KR100232638B1

KR100232638B1 - 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산 아실레이즈를 생산하는 슈도모나스속 세균 kac-1

Info

Publication number: KR100232638B1
Application number: KR1019950018730A
Authority: KR
Inventors: 김정우; 정구헌; 이왕식; 윤기홍; 박장우; 정경화; 김대원; 신한재
Original assignee: 김충환; 주식회사종근당; 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 1999-12-01
Also published as: KR970001534A

Abstract

본 발명은 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산 (GL 7-ACA) 아실레이즈를 생산하는 신규의 슈도모나속스의 세균 KAC-1(수탁번호 KCTC 8668P)에 관한 것이다. 신규의 GL 7-ACA 아실레이즈는 GL 7-ACA를 7-ACA로 전환시키는데 이용된다. 7-ACA는 세파로스포린계 항생제의 중간원료물질로 널리 쓰이고 있다.

Description

글루타릴 7-아미노세팔로스포란산 아실레이즈를 생산하는 슈도모나스속 세균 KAC-1

제1도는 본 발명의 신균주 슈도모나스(Pseudomonas)속 KAC-1의 전자현미경 사진이다.

제2도는 본 발명의 신규 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산(Glutaryl 7-aminocephalosporanic acid ; GL 7-ACA) 아실레이즈가 GL 7-ACA를 7-ACA로 전환시키는 반응에서 반응산물인 7-ACA와 글루타릴산이 효소의 가수분해 반응을 저해하는 정도를 나타낸 그래프이다.

제3도는 본 발명의 신규 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산 아실레이즈 효소의 합성반응을 나타낸 그래프이다.

제4도는 신규 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산 아실레이즈 효소의 글루타릴기 전이 반응에 대한 그래프이다.

[발명의 목적]

본 발명은 토양균으로부터 분리한 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산(이하 GL 7-ACA라고 약칭한다) 아실레이즈를 생산하는 슈도모나스속 KAC-1을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기한 KAC-1 균주가 생산하는 신규한 GL 7-ACA 아실레이즈 효소를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 신규의 GL 7-ACA 아실레이즈를 이용하여 7-아미노세팔로스포란산(이하 7-ACA라고 약칭한다)을 효소적 방법으로 제조하는데 목적이 있다.

[발명이 이용 분야 및 종래기술]

세팔로스포린계 항생제는 페니실린계 항생제보다 항균활성이 우수하고 독성도 낮아 현재 가장 많이 사용되는 베타 락탐계 항생제로서, 여러가지 유도체들의 개발이 진행되어 1세대에서 3세대 세팔로스포린계 항생제들이 이미 상품화 되었으며 최근에는 4세대 항생제도 활발히 개발되고 있는 실정이다.

세파로스포린계 행생제는 세팔로스포린 C(이하 CPC라고 약칭한다)로 부터 만들어지는 항생제를 말하며, CPC는 아크레모늄 크리소제늄(Acremonium chrysogenium)의 발효산물에서 분리된 물질로서 구조식 (I)의 구조를 가지고 있다.

이 세파로스포린은 3위치의 아세톡시그룹이 쉽게 제거 또는 치환될 수 있으며, 7위치의 아마이드 그룹이 쉽게 가수분해 또는 치환이 될 수 있다.

제1세대 세팔로스포린계 항생제에는 세팔로틴(Cephalothin)이 있으며, 그람 음성균에 대한 효과가 크나, 경구흡수률이 낮고, 근육주사시 통증이 있고, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 일부 균주에 대해서는 효과가 없으며, 투여후 체내에서 너무 빨리 소실된다는 단점이 있다.

제2세대, 제3세대, 세팔로스포린계 항생제는 3위치와 7위치가 치환된 것으로 그람음성균 뿐만아니라 그람양성균에도 효과가 큰 광범위 항생제이다. 특히 제3세대 세팔로스포린계 항생제는 전에는 치료가 매우 어려웠던 그람음성균에도 잘 듣는다.

세팔로스포린계 항생제는 질병의 치료에 많은 발전을 가져왔으나, 최근 이들에 대한 내성균이 발생함에 따라 제4세대 세팔로스포린계 항생제에 대한 연구도 활발하다.

가장 자주 보이는 내성균은 β-lactamase라는 효소를 생산하는 능력을 획득한 균으로서 β-lactam ring을 개환시켜 세팔로스포린계 항생제를 불활성화 시킨다.

세팔로스포린계 항생제는 중간원료물질에 따라 최종생산물질이 달라지는데, 세프라딘 (Cefradine), 세파렉신(Cephalexin), 세파드록실(Cehadroxil)은 7-아미노디아세톡시세팔로스포란산(7-Aminodeacetoxycephalosporanic acid)(이하 ADCA라고 약칭한다)을 중간원료로 하고, 이들을 제외한 대부분의 세팔로스포린계 항생제는 7-아미노세팔로스포란산(7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA)을 중간원료 물질로 하여 합성되고 있다. 중간원료 물질은 7-ADCA와 7-ACA은 모두 세팔로스포린 C(CPC)를 원료물질로 하여 제조된다.

CPC를 원료로하여 7-ACA를 제조하는 방법은 화학공정에 의한 방법과 효소공정에 의한 방법으로 대별된다. 화학공정에 의한 구조식 (II)의 7-ACA 합성은 다단계의 초저온 반응을 필요로하며 반응중에 사용되는 유독성 용매가 최종제품에 잔존하거나 또는 환경을 오염시키는 등의 문제점이 있어, 1980년대 들어서는 CPC의 δ-아미노아디필아미도(aminoadipylmido) 그룹을 가수분해 시킴으로써 7-ACA을 제조하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

효소공정에 의한 7-ACA를 제조하기 위해서는 CPC를 직접 가수분해 할수 있는 효소(cephalosporin acylase)가 필요하지만 CPC의 7번 탄소위치의 아실결합이 매우 안정하므로 아직까지는 한단계 효소 반응공정에 의해 CPC로부터 직접 7-ACA를 제조하는 방법을 산업에 적용하기는 부적합한 실정이다. 그러므로 현재는 D-아미노산옥시데이즈(D-aminoacid oxidase 이하 D-AAO라고 약칭한다)와 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산 아실레이즈(glutaryl 7-aminocephalosporanic acid acylase GL 7-ACA ayclase)의 두 종류의 효소를 이용한 2단계 반응공정에 의해 7-ACA를 제조하는 방법이 실용화 단계에 있다. 실제로 GL 7-ACA 아실레이즈는 CPC보다는 GL 7-ACA를 훨씬 효과적으로 가수분해 시키므로 7-ACA의 합성 수율을 높이기 위해서는 우선 D-AAO를 이용하여 CPC를 GL 7-ACA로 전환시킨 후 GL 7-ACA 아실레이즈로 처리하여 7-ACA를 합성하게 된다. 즉, CPC를 먼저 D-아미노산 옥시데이즈와 반응시켜 GL 7-ACA를 제조하고, 여기서 생성된 GL 7-ACA를 GL 7-ACA 아실레이즈가 가수분해되어 7-ACA를 제조하는 2단계 방식이 효과적이다. 이러한 효소적 전환 기술은 일본의 Asahi Chemical회사 Fujisawa Pharmaceutical사, 미국의 Biopure사, Lilly사, 독일의 Boehringer Mannhein사 등이 지니고 있는데, GL 7-ACA 아실레이즈는 대개가 자체적으로 분리 개발하여 각 회사가 특허권을 가지고 있는 실정이다.

7-ACA 제조에 이용되어질 GL 7-ACA 아실레이즈에서 고려되어져야 할 중요한 성질은 기질에 대한 친화도, 효소의 안정성, 반응물질에 의한 반응속도 저하여부 등이며 현재까지 슈도모나스(Pseudomonas), 아쓰로박터(Arthrobacter), 바실러스(Bacillus), 아시네토박터(Acinetobacer), 푸자리움(Fusarium), 아스페르질러스(Aspergillus)와 페니실륨(Penicillium)속에 속하는 미생물에 GL 7-ACA 아실레이즈가 존재하고 있는 것으로 알려졌다. GL 7-ACA 아실레이즈 효소는 대부분 자연계에서 미생물 균체로부터 분리, 정제 되었는데 분리된 균주에 따라 정제된 효소의 기질 특이성, 반응온도, 기질 친화도 등의 반응특성과 효소의 분자량 및 서브유닛(subunit)의 구조 등이 있어서 약간의 차이들이 있으나 기질 특이성이 유사한 GL 7-ACA 아실레이즈들 사이에는 아미노산 잔기 배열의 상동성이 매우 높은 것으로 밝혀졌다. 한편, 실용화 단계에서 이용되고 있는 GL 7-ACA 아실레이즈는 주로 슈도모나스와 아쓰로박터속 미생물에서 유래된 효소이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 자연계 토양으로 부터 GL 7-ACA 아실레이즈를 생산하는 미생물을 분리하여 동정하였다. GL 7-ACA 아실레이즈를 생산하는 분리균은 제1도에 나탄낸 바와같은 간균의 미생물이고 신규 슈도모나스 속 균주임을 알 수 있다. 이러한 슈도모나스 속 분리균을 배양조건하에서 배양하여 얻은 균체로부터 순수분리된 신규의 GL 7-ACA 아실레이즈는 기존의 슈도모나스가 생산하는 GL 7-ACA 아실레이즈와는 조금 다른 N-말단의 아미노산 잔기 배열을 보이며, 금속이온에 의한 효소활성 저해도가 낮다. 또한, SDS를 제외한 효소활성 저해제들에 의해서도 효소 활성이 크게 감소되지 않는다. 신규의 GL 7-ACA 효소는 GL 7-ACA에 대한 기질친화도와 7-ACA로의 전환효율이 기존에 보고된 GL 7-ACA 효소 만큼 우수하고, 특히 제2도에 나타낸 바와 같이 반응산물이 7-ACA에 의한 효소반응의 저해정도가 미미하여 GL 7-ACA를 7-ACA로 효율적으로 전환시키는 효소임을 알 수 있다.

이와함께 본 발명은 제3도의 제4도에 나타낸 바와 같이 글루타릴산(glutaricacid) 수용체 존재시 합성 및 전이반응 활성능이 크므로 7-ACA 유도체 합성공정에도 사용될 수 있는 효소를 제공한다.

하기의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로서, 이러한 실시예는 본 발명을 예시한 것일뿐, 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[GL 7-ACA 아실레이즈 생산균의 분리]

GL 7-ACA 아실레이즈(acylase) 생산균주를 검색,분리하는 방법은 다음과 같다. 전국 각지에서 채취한 200여종의 토양시료를, 이스트 추출물 0.1%, 펩톤 0.2%, 글루탐산 모노나트륨 3%, 글루타릴산 0.15% 조성으로 제조된 액체 배지에 접종하고 2-3일간 배양한 후, 배양액을 단계별로 희석하여 상기의 한천배지의 도말하고 콜로니가 형성될 때까지 배양하였다. 형태가 다른 콜로니들을 다시 한천배지에서 옮겨 배양한 후 형성된 각각의 콜로니를 채취하여 100mM Tris 완충용액(pH 8.0)에 현탁하고 여기에 GL 7-ACA를 기질로 첨가함으로써 37℃에서 균체자체를 효소원으로 사용하여 반응하였다. 반응액을 박막 크로마토그래피(TLC) 및 고성능액체 크로마토그래피(HPLC)로 7-ACA 생성량을 분석하여 가장 활성이 우수한 미생물을 분리하고 이를 KAC-1로 명명하였다.

[실시예 2]

[분리균 (KAC-1)의 형태학적 및 생리학적 특성]

(2-1) 형태 및 배양학적 특성

상기 실시예 1에서 분리된 GL 7-ACA 아실레이즈 생산균을 영양 한천배지에서 배양온도를 30℃로 하여 2일간 배양한 결과 크림색 콜로니가 형성되었으며, 이들 콜로니로부터 채취한 균주를 광학현미경과 위상차 전자현미경으로 관찰한 결과 제1도와 같이 크기가 0.3-0.4×0.7-1.2㎛인 간균으로 밝혀졌다. 그람 염색을 행한 결과 그람음성균으로 판명되었으며, 한편 분리균은 유동성 한천배지에서 운동성을 보였다. 호기성 조건하에서 분리균은 정상적 성장을 하였으나 혐기적 상태에서는 증식하지 못하였다. 영양 한천배지를 사용하여 분리균의 콜로니형상을 조사함으로써 이들의 생육온도가 20-37℃임을 밝혔다.

(2-2) 생리학적인 특성

분리균주의 생리학적 특성은 표 1에서와 같이 일반적인 당 발효능이 매우 낮았으며 카탈레이즈, 옥시데이즈를 제외한 대부분의 생화학반응에 음성을 나타내어 슈도모나스속 균주의 전형적인 특징을 보였다.

[표 1]

(2-3) 세포벽 지방산의 조성

분리균주 세포벽 지방산을 분석한 결과는 표 2와 같으며, 이를 미디시스템(Microbial Identification System)으로 조사한 결과 슈도모나스 디미누타(Pseudomonas diminuta)와 78%의 높은 유사성을 나타내었다.

[표 2]

(2-4) 분리미생물의 동정

상기 실시예(2-1, 2-2, 2-3)과 같이 분리균주의 형태학적, 배양학적, 생리학적 및 세포벽 지방산 성분의 분석결과, 본 분리균은 슈도모나스속 균주로 동정 되었으므로 이를 슈도모나스 KAC-1으로 명명하고, 1995년 6월 9일에 한국과학기술원에 기탁하였다(수탁번호 KCTC 8668P).

[실시예 3]

[KAC-1 배양에 의한 신규 GL 7-ACA 아실레이즈의 제조방법]

GL 7-ACA 아실레이즈를 제조하기 위하여 상기 실시예(2-4)에서 규명한 슈도모나스 KAC-1의 배양조건을 검토하였다. 소고기 추출물 0.3%, 펩톤 0.5%의 영양배지에 효소 생산의 유도체로 작용할 수 있는 글루타릴산을 0.1% 첨가한 배지에 배양된 균체가 글루타릴산을 첨가하지 않은 영양배지에서 배양된 균체보다 효소활성이 2배 이상으로 향상되었으며, 소고기 추출물 0.3%, 펩톤 0.5%, MSG 0.5%, 글루타릴산 0.1%, 조성의 배지에서 초발 pH를 6.0, 7.0, 8.0, 9.0과 10.0으로 각각 조절하여 효소 생산성을 조사한 결과 초발 pH를 9.0으로 하였을때 가장 효소 생산량이 높았다. 또한, 초발 pH를 9.0으로 조절한 상기의 배지를 사용하여 각기 다른 배양온도(20℃, 22℃, 25℃, 28℃, 30℃, 37℃)에서 2일간 배양하여 균체내의 효소활성을 비교한 결과 25℃에서 배양하였을때 효소 생산량이 최대임이 확인되었다.

[실시예 4]

[신규 GL 7-ACA 아실레이즈의 효소학적 특성]

상기 실시예에서 구해진 GL 7-ACA 아실레이즈 생산을 위한 최적의 배양조건하에서 슈도모나스 KAC-1을 배양하고 이를 원심분리하여 얻은 균체를 파쇄한 후, 35-58% 암모니움 설페이트 처리 및 탈염, DEAE-세파로즈 CL-16B, 페닐 세파로즈 CL-4B, Q-세파로즈, 수퍼로즈 12HR 컬럼을 사용하여 신규 아실레이즈 효소를 순수분리 정제하였다. 이리하여 얻어진 정제된 효소를 사용하여 아래의 실험예를 따라 효소의 특성을 조사하였다.

(4-1) 효소단백질의 분자량 및 N-말단 아미노산 서열 결정

분리된 GL 7-ACA 아실레이즈를 포준단백질과 같이 겔여과 크로마토그래피를 행하여 분자량을 조사한 결과 정제된 효소의 분자량은 약 74,000 달톤이었다. SDS-PAGE 전기영동법으로 정제된 효소의 분자량을 조사한 결과 55,000 달톤(베타 서브유닛), 17,3000 달톤(알파 1 서브유닛)과 16,500 달톤(알파2 서브유닛)의 3개의 서브유닛으로 나뉘어졌는데 이는 겔여과 크로마토그래피를 이용하여 구한 효소의 분자량과 합치되지 않았다. 그러므로, 이들 각 서브유닛의 단백질을 분리하여 N-말단 아미노산 잔기 서열을 조사하여 표 3과 같은 결과를 얻었다. 표 3에서 보는 바와같이 베타 서브유닛과 알파 서브유닛간에는 아미노산 잔기 배열이 완전히 달랐으며, 알파1 서브유닛과 알파2 서브유닛 사이에는 알파1 서브유닛이 알파2 서브유닛보다 N-말단의 3개 아미노산 잔기를 더 지니고 있는 것 이외에는 동일한 것으로 나타났다. 이로보아 슈도모나스 KAC-1에서 생산되는 GL 7-ACA 아실레이즈는 기존의 슈도모나스가 생산하는 GL 7-ACA 아실레이즈(Matsuda 등, J. Bac.,1222-1228(1985), Aramori등, J. Ferment. Bioeng., 232-242(1991), Ishii 등, J. Ferment. Bioeng., 591-597(1994))와는 달리 베타 서브유닛과 알파1 서브유닛으로 구성된 효소와 베타 서브유닛과 알파2 서브유닛으로 구성된 효소의 두가지 형태로 존재함으로 알 수 있다.

[표 3]

(4-2) 반응특성

분리된 효소의 반응특성을 조사한 결과 반응온도가 40℃일때 최대의 효소활성을 나타냈으며, 반응 pH 7.0-8.0에서 효소활성이 가장 높았다. 효소활성에 미치는 저해제의 영향을 조사한 결과 표 4와 같이 세린 저해제, 환원제에 의해서는 크게 영향을 받지 않았으나 소디움 도데실설페이트(SDS)에 의해서는 활성을 저해받았다. 금속이온으로는 아연(Zn)과 수온(Hg)이 효소활성을 저해하였다[표 5].

[표 4]

[표 5]

GL 7-ACA를 7-ACA로 전환시키는 반응공정중에 반응산물인 7-ACA와 글루타릴산이 효소반응에 미치는 영향을 조사하기 위해 농도를 각기 달리한 7-ACA와 글루다릴산의 존재하에 GL 7-ACA를 7-ACA로 가수분해 시키는 효소의 활성을 각각 비교 측정한 결과, 제2도와 같이 글루타릴산과 7-ACA가 각각 5mM 농도로 존재하여도 효소활성이 90% 이상으로 유지되었는데 이는 본 신규 GL 7-ACA 아실레이즈가 7-ACA 제조에 사용되기 위한 유리한 특성이다.

(4-3) 기질특이성

신규 아실레이즈의 여러 세팔로스포린 유도체에 대한 기질 특이성을 조사한 결과, GL 7-ACA와 GL 7-ADCA(Glutaryl 7-aminodeactoxycephalosporanicacid)에 강한 특이성을 나타내며, 반응하여 산물인 7-ACA와 7-ADCA를 생산하였다. 이때 본 아실레이즈의 두 기질에 대한 반응 최대속도는 각각 8.0과 7.0(μmol product/mg protein/min)이었고 기질친화도를 나타내는 Km 값은 0.45와 0.67(mM) 이었다.

[실시예 5]

[신규아실레이즈를 이용한 세팔로스포린 유도체의 제조]

글루타릴산과 7-ACA을 기질로하여 본 GL 7-ACA 아실레이즈의 역반응인 합성반응을 조사한 결과 GL 7-ACA가 매우 적은량이 생성되었다(제3도). 그러나, 기질로 GL 7-ACA와 7-ACA를 혼합하여 효소반응을 수행하였을때 7-ADCA와 GL 7-ACA로의 전환효율이 글루타릴산과 7-ACA를 기질로 하였을때 보다 훨씬 높았다(제4도). 이는 본 효소가 7-ACA나 7-ADCA를 모핵으로 하였을때 글루타릴산을 전이시키는 기능을 나타낸 것으로 이 결과는 본 효소가 7-ACA 제조 이외에도 7-ACA를 모핵으로 하는 유사 항생물질의 제조에도 응용가능성을 나타낸다.

[발명의 효과]

상기한 바와 같이 본 발명에서는 토양균으로부터 분리한 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산(GL 7-ACA) 아실레이즈를 생산하는 슈도모나스속의 균주 KAC-1을 제공하며 또한 본 발명은 이 신규의 균주 KAC-1이 생산하는 신규의 글루타릴 7-아미노세팔로스포란산 아실레이즈를 제공하며, 이 효소는 GL 7-ACA를 7-ACA로 가수분해 시키는 효소로서, 반응산물인 글루타릴산과 7-ACA가 존재해도 효소활성이 90% 이상 유지되며 GL 7-ACA와 GL 7-ADCA에 강한 기질특이성을 나타내므로 7-ACA의 제조에 매우 유용한 효소임을 알 수 있다.

Claims

신규 분리한 슈도모나스속 KAC-1 균주(수탁번호 KCTC 8668P).
분쟈량 74,000 Da이고 두 개의 서브유니트로 구성되며, 기질친화도가 높고 반응산물에 의한 반응저해효과가 낮은 것을 특징으로 하는, 제1항의 균주가 생산하는 GL 7-ACA 아실레이즈 효소.
제2항의 효소를 이용하여 GL 7-ACA 또는 그 유도체에서 7-ACA 또는 그 유도체를 제조하는 방법.
제2항의 효소를 이용하여 7-ACA 또는 7-ADCA을 모핵으로 하는 세팔로 스포린계 항생제에서 7번 곁사슬의 글루타릴산을 전이시키는 방법.