からのグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性を記載している。藤沢薬品工業の研究者ら（Ａｒａｍｏｒｉら、米国特許第５，３１０，６５９号およびＥＰ０４８２８４４号；Ａｒａｍｏｒｉら、１９９１， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７３： ７８４８−７８５５）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓから単離したグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼを記載している。Ｃｈｕら（米国特許第５，７６６，８７１号）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓから単離したグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼを記載している。ＢａｔｔｉｓｔｅｌらはＥＰ０５２５８６１号において、種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ種からのグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼを記載している。
【０００７】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
セファロスポリンＣの７−ＡＣＡへの加水分解（スキーム１、工程Ｃ）を直接触媒することのできる多くの酵素が報告されている。たとえば、旭化学工業の研究者ら（Ｉｃｈｉｋａｗａら、米国特許第４，７７４，１７９号；Ｍａｔｓｕｄａら、Ｊ． Ｂａｃｔ．， １９８７， １６９： ５８１５−５８２０および５８２１−５８２６）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａの株ＳＥ−４９５および密接に関連したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種の株ＳＥ８３を開示しており、両者ともセファロスポリンＣの７−ＡＣＡへの直接変換を行うことのできる酵素を産生する。Ｌｅｉｎは米国特許第４，９８１，７８９号およびＥＰ０２８３２１８号において、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｓｃｏｕｓからのセファロスポリンＣアミダーゼを報告している。ＬｅｉｎらはＥＰ０３２２０３２号において、Ｃｒａｗｆｏｒｄらが米国特許第５，１０４，８００号（および分割米国特許第５，２２９，２４７号）およびＥＰ０４０５８４６号において行ったように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからのセファロスポリンＣアミダーゼを報告している。Ｉｗａｍｉらは米国特許第５，１９２，６７８号（および分割米国特許第５，３２０，９４８号）およびＥＰ０４７５６５２号において、その後、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ Ｎ−１７６からのセファロスポリンＣアシラーゼを開示しており、該酵素は工程Ｃを直接行うことができるが、グルタリル７−ＡＣＡの７−ＡＣＡへの変換を触媒することの方に一層熟達している。そのような酵素は、７−ＡＣＡの産生にとって経済的に現実味のあることが未だに示されていない。
【０００８】
種々のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを発現する組換え宿主細胞の調製が多くの研究者によって記載されている。たとえば、Ｍ． ＩｓｈｉｙｅおよびＭ． Ｎｉｗａ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９２， １１３２： ２３３−２３９；Ｃｒｏｕｘら、ＥＰ０４６９９１９号；Ａｒａｍｏｒｉら、米国特許第５，３１０，６５９号；Ｉｗａｍｉら、米国特許第５，１９２，６７８号；およびＨｏｎｄａら、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９７， ６１： ９４８−９５５を参照（全て参照のため本明細書中に引用される）。
【０００９】
７−ＡＣＡの医薬中間体としての価値に鑑み、酵素のコスト、反応速度および収率および酵素の安定性などの要素の観点から優れた結果をもたらす改良された７−ＡＣＡアミダーゼに対する必要性が存在する。
【００１０】
（その解決方法）
本発明は、細菌株Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３から単離した新規なグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ、およびその誘導体、サブユニットおよびフラグメントを提供する。本発明はまた、本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼをコードする核酸配列を含むオリゴヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子）並びにその誘導体、フラグメントおよび部分配列、および本発明のＤＮＡ分子に相補的なポリヌクレオチドをも提供する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞にも関する。
【００１１】
本発明はまた、好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼに対して少なくとも８０％のホモロジーを有する相同なタンパク質をも提供する。１１３までの保存的アミノ酸置換、および／または２０までのアミノ酸付加または欠失を有するタンパク質は、本発明の一部を構成すると考えられる。そのような相同なタンパク質をコードする核酸配列もまた、本発明の一部を構成すると考えられる。
【００１２】
本発明はさらに、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３を適当な培地で培養し、ついでグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性を有するタンパク質画分を回収することによる、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３のアミダーゼを得る方法に関する。本発明はまた、本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを産生するための、本発明の核酸、ベクターおよび宿主細胞の使用方法にも関する。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼと接触させることによる、７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸（グルタリル７−ＡＣＡ）および他の７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸から７−アミノセファロスポラニン酸（７−ＡＣＡ）を得る方法に関する。本発明はまた、本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼと接触させることによる、７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸（グルタリル７−ＡＣＡ）および他の７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸のデスアセチル誘導体からデスアセチル７−ＡＣＡを製造する方法にも関する。
【００１４】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、新規なグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼの単離および特徴付けに関する。とりわけ、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３により産生されるグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼに関する。アラインメントした配列は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種株ＳＥ８３からの「アシル」セファロスポリンアシラーゼ（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｊ． Ｂａｃｔ． １９８７ １６９： ５８２１−５８２６）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種株Ｖ２２から単離したほぼ同一の酵素（Ｍ． ＩｓｈｉｙｅおよびＭ． Ｎｉｗａ， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １９９２， １１３２： ２３３−２３９）に対して約５６％の同一性（３２０の一致）を示す。興味深いことに、本発明のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３酵素とＩｗａｍｉらのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ Ｎ−１７６酵素（米国特許第５，１９２，６７８号）との間にはわずか約２０％の同一性しか存在しない。本発明は、粗製のまたは部分的に精製したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを含む組成物を提供し、単離および精製したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼをも提供する。
【００１５】
本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼは、グルタリル７−ＡＣＡの７−ＡＣＡへの加水分解を触媒することができる。本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼは、４２，０００ダルトンの大ユニットと２６，０００ダルトンの小ユニットとからなる。前駆体タンパク質（配列番号２）のサブユニットへの開裂は、一致する位置でのＳＥ８３アシルセファロスポリンアシラーゼの開裂に鑑みて（Ｍａｔｓｕｄａら、Ｊ． Ｂａｃｔ． １９８７ １６９： ５８２１−５８２６）、図５に示す部位でおそらく起こる。
【００１６】
本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）への付着が容易であることを特徴とし、このことは以下にさらに記載するように酵素の精製および固定化プロセスに用いることができる。
本発明はまた、配列番号２またはその部分に少なくとも８０％相同なタンパク質に関し、該タンパク質は酵素活性部位が実質的に変化していない限り、同様の酵素活性を有することが予期される。
【００１７】
本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼは、ＢＳ−２０３と称する土壌から得た細菌株から単離および精製した。ＢＳ−２０３細菌はグルタリル７−ＡＣＡに対する有意のアミダーゼ活性を含むが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のｄｉｍｉｎｕｔａ種に属すると思われる。ＢＳ−２０３株のさらなる特徴は実施例１に記載してある。
【００１８】
本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸などのような、本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼをコードする単離および精製した核酸、およびそのフラグメント（すなわち部分配列）にも関する。本発明はまた、配列番号２に少なくとも８０％相同であり、グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸にも関する。
【００１９】
本発明はまた、配列番号１に示す配列の相補（すなわちアンチセンス）配列、好ましくは完全に相補的な配列、並びにそのフラグメント（すなわち部分配列）にも関する。部分配列を有するポリヌクレオチドは、グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ遺伝子の全ヌクレオチド配列の制限消化、ＰＣＲ増幅、および直接合成を含む種々の方法によって得ることができる。
【００２０】
本発明は、配列番号１を有するＤＮＡ分子または配列番号１の相補鎖からなるＤＮＡ分子にハイブリダイズする、１０〜１７２２ヌクレオチド、好ましくは１７〜１７２２ヌクレオチド、最も好ましくは２０〜１７２２ヌクレオチドの核酸分子を提供する。最も好ましくは、そのような核酸分子は、ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下［４２℃で７２時間緩衝した、４×ＳＳＰＥ、１０％ＰＥＧ６０００、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、および５０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡと同一または等価］で行ったときに配列番号１またはその相補鎖にハイブリダイズする。好ましいフラグメントは、配列番号１の残基２９３〜１９９３の部分（グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼのコード領域である）に相補的なフラグメントである。特に好ましいのは、配列番号１の残基２９３〜１９９３の部分に少なくとも７４％相補的な、さらに好ましくは８４％相補的な、最も好ましくは少なくとも９４％相補的なフラグメントである。たとえば、プローブ＃７（配列番号１２）は９４％相補的（１７塩基のうち１６が一致）である。７７塩基のゲスマープローブ（配列番号２２）は７４％相補的（５７の一致）であり、少なくともこのレベルのホモロジーを有するプローブの有用性を示している。
【００２１】
本明細書においてアミノ酸配列およびヌクレオチド配列に関するパーセント配列同一性は、第一の配列を第二の配列とアラインメントし、最大のパーセント配列同一性に近づくまたは達成すべく必要ならギャップを導入した後、第二の配列における残基と同一である第一の配列における残基のパーセントとして定義される。保存的な置換はアミノ酸配列の配列同一性に寄与するとは考えない。パーセント配列同一性を決定することを目的としたアラインメントは、当業者の技術レベルの範囲内の種々の仕方で行うことができ、たとえば、ＢＬＡＳＴ（Ｓ． Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９７７， ２５： ３３８９−３４０２）やＡＬＩＧＮ（Ｅ． ＭｙｅｒｓおよびＷ． Ｍｉｌｌｅｒ， １９８９， ＣＡＢＩＯＳ ４： １１−１７）などの公的に利用可能なコンピューターソフトウエアを用いて行うことができる。当業者であれば、比較しようとする配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な適切なパラメータおよびアルゴリズムを決定できるであろう。
【００２２】
短い配列のホモロジーまたは相補性の程度は点検することによって決定できるし、より長い配列についてはＢＬＡＳＴまたはＡＬＩＧＮソフトウエアを用いて決定できる。たとえば、配列番号１を公知の７−ＡＣＡアミダーゼ遺伝子と比較するのに、後者のプログラム（バージョン２．０ｕ）をＢＬＯＳＵＭ５０スコアリングマトリックスおよびエンドギャップウエイティング（ｅｎｄ−ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）とともに用い、−１６のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）および−４のギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）を用いた。−１２のギャップオープニングペナルティおよび−２のギャップエクステンションペナルティを用い、同プログラムを対応アミノ酸配列を比較するのに用いた。
【００２３】
本明細書に記載するヌクレオチド配列は、本発明の１つの態様を表すにすぎない。遺伝子コードの縮重により、本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼまたはそのサブユニットまたはペプチドフラグメントの産生を指令しうる配列に導くヌクレオチドの多くの選択を行えることが理解されるであろう。そのような意味で、本明細書に記載する配列と機能的に等価な核酸配列は本発明の範囲に包含されることを意図する。そのような配列は、たとえば、宿主生物によって優先的に用いられるコドンで置換することによって得ることができる。本発明の核酸はまた、当該技術分野で公知の方法によって単離および実質的に精製してもよい。
本発明の核酸は、ベクター中、および／または培養宿主細胞中に存在してよい。それゆえ、本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターおよび宿主細胞に関する。
【００２４】
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３をグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼの発現に適した条件下、適当な培地で培養し、ついで該アミダーゼ活性を有するタンパク質画分を任意に回収することにより、グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性を有する組成物を得る方法を提供する。本発明はまた、本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを産生させるために本発明の核酸、ベクター、および宿主細胞を用いる方法にも関する。本発明はさらに、本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを接触させることによる、７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸（グルタリル７−ＡＣＡ）またはデスアセチル７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸から７−アミノセファロスポラニン酸（７−ＡＣＡ）またはデスアセチル７−ＡＣＡを得る方法に関する。
【００２５】
本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼは、該酵素のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、たとえば、配列番号２をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養することによって調製できる。この宿主細胞を栄養培地で培養し、引き続き７−ＡＣＡアミダーゼを宿主細胞および／または培地から回収すればよい。本発明で使用することが考えられる宿主細胞は、微生物、酵母、真菌、植物、昆虫、または動物細胞株であってよい。一般に、グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ酵素を活性な形で発現することのできるいかなる宿主細胞も利用できるであろう。
【００２６】
適当な宿主細胞としては、微生物（たとえば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、動物細胞株および培養した植物細胞が挙げられる。好ましい微生物は細菌であり、最も好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する株（たとえば、大腸菌ＪＭ１０９ ＡＴＣＣ５３３２３；大腸菌ＨＢ１０１、ＡＴＣＣ３３６９４；大腸菌ＨＢ１０１−１６、ＦＥＲＭ ＢＰ−１８７２；大腸菌２９４、ＡＴＣＣ３１４４６）、またはＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する株（たとえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４）である。好ましい酵母宿主としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する株（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２）が挙げられる。適当な動物細胞株としては、マウスＬ９２９細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などが挙げられる。適当な昆虫細胞の例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ由来（たとえば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１）、Ｔｒｉｃｈｏｌｐｌｕｓｉａ由来（たとえば、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ^ＴＭ、Ｔｎ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来、およびＨｅｌｉｏｔｈｉｓ由来のものである。細菌を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターは通常、少なくともプロモーター、開始コドン、配列番号２（またはその一部）をコードするＤＮＡ配列、終止コドン、ターミネーター領域、および複製ユニットからなる。酵母または動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターは、エンハンサー配列、スプライシング連結部、およびポリアデニル化部位を含んでいてよい。
【００２７】
細菌での発現のためのプロモーターは、通常、シャインダルガーノ配列を含む。細菌発現のために好ましいプロモーターは、大腸菌のためのＰＬ−プロモーターやｔｒｐ−プロモーターなどのような、市販され、通常用いられているプロモーターである。酵母での発現に適したプロモーターとしては、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのためのＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨＩまたはＡＤＨＩＩ遺伝子、および酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）遺伝子のプロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞での発現のためのプロモーターとしては、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、ＨＴＬＶ−ＬＴＲ−プロモーター、マウスメタロチオネインＩ（ＭＭＴ）プロモーター、ワクシニアプロモーターなどが挙げられる。多くの他の適当なプロモーターが当業者に知られている。
【００２８】
本発明に使用することが考えられるベクターとしては、好ましいまたは必要な操作上の配列とともに上記核酸配列を挿入することができるベクターであって、該ベクターをその後に宿主細胞に移すことができ、および好ましくはそのような宿主細胞で複製することのできるものが挙げられる。好ましいベクターは、制限部位が充分に調べられており、核酸配列の転写のために好ましいまたは必要な操作上の配列を含むものである。ベクターはまた、本発明の核酸を大量に調製するのにも用いることができ、該核酸は、たとえばプローブや他の核酸構築物を調製するのに用いることができる。そのようなプローブは、他の細菌種からの相同なグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ酵素を同定するのに用いることができる。
【００２９】
本発明のベクターは、細菌細胞および／または真核生物細胞で機能することができる。適当なプラスミドとしては、大腸菌のためのプラスミドｐＢＲ３２２またはその改変体、酵母のための酵母２μプラスミドまたは酵母染色体ＤＮＡ、哺乳動物細胞のためのプラスミドｐＲＳＶｎｅｏ ＡＴＣＣ３７１９８、プラスミドｐＳＶ２ｄｈｆｒ ＡＴＣＣ３７１４５、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ ＡＴＣＣ３７２２４、およびプラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ ＡＴＣＣ３７１４９が挙げられる。哺乳動物細胞のためには、エンハンサー配列、ポリアデニル化部位およびスプライシング連結部はＳＶ４０に由来してよい。ベクターは、分泌を促進するために開裂可能なシグナルペプチドを任意にコードしていてよい。
【００３０】
プロモーター、開始コドン、配列をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域、および宿主細胞に適したさらなる配列を、たとえばリンカーや制限部位を用い、通常の仕方（たとえば、制限酵素による消化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるライゲーション）で適当な複製ユニット（たとえば、プラスミド）に挿入して発現ベクターを得ることができる。この発現ベクターで宿主細胞を当該技術分野で知られた方法（たとえば、リン酸カルシウム沈降法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなど）により形質転換（トランスフェクション）することができる。
【００３１】
本発明はまた、本発明の核酸を用いて本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを製造する方法にも関する。本発明の一つの態様において、グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼは以下を含む組換え法により調製する：
（ａ）本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼの産生を宿主細胞に指令しうる核酸を調製し、
（ｂ）宿主細胞に移し宿主細胞で複製することのできるベクター中に該核酸をクローニングし、その際、そのようなベクターは必要なら該核酸の発現のための操作配列を含んでおり、
（ｃ）該核酸および操作配列を含む該ベクターを、グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを発現しうる宿主細胞に移し、
（ｄ）該宿主細胞をグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼの発現に適した条件下で増殖させ、ついで
（ｅ）グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを単離する。
【００３２】
他の態様において、本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａの培養液から単離する。Ｐ． ｄｉｍｉｎｕｔａからグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを単離する方法の例は下記実施例に記載してある。
【００３３】
本発明はさらに、本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを用いて７−β−（４−アシルアミド）セファロスポラニン酸（たとえば、グルタリル７−ＡＣＡ）から７−アミノセファロスポラニン酸（７−ＡＣＡ）を得る方法にも関する。この方法は、グルタリル７−ＡＣＡまたは等価なアシル７−ＡＣＡ基質を、アシル７−ＡＣＡの７−ＡＣＡへの加水分解を可能にする条件下、本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼで処理することにより行う。本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼは溶液中で用いることもできるし、または当該技術分野で知られた方法により、不溶性の支持体に架橋または付着させるかまたは包括することによって固定化してもよい。たとえば、Ｃａｍｂｉａｇｈｉら、米国特許第５，４２４，１９６号；Ｊ． Ｗｏｏｄｗａｒｄ、米国特許第５，８４６，７６２号；Ｍ． Ｂｉｇｗｏｏｄ、米国特許第４，６１２，２８８号；およびＭ． Ｎａｖｉａ、米国特許第５，６１８，７１０号を参照（全て参照のため本明細書に引用する）。
【００３４】
本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼは宿主細胞により培地に分泌されてよい。これら態様では、該酵素は所望なら常法により容易に単離できる。７−ＡＣＡを調製するのに有用な本発明の代表的な組成物は、培養ブロス自体、および濃縮物、沈降物、およびこれらに由来するグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性を含むペプチド画分である。発現された７−ＡＣＡアミダーゼが宿主細胞内に残る場合は、下記の組成物が本発明の代表的な態様である：
（１）宿主細胞；濾過や遠心分離などの常法により培養ブロスから分離
（２）乾燥した細胞；上記宿主細胞を常法により乾燥して得る
（３）細胞不含抽出物；上記宿主細胞を常法（たとえば、有機溶媒による溶解、ホモジナイズ、粉砕、または超音波照射）により破砕し、細胞破砕物を濾過や遠心分離により任意に除去して得る
（４）沈降した酵素；上記細胞不含抽出物を沈降剤（たとえば、硫酸ナトリウム、トリクロロ酢酸、ポリ（エチレンイミン）など）で処理して得る
（５）酵素溶液；上記細胞不含抽出物を常法（たとえば、イオン交換または疎水相互作用クロマトグラフィー）により精製または部分精製して得る
（６）固定化した細胞または酵素；宿主細胞または酵素を常法（たとえば、ポリマーに付着または包括、粒状支持体に付着、または架橋など）により固定化して調製。
【００３５】
本発明のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼをグルタリル７−ＡＣＡと接触させるプロセスは、適当な溶媒、すなわち基質が可溶で酵素が活性な溶媒中で行うことができる。溶媒は、好ましくは水や緩衝液などの水性媒体である。典型的にこのプロセスは、培養ブロスまたは上記の代表的な組成物を、グルタリル７−ＡＣＡまたは同等の基質を含む緩衝液に溶解または懸濁することにより行う。反応混合物のｐＨ、基質の濃度、反応時間および反応温度は、使用した培養ブロスの性質またはそのプロセシングされた物質により変わる。好ましくは、反応は６〜１０のｐＨ、さらに好ましくはｐＨ７〜９；および好ましくは０℃〜４０℃、さらに好ましくは４℃〜１５℃で０．５〜５．０時間行う。反応混合物中の基質の濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌが好ましい。産生した７−ＡＣＡは、当該技術分野で知られた方法により反応混合物から精製および単離できる。
【００３６】
本発明の酵素は、以前に知られているグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼと同様、他のアシル７−ＡＣＡ、たとえばスクシニル７−ＡＣＡやマロニル７−ＡＣＡなどの加水分解も行うことができ、それゆえそのような他の同等の基質の７−ＡＣＡへの変換にも有用であろうことが予期される。７−β−（アシルアミド）−セファロスポラニン酸なる語は、他のセファロスポリンアミダーゼおよびアシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）の基質として知られた７−ＡＣＡ誘導体をいう。一般に、このクラスは、アシルアミドが炭素数３〜６のカルボキシ置換されたアシルアミド基である化合物からなり、さらに詳細には、アシルアミドがマロニルアミド、スクシニルアミド、グルタリルアミド、および５−カルボキシ−５−オキソペンタンアミドよりなる群から選ばれる化合物を含む。
【００３７】
本発明の酵素はまた、グルタリル７−ＡＣＡおよび他の７−β−（アシルアミド）−セファロスポラニン酸のデスアセチル誘導体の加水分解も行うことができ、それによりデスアセチル７−ＡＣＡを生成する。それゆえ、本発明はまた、これら誘導体からデスアセチル７−ＡＣＡを製造する方法をも提供する。
【００３８】
つぎに本発明を実施例により記載するが、これら実施例は例示のものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例１：株ＢＳ−２０３の同定
グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性を有する微生物を探索する経緯の中でＢＳ−２０３と称する細菌を土壌から単離した。この細菌を、ブダペスト条約の規定に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２５１７にて寄託してある。
グルタリルセファロスポラニン酸に対して有意のアミダーゼ活性を含むこの細菌は、以下の特性を有する。
【００３９】
Ａ．形態
この細菌は、厳密に好気性であり、グラム陰性、非胞子形成、運動性の桿菌である。この細菌は、０．５〜０．８×２〜４μｍと計測され、末端が丸く、単一の極性鞭毛を有する。
【００４０】
Ｂ．培養および生理特性
栄養アガー上のコロニーは、円形、凸状、滑らかで無色である。グルコースは酸化的に代謝され、インドール産生は陰性である。増殖は２０℃および２８℃では観察されるが、５℃または３７℃では観察されない。さらに、この株は合成培地では増殖できず、成長因子の要求が示唆される（表１）。合成培地に酵母エキスを添加すると、この株の増殖はよくなる。生理特性を表２にまとめて示す。
表１：種々の培地での株ＢＳ−２０３の増殖

【００４１】
表２：株ＢＳ−２０３の生理特性

【００４２】
表３：関連するシュードモナス種とのＢＳ−２０３の比較

【００４３】
Ｃ．分類学的位置
株ＢＳ−２０３の分類学的特徴は、この株がシュードモナス属に置かれ得ることを示している（Ｎ． Ｐａｌｌｅｒｏｎｉ、Ｆａｍｉｌｙ Ｉ．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｅａｃｅａｅ、１４１−１９９頁、Ｎ． Ｋｒｉｅｇ（編）、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第９版、第１巻（１９８６）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、ボルチモア中；Ｈ． ＳｔｏｌｐおよびＤ． Ｇａｄｋａｒｉ， Ｎｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、７１９−７４１頁、Ｍ． Ｐ． Ｓｔａｒｒら（編）、Ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ： ａ ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ ｈａｂｉｔａｎｔｓ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｖｏｌ． Ｉ （１９８１）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ベルリン中）。株ＢＳ−２０３は、Ｐ． ｄｉｍｉｎｕｔａのグループ（特定の成長因子を要求する）と密接に関連するようである（上掲のＰａｌｌｅｒｏｎｉ、１８４頁）（表３）。
【００４４】
実施例２：活性なグルタリルセファロスポリンアミダーゼの単離および精製
ＢＳ−２０３を、１％カゼイン加水分解物（ＮＺＡｍｉｎｅ Ａ， Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）、１％酵母エキス（Ａｍｂｅｒｅｘ １００３）、１％カゼイン加水分解物（ＣＥＲ９０Ｃ， Ｄｅｌｔｏｗｎ）を含む５００リットルの培地（ｐＨ７．０、２８℃）中、５ＰＳＩＧの０．２ＶＶＭ空気流を用い、激しく攪拌しながら増殖させた。４４時間の増殖の後、１ｋｇの菌体を遠心分離により回収した。
【００４５】
菌体を２．５リットルの水中に再浮遊させ、ＴＩＳＳＵＥＭＩＺＥＲ^ＴＭブランドホモジナイザー（Ｔｅｋｍａｒ）を最大スピードで操作して用いてホモジナイズした。ホモジネートの粘度は１００ｍｇのＤＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を加えて調節した。細胞破砕物を、０．１％のポリ（エチレンイミン）の存在下で遠心分離（７０００×ｇで２０分間）して除去した。さらに０．３％のポリ（エチレンイミン）を加え、沈降するグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性をさらなる遠心分離により除去した。
【００４６】
得られたペレットを８０ｍｌの０．６Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解することにより、活性のアミダーゼを再懸濁した。この懸濁液を水で３倍に希釈し、遠心分離して溶液を清澄化した。得られた透明な上澄み液を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．５）で平衡化した４０ｍｌのＱ−セファロースイオン交換カラムに負荷した。活性部分を０．１５〜０．７５ＭのＮａＣｌ塩勾配を用いて溶出した。３００ｍＭ ＮａＣｌ付近で溶出する最大活性画分をプールし、濃縮し、ついでＳ−２００サイズ排除カラムに負荷した。このカラムを０．２５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス−Ｃｌ（ｐＨ８）で溶出した。
【００４７】
グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性を含むフラクションをプールし、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に対して透析し、ヒドロキシアパタイトの１３ｍｌカラム（Ｂｉｏｒａｄ ＨＴＰ）に負荷した。アミダーゼをリン酸カリウムの勾配（１０〜６００ｍＭ）で溶出した。最大アミダーゼ活性を含むフラクションをプールし、３０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．４）で平衡化したＤＥＡＥ Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ^ＴＭイオン交換カラムに負荷した。この仕上げ（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）カラムを、３０ｍＭトリス−ＨＣｌを含む塩勾配（０〜６００ｍＭ）で溶出した。このカラムから溶出するピークのフラクションは依然として有意の量の混入タンパク質を含んでいたので、Ｄａｖｉｓの方法（Ｄａｖｉｓ， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １９６４， １２１： ４０４−４２７）に従い、調製的天然（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ｎａｔｉｖｅ）ゲル電気泳動を用いてさらに精製を行った。
【００４８】
第二のＤＥＡＥ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌカラムからの半精製アミダーゼの天然ゲル電気泳動は、アミダーゼから混入タンパク質を分離した。天然ゲルのスライスから溶出したタンパク質の活性アッセイにより、同一性が確認された；溶出したタンパク質の天然およびＳＤＳゲル電気泳動の両者により、均質性が確認された。天然ゲルから溶出した天然アミダーゼに対して調製的ＳＤＳゲル電気泳動を行い、このタンパク質の２つのサブユニットを分離した。大ユニット（４２，０００ダルトンの分子量を有する）および小ユニット（２６，０００ダルトンの分子量を有する）の両者を調製的ＳＤＳゲルから溶出し、透析し、ついで濃縮した。これら調製物をトリプシンで消化し、単離したフラグメントを用いてこれら２つのサブユニットからのフラグメントのＮ末端アミノ酸配列を決定した。これらアミノ酸配列を図２および図３に示す。
【００４９】
実施例３：グルタリルセファロスポリンアミダーゼをコードする遺伝子のＢＳ−２０３からの単離
Ａ．ＢＳ−２０３からの染色体ＤＮＡの調製
１００ｍｌのルリアベルタニ（ＬＢ）培地にＢＳ−２０３のコンフルエントな培養液１ｍｌを接種した。この培養液を２８℃にて２４時間、２００ｒｐｍで振盪した。菌体をＴＪ−６ Ｂｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機で６０００ｒｐｍにて１５分間ペレット化した。菌体を４ｍｌの５０ｍＭグルコース／１０ｍＭ ＥＤＴＡ／２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再浮遊させ、１０ｍｇの強化リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）とともに１５分間、３７℃でインキュベートした。１ｍｌの２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを５０℃にて３時間加えて菌体を溶解させた。この懸濁液を、１ｍｌのフェノール、１ｍｌのクロロホルムおよび１ｍｌのエーテルで順に抽出した。ついで、３０μｌの５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍｌの１００％エタノールを加えて沈降させ、ついでクロットが生成するまで逆さにして穏やかに混合した。
【００５０】
このＤＮＡクロットを密封したフックトパスツールピペットを用いて除去し、ついで７０％、８５％および１００％エタノール溶液で順に濯いだ。この７０％および８５％エタノール溶液を、１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌで希釈した。このＤＮＡを、０．５ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中、２２℃で１６時間溶解させた。ＲＮアーゼＡを５０μｇ／ｍｌまで加え、３７℃で２時間インキュベートし、ついで０．５％ＳＤＳおよび５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで３７℃にて１６時間、第二の消化を行った。有機抽出およびエタノール沈殿を繰り返した。最終的なＤＮＡクロットを０．４ｍｌのＴＥに溶解した。ＤＮＡの濃度を分光光度的に２６０ｎｍで決定した。
【００５１】
Ｂ．ＢＳ−２０３のゲノムコスミドＤＮＡライブラリーの構築
ＢＳ−２０３からゲノムコスミドライブラリーを得るため、新たなコスミドベクターｐＷＢ７０を用いた。このベクターは、図６に示すように、プラスミドｐＮＥＯ（Ｒ． Ａ． Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、Ｍｏｌ． Ｇｅｎｅ Ｇｅｎｅｔ． １７７： ６５−７２ （１９７９））およびｐＪＰ１Ａ（Ｊ． Ｊ． Ｐｏｒｔｍｏｒｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｌｅｔｔｅｒｓ ９： ７−１２ （１９８７））から構築した。プラスミドｐＮＥＯをＰｓｔＩで部分消化し、ＥｃｏＲＩで完全消化した。４．２キロベース（Ｋｂ）のフラグメントを調製的アガロースゲル電気泳動により単離し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ^ＴＭ（ＢＩＯ １０１）を用いて精製した。ｐＪＰ１ＡをＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、バクテリオファージラムダのｃｏｓ部位（ＤＮＡがラムダファージヘッドにパッケージングされるのを可能にする）を含む１．１Ｋｂフラグメントを単離した。これら２つのフラグメントをライゲートし、形質転換体をネオマイシン耐性およびアンピシリン感受性についてスクリーニングした。このベクター（β−ラクタマーゼ活性を産生せず、ネオマイシンに対して耐性を付与する）は、大きな（３０〜４５Ｋｂ）染色体ＤＮＡフラグメントが大腸菌中に挿入され、ゲノムコスミドライブラリーを生成することを可能にする。
【００５２】
ＢＳ−２０３からゲノムコスミドライブラリーを生成するため、以下の方法を用いた：コスミドｐＷＢ７０をＢａｍＨＩで消化し、自己ライゲーションを防ぐため細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で脱リン酸した。コスミドクローニングに必要な３０〜４５ＫｂのＤＮＡフラグメントを生成する最適条件を確立するため、ＢＳ−２０３の高分子量染色体ＤＮＡを種々の量のＳａｕ３ＡＩで３７℃にて１時間消化した。Ｓａｕ３ＡＩは４塩基対（ｂｐ）配列ＧＡＴＣを認識し、ＢａｍＨＩ粘着末端にライゲートできる粘着末端を生成する。０．０１６単位／μｇ（ＤＮＡ）の酵素濃度が、３０〜４５Ｋｂの範囲のＤＮＡフラグメントを最大の濃度で与えた。これら条件を用いて多量の部分消化ＢＳ−２０３ＤＮＡを調製した。３０〜４５ＫｂのＤＮＡフラグメントを富ませるため、ＤＮＡを１０〜４０％のショ糖勾配で分画した。フラクション（０．４ｍｌ）を回収し、各３番目のフラクションを０．４％アガロースゲルの電気泳動により分析した。適当なサイズのフラグメントを含むフラクションをプールし、エタノールで２回沈殿させた。アガロースゲル電気泳動による最終的な分析は、このＤＮＡがコスミドクローニングにとって正しいサイズであることを示した。
【００５３】
上記の富ませたＢＳ−２０３ＤＮＡフラグメント（３０〜４５Ｋｂ）を、ＢａｍＨＩ消化したｐＷＢ７０にＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を用いて２２℃で１６時間ライゲートした。製造業者の指示に従い、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｇｏｌｄ^ＴＭキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてライゲーション混合物をインビトロパッケージングした。トランスフェクタントを３０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含有するＬＢアガー上で選択した。パッケージング効率は、約７．２×１０^３トランスフェクタント／μｇ（挿入ＤＮＡ）であった。
【００５４】
ＢＳ−２０３ゲノムコスミドライブラリーのコロニーブロットを調製し、グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ遺伝子をスクリーニングした。トランスフェクタントを８２ｍｍ、０．４５μｍのニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移した。ついで、１７０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢアガープレートにフィルターを移すことによりトランスフェクタントを増幅させ、３７℃で１６時間インキュベートした。このフィルター（コロニー側を上に）を下記溶液：１０％ＳＤＳを３分間、０．５Ｍ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌを５分間、１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５を５分間および２×ＳＳＰＥを５分間、で飽和した３ＭＭペーパーに移すことにより、ＤＮＡをフィルターに結合させた。フィルターを３０分間空気乾燥させ、ついで真空オーブンで８０℃にて３０分間燒結した。細菌破砕物を除去するため、フィルターを１×ＳＳＰＥ／０．５％ＳＤＳ／５０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ中、４２℃で３０分間インキュベートした。フィルターを前もって６５℃に加熱した２×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ中、グラブをはめた手で穏やかに擦ることにより、細菌破砕物を除去した。ついで、フィルターを２×ＳＳＰＥで各５分間、２回洗浄し、空気乾燥し、ついでハイブリダイゼーションするまで覆った。
【００５５】
Ｃ．グルタリルセファロスポリンアミダーゼ遺伝子を含むクローンの選択
グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼのアミノ酸配列から得られた、１６の１７−ｍｅｒ縮重オリゴヌクレオチドプローブを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３９１ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ ＰＣＲ−ＭＡＴＥ^ＴＭを用いて合成し（図２）、［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で末端標識し、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したＢＳ−２０３染色体ＤＮＡのサザーンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｅ． Ｍ． １９７５， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９８： ５０３−５１７）をプローブするのに用いた。ハイブリダイゼーションは、４×ＳＳＰＥ、１０％ＰＥＧ６０００、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）および５０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ緩衝液中、４２℃で７２時間行った。ハイブリダイゼーション洗浄条件は以下のとおりであった：５×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ中、２０〜２５℃（室温）で各５分間を２回、５×ＳＳＰＥ／０．１％ＳＤＳ中、４５℃で各５分間を２回、および５×ＳＳＰＥ中、２０〜２５℃で各５分間を２回。
【００５６】
９つのプローブがサザーンブロットにハイブリダイズした。これら９つのプローブのうち、４つを選択してゲノムコスミドライブラリーのコロニーブロットをスクリーニングした。ハイブリダイゼーション時間を４８時間に短縮した他は上記と同じハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用い、各プローブを用いてそれぞれ約２００のトランスフェクタントを含む４つのコロニーブロットをスクリーニングした。プローブ＃３（配列番号８）およびプローブ＃７（配列番号１２）で同定された１２のトランスフェクタントをさらなる評価のために選択した。プラスミドＤＮＡをＴＥＬＴミニプレップ法（Ｈｅら、１９９０， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １８： １６６０）を用いて各トランスフェクタントから単離した。これらクローンのサザーン分析は、１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブおよび７７塩基ゲスマープローブ（Ｌａｔｈｅ， Ｒ．， １９８５， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８３： １−１２）の両者にハイブリダイズする５つのコスミドクローンを同定した。
【００５７】
７７塩基ゲスマープローブ（図３）は、図２に記載のアミノ酸配列に基づいてデザインおよび合成した。ハイブリダイゼーションは、２×ＳＳＣ、５×デンハルト、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ緩衝液中、５０℃で４８時間行った。ハイブリダイゼーション洗浄条件は以下のとおりであった：２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中、２０〜２５℃で各１０分間を２回、２×ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中、６０℃で２０分間を１回、および２×ＳＳＣ中、２０〜２５℃で５分間を１回。これら５つのコスミドクローンをグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性についてさらに評価した。３つのクローンが有意の量の活性を示し、クローン７．１０が最大の活性を示した。
【００５８】
その都合のよいサイズにより、オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズしたコスミドクローン７．１０からの２．３Ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントを単離し、ＰｓｔＩで開裂しＢＡＰで脱リン酸したバクテリオファージＭ１３ｍｐベクター中にサブクローニングした。コスミドクローン７．１０からの２．３Ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントのヌクレオチドシークエンシングは、該遺伝子を同定するのに用いた１７−ｍｅｒプローブおよび７７塩基ゲスマープローブに相補的な配列を同定した。隣接するＤＮＡ配列の翻訳は、前に決定したアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を生成した（図２および図３）。
【００５９】
全２．３Ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントのヌクレオチド配列の翻訳は、グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ遺伝子の３’末端が欠失していることを明らかにした。それゆえ、該遺伝子の３’末端を配列決定し、完全長の遺伝子を再構築するために３’末端をサブクローニングする必要があった。シークエンシングは、翻訳開始部位の約１００塩基対上流にあるＨｉｎｄＩＩＩ部位を同定した。それゆえ、１７−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブおよび７７塩基ゲスマープローブの両者にハイブリダイズしたコスミドクローン７．１０からの１１Ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで開裂したｐＵＣ１９中にサブクローニングした。形質転換体をスクリーニングし、１つを選択してさらに評価した。
【００６０】
１１Ｋｂ ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含むこのクローンの３’末端非コード領域を切り取るため、このクローンをＢａｍＨＩで完全消化し、ついでＳａｕ３ＡＩで部分消化した。アリコートを５分、１０分および２０分で取り、コンバインし、ついでアガロース調製的ゲルで電気泳動にかけた。４．８〜５．８Ｋｂの範囲をゲルから切り出し、単離した。この４．８〜５．８Ｋｂフラグメントをそれ自身で再ライゲートし、ＤＨ５α細胞を形質転換するのに用いた。ミニプレップＤＮＡを１２の形質転換体から調製し、ＥｃｏＲＩ消化によりスクリーニングした。クローン＃６は１．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメント（ＰｓｔＩ部位の下流の１０００塩基の配列をさらに含んでいる）を含んでいた。このフラグメントを単離し、Ｍ１３ｍｐ１９中にクローニングし、該遺伝子の３’末端のシークエンシングに用いた。
【００６１】
Ｄ．ヌクレオチド配列の決定
２．３Ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントおよび１．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメント上にコードされるグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を、ＴＡＱ ＴＲＡＣＫ^ＴＭシークエンシングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたジデオキシチェインターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７４： ５４６３−５４６７）により決定した。２．３Ｋｂ ＰｓｔＩフラグメントを反対方向に含む２つのクローンを同定した。エキソヌクレアーゼＩＩＩを用い、挿入物の一つの末端から一方向に入れ子状の（ｎｅｓｔｅｄ）欠失物のセットを生成した。これら欠失物から一本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３クローニング／ジデオキシシークエンシングインストラクションマニュアル、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、フォーム＃１９５４１：４４−４９）を単離し、シークエンシングに用いた。Ｍ１３ｍｐ１９中にクローニングした１．８Ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントからも一本鎖ＤＮＡを単離し、該遺伝子の３’末端をシークエンシングするのに用いた。Ｍ１３（−２０）プライマー５’−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−３’（配列番号２３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）および合成内部プライマーを用いて両鎖からの全遺伝子をシークエンシングした。電気泳動を、ＴＢＥ（０．０８９Ｍトリス−ホウ酸、０．０８９Ｍホウ酸、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ）緩衝液中に８Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲルおよびＴＢＥ緩衝液中に７Ｍ尿素を含む５％ＨＹＤＲＯＬＩＮＫ ＬＯＮＧ ＲＡＮＧＥＲ^ＴＭ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、米国）ポリアクリルアミドゲル上、２７００ボルトで行った。
【００６２】
全ヌクレオチド配列を図４に示す。コード領域は１７０１ｂｐの長さであり、５６７アミノ酸のタンパク質（ＭＷ＝６０ｋＤ）をコードしている。該遺伝子を同定するのに用いた１７−ｍｅｒプローブおよび７７塩基ゲスマープローブに相補的な配列は、図４で下線を付してある。
このＤＮＡ配列の翻訳から決定したタンパク質配列（配列番号２）は、図２および図３で同定したアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含んでいる。
【００６３】
実施例４：グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼのサブクローニングおよび大腸菌での発現
大腸菌での酵素発現用プラスミドベクター中へのグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ遺伝子のサブクローニングを容易にするため、該遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）に制限酵素部位を導入すべく、Ｍｏｒｉｎａｇａの方法（Ｍｏｒｉｎａｇａら、１９８４， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７： ６３６−６３９）を用いてグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼのゲノムクローンにオリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発を行った。ＢｓｐＨＩ部位（ＴＣＡＴＧＡ）を生じる単一塩基変化（ＡからＴ）を含む合成オリゴヌクレオチド突然変異原を以下に示す：
（ａ）突然変異させるべきグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼの配列：
【化２】

（配列番号２４）
（ｂ）合成オリゴヌクレオチド（２１−ｍｅｒ）：
【化３】

（配列番号２５）
【００６４】
首尾よく突然変異したグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼＤＮＡを制限酵素ＢｓｐＨＩで開裂して同定し、ＤＮＡ配列分析により確認した。ついで、グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ遺伝子を制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＢａｍＨＩで消化してゲノムクローンプラスミドから単離し、大腸菌発現プラスミドｐＢＭＳ２０００（図１）中にライゲートし、ついで大腸菌株ＢＬ２１に形質転換した。ＬＢアガープレート（１％バクトトリプトン、０．５％ＮａＣｌ、０．５％酵母エキス、および１．５％アガー；３０μｇ／ｍｌのネオマイシンを添加）で選択した組換え培養液を３０μｇ／ｍｌのネオマイシンを添加したＬＢ培地で増殖させ、対数増殖期の間に６０μＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて４時間誘発した。プラスミドｐＢＭＳ２０００／ＧＣＡを有するＩＰＴＧ誘発組換え大腸菌ＢＬ２１の溶解液は、グルタリル７−ＡＣＡを７−アミノセファロスポラニン酸に首尾よく変換し、活性なグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ酵素活性を示していた（形質転換していないＢＬ２１はグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性を有しない）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）分析に供した同溶解液は、グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼの小サブユニットおよび大サブユニットに対応する２６キロダルトン（ｋｄ）および４２キロダルトンの新たなタンパク質バンドを明らかにした。
【００６５】
より大スケールの産生のため、好ましい発酵プロセスは以下のとおりである：
組換え大腸菌ＢＬ２１を、リン酸二カリウムを３ｇ／ｌ；リン酸一カリウムを２ｇ／ｌ；硫酸マグネシウムを２ｇ／ｌ；酵母エキスを３ｇ／ｌ；硫酸アンモニウムを０．５ｇ／ｌ；硫酸第一鉄を０．０３ｇ／ｌ；およびカナマイシンを０．０３ｇ／ｌ含む培地で培養する。発酵を３０℃にて１．０ＶＶＭ＠７ＰＳＩＧの空気流にて行う；ｐＨをアンモニアガスで７．０に保持する。線状の増殖速度を維持するため、培養液に２０％カゼイン加水分解物および２０％グルコースの溶液を与える。アミダーゼ産生の誘発は、１０時間の発酵後、１５０μＭのＩＰＴＧを用いて行う。発酵は、アミダーゼ力価が最大に達したとき、通常、約４５時間後の約４０ｇ／リットル（菌体乾燥重量）の細胞密度のときに停止させる。全ブロスをホモジナイズしてアミダーゼを放出させ、濾過により清澄化する。
【００６６】
酵素の固定化のためには、好ましい方法は、活性な濾液を５％珪藻土、０．５％ポリアリルアミン、および０．２％ポリエチレンイミンで処理することである。ついで、混合物を０．１５％グルタルアルデヒドでｐＨ８．０にて処理して該アミダーゼを珪藻土上に固定化する。ついで、アミダーゼを濾過により回収することができる。
固定化したアミダーゼは、アンモニアでｐＨ９．０に維持しながら、基質濃度が１００ｇ／ｌのグルタリル７−ＡＣＡである４℃の水性懸濁液を攪拌することにより、グルタリル７−ＡＣＡを７−ＡＣＡに変換するのに用いることができる。収率は約９０％で、物質収支は９５％である。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌発現プラスミドｐＢＭＳ２０００ＧＣＡの制限地図を示す。使用した略語は以下のとおりである。
Ｐｔａｃ：ｔａｃ転写プロモーター
ｇｒｏＥＳ：ｇｒｏＥＳシャペロン遺伝子
ＭＣＳ：マルチプルクローニングサイト
ｏｒｉ：ＤＮＡ複製起点
ｎｅｏ^ｒ：ネオマイシン耐性遺伝子
ｌａｃｉ^ｑ：転写リプレッサー遺伝子
ＧＣＡ：グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ遺伝子
【図２】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼからの１０アミノ酸の配列（配列番号３）、この配列の６アミノ酸部分集合、これら６アミノ酸をコードできる包括的なヌクレオチド配列（配列番号４）、その相補配列（包括的な相補配列；配列番号５）、および包括的な相補配列に対応する１６の縮重オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号６〜２１）を示す。図中、Ｘ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｒ＝ＡまたはＧ。
【図３】グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼのアミノ酸配列（配列番号２の一部）、およびそれから得られた７７塩基対の「ゲスマー（ｇｕｅｓｓ−ｍｅｒ）」プローブのヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。
【図４】Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３からのグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ遺伝子の全ヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。翻訳開始部位および終止部位は矢印で示してある。縮重プローブの１つ（配列番号８）およびゲスマープローブ（配列番号２２）に相補的な領域は下線を付してある。
【図５】図４のヌクレオチド配列によってコードされる、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ ＢＳ−２０３からのグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ前駆体タンパク質の全アミノ酸配列（配列番号２）を示す。矢印は、サブユニットへの開裂の起こりそうな部位を示す。
【図６】プラスミドｐＷＢ７０の構築法を示す。
使用した略語は以下のとおりである：ｃｏｓはバクテリオファージラムダの粘着末端である；Ｎｅｏｒ、Ａｍｐｒ、およびＴｅｔｒは、ネオマイシン、アンピシリン、およびテトラサイクリンに対する耐性をコードする遺伝子である。

Claims (38)

1. 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼをコードする単離核酸。
2. 配列番号１に示す配列を含む、請求項１に記載の核酸。
3. 配列番号１に示す配列からなる、請求項２に記載の核酸。
4. 配列番号１からなるＤＮＡ分子かまたは配列番号１の相補鎖からなるＤＮＡ分子のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、１０〜１７２２ヌクレオチドの単離核酸。
5. 長さが１７〜１７２２ヌクレオチドである、請求項４に記載の単離核酸。
6. 長さが２０〜１７２２ヌクレオチドである、請求項４に記載の単離核酸。
7. 請求項１ないし６のいずれか１つに記載の核酸配列を含むベクター。
8. 請求項７に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
9. 細菌である、請求項８に記載の宿主細胞。
10. 以下の特徴を有するグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ：
    シュードモナス・ディミヌタＢＳ−２０３から単離できる；７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸から７−アミノセファロスポラニン酸およびグルタル酸への加水分解を触媒する；およびＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動による４２ｋｄおよび２６ｋｄのみかけの分子量を有する２つのサブユニットからなる。
11. 配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ。
12. 配列番号２に示すアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ。
13. 請求項１２に記載のアミダーゼに対して少なくとも８０％のホモロジーを有するグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ。
14. アミノ酸配列が、１１３までの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２を含む、請求項１３に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ。
15. アミノ酸配列が、２０までのアミノ酸残基の付加または欠失を有する配列番号２を含む、請求項１３に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ。
16. 不溶性の支持体に固定されている、請求項１０ないし１５のいずれか１つに記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ。
17. 請求項１３ないし１５のいずれか１つに記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼをコードする単離核酸。
18. 請求項１７に記載の核酸配列を含むベクター。
19. 請求項１８に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
20. シュードモナス・ディミヌタＢＳ−２０３からグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼを製造する方法であって、
    （ａ）シュードモナス・ディミヌタＢＳ−２０３細菌を好気的条件下、適当な培地で培養し、ついで
    （ｂ）得られた培養液からグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性を有するタンパク質フラクションを回収することを含む方法。
21. グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼの製造方法であって、
    （ａ）請求項８に記載の宿主細胞をグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼの発現に適した条件下で培養し、ついで
    （ｂ）得られた培養液からグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性を有するタンパク質フラクションを回収する
    ことを含む方法。
22. グルタリル７−ＡＣＡアミダーゼの製造方法であって、
    （ａ）請求項１９に記載の宿主細胞をグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼの発現に適した条件下で培養し、ついで
    （ｂ）得られた培養液からグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼ活性を有するタンパク質フラクションを回収する
    ことを含む方法。
23. ７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸を適当な溶媒中で請求項１０に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼと接触させることを含む、７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸から７−アミノセファロスポラニン酸を得る方法。
24. ７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸を適当な溶媒中で請求項１１に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼと接触させることを含む、７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸から７−アミノセファロスポラニン酸を得る方法。
25. ７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸を適当な溶媒中で請求項１２に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼと接触させることを含む、７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸から７−アミノセファロスポラニン酸を得る方法。
26. ７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸を適当な溶媒中で請求項１６に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼと接触させることを含む、７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸から７−アミノセファロスポラニン酸を得る方法。
27. ７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸が７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸である、請求項２３に記載の方法。
28. ７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸が７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸である、請求項２４に記載の方法。
29. ７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸が７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸である、請求項２５に記載の方法。
30. ７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸が７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸である、請求項２６に記載の方法。
31. デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸を適当な溶媒中で請求項１０に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼと接触させることを含む、デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸からデスアセチル７−アミノセファロスポラニン酸を得る方法。
32. デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸を適当な溶媒中で請求項１１に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼと接触させることを含む、デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸からデスアセチル７−アミノセファロスポラニン酸を得る方法。
33. デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸を適当な溶媒中で請求項１２に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼと接触させることを含む、デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸からデスアセチル７−アミノセファロスポラニン酸を得る方法。
34. デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸を適当な溶媒中で請求項１６に記載のグルタリル７−ＡＣＡアミダーゼと接触させることを含む、デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸からデスアセチル７−アミノセファロスポラニン酸を得る方法。
35. デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸がデスアセチル７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸である、請求項２９に記載の方法。
36. デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸がデスアセチル７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸である、請求項３０に記載の方法。
37. デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸がデスアセチル７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸である、請求項３１に記載の方法。
38. デスアセチル７−β−（アシルアミド）セファロスポラニン酸がデスアセチル７−β−（４−カルボキシブタンアミド）セファロスポラニン酸である、請求項３２に記載の方法。

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