FI90563B - -glutamyylitranspeptidaasin käyttö glutaryyli-7-amino- tai -ketoadipinyylikefalosporaanihapon entsymaattiseen hydrolysointiin - Google Patents

Description

1 9 o 6 3 V-glutamyylitranspeptidaasin käyttö glutaryyli-7-amino-tai α-ketoadipinyylikefalosporaanihapon entsymaattiseen hydrolysointiin 5 'K-transpeptidaaseilla (jatkossa T^-GTP) on tärkeä osa eläinkudosten ja mikro-organismien aminohappoaineen-vaihdunnassa ja glutationisyklissä [Meth. Enzymol. 77 (1981) 237]. Ne saavat aikaan eri aminohappojen kuljetuksen ^-glutamyylijohdannaistensa muodossa, polyglutamiini-10 hapon muodostumisen basilleissa samoin kuin glutationin (^-glutanyylikysteinyyliglysiinin) hajoamisen.

Nyt on yllättävästi havaittu, että jotkut mikro-organismit syntetisoivat ^-GTP: tä, jonka avulla voidaan edellä mainittujen reaktioiden lisäksi saada aikaan adi-15 pinyyli- tai glutaryylimonoaminoyhdisteiden hydrolyysi.

Keksintö koskee siten ^-glutamyylitranspeptidaasin ('^-GTP) käyttöä α-ketoadipinyyli- tai glutaryyli-7-amino-kefalosporaanihapon entsymaattiseen hydrolysointiin, joka entsyymi on saatavissa fermentoimalla bakteereja ja jolle 20 lisäksi on ominaista, että sen - molekyylipaino on 20 000 - 60 000 - isoelektrinen piste on pH-alueella 5,0 - 6,5 - pH-optimi on pH-alueella 6,5 - 10 L-^-glutamyyliparanit-roanilidin ollessa substraattina 25 - Km-arvo on 9 - 36 μΜ pHrssa 8.

Seuraavassa kuvataan yksityiskohtaisesti keksintöä, erityisesti sen edullisia suoritusmuotoja. Keksintö määritellään lisäksi patenttivaatimuksissa.

Yleisesti"'K’-glutamyylitranspeptidaasi (T'-GTP) kata-30 lysoi glutaryyli- tai adipinyylimonoaminoyhdisteiden, joilla on esimerkiksi seuraava yleinen kaava R1-(CH_)--C-NH-R2 2 3 II o 35 0 1 " jossa R on karboksyyli-, karboksikarbonyyli-(-C-C00H-) 2 9i:S63 . 2 tai karboksimetyyliryhmä ;ja R on aminohappo, dipeptidi, kefeemi, kefaami tai niiden johdannainen, hydrolyysiä vastaavaksi hapoksi ja monoaminoyhdisteeksi. Substraattina 5 käytetään edullisesti 7-aminokefalosporaanihappojohdan-naisia, erityisesti a-ketoadipinyyli- tai glutaryyli-7-aminokefalosporaanihappoa.

Entsyymituote esiintyy mikro-organismien periplas-massa, ja sille on tunnusmerkillistä molekyylipaino 20 000 10 - 60 000, edullisesti 23 000 - 40 000, erityisesti 30 000 - 35 000, sekä isoelektrinen piste, joka on pH-arvossa 5,0 - 6,5, edullisesti 5,7 - 6,1. Entsyymituotteen pH-optimi on pH-alueella 6,5-10 L-y-glutaryyliparanitroamilidin ollessa substraattina. Saman substraatin ollessa kyseessä on 15 keksinnön mukaisen transpeptidaasin Km-arvo 9-36, edullisesti 15 - 20, erityisesti 8,1 μπι, pH:n ollessa 8.

Atsaseriinin tai jodiasetamidin läsnäollessa tulee 7-GTP irreversiibelisti estetyksi. Kuparin, elohopean ja seriinin ja boraatin seoksen samoin kuin 7-aminokefalospo-20 raanihapon läsnäolo inhiboi entsyymiä reversiibelisti.

Valmistus tapahtuu mikro-organismien avulla. Tutkimuksissa löydettiin bakteereja, erityisesti sukujen Pseudomonas, Proteus, Arthrobacter ja Bacillus jäseniä, jotka tuottavat 7~GTP:tä hyvällä saannolla; erityisen hyvin so-25 veltuvia ovat esimerkiksi Pseudomonas fragi DSM 3881 ja Bacillus subtilis IFO 3025. Erityisen edullista on ottaa talteen entsyymi Pseudomonas fragi DSM 3881:stä. Myös mainittujen mikro-organismien mutantit ja variantit ovat soveltuvia.

30 Mikro-organismien kasvatus tapahtuu aerobisesti yksittäis- tai sekaviljelminä, esimerkiksi pinnanalaises-ti, ravistellen tai sekoittaen ravistuspulloissa tai fer-mentoreissa, mahdollisesti ilmaa tai happea syöttäen. Fer-mentointi voidaan tehdä suunnilleen lämpötila-alueella 35 20 - 37 °C, edullisesti noin 25 - 30 °C, erityisesti 28 - 30 °C. Fermentointi toteutetaan pH-alueella 5 - 8,5, edul- li 3 9 ' S 3 3 lisesti 5,5 - 8,0. Näissä olosuhteissa esiintyy kasvatus-liemessä tavallisesti 1-3 vrk:n kuluttua huomattavaa entsyymin akkumuloitumista. γ-GTP-synteesi alkaa myöhäisessä logaritmisessa vaiheessa ja saavuttaa huippunsa sta-5 tionäärisessä kasvuvaiheessa. Periplasmassa esiintyvän entsyymin tuotantoa voidaan seurata mittaamalla aktiivisuutta HPLC-analyysillä tai fotometrisesti.

y-GTP:n tuotantoon käytettävä ravintoliuos sisältää 0,2 - 5, edullisesti 0,5 - 2 % orgaanisia typpiyhdisteitä 10 samoin kuin epäorgaanisia suoloja. Orgaanisina typpiyhdisteinä tulevat kyseeseen aminohapot, peptoni, lihauutteet, jauhetut siemenet, esimerkiksi maissin, vehnän, pavun, soijapavun tai puuvillan siemenet, alkoholinvalmistuksen tislausjäännökset, lihajauhot tai hiivauutteet. Epäor-15 gaanisina suoloina voi ravintoliuos sisältää esimerkiksi alkali- ja maa-alkalimetallien, raudan, sinkin ja mangaanin klorideja, karbonaatteja, sulfaatteja tai fosfaatteja, mutta myös ammoniumsuoloja ja nitraatteja.

Assimiloituvien hiilihydraattien lisääminen suu-20 rentaa biomassasaantoa. Hiilihydraatteja lisätään samoin edellä mainituiksi pitoisuuksiksi. Edullisia hiililähtei-tä, joita voidaan lisätä ravintoliuokseen, ovat esimerkiksi sokerit, kuten glukoosi ja sakkaroosi, samoin kuin hiilihydraattipitoiset luonnontuotteet, kuten mallasuute. 25 Optimaaliset fermentointiolosuhteet ovat erilaiset kullakin mikro-organismilla, mutta ne ovat joko ammattimiehen ennestään tuntemat tai määritettävissä helpoin esi-kokein.

Puhdistus voidaan tehdä tavanomaisin menetelmin, 30 lysotsyymi-hajotuksella, ammoniumsulfaattisaostuksella ja ioninvaihto- ja geelipermeaatiokromatografiällä. Entsyymi voidaan kytkeä sopivin menetelmin (Colowick ja Kaplan, Meth. Enzymol., voi. XLIV).

Entsymaattisiin reaktioihin voidaan käyttää sekä 35 vapaina tai immobilisoidussa muodossa olevia kokonaisia soluja, jolloin lisätään 0-laktamaasi-inaktivaattoreita, ° i S A λ

4 s J J

esimerkiksi klavulaanihappoa tai tienamysiiniä, että myös eristettyä entsyymituotetta, joka voi samoin olla sidottuna kantajalle. Kokonaisten solujen immobilisointiin soveltuvia materiaaleja ovat esimerkiksi kitosaani, algi-5 naatti, χ-karrageeni, polyakryylihydratsidi ja muut kirjallisuudessa kuvatuista menetelmistä tunnetut aineet [K. Venkatsubramanian, Immob. Cells (1979), ACS Symposium Series, s. 106].

7~GTP:llä on teknistä merkitystä erityisesti 7-ami-10 nokefalosporaanihapon talteenotossa kefalosporiini-C:stä erityisesti sen jälkeen kun on löydetty hiiva, nimittäin Trigonopsis variabilis (DE-hakemusjulkaisu 2 219 454), jonka avulla voidaan valmistaa kefalosporiini-C:stä gluta-ryyli-7-aminokefalosporaanihappoa hyvällä saannolla. Tämä 15 yhdiste voidaan nyt hydrolysoida hyvällä saannolla 7-glu-tamyylitranspeptidaasin avulla 7-aminokefalosporaaniha-poksi. Täten on suljettu yksi aukko kefalosporiini-C:n entsymaattisessa hajotuksessa puolisynteettisten kefalo-sporiinien kannalta teknisesti tärkeäksi 7-aminokefalospo-20 raanihapoksi.

Keksintöä valaistaan vielä tarkemmin seuraavissa esimerkeissä. Prosenttisuudet ovat esimerkeissä samoin kuin edellä olevassa kuvauksessa massaprosentteja, ellei toisin mainita.

25 Esimerkki 1 7~GTP:tä tuottava mikro-organismikanta pidetään yllä vinopinta-agarilla, jonka koostumus on seuraava: Glukoosia 1 %

Kaseiinipeptonia 0,4 % 30 Lihauutetta 0,4 %

Hiivauutetta 0,05 %

Maksauutetta 0,05 %

NaCl 0,25 % pH 7,2 I! 5 - , Ο ό

Vinopintaputkia inkuboidaan 2 vrk lämpötilassa 28 °C. Sen jälkeen solut lietetään fysiologiseen suolaliuokseen (10 ml), ja inokuloidaan 1 ml:11a tätä suspensiota 300 ml:n erlenmeyer-puliossa oleva 50 ml:n esivil-5 jelmä, jonka koostumus on seuraava:

Peptonia 1 %

Mallasuutetta 0,5 % pH 7,0

Pulloja inkuboidaan 24 tuntia lämpötilassa 30 °C 10 sekoittaen kierrosnopeudella 190 min"1 pyöröravistimessa. 2,5 ml tätä viljelmää käytetään inokulaattina pääviljel-mälle (50 ml): A) Gram-negatiiviset bakteerit

Peptonia 1 % 15 Lihauutetta 0,5 %

NaCl 0,5 % kh2po4 0,1 % k2hpo2 0,1 %

MgS04X7H20 0,05 % 20 pH 7,0 B) Basillit

Peptonia 0,12 %

Hiivauutetta 0,12 %

Glukoosia 0,25 % 25 Na-laktaattia (60 %) 5,6 ml NH4C1 0,12 % K2HP04 0,12 % KH2P04 0,034 %

MgS04x7H20 0,025 % 30 NaCl 0,5 % KC1 0,5 %

CaCl2x2H20 0,0015 %

MnCl2x4H20 0,0007 %

Fe(NH4)sitraattia 0,00015 % 35 6 9:-,63

Viljelmää inkuboitiin 24 tuntia lämpötilassa 28 °C ravistellen kierrosnopeudella 190 min-1, ja erotettiin sitten solut sentrifugoimalla.

Seuraavassa taulukossa annetaan joidenkin kantojen 5 7-GTP-aktiivisuudet:

Kanta γ-GTP (milliyksikköä/ml viljelmäliuosta) PS. putida ATCC 17390 13 10 Ps. aeruginosa NCTC 10701 11

Proteus vulgaris ATCC 9634 26

Arthrobacter parafineus ATCC 31917

Ps. fragi DSM 3881 37 15 B. subtilis IFO 3025 31

Esimerkki 2

Ps. fragi DSM 3881 -esiviljelmä kasvatetaan esimerkin 1 mukaisesti. 50 ml:11a tätä viljelmää inokuloidaan 5 l:n fermentorissa oleva pääviljelmäliuos (2 litraa). 20 Kantaa kasvatetaan lämpötilassa 28 °C hapen osapaineessa 70 %. 7~GTP:n muodostumista seurataan fotometrisesti, ja tuote otetaan talteen viljelmästä entsyymipitoisuuden ollessa suurimmillaan. Näissä olosuhteissa saavutetaan y-GTP-pitoisuus 50 milliyksikköä/ml viljelmäliuosta.

25 Esimerkki 3

Esimerkin 2 mukaisesti talteen otettuihin soluihin (1 g) lisätään 2 ml hajotuspuskuria, jonka koostumus on seuraava: 20 mmol/1 TRISiä 30 10 mrnol/l EDTAa, pH 7,6 12 mmol/1 MgS04 x 7H20:a.

Liettämisen jälkeen tehdään seuraavat lisäykset: Lysotsyymiä 0,8 mg/ml DNAasia 10 mg/ml, lisätään 30 μΐ 1 ml:aan suspensiota.

II

: 35 Λ · : Γ r 7 7 y "jO 5

Inkuboidaan 15 min huoneen lämpötilassa. Hajotettuja soluja sentrifugoidaan kiihtyvyydellä 30 000 g. Su-pernatanttiin lisätään 2-%i:sta protamiinisulfaattiliu-osta niin paljon, että sen osuus saatavassa liuoksessa on 5 20 tilavuus-%. Sentrifugoidaan, ja heitetään sakka pois.

Supernatantille tehdään fraktioiva saostus ammoniumsulfaatilla (50 - 80 % kyllästyspitoisuudesta). Pelletti sekoitetaan 0,1 M sitraattipuskuriin (pH 5,0), jota käytetään 1/20 alkuperäisestä tilavuudesta. Sen jälkeen tehdään läm-10 pökäsittely (1 tunti, 37 °C) , sentrifugoidaan ja dialysoi-daan 20 mM sitraattipuskuria (pH 5,0) vastaan. Retentaatti siirretään karboksimetyyliselluloosapylvääseen. Yhtä ml: aa kohden entsyymiliuosta käytetään 6 ml CM-Cellulose 52:a (Whatman). Eluenttina käytetään lineaarista NaCl-gradient-15 tia (0 ---> 0,5 M) 20 mM sitraattipuskurissa (pH 5,0).

Aktiivisuutta sisältävät fraktiot (HPLC-testi) dia-lysoidaan 10 mM TRIS-puskuria (pH 8,0) vastaan ja puhdistetaan edelleen DEAE-selluloosapylväällä (DE 52, Whatman). Eluenttina käytetään lineaarista NaCl-gradienttia 20 (0 ---> 0,3 M) 20 mM TRIS-puskurissa (pH 8,0).

Eniten aktiivisuutta sisältävä fraktio (fotomet-risesti) käytetään jatkotutkimuksiin.

Esimerkki 4 1 ml esimerkin 3 mukaisesti valmistettua entsyymi-25 preparaattia konsentroidaan pitoisuudeltaan viisinkertai seksi, ja konsentraatti laitetaan silloitettua agaroosia » ( Superose 12, Pharmacia) sisältävään pylvääseen. Liikkuvana faasina käytetään 50 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,0), joka sisältää 0,15 mol/1 NaClia. Pumppausnopeus 30 on 0,3 ml/min. 7-glutamyylitranspeptidaasi eluoidaan 15,4 ml:lla puskuria. Se voidaan todeta L-7-glutamyyli-p-N02-anilidilla ja glutaryyli-7-aminokefalosporaanihapon pilkkomisella 7-aminokefaloporaanihapoksi. 7~GTP:n mole-kyylipaino on alueella 30 000 - 35 000.

: 35 ® n, . r ' -7

s - ’J O

Esimerkki 5

Esimerkin 2 mukaisesti valmistettu biomassa käsitellään esimerkin 3 mukaisesti lämpökäsittelyyn asti tämä vaihe mukaan lukien. Sitten tehdään dialyysi 20 mM kalium-5 fosfaattipuskuria (pH 5,5) vastaan; retentaattiin lisätään niin paljon karboksimetyyliselluloosaa (CM 52, Whatman), että supernatantti on laktamaasitonta. Kun on dialysoitu 10 mM TRIS-puskuria (pH 8,0) vastaan, tuote käsitellään kromatografisesti nelinkertaisella tilavuudella DEAE-sel-10 luloosaa (DE 52, Whatman). Eluenttina käytetään 20 mM

TRIS-puskuria (pH 8,0), johon on lisätty NaCl:a lineaariseksi gradientiksi (--->0,1 M). Aktiivisuutta sisältävät fraktiot määritetään fotometrillä, minkä jälkeen entsyymi saostetaan 80 %:isella ammoniumsulfaattiliuoksella. Pel-15 letti sekoitetaan 50 mM kaliumfosfaattipuskuriin (pH 7,0), joka sisältää 0,15 mol/1 NaCl (väkevöitymissuhde 25:1).

Jatkopuhdistus tehdään pylväällä, joka on täytetty

. . . . B

dekstraanin ja akryyliamidin kopolymeerillä ( Sephacryl, Pharmacia). 3,5 ml:lie konsentraattia käytetään pylvästä, 20 jonka mitat ovat 2,5 x 82 cm. Eluenttina käytetään 50 mM kaliumfosfaattipuskuria (pH 7,0). HPLC-testillä määritetyt, aktiivisuutta sisältävät fraktiot konsentroidaan ammoniumsulf aatin avulla. Pelletti sekoitetaan 20 mM kaliumfosfaattipuskuriin (pH 6,0).

25 Esimerkki 6

Glutaryyli-7-aminokefalosporaanihapon preparatii-vinen reagoimaan saattaminen tehtiin seuraavasti: 100 μΐ esimerkin 3 mukaisesti valmistettua entsyymikonsentraattia ja 100 μΐ 40 mM qlutaryyli-7-aminokofalosporaanihappo-30 liuosta 20 mM kaliumfosfaattipuskurissa (pH 6,0) inkuboi-daan lämpötilassa 33 °C.

Otetaan näytteitä tunnin väliajoin, ja tutkitaan HPLC:llä 7-aminokefalosporaanihapon muodostuminen. 2,5 tunnin kuluttua on 52 % seoksesta reagoinut. Asteittainen 35 pH:n nostaminen arvoon 7,0 saa aikaan maksimireagointias- teen 70 % kaikkiaan kahdeksan tunnin kuluttua.

9 9 : S ό 3

Esimerkki 7 7-GTP-aktiivisuuden määrittäminen a) HPLC-testi 50 μΐ 80 mM glutaryyli-7-aminokefalosporaanihappo-5 liuosta sekoitetaan 100-140 Miraan 250 mM kaliumfosfaatti-puskuria (pH 5,0) ja 10-50 Miraan entsyymiliuosta, ja in-kuboidaan lämpötilassa 33 °C. Otetaan 10 min:n väliajoin 20 Ml:n näytteitä. Reaktio pysäytetään lisäämällä 20 μΐ metanolia. Näyte sentrifugoidaan ja laimennetaan vedellä 10 suhteessa 1:10. 10 μ1:η näytteestä tutkitaan HPLCrllä 7-aminokefalosporaanihappopitoisuus. Stationäärifaasi: C-18-silikageeli; liikkuva faasi: 50 mmol/1 KH2P04:a H20:ssa, MeOH (20:20) + 0,001 % tetrabutyyliammoniumsul-faattia.

15 b) Fotometrinen testi 600 μ! L-7-glutanyyli-p-nitroanilidia (166 mM) 300 Ml kaliumfosfaattipuskuria, pH 5,7, 50 mM ja 100 μΐ viljelmäliuosta sekoitetaan keskenään ja inkuboidaan lämpötilassa 37 °C.

20 _1_ e 405 = 9620 mol‘cm

Claims (3)

1. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen Ϋ-ΟΤΡιη käyttö, tunnettu siitä, että entsyymi on saatavissa fer- 15 mentoimalla bakteereja Pseudomonas fragi, DSM 3881, tai Bacillus subtilis, IFO 3025.
2. 3. Pseudomonas fragi, DSM 3881, ja sen jälkeläiset, mikäli ne tuottavat patenttivaatimuksessa 1 määriteltyä 'V-GTP: tä. 20 li 11 y: 563