JPS592688A - グリセロ−ルキナ−ゼの製造法 - Google Patents
グリセロ−ルキナ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS592688A JPS592688A JP11223882A JP11223882A JPS592688A JP S592688 A JPS592688 A JP S592688A JP 11223882 A JP11223882 A JP 11223882A JP 11223882 A JP11223882 A JP 11223882A JP S592688 A JPS592688 A JP S592688A
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- arthrobacter
- glycerol kinase
- glycerol
- culture
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアルスロバクタ属に属するグリセロールキナー
ゼ生産性菌株を培養し、該培養物からグリセロールキナ
ーゼを採取することを特徴とするグリセロールキナーゼ
の製造法に関する。
ゼ生産性菌株を培養し、該培養物からグリセロールキナ
ーゼを採取することを特徴とするグリセロールキナーゼ
の製造法に関する。
グリセロールキナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｋｉｎａｓ
ｅ Ｅ、Ｃ。
ｅ Ｅ、Ｃ。
２、７．１．３０．以下ＧＫと略す）は、グリセロール
＋ＡＴＰ→Ｌ−α−グリセロリン酸＋ＡＤＰの反応を触
媒する酵素で血清中のグリセロール、トリグリセライド
およびリン脂質の定量などに利用される。
＋ＡＴＰ→Ｌ−α−グリセロリン酸＋ＡＤＰの反応を触
媒する酵素で血清中のグリセロール、トリグリセライド
およびリン脂質の定量などに利用される。
従来ＧＫを生産する微生物としてはキャンシダ属、アエ
ロバクタ−属、プロピオニ〜クテリウム属、アセトバク
ター属、ストレプトマイセス属、バチルス属、セルロモ
ナス属、コリネバクテリウム属などが知られている。
ロバクタ−属、プロピオニ〜クテリウム属、アセトバク
ター属、ストレプトマイセス属、バチルス属、セルロモ
ナス属、コリネバクテリウム属などが知られている。
本発明者らは、工業的に安価にＧＫを産生ずる微生物を
求めて検索した結果、上記の種々の微生物とその属を異
にするアルスロバクタ属に属する菌株が著量のＧＫを生
産することを見出した。
求めて検索した結果、上記の種々の微生物とその属を異
にするアルスロバクタ属に属する菌株が著量のＧＫを生
産することを見出した。
本発明は、上記の知見に基いて完成されたもので、アル
スロバクタ属に属し、ＧＫを生産する能力を有する菌株
を培地に培養し、その培養物よりＧＫを採取することを
特徴とするＧＫの製造法に関する。
スロバクタ属に属し、ＧＫを生産する能力を有する菌株
を培地に培養し、その培養物よりＧＫを採取することを
特徴とするＧＫの製造法に関する。
本発明においてＧＫの製造に用いられるアルスロバクタ
属に属する菌株とは例えば、アルスロバクタ・ルテウス
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ １ｕｔｅｕｓ） Ａ Ｔ
ＣＣ２１６０６１フルスロハクタ・アルトロシアネウ
ス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｒｔｒｏｃｙａｎｅ
ｕｓ） Ｉ Ａ Ｍ １２３３９などが挙げられるが、
これらの菌の他、アルスロバクタ属に属しＧＫ生産能を
有する菌株はすべて本発明の方法に使用することができ
る。
属に属する菌株とは例えば、アルスロバクタ・ルテウス
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ １ｕｔｅｕｓ） Ａ Ｔ
ＣＣ２１６０６１フルスロハクタ・アルトロシアネウ
ス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｒｔｒｏｃｙａｎｅ
ｕｓ） Ｉ Ａ Ｍ １２３３９などが挙げられるが、
これらの菌の他、アルスロバクタ属に属しＧＫ生産能を
有する菌株はすべて本発明の方法に使用することができ
る。
本発明の方法における菌株の培養方法としては、細菌の
通常の培養方法が適用できる。栄養源としては、通常用
いられるものが広く利用され得る。
通常の培養方法が適用できる。栄養源としては、通常用
いられるものが広く利用され得る。
例えば炭素源としては、グルコース、ツユクロース、ラ
クトース、キンロース、マルトースなどのニ 糖類、マ勢トール、ソルビトールなどの糖アルコール、
ピルビン酸、酢酸、クエン酸などの有機酸、又はエタノ
ール、グリセロールなどのアルコール類が使用される。
クトース、キンロース、マルトースなどのニ 糖類、マ勢トール、ソルビトールなどの糖アルコール、
ピルビン酸、酢酸、クエン酸などの有機酸、又はエタノ
ール、グリセロールなどのアルコール類が使用される。
窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例
えば酵母エキス、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、
大豆粉などが用ｔ・られる。その他リン酸塩、硫酸塩、
ナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンノノン、鉄
などの塩類が必要に応じて使用される。
えば酵母エキス、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、
大豆粉などが用ｔ・られる。その他リン酸塩、硫酸塩、
ナトリウム、カリウム、マグネシウム、マンノノン、鉄
などの塩類が必要に応じて使用される。
培養温度は菌が生育しＧＫを生産する範囲内であればい
ずれの温度でも良いが、好ましくは２５〜３０℃が良い
。また、培養時間はＧＫが最高収量に達する時間に培養
を終了すれば良く、通常１６〜２８時間程度である０ 本発明で使用される菌株はグリセロール又はグリセロー
ル類を培地に添加することにより、より多量のＧＫを生
産せしめろことができる。
ずれの温度でも良いが、好ましくは２５〜３０℃が良い
。また、培養時間はＧＫが最高収量に達する時間に培養
を終了すれば良く、通常１６〜２８時間程度である０ 本発明で使用される菌株はグリセロール又はグリセロー
ル類を培地に添加することにより、より多量のＧＫを生
産せしめろことができる。
この様にして得られた培養物からＧＫを採増するには公
知の方法を適宜組合せて行うことができる。例えば、培
養液を遠心分離などして菌体を集め、次いでこの菌体な
種々の機械的方法にて破砕し、さらに遠心分離して清澄
酵素液を得る。この酵素液から硫安などによる塩析によ
り不純物を除去した後、吸着クロマトグラフィー、イオ
ン交換りｐマドグラフィー、ゲル濾過などの常法により
精製する。
知の方法を適宜組合せて行うことができる。例えば、培
養液を遠心分離などして菌体を集め、次いでこの菌体な
種々の機械的方法にて破砕し、さらに遠心分離して清澄
酵素液を得る。この酵素液から硫安などによる塩析によ
り不純物を除去した後、吸着クロマトグラフィー、イオ
ン交換りｐマドグラフィー、ゲル濾過などの常法により
精製する。
次に本発明の方法におけるＧＫの活性測定法、およびア
ルスロバクタ・アルトロゾアネウスＩＡＭｌ ２３３９
の生産するＧＫの理化学的性質について述べる。
ルスロバクタ・アルトロゾアネウスＩＡＭｌ ２３３９
の生産するＧＫの理化学的性質について述べる。
活性測定法 ０．２ Ｍグリシン−ヒドラジン緩衝液
（２ｐ Ｍ 、 Ｍｇ ｃｔ２含、ｐＨ９，８）３’、
１４ｍＭＮＡＤにコチン７ミドアテニンジヌクレオチェ ド）０．１７．０．１Ｍ ＡＴＰ（７デノシン〜リン
酸）ｏ、ｏｓｒｎｌ、グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ
（ベーリンガー社製： １ ｍｆ ／ ｍｌ １１７０
ｕＡｎ！、） １０μｔ、１Ｍグリセロール１０μｔ
および本発明のＧＫ溶液３０μｔ を混合して２５℃
で反応し、ＮＡＤの変化を３４０ ｎｍ の増加によ
り測定した。活性は、１分間に１マイクロモルのＮＡＤ
を還元するのに要する酵素量を１単位とした。
（２ｐ Ｍ 、 Ｍｇ ｃｔ２含、ｐＨ９，８）３’、
１４ｍＭＮＡＤにコチン７ミドアテニンジヌクレオチェ ド）０．１７．０．１Ｍ ＡＴＰ（７デノシン〜リン
酸）ｏ、ｏｓｒｎｌ、グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ
（ベーリンガー社製： １ ｍｆ ／ ｍｌ １１７０
ｕＡｎ！、） １０μｔ、１Ｍグリセロール１０μｔ
および本発明のＧＫ溶液３０μｔ を混合して２５℃
で反応し、ＮＡＤの変化を３４０ ｎｍ の増加によ
り測定した。活性は、１分間に１マイクロモルのＮＡＤ
を還元するのに要する酵素量を１単位とした。
理化学的性質
ｆｉ＋作用 本酵素は少なくとも次式に示す反応を触媒
する。
する。
グリセロール＋ＡＴＰ−＋Ｌ−α−グリセロリン１酸＋
ＡＤＰ （２）基質特異性 ０．２Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，
５）、１０ｍＭ ＡＴＰ ０．１＋＋＋７！、３ｍ
Ｍ ホスホエノールピルビン酸 ０． ｌ ｔｄ、２
ｒｐＭ ＮＡＤＨＯ，１−１０，１Ｍ ＭｇＣｌ２
２０μｔ１ピルビン酸キテーゼー乳酸脱水素酵素混合物
（ベーリン力−社製）１０μｔ および基質として０．
２ Ｍグリセロール、０２Ｍジヒドロキシ７セトンまた
はＤＬ−グリセロアルデヒドの０．１−を混合し、これ
に本酵素液を加えて最終１−としたのち２５℃で反応し
ＮＡＤＨの減少速度を測定した。各基質の相対活性は次
の通りである０ 基 質 相対活性 グリセロール １００％ ノヒドロキシアセトン ９７チＤＬ−グリセ
ロアルデヒド ５５％（３）至適ｐＨ本酵素の至
適ｐＨは第１図に示すようにｐＨ９，５〜１０付近にあ
る。
ＡＤＰ （２）基質特異性 ０．２Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，
５）、１０ｍＭ ＡＴＰ ０．１＋＋＋７！、３ｍ
Ｍ ホスホエノールピルビン酸 ０． ｌ ｔｄ、２
ｒｐＭ ＮＡＤＨＯ，１−１０，１Ｍ ＭｇＣｌ２
２０μｔ１ピルビン酸キテーゼー乳酸脱水素酵素混合物
（ベーリン力−社製）１０μｔ および基質として０．
２ Ｍグリセロール、０２Ｍジヒドロキシ７セトンまた
はＤＬ−グリセロアルデヒドの０．１−を混合し、これ
に本酵素液を加えて最終１−としたのち２５℃で反応し
ＮＡＤＨの減少速度を測定した。各基質の相対活性は次
の通りである０ 基 質 相対活性 グリセロール １００％ ノヒドロキシアセトン ９７チＤＬ−グリセ
ロアルデヒド ５５％（３）至適ｐＨ本酵素の至
適ｐＨは第１図に示すようにｐＨ９，５〜１０付近にあ
る。
１４１ ｐＨ安定性 本酵素のＰＨ安定性は、第２図に
示すように３７℃、１時間の処理でＰ Ｈ５，５〜９５
である。
示すように３７℃、１時間の処理でＰ Ｈ５，５〜９５
である。
（５）熱安定性 本酵素は第３図に示すようにＰＨ７
，０，１５分の処理において４５℃以下の温度で安定で
ある。
，０，１５分の処理において４５℃以下の温度で安定で
ある。
（６）至適温度 本酵素の至適温度はＰ Ｈ７，０の
条件で第４図に示すように５０℃付近にある。
条件で第４図に示すように５０℃付近にある。
（７）分子量 約８２．０００１（セファデックスＧ
−１００ゲルｒ過による） （８）等電点 Ｐ Ｈ４，３付近（アンフオラインを
用いる焦点電気泳動法による） （９）基質親和性 本酵素のグリセロールに対するミ
バエリス定数（ＫＩ＋ｌ値）は３．５Ｘ１０−’Ｍで、
ＡＴＰＫ対するｂ値は３．７ Ｘ ］ ０−５であった
。
−１００ゲルｒ過による） （８）等電点 Ｐ Ｈ４，３付近（アンフオラインを
用いる焦点電気泳動法による） （９）基質親和性 本酵素のグリセロールに対するミ
バエリス定数（ＫＩ＋ｌ値）は３．５Ｘ１０−’Ｍで、
ＡＴＰＫ対するｂ値は３．７ Ｘ ］ ０−５であった
。
次に、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。
実施例１
グリセロール０５％、ポリペプトン０５％、酵母エキス
０３係、消泡剤７デカノールＬＧ−１２６（旭電化製）
００２％の組成の培地（Ｐ Ｈ７，０）２１を３１容の
ジャーファーメンタ−にとり、１２０℃、２０分間オー
トクレーブ殺菌した後、アルスロバクタ・アルトロシア
ネウスＩＡＭ１２３３９を植菌し、３０℃で２０時間培
養した。
０３係、消泡剤７デカノールＬＧ−１２６（旭電化製）
００２％の組成の培地（Ｐ Ｈ７，０）２１を３１容の
ジャーファーメンタ−にとり、１２０℃、２０分間オー
トクレーブ殺菌した後、アルスロバクタ・アルトロシア
ネウスＩＡＭ１２３３９を植菌し、３０℃で２０時間培
養した。
得られた培養液を遠心分離して菌体を集め、これを２０
ｍＭ！Ｉン酸緩衝液（Ｐ Ｈ７，０’ ）に懸濁した後
、セルミル（エムニス機器社製）で破砕し、遠心分離に
より粗酵素抽出液１５０ｍ／！を得た。本酵素液の活性
は８．８ Ｕ／ｍｌであった。し・かる後、硫安２０〜
６０％ 飽和の沈殿画分を集め、これを前記と同じリン
酸緩衝液に溶解後、同緩衝液に対（−タアミノへ千ンル
セファロース力ラム（１３０−容）に通した。カラムに
吸着した本酵素を０４Ｍ Ｎａｃｔ含有２０ｍＭリン酸
緩衝液（Ｐ Ｈ７，０）で溶出した。溶出液１３０−を
ホローファイバーＨＩ ６０００限外濾過膜（旭化成製
）で脱塩濃縮（１５０づ容）に通した。
ｍＭ！Ｉン酸緩衝液（Ｐ Ｈ７，０’ ）に懸濁した後
、セルミル（エムニス機器社製）で破砕し、遠心分離に
より粗酵素抽出液１５０ｍ／！を得た。本酵素液の活性
は８．８ Ｕ／ｍｌであった。し・かる後、硫安２０〜
６０％ 飽和の沈殿画分を集め、これを前記と同じリン
酸緩衝液に溶解後、同緩衝液に対（−タアミノへ千ンル
セファロース力ラム（１３０−容）に通した。カラムに
吸着した本酵素を０４Ｍ Ｎａｃｔ含有２０ｍＭリン酸
緩衝液（Ｐ Ｈ７，０）で溶出した。溶出液１３０−を
ホローファイバーＨＩ ６０００限外濾過膜（旭化成製
）で脱塩濃縮（１５０づ容）に通した。
θ〜０．５’ＭＮａｃＡによる直線濃度勾配法で溶出を
行い活性画分を集めた。これを前記ホローファイバーに
て脱塩濃縮した後凍結乾燥した。かくして比活性３０単
位／ｑのＧＫを１５■得た。
行い活性画分を集めた。これを前記ホローファイバーに
て脱塩濃縮した後凍結乾燥した。かくして比活性３０単
位／ｑのＧＫを１５■得た。
実施例２
アルスロバクタ・ルテウスＡＴＣＣ２１６０６を実施例
１と同様に培養し、菌体破砕により粗酵素抽出液１７０
ｍ／！を得た。本酵素液の活性は３．７Ｕ／−であった
。
１と同様に培養し、菌体破砕により粗酵素抽出液１７０
ｍ／！を得た。本酵素液の活性は３．７Ｕ／−であった
。
第１図は本発明の方法において、アルスロバクタ・アル
トロシアネウスＩＡＭ１２３３９の生産するグリセルー
ルキナーゼの至適Ｐ、Ｈを示す図であり、同じく第２図
はＰＨ安定性を、第３図は熱安定性を、第４図は至適温
度を示す図である０特許出願人 天野製薬株式会社 第１図 Ｈ 第２図 ４５６７８９１０
トロシアネウスＩＡＭ１２３３９の生産するグリセルー
ルキナーゼの至適Ｐ、Ｈを示す図であり、同じく第２図
はＰＨ安定性を、第３図は熱安定性を、第４図は至適温
度を示す図である０特許出願人 天野製薬株式会社 第１図 Ｈ 第２図 ４５６７８９１０
Claims (1)
- アルスロバクタ属に属しグリセロールキナーゼ生産能力
を有する菌株を培養し、該培養物からグリセロールキナ
ーゼを採取することを特徴とするグリセロールキナーゼ
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11223882A JPS592688A (ja) | 1982-06-28 | 1982-06-28 | グリセロ−ルキナ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11223882A JPS592688A (ja) | 1982-06-28 | 1982-06-28 | グリセロ−ルキナ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS592688A true JPS592688A (ja) | 1984-01-09 |
| JPS6262151B2 JPS6262151B2 (ja) | 1987-12-24 |
Family
ID=14581696
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11223882A Granted JPS592688A (ja) | 1982-06-28 | 1982-06-28 | グリセロ−ルキナ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS592688A (ja) |
-
1982
- 1982-06-28 JP JP11223882A patent/JPS592688A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6262151B2 (ja) | 1987-12-24 |
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