PT86552B

PT86552B - Processo para a preparacao de gama-glutamil-transpeptidase e de hidrolise enzimatica usando aquela enzima

Info

Publication number: PT86552B
Application number: PT86552A
Authority: PT
Inventors: Klaus Sauber; Werner Aretz
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-01-17
Filing date: 1988-01-14
Publication date: 1991-12-31
Also published as: FI880151A0; HU202916B; ES2058141T3; FI90563C; PH27217A; DK18588A; HUT45554A; FI880151L; CZ28588A3; EP0275901B1; IL85109A0; DK18588D0; ZA88267B; AU611406B2; NO880171L; US4990444A; EP0275901A3; IL85109A; DE3881531D1; NO880171D0

Description

As ^T-transpeptidases (em seguida repre sentadas por T —GTP) representam um papel importante no meta bolismo dos Ácidos aminados e no ciclo do glutatiao em tecidos animais e em microorganismos (Meth. Enzymol. 77. 237 (1981))· Estas enzimas sao responsAveis pelo transporte de diferentes Ácidos aminados sob a forma dos respectivos deriva dos 't'-glutamilo, pela formaçao do Acido poliglutamico nos bacilos bem como pela decomposição do glutatiao (T -glutamil-cisteinil-glicina)·

Verificou-se agora de modo surpreenden te que alguns microorganismos sintetizam T —GTP com a qual, alAm das reacçoes acima referidas, também ê possível hidroli sar compostos monoaminados com grupos adipinilo ou glutarilo.

Por conseguinte a presente invenção tem por objectivo

FM- 1 f

1.

Um processo para a preparaçao duma T —glutamil—transpepti da se ( Τ' ~GTP) que possui

- um peso molecular de 20 000 a 6o 000

- um ponto isoelêctrico correspondente a um pH de 5,0 a

6,5

- um pH óptimo de 6,5 a 10 quando o substrato ê

L—T-glutaril-p—nitro—anilida

- um valor de Km de 9 a 36 pM a pH 8.

caracterizado por se cultivar uma bactéria num meio de cultura até que se verifique a acumulaçao da enzima no meio·

2. Um processo para a hidrólise de compostos monoaminados com grupos adipinilo ou glutarilo·

Na especificação que se segue descreve ~se a invenção mais em pormenor, especialmente na respectiva forma preferida de concretização· A invenção é, para além dis so, definida nas reivindicações·

As T-glutamiltranspeptidases ( 7-GTP) obtidas de acordo com o processo da presente invenção catalisam a hidrólise de compostos monoaminados com grupos gluatarilo ou adipinilo tendo, por exemplo, a fórmula seguinte

R¹-(CH„) _—C—NH—R² “ 3 _H na qual R significa um grupo carboxilo, um grupo tt carboxicarbonilo*-(-C— COOH)- ou um grupo carboximetilo e R significa um Acido aminado, um dipeptldeo, um grupo cefem ou cefam ou um seu derivado, obtendo—se os respectivos Ácidos e os compostos monoaminados correspondentes· Sao preferidos como substratos derivados do Acido 7-aminocefalosporãnico, especialmente o Acido ceto—adipinil—7—cefalosporanico e o

Acido glutari1-7-aminocefalosporânico.

preparado enzimético provêm de microorganismoe por via periplasmética e pode ser caracterizado por meio dum peso molecular entre 20 000 e 60 000, de pr<í ferencia entre 23 000 e 40 000, especialmente entre 3θ 000 e 35 000, bem como por um ponto isoeléctrico situado a um valor de pH entre 5»0 e 6,5» de preferencia entre 5>7 ^e 6,1· 0 pH óptimo do produto enzimético situa—se numa gama de pH entre

6,5 ® 10 quando se usa como substrato L- V-glutamilparanitro anilida. Para o mesmo substrato a trnaspeptidase da presente ** a invenção tem um valor de Km entre 9 e 3° AM, de preferencia entre 15 e 20 /uM, especialmente 8,1 juM, a pH 8·

Na presença de azaserina ou de iodacje tamida a T -GTP ê inibida de forma irreversível. Na presença de cobre* mercúrio e duma mistura de serina e de borato, bem como na presença de ácido 7-aminocefalo8porãnico, a enzima apresenta uma inibição reversível·

A preparaçao é efectuada por meio de microorganismos· Por meio dum processo de selacçao verificou~se que é possível obter bons rendimentos com bactérias, esp£ cialmente dos gêneros Pseudomonas, Proteus, Arthrobacter e Bacillus, de T -GTP da presente invenção, sendo especialmente apropriados por exemplo. Pseudomonas putida ATCC 1739O> Pseu domonas aeruginosa NCTC 10701» Proteus vulgaris ATCC 9634* Arthrobacter parafineus ATCC 31917 bem como Pseudomonas fragi DSM 3881 e Bacillus subtilis IFO 3θ²5· Considera—se especialmente preferida a enzima proveniente de Pseudomonas fragi DSM 3881· Também sao apropriados mutantes e variantes dos microor ganismos referidos· crescimento dos microorganismos ê levado a efeito por via aerébica isoladamente ou em culturas mistas, por exemplo por fermentação submersa com agitaçao em agitador orbital ou oscilante ou com agitaçao mecanica em balões cénicos ou em fermentadores, eventualmente com uma intrjo duçao de ar ou de oxigénio· A fermentação pode ser efectuada numa gama de temperaturas de cerca de 20 a 37^CC, de preferên cia entre cerca de 25 e 30fiC, especialmente entre 28 e 30&C· Fermenta-se numa gama de pH entre 5 e 8*5» de preferencia en— Π ** tre 5,5 ^e o*0· Nestas condiçoes o caldo da cultura apresenta em geral depois de 1 a 3 dias uma notável acumulaçao da enzi ma. A síntese de 7 -GTP inicia-se na fase logarítmica tardia e alcança o máximo na fase de crescimento estacionário. A pro duçao da enzima periplasmática pode ser seguida por meio de ensaios de actividade por análise de HPLC ou por métodos fot<> métricos.

As soluçoes nutrientes usadas para a produção de T -GTP contém entre 0*2 a 5%» de preferencia entre 0*5 a 2% de compostos de azoto orgânico bem como sais

A Λ inorgânicos. Os compostos de azoto orgânico considerados sao! ácidos aminados, peptonas, bem como extracto de carne* farinhas de cereais* por exemplo de milho e de trigo, ou de feijão, de soja ou de plantas de algodao* farinha de carne ou extracto de levedura. No que se refere a sais inorgânicos, a solução nutriente pode conter, porexemplo, cloretos, carbonatos, sulfatos ou fosfatos de metais alcalinos ou alcalinoterrosos, de ferro, de zinco, e de manganês e ainda sais de am6nio e nitratos.

A adiçao de hidratos de carbono assimi^ láveis eleva o rendimento em biomassa· Os hidratos de carbono sao igualmente adicionados nas concentrações acima referidas. Como fontes preferidas de carbono, podem ser adicionados à solução nutriente, por exemplo, açécares, como glucose ou sa, carose, bem como produtos naturais contendo hidratos de carbono, como extractos de malte.

„ ** As condiçoes óptimas de fermentação sao sem d&vida distintas para cada microorganismos mas ou sao conhecidas dos especialistas na matéria ou podem ser estabelecidas facilmente por meio de ensaios prévios.

A purificação pode ser levada a efeito de acordo com processos clássicos por meio de lisozimas, por precipitação com sulfato de amónio ou por cromatografia de permutação iénica ou de permeacçao por gel· 0 acoplamento da enzima 6 possível por meio de métodos usuais (Colowick e Kaplan, Meth. Enzymol. , vol. XLIV).

Para a transformação enzimâtica tanto se podem usar células inteiras sob a forma livre ou imobilizada por meio da adiçao de inactivadores de A—lactamase, por exemplo de ácido clavulãnico ou de tienamicina, como também se podem usar produtos enzimáticos isolados que igualmente podem ser ligados a um suporte. Cosntituem materiais apropria^ dos para a imobilização de células inteiras, por exemplo, quitosano, alginato, ΰ(-carragénio, poliacril-hidrazida e outras substancias conhecidas de processos da literatura (K. Ven katsubraganian, Immob. Cells (1979)* ACS Symposium Series, pág. 106).

A Y —GTP da presente invenção é impor tante do ponto de vista técnico especialmente para a obtenção de ácido 7-2minocefalosporânico a partir de cefalosporina C e esta importância assume relevância especial uma vez que se teve conhecimento da existência duma levedura, nomeadamente a Trigonopsis Variabilis (publicação de pedido de Patente Alema 2 219 4^4) por meio da qual é possível obter ácido glutaril— -7-amino cefalosporânico a partir de cefalosporina C em alto rendimento. Este composto pode agora ser hidrolisado por meio da Y-glutamil-transpeptidase com bom rendimento para se obter ácido 7-aminocefalosporânico. Deste modo preencheu-se uma 1£ cuna ne degradaçao enzimática da cefalosporina C para a preparação do ácido 7-aminocefalosporânico que constitui um intermediário de importância técnica para as cefalosporinas semi-sintéticas.

Nos exemplos que se seguem descreve-se ** a invenção mais em pormenor. Tal como na descrição anterior,

os dado· em percentagem referem—se a peso, sempre que nao houver qualquer indicaçao em contrário.

EXEMPLO 1

A manutenção das estirpes dos microor-

ganismos que produzem a T —GTP δ feita em cunhas de agar da seguinte composição:
Glucose	1	%
Peptona de caseína	0,4	%
Extracto de carne	0,4	%
Extracto de levedura	0,05	%
Extracto de fígado	0,05	%
Na Cl	0,25	%
pH 7,2

Os tubos com as cunhas foram incubados durante dois dias a 28&C. Em seguida arrastaram-se as células com 10 ml de solução salina fisiológica e utilizou—se 1 ml desta suspensão para inocular 50 «1 de pré-cultura da compos£ ção seguinte num balao de Erlenmeyer de 300 ml de capacidade! Peptona 1 %

Extracto de malte 0,5 % pH 7>0

Incubou-se o balão num agitador orbital a 190 rpm durante 24 horas a 30*C. 2,5 ml desta cultura servi ram como inóculo de 5θ ml da cultura principal·

À) Bactérias gram-pegativas		B) Bacilos
Peptona	1	%	Peptona	0, 12%
Extracto de carne	0,5	%	Extracto	leveduraO,12%
NaCl	0,5	%	Glucose	0,25%
kh₂po₄	0,1	%	Lactato	de Na (60%) 5,6
				ml
^K2^HP04	0,1	%	NH^Cl	0,12%
MgSO^ x 7 HgO	0,05	%	K₂P°4	0,12%
pH 7,0			kh₂po₄	0,034%

MgSO₄ x 7 H₂0

NaCl

KC1
CaCl_o x	2	H 0
2		2
MnClg x	4	^H2°
Citrato	de	Fe

0,025%

0,5 %

0,0015%

0,0007% nh₄ 0,00015%

A cultura foi incubada num agitador orbital com uma frequência de 190 rpm durante 24 horas a 28&C e em seguida as células foram separadas por centrifugação·

No quadro seguinte apresentam—se as actividades de T-GTP de algumas estirpes:

Estirpe

Ps. putida ATCC 17390

Ps. aeruginosa NCTC

Proteus vulgaris ATCC 9634

Arthrobacter parafineus

ATCC 31917

Ps. fragi DSM 3881

B. subtilis IFO 3025

Τ'-GTP(mU/ml de solução da cultura

EXEMPLO 2

De modo análogo ao descrito no Exemplo 1 cultivou-se uma prl-cultura de Ps. fragi DSM 3881. 50 ml desta cultura serviram como inôculo para 2 1 da solução da cultura principal num fermentador de 5 1· 0 crescimento da ejs tirpe foi levado a efeito a 28&C com uma pressão parcial de oxigénio de 70%. A formaçao de Ύ -GTP foi seguida fotometrica^ mente e as células foram separadas da cultura no momento do máximo título em enzima. Sob as condiçoes indicadas atingiu—se um titulo em T—GTP de 50 mU/ml de solução da cultura.

EXEMPLO 3

Tratou-se 1 g das célula» obtidas de acordo com o Exemplo 2 com 2 ml do tampão de desintegração da seguinte composição»

TRIS 20 mM

EDTA 10 mM de pH 7»6 MgSO^ x 7 H₂0 12 mM

Após separação dos resíduos sólidos efectuaram-se as seguintes adições:

Lisozima: 0,8 mg/ml

ADNase: 10 mg/ml de que se adicionaram 30 jal sobre uma suspensão de 1 ml

Incubou—se durante 13 minutos à tempera tura ambiente. As células lisadas foram separadas por centrifugação a 30 000 g. 0 sobrenadante foi tratado a 20 vol. % com uma solução de sulfato de protamina a 2%. 0 precipitado foi desprezado depois de separado por centrifugação. 0 sobre^ nadante foi submetido a uma precipitação fraccionada com sul fato de amónio (50 a 80% da saturação). 0 sólido foi retomado em 1/20 do volume original com tampão de citrato 0,1 M a pH 5,0. Em seguida realizou-se um tratamento térmico (lha 37^flC] centrifugou-se e dialisou-se contra tampão de citrato 20 mM a pH 5,0. 0 produto retido foi carregado numa coluna de car— boximetilcelulose· Usaram-se 6 ml de CM-celulose 52 da Whatmar ·* w por cada ml de solução de enzima. Como eluente usou—se tampao de citrato 20 mM a pH 5,0 com gradiente linear de cloreto de sódio (0 a 0,5 M).

As fracções activas (anélise por HPLC) foram dialisadas de TRIS 10 mM a pH 8,0 e purificadas ainda numa coluna de DEAE-celulose (DE 52, Whatman). Como eluente usou-se tampao de TRIS 20 mM a pH 8,0 com gradiente linear de NaCl (0 a 0,3 M).

Ακ fracções mais activas (análise fot<> métrica) foram utilizadas para as investigações seguintes:

EXEMPLO 4 ml do preparado enzimático obtido de acordo com o Exemplo 3 foi concentrado na proporção de 5 : 1 e carregado numa coluna com agarose com ligações cruzadas Superose 12, Pharmacia)· Como fase móvel usou-se tampão de fosfato de potássio 50 mM a pH 7 com NaCl 0,15 M· 0 caudal de bombagem foi de 0,3 ml por minuto· A f—glutamil-transpeptidase foi eluida por meio de 15*4 ml de tampao· A enzima pode ser analisada com L~ T -glutamil-p-NOg-anilida e hidróli se de ácido glutaril-7-aminocefalosporánico a ácido 7<~amino cefalosporánico· A T-GTP corresponde a uma gama de peso mole cular de 30 000 a 35 000.

EXEMPLO 5

Tratou-se biomassa preparada de acordo com o Exemplo 2 de forma análoga ao descrito no Exemplo 3 Até ao tratamento térmico inclusivÓ. Em seguida dialisou-se contrt. tampão de fosfato de potássio 20 mM a pH 5,5· Ao produto retido adicionou-se a quantidade de carboximetilcelulose (CM 52 da Whatman) necessária para se obter o sobrenadante isento de lactamase· ApÓs diálise contra TRIS 10 mM a pH 8,0 submeteu—se a cromatografia numa coluna de DEÀE—celulose (DE 52, Whatman) com um volume quádruplo do volume da coluna· Como tampão utilizou—se tampão de TRIS 20 mM a pH 8,0 com gradien te linear de NaCl 0,1 M adicionalmente· Por meio de análise fotométrica reuniram-se as fracções activas das quais a enzima foi precipitada com sulfato de amónio a 80%, 0 sólido foi retomado em tampão de fosfato de potássio 5θ «M a pH 7»θ β NaCl 0,15 M (concentrado 25 : 1)·

Levou—se a efeito uma purificação adxciç^ nal numa coluna cheia com um copolímero de dextrano e de acri

(r) amida ( Sephacryl, Pharmacia). Para 3,5 ml de concentra^ ção utilizou—se uma coluna com a dimensão de 2,5 x 82 cm· 0 tampao eluente foi um tampao de fosfato de potássio 50 mM a pH 7,0. As fracções activas determinadas por meio de análise por HPLC foram concentradas com sulfato de amónio. 0 sólido foi retomado com tampão de fosfato de potássio a pH 6,0·

EXEMPLO 5

Para uma transformaçao preparativa de ácido glutaril-7-amino cefalosporãnico adoptou-se o seguinte procedimento:

100 ul de concentrado enzimático, preparado de acordo com o exemplo 3» ^e

100 jil de ácido glutaril-7-aminocefalosporánico, dissolvidos em tampao de fosfato de potássio 20 mM a pH 6,0, foram incubados a uma temperatura de 33^flC.

Após cada período de uma hora retiraram -se alíquotas que foram analisadas por HPLC para comprovação da formação de ácido 7-amino-cefalosporãnico. Após cerca de

2,5 horas estava transformado 52% do substrato· Uma elevaçao gradual do pH atá 7,0 permitiu uma transformaçao máxima de 70% no decurso de 8 horas·

EXEMPLO 6

Análise da actividade de f—GTP

a) Análise por HPLC

Misturaram-se 50 ul de glutaril-7-aminocefalosporánico

8o mM com 100 a 140 pl de tampao de fosfato de potássio

25O mM a pH 5)0 e 10 a 50 /11 de solução de enzima e inc<> bou-se a 33QC. A intervalos de 10 minutos tomaram-se amos

A# tras de 20 p.1 cada uma. Provocou-se a paragem da reacçao por adiçao de 20 jil de metanol. Centrifugou-se e diluiu-se com água numa proporção de 1 : 10. Determinou—se o conte& do em ácido 7-aminocefalosporãnico numa amostra de 10 jul

por meio de HPLC·

Fase estacionária: Gel de sílica C-18

Fase móvel: ^KH2^P04 ^{50 em H} ₂ ⁰’ ^{Me0H <8}° ^{: 20}>

+ 0,001% de sulfato de tetrabutilamónio

b) Ensaio fotomátrico

600 pl de Lrfglutamil-p-nitroanilida (166 /iM)

3OO μΐ de tampao de fosfato de potássio, pH 5,7»*50 mM e

100 pil de caldo de cultura foram misturados e indubados a 37^qC.

^E4O5^{= 9620 X 1}

Claims

REIVINDICAÇÕES « lâ Processo para a preparação de Ϊ-glu tamil— transpeptidase ( f-GTP), que tem como caracterlsticas — um pese molecular na gama d« 20 000 a 60 000 — um ponto isoeléctrico correspondente a um pH de 5»0 a 6,5

- um pH éptimo de 6,5 a 10 usando L- <-glutamil—para-nitroanilida como substrato

- um valor de Km de 9a 36 pM a pH 8, caracterizado por se cultivarem bactérias num meio de cultura até se verificar acumulaçao da enzima·

- 2» Processo de acordo com a reivindica, ção 1 caracterizado por se realizar uma fermentação de bactérias do género Pseudomonas e/ou Proteus e/ou Arthrobacter e/ou Bacillus· » Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por se realizar uma fermentação de Pseudomonas putida ATCC 17390 e/ou Pseudomonas aeruginosa NCTC 10701 e/ou Proteus vulgaris ATCC 963^ e/ou Arthrobacter parafineus ATCC 31017 e/ou Pseudomonas fragi DSM 3881 e/ou Bacillus subtilis IFO 3025· « 4» Processo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 3 caracterizado por a cultura se efectuar a uma temperatura entre 20 e 37²C.

Processo de acordo com a reivindica^ ção 4 caocterizado por a cultura se efectuar a uma temperatu ra entre 25 β 30^flC·

- 6< Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 caracterizado por a cultura se efectuar a um pH entre 5 e 8,5« — 7* -

Processo para a hidrólise de compo£ tos monoaminados com grupos adipinilo ou glutarilo caracteri zado por se fazer actuar a enzima Y* — GTP quando preparada pelo processo de qualquer das reivindicações 1 a 6· — 8a -

Processo para a hidrólise de ácido Y —ceto—adipinil-7~aminocefaloeporânico ou glutaril— cefalojB porânico caracterizado por se fazer actuar a enzima /—GTP quando preparada pelo processo de qualquer das reivindicações 1 a 6.

— 9a —

Pseudomonas putida ATCC 17390» Pseudomonas aeruginosa NCTC 10701, Proteus vulgaris ATCC 9634» Arthrobacter parafineus ATCC 31017» Pseudomonas fragi D SM 388]. Bacillus subtilis IFO 3025 bem como as suas variantes e mu— tantes desde que produzam γ -GTP tal como caracterizada na reivindicação 1·