JPS6243675B2

JPS6243675B2 -

Info

Publication number: JPS6243675B2
Application number: JP56161071A
Authority: JP
Inventors: Toshuki Kamisaka; Toshizo Sakurai; Masahiko Mutai
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1981-10-12
Filing date: 1981-10-12
Publication date: 1987-09-16
Also published as: JPS5863387A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はビフイドバクテリウム・ビフイダムを
利用して制限酵素を製造する方法に関するもので
ある。制限酵素は２本鎖デオキシリボ核酸（DNA）
の中の特定の塩基配列を認識してこれを特定の部
位で切断するエンドヌクレアーゼ型DNA分解酵
素である。この酵素はその特異な酵素作用に基づ
き特定の生物種のDNAを認識して特定の大きさ
のDNA断片に切断することができるから、DNA
の構造と機能の解析、塩基配列の決定、遺伝子の
単離などの試薬として有用なだけでなく、今後き
わめて重要な産業的意義を持つ遺伝子の人工的変
換のための試薬として不可欠のものである。本発明者らはこのように実用性に富む重要な生
化学試薬としての制限酵素を、微生物を利用して
製造する方法につき研究を重ね、特に非病原性
であること、培養が容易で菌体を大量に取得で
きること、制限酵素生産量が多く精製が容易で
あること、などを指標として腸内細菌を中心に制
限酵素生産菌の検索を行なつてきた。その結果、
ビフイドバクテリウムに属する細菌がきわめて安
定で取扱いや保存が容易な種々の制限酵素を産生
することを見いだし、その一部について、日本農
芸化学会昭和55年度大会において発表したが、そ
の後さらに研究を進めた結果、ビフイドバクテリ
ウム・ビフイダムに属する菌株が、公知の制限酵
素AcyのアイソシゾマーすなわちAcyが認識
するのと同一の塩基配列を認識する制限酵素（以
下この酵素をBbiという）を産することを知つ
た。本発明は上記知見に基くものであつて、ビフイ
ドバクテリウム・ビフイダムに属する制限酵素
Bbi生産菌を培養し、得られた上記菌の菌体よ
り制限酵素Bbiを採取することを特徴とする制
限酵素Bbiの製造法を提供するものである。本発明の方法により製造することができる制限
酵素Bbiは次のような理化学的性質を持つ酵素
である。 (1) 作用及び基質特異性種々のDNAにこの酵素を作用させたときの
切断部位の数は第１表のとおりである。

【表】また塩基配列 5′−GRCGY−3′ 3′−CYGCRG−5′ （但しＲはＡ又はＧで、ＹはＲがＡのときＴ、
ＲがＧのときＣである。）を認識して２本鎖DNAを特定の部位で切断す
る。（これらにより、Bbiは公知の制限酵素
Acyのアイソシゾマーであると認められ
る。） (2) 至適PH：7.4付近（安定な範囲：6.8〜8.2） (3) 至適温度：35〜38℃ (4) 阻害、活性化及び安定化１〜15ｍＭのMg²⁺で活性化されるが、ATP
やＳ−アデノシルメチオニンのような補助困子
を必要としない。本発明の製法を実施するに当り、制限酵素Bbi
生産菌の培養法には特に制限はない。基本的に
はビフイドバクテリウム菌につき周知の培養法に
従い、用いる菌が増殖可能な培地及び条件下に、
通常は菌の増殖が定常期に達する迄、培養を行え
ばよい。培養終了後は常法により培養物を遠心分離して
集菌する。得られた菌体から制限酵素を採取する
方法も任意であるが、代表的な方法を示せば次の
とおりである。菌体はまずリゾチーム処理した後、超音波破砕
する。次いで遠心分離して沈殿物を除き、無細胞
抽出液を得る。この無細胞抽出液をストレプトマ
イシン硫酸塩で処理し、更に硫酸アンモニウムで
分画した後、バイロゲル、セフアデツクスなどを
用いるゲル炉過法、ホスホセルロース、ハイドロ
キシアパタイト、DEAE−セルロースなどを用い
るイオン交換クロマト法、ヘパリン−セフアロー
スなどを用いるアフイニテイークロマト法、又は
これらの組合せにより精製して、目的物である制
限酵素を得る。これらの精製工程も、従来の酵素
精製の常法に従つて行えばよい。本発明の方法に使用することができる制限酵素
Bbi生産菌の例としては、ビフイドバクテリウ
ム・ビフイダムYIT−4005（微工研菌寄第3372
号）、同YIT−4007（微工研条寄第791号）などが
ある。これらの菌の菌学的性質は次のとおりであ
る。分類学的性状グラム陽性無芽胞桿菌で、細胞内部にメチレ
ンブルーに親和性を有する顆粒が存在する。顕
微鏡で観察すると、細胞の先端が分岐して、Ｙ
字状、湾曲状の多形性を示す。重層法で形成さ
せたコロニーは、円筒状、凸状、レンズ状を示
す。カタラーゼ活性（−）、炭酸ガス産生（−）、
ミルク疑固性（＋）、ゼラチン液化性（−）、硝
酸塩還元性（−）、インドール産生（−）、硫化
水素産生（−）である。糖発酵性は、グルコース、フラクトース、ラ
クトース、ガラクトースの各糖が陽性、アラビ
ノース、キシロース、サリシン、マンノース、
マンニトール、メレジトース、セロビオース、
ソルビトール、イヌリン、トレハロース、マル
トース、リボース、ソルボースの各糖が陰性で
ある。以上の性状から、本菌株はBargey′s Manual
（1974年）の分類基準を参照してビフソドバク
テリウム・ビフイダムであると同定したが、後
に詳述するような、公知のビフイズス菌にはな
い特性も備えているところから、ビフイダムの
変異株であると判断した。増殖しうる温度及びPH 25〜45℃、PH５〜７（至適条件：36〜38℃、PH６〜７）（上記及びの特性はYIT−4005及びYIT−
4007に共通のものである。）胆汁酸耐性デオキシコール酸300μｇ／mlを含有する培
地でYIT−4005は増殖せず、YIT−4007は増殖
する。上述のように本発明の製造法により得られる制
限酵素は公知酵素Acyのアイソシゾマーである
が、Acyの原料はラン藻の一種であるアナベ
ナ・シリンカドリカであつて、このラン藻が培養
しにくく多量の藻体を得るのは容易でない（10
の培地から100ｇの藻体を得るのに約３週間を要
する）から、Acyの商業生産は極めて困難であ
るのに対し、本発明の製法は、飲食品あるいは医
薬品の分野で大規模培養の技術が確立されていて
容易に大量の菌体を入手することができる（10
の培地から１昼夜で40〜50ｇの菌体を得ることが
できる）ビフイドバクテリウム菌を使用するもの
であり、菌体からの酵素の抽出・精製も容易であ
つて精製された酵素の安定性も良好であるなど、
きわめて有利な方法である。以下実施例を示して本発明を説明する。実施例１ビフイドバクテリウム・ビフイダムYIT−4007
（微工研菌寄第5871号）を炭酸ガス噴射法で嫌気
性とした下記の組成のVLG培地に接種し、37℃
で約15時間嫌気培養して前培養液を得た。ビーフエキストラクト２ｇトリプテイケース 10ｇイーストエキス５ｇ K₂HPO₄水溶液（濃度30ｇ／） 7.5ml 塩溶液※ 7.5ml 0.1％レサズリン溶液１ml イオン交換水 914ml グルコース 10ｇ 0.07％ヘミン溶液 10ml ３％システイン塩酸塩溶液 10ml ８％Na₂CO₃水溶液 50ml ※塩溶液組成 KH₂PO₄ 30ｇ（NH₄）₂SO₄ 30ｇ NaCl 60ｇ MgSO₄・7H₂O ３ｇ CaCl₂・2H₂O ３ｇイオン交換水１これを同組成のVLG培地に、その1/250量接種
し、37℃で約15時間嫌気培養して定常期初期の培
養液を得た。この培養液から冷却遠心機を用いて
集菌して得られた菌体約60ｇを４倍量の0.4M
NaCl及び0.1ｍＭフエニルメチルスルホニルフル
オライドを含む緩衝液Ａ（10ｍＭリン酸カリ緩衝
液、PH7.0、７ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル、１ｍＭ EDTA）に懸濁し、卵白リゾチーム
（100μｇ／ml）を加え、氷水中で30分間処理して
細胞壁を部分分解した後、超音波処理して菌体を
破砕し、超遠心分離して無細胞抽出液を得た。こ
の後、下記の処理をすべて０〜５℃で行なつた。
まず無細胞抽出液に10％ストレプトマイシン硫酸
塩を最終濃度が1.2％になるように撹拌しながら
徐々に加え、更に30分間撹拌した後、遠心分離し
て沈殿を除いた。この上清に硫酸アンモニウムを
70％飽和になるように徐々に加え、１時間撹拌
後、遠心分離して沈殿を集め、これを少量の緩衝
液Ｂ（10ｍＭリン酸カリ緩衝液、PH7.4、７ｍＭ
β−メルカプトエタノール、１ｍＭ EDTA）
に溶解し、同じ緩衝液に対して一夜透析した。透
析試料を、あらかじめ緩衝液Ｂで平衡化したホス
ホセルロースカラム（p11、ワツトマン、1.5×30
cm）に添加し、洗浄後、0.8M NaClの直線的濃度
勾配を持つ緩衝液Ｂで分画すると、制限酵素Bbi
は0.13〜0.19M NaCl濃度画分に回収された。上記Bbi含有画分を集め、これを0.2M NaCl
を含む緩衝液Ａに対して一夜透析し、あらかじめ
同じ緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタイト
カラム（1.0×10cm）に吸着させ、洗浄後0.01〜
0.5Mリン酸カリの直線的濃度勾配を持ち且つ
0.2M NaClを含む緩衝液Ａで溶出させると、Bbi
活性が0.28〜0.36M、リン酸カリ濃度の画分に
回収された。以上のようにして得られた制限酵素Bbi標品
には他の制限酵素活性は検出されなかつた。

Claims

【特許請求の範囲】１２本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列 5′−GRCGYC−3′ 3′−CYGCRG−5′ （但しＲはＡ又はＧであり、ＹはＲがＡのとき
Ｔ、ＲがＧのときＣである。）を認識する制限酵素を生産する能力を有するビフ
イドバクテリウム・ビフイダムを培養し、得られ
た菌体より上記制限酵素を採取することを特徴と
する制限酵素の製造法。