DE60115267T2

DE60115267T2 - Glutaryl-cephalosporin-amidase aus pseudomonas diminuta bs-203

Info

Publication number: DE60115267T2
Application number: DE60115267T
Authority: DE
Inventors: Ross Binder; Joanne L. Hill; J. Thomas FRANCESCHINI; V. William BURNETT; Michael Politino; Win Suo LIU; M. Sean TONZI
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2021-09-20
Also published as: HUP0301202A2; CY1105551T1; US6942990B2; US20020160500A1; DE60115267D1; DK1322751T3; ATE310808T1; AU9688601A; US20030143715A1; EP1322751B1; AU2001296886B2; US6528300B2; EP1322751A2; CA2423161A1; JP2004524006A; WO2002024879A3; ES2252302T3; WO2002024879A2

Description

Diese Erfindung betrifft ein neues Glutarylcephalosporin-Amidase (Glutaryl-7-ACA-Amidase) Enzym von Pseudomonas diminuta BS-203, welches die Hydrolyse von 7-(4-Carboxybutanamido)-3-acetoxymethyl-3-cephem-4-carboxylsäure (Glutaryl-7-ACA) katalysiert, um 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) und Glutarsäure zu ergeben. Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuren, welche Sequenzen aufweisen, die das Glutaryl-7-ACA-Enzym codieren, einschließlich der Nucleinsäuresequenz des Glutaryl-7-ACA-Amidasegens von P. diminuta BS-203 und die davon abgeleiteten Nucleinsäuresequenzen. Die Erfindung betrifft auch Vektoren und Wirtszellen, welche diese Nucleinsäuresequenzen beinhalten, und Verfahren zur Herstellung von Glutaryl-7-ACA-Amidase mit diesen Vektoren und Wirtszellen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Erzeugung von 7-ACA durch Verwendung von Glutaryl-7-ACA-Amidase von P. diminuta BS-203.
3-Acetoxymethyl-7-amino-3-cephem-4-carboxysäure (7-Aminocephalosporansäure, 7-ACA) ist das Startmaterial für die Synthese von vielen halbsynthetischen Cephalosporin-Antibiotika. 7-ACA kann von Cephalosporin C (einem leicht erhältlichen Fermentationsprodukt) durch ein enzymatisches Verfahren in zwei Schritten erzeugt werden (Schema 1), indem zuerst eine D-Aminosäure-Oxidase in Verbindung mit oxidativer Decarboxylierung verwendet wird, um Glutaryl-7-ACA (Schritt A) zu erzeugen, und dann Glutaryl-7-ACA-Acylase verwendet wird, um die Glutarylgruppe zu entfernen, um 7-ACA zu erzeugen (Schritt B).
Schema 1
Schritte A und B können auch durch chemische Verfahren durchgeführt werden. Die chemischen Verfahren, welche die Verwendung von großen Mengen an organischen Lösungsmitteln und giftigen Chemikalien einschließen, haben Sicherheitsnachteile und Nachteile für die Umwelt. Durch Verwendung enzymatischer Verfahren wird andererseits 7-ACA unter sanften Bedingungen in einem wässrigen Lösungsmittelsystem erhalten. Enzyme, welche die Hydrolyse von Glutaryl-7-ACA zu 7-ACA (Schritt B) katalysieren, sind leicht verfügbar gewesen, aber Enzyme, welche die direkte Hydrolyse von Cephalosporin C in 7-ACA (Schritt C) effizient katalysieren, sind es nicht gewesen. Folglich ist im Allgemeinen ein Zweischittverfahren angewendet worden, bei dem Schritt A chemisch oder enzymatisch durchgeführt wird und Schritt B enzymatisch durchgeführt wird. Siehe zum Beispiel Cambiaghi et al., US 5.424.196 und Literaturhinweise darin.
Schritt A wird üblicherweise mit D-Aminosäure-Transaminasen (auch als D-Aminosäure-Oxidase EC-1.4.3.3 bekannt) (Aretz et al., US-Patent 4.745.061) durchgeführt, um die Aminogruppe der Seitenkette der D-Aminosäure in eine Ketogruppe zu oxidieren, gefolgt von der Behandlung mit Hydrogen-Peroxid, um Decarboxylierung durchzuführen und Glutaryl-7-ACA bereitzustellen.
Großer Aufwand wurde für die Entwicklung effizienter Verfahren zur Durchführung von Schritt B verwendet. Crawford et al., in US 5.104.800 , stellen eine kurze Zusammenfassung früherer Arbeit im Gebiet der 7-ACA-Synthese bereit. Matusda et al. in US 3.960.662 beschreibt Glutaryl-7-ACA-Amidaseaktivität von Kulturen von Comamonas sp. und Pseudomonas ovalis. Mitarbeiter von Fujisawa Pharmaceutical Co. (Aramori et al., US 5.310.659 und EP 0482844 ; Aramori et al., J. Bacteriol. 173: 7848–7855) beschreiben eine Glutaryl-7-ACA-Acylase, die von Bacillus (Brevibacillus) laterosporus isoliert wurde. Chu et al. ( US 5.766.871 ) beschreiben eine Glutaryl-7-ACA-Acylase, die von Pseudomonas nitroreducens isoliert wurde. Battistel et al., beschreiben in EP 0525861 Glutaryl-7-ACA-Acylasen von verschiedenen Pseudomonas-, Bacillus- und Achromobacter-Arten.
Es wurde von etlichen Enzymen berichtet, die in der Lage sind die Hydrolyse von Cephalosporin C zu 7-ACA (Schema 1, Schritt C) direkt zu katalysieren. Zum Beispiel offenbarten Mitarbeiter von Asahi Chemical (Ichikawa et al., US 4.774.179 ; Matsuda et al., J. Bact., 1987, 169: 5815–5820 und 5821–5826) den Stamm SE-495 von Pseudomonas diminuta und den Stamm SE83 von einer nahe verwandten Pseudomonas-Art, von welchen beide Enzyme produzieren, die in der Lage sind die direkte Umwandlung von Cephalosporin C in 7-ACA durchzuführen. Lein berichtete in US 4.981.789 und EP 0283218 von einer Cephalosporin C-Amidase von Arthrobacter viscous. Lein in EP 0322032 wie auch Crawford et al., in U.S. 5.104.800 (und Teil-US 5.229.247) und EP 0405846 berichteten von einer Cephalosporin C-Amidase von Bacillus megaterium. Iwami et al., offenbarten in US 5.192.678 (und Teil-US 5.320.948) und später in EP 0475652 eine Cephalosporin C-Acylase von Pseudomonas diminuta N-176, welche in der Lage ist Schritt C direkt auszuführen, die aber beim Katalysieren der Umwandlung von Glutaryl-7-ACA in 7-ACA besser ist. Von solchen Enzymen ist bis jetzt noch nicht gezeigt worden, dass sie für die Produktion von 7-ACA ökonomischer brauchbar sind.
Die Erzeugung von rekombinanten Wirtszellen, die verschiedene Glutaryl-7-ACA-Amidasen exprimieren, ist von zahlreichen Forschern beschrieben worden. Siehe zum Beispiel M. Ishiye und M. Niwa, Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1132: 233–239; Croux et al., EP 0469919 ; Aramori et al., US 5.310.659 ; Iwami et al., US 5.192.678 ; und Honda et al., Biosci, Biotechnol. Biochem., 1997, 61: 948–955.
Angesichts des Wertes von 7-ACA als ein pharmazeutisches Zwischenprodukt besteht das Erfordernis für verbesserte 7-ACA-Amidasen, welche bessere Ergebnisse in Bezug auf Faktoren wie Enzymkosten, Reaktionsrate und Ausbeute und Enzymstabilität bereitstellen.
Die Erfindung stellt eine Nucleinsäure bereit, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einer Nucleinsäure, die Glutaryl-7-ACA-Amidase mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 codiert;
(b) der Nucleinsäure gemäß (a), wobei die Nucleinsäure aus der Sequenz von SEQ ID NR: 1 besteht;
(c) einer Nucleinsäure, die eine Glutaryl-7-ACA-Amidase mit den folgenden Eigenschaften codiert: isolierbar aus Pseudomonas diminuta BS-203 (ATCC PTA-2517), katalysiert die Hydrolyse von 7-β-(4-Carboxybutanamido)-cephalosporansäure zu 7-Aminocephalosporansäure und Glutarsäure und ist gemäß SDS-PAGE-Elektrophorese aus zwei Untereinheiten mit offensichtlichen Molekulargewichten von 42 kD und 26 kD zusammengesetzt;
(d) der Nucleinsäure, die Glutryl-7-ACA-Amidase gemäß (c) codiert, wobei die Amidase die in SEQ ID NR: 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst;
(e) der Nucleinsäure, die Glutatyl-7-ACA-Amidase gemäß (c) codiert, wobei die Amidase aus der in SEQ ID NR: 2 gezeigten Aminosäuresequenz besteht;
(f) einer Nucleinsäure, die eine Gutaryl-7-ACA-Amidase mit mindestens 80% Identität zur Amidase von (e) codiert;
(g) der Nucleinsäure, die die Glutaryl-7-ACA-Amidase gemäß (f) codiert, wobei die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 mit bis zu 113 konservierten Aminosäureaustäuschen umfasst; und
(h) der Nucleinsäure, die die Glutaryl-7-ACA-Amidase gemäß (f) codiert, wobei die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 mit der Hinzufügung oder Deletion von bis zu 20 Aminosäureresten umfasst.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren und Wirtszellen, umfassend die Nucleinsäuren der Erfindung.
Die Erfindung betrifft auch eine neue Glutaryl 7-ACA-Amidase, codiert durch die vorstehend beschriebene Nucleinsäure oder isoliert von dem Bakterienstamm Pseudomonas diminuta BS-203 oder erhalten durch Züchtung der vorstehend erwähnten Wirtszellen.
Die Erfindung stellt auch homologe Proteine bereit, die mindestens 80% Identität zur Pseudomonas diminuta BS-203-Glutaryl-7-ACA-Amidase aufweisen. Proteine, welche bis zu 113 konservative Aminosäureaustausche und/oder bis zu 20 Aminosäure-Additionen oder Deletionen aufweisen, werden als ein Teil der Erfindung angesehen. Nucleinsäuresequenzen, die solche homologen Proteine codieren, werden auch als Teil der Erfindung angesehen.
Die Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Erlangung der Amidase von Pseudomonas diminuta BS-203 durch Züchtung von P. diminuta BS-203 in einem geeigneten Medium und Gewinnung einer Proteinfraktion, welche Glutaryl-7-ACA-Amidaseaktivität aufweist. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung der Nucleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen der Erfindung zur Produktion der Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Erlangung von 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) von 7-β-(4-Carboxybutanamido)-cephalosporansäure (Glutaryl-7-ACA) und anderen 7-β-(Acylamido)-cephalosporansäuren durch Inkontaktbringen solcher Substrate mit einer Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion von Desacetyl-7-ACA von den Desacetyl-Derivaten von 7-β-(4-Carboxybutanamido)-cephalosporansäure (Glutaryl-7-ACA) und anderen 7-β-(Acylamido)-cephalosporansäuren durch Inkontaktbringen solcher Substrate mit einer Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Nucleinsäure, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus:

(a) einer Nucleinsäure mit zwischen 10 und 1722 Nucleotiden, die unter stringenten Bedingungen entweder an ein DNA-Molekül, bestehend aus SEQ ID NR: 1, oder an ein DNA-Molekül, bestehend aus dem Gegenstrang von SEQ ID NR: 1 hybridisiert;
(b) der Nucleinsäure gemäß (a), wobei die Nucleinsäure zwischen 17 und 1722 Nucleotide lang ist; und
(c) der Nucleinsäure gemäß (a), wobei die Nucleinsäure zwischen 20 und 1722 Nucleotide lang ist; für den Nachweis der Sequenz von SEQ ID NR: 1.

1 zeigt die Restriktionskarte des E.coli-Expressionsplasmids pBMS2000GCA. Verwendete Abkürzungen sind

Ptac:: tac-Transkriptionspromotor
groES:: groES-Chaperongen
MCS:: Multiple-Clonierungsstelle
ori:: DNA-Replikationsursprung
neo^r:: Neomycin-Resistenzgen
lac i^q:: Transkriptions-Repressorgen
GCA:: Glutaryl-7-ACA-Amidasegen

2 zeigt eine Sequenz von 10 Aminosäuren von der Glutaryl-7-ACA-Amidase von Pseudomonas diminuta BS-203 (SEQ ID NR: 3), eine 6 Aminosäuren-Untergruppe dieser Sequenz, eine generische Nucleotidsequenz, welche diese sechs Aminosäuren codieren könnte (SEQ ID NR: 4), die komplementäre Sequenz (die generische komplementäre Sequenz; SEQ ID NR: 5) und die Nucleotidsequenzen von 16 degenerierten Oligonucleotidsonden (SEQ ID NR: 6–12), die der generischen komplementären Sequenz entsprechen. In der Figur ist X = A, C, G, oder T; Y = C oder T; R = A oder G.
3 zeigt eine Glutaryl-7-ACA-Amidase-Aminosäuresequenz (ein Teil von SEQ ID NR: 2) und die Nucleotidsequenz einer davon abgeleiteten 77-Basenpaar-„Guess-mer"-Sonde (SEQ ID NR: 22).
4 zeigt die gesamte Nucleotidsequenz des Glutaryl-7-ACA-Amidasegens von Pseudomonas diminuta BS-203 (SEQ ID NR: 1). Die Translationsstart und -stoppstellen werden durch Pfeile angedeutet. Bereiche, die komplementär zu einer der degenerierten Sonden sind (SEQ ID NR: 8) und die Guess-mer-Sonde (SEQ ID NR: 22) sind unterstrichen.
5 zeigt die gesamte Aminosäuresequenz des Vorläuferproteins der Glutaryl-7-ACA-Amidase von Pseudomonas diminuta BS-203 (SEQ ID NR: 2), codiert durch die Nucleotidsequenz von 4. Der Pfeil zeigt die wahrscheinliche Stelle der Spaltung in Untereinheiten an.
6 zeigt das Verfahren der Konstruktion von Plasmid pWB70. Verwendete Abkürzungen: cos ist das kohäsive Ende des Bakteriophagen Lambda; Neo r, Amp r und Tet r sind Gene, welche Resistenz gegen Neomycin, Ampicillin bzw. Tetracyclin codieren.
Die Erfindung betrifft die Isolierung und Charakterisierung einer neuen Glutaryl-7-ACA-Amidase. Im Besonderen betrifft die Erfindung eine Glutaryl-7-ACA-Amidase, produziert von Pseudomonas diminuta BS-203, welche die in SEQ ID NR: 2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist. Die ausgerichtete Sequenz zeigt etwa 56% Identität (320 Übereinstimmungen) zur Sequenz der „Acyl"-Cephalosporin-Acylase von Pseudomonas sp. Stamm SE83 (Matsuda et al., J. Bact. 1987 169: 5821–5826) und zu dem fast identischen Enzym, welches von Pseudomonas sp. Stamm V22 isoliert wurde (M. Ishiye und M Niwa, Biochim. Biophys. Acta. 1992, 1132: 233–239). Interessanterweise liegt nur eine etwa 20%ige Identität zwischen dem P. diminuta BS-203-Enzym der vorliegenden Erfindung und dem P. dimunuta N-176-Enzym von Iwami et al., ( US 5.192.678 ) vor. Die Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die rohe und teilweise gereinigte P. diminuta BS-203-Glutaryl-7-ACA-Amidase enthalten, und stellt auch isolierte und gereinigte P. diminuta BS-203-Glutaryl-7-ACA-Amidase bereit.
Die Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung ist in der Lage die Hydrolyse von Gutaryl-7-ACA in 7-ACA zu katalysieren. Sie setzt sich aus einer großen Untereinheit mit 42.000 Dalton und einer kleinen Untereinheit mit 26.000 Dalton zusammen. Die Spaltung des Vorläuferproteins (SEQ ID NR: 2) in Untereinheiten findet, in Anbetracht der Spaltung der SE83-Acyl-Cephalosporin-Acylase an der homologen Position (Matsuda et al., J. Bact. 1987 169: 5821–5826), am Wahrscheinlichsten an der in 5 angezeigten Stelle statt.
Die Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung ist durch die Leichtigkeit ihrer Anlagerung an Polyethylenimin (PEI) charakterisiert, was, wie nachstehend weiter beschrieben, entsprechend in Enzymreinigungs- und Immobilisierungsvorgängen verwendet werden kann.
Die Erfindung betrifft auch Proteine, welche mindestens 80% identisch zu SEQ ID NR: 2 oder einem Teil davon sind, wobei davon ausgegangen wird, dass sie ähnliche enzymatische Aktivität aufweisen, solange die aktive Stelle des Enzyms nicht beträchtlich verändert wird.
Die Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung wurde von einem bakteriellen Stamm, erhalten aus der Erde und bezeichnet als BS-203, isoliert und gereinigt. Das BS-203-Bakterium, welches erhebliche Amidaseaktivität gegen Glutaryl-7-ACA enthält, scheint der Spezies diminuta der Gattung Pseudomonas anzugehören. Zusätzliche Eigenschaften des BS-203-Stammes sind in Beispiel 1 beschrieben.
Die Erfindung betrifft auch isolierte und gereinigte Nucleinsäuren, welche die Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung codieren, wie zum Beispiel Nucleinsäuren, welche die Nucleotidsequenz SEQ ID NR: 1 aufweisen, sowie Fragmente (oder Teilsequenzen) davon. Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuren, welche Proteine codieren, die mindestens 80% identisch zu SEQ ID NR: 2 sind und welche Glutaryl-7-ACA-Amidaseaktivität aufweisen.
Die Erfindung beschreibt auch Nucleinsäuren, welche komplementäre (oder Antisense)-Sequenzen der in SEQ ID NR: 1 gezeigten Sequenz aufweisen, vorzugsweise völlig komplementäre Sequenzen, sowie Fragmente (oder Teilsequenzen) davon. Polynucleotide, welche Teilsequenzen aufweisen, können durch verschiedene Verfahren, einschließlich Restriktionsspaltung der gesamten Nucleotidsequenz des Glutaryl-7-ACA-Amidasegens, PCR-Amplifikation und direkter Synthese, erhalten werden.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung von Nucleinsäuremolekülen zwischen 10 und 1722 Nucleotiden bereit, vorzugsweise zwischen 17 und 1722 Nucleotiden und besonders bevorzugt zwischen 20 und 1722 Nucleotiden, welche an ein DNA-Molekül, das SEQ ID NR: 1 aufweist, oder ein DNA Molekül, bestehend aus dem Komplement von SEQ ID NR: 1, für den Nachweis von SEQ ID NR: 1 hybridisieren. Besonders bevorzugt hybridisieren solche Nucleinsäuremoleküle an SEQ ID NR: 1 oder sein Komplement, wenn die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen durchgeführt wird, welche identisch oder äquivalent sind zu 4 × SSPE, 10% PEG 6000, 0,5% SDS, 5 × Denhardt und 50 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA, gepuffert bei 42°C für 72 Stunden. Bevorzugte Fragmente sind jene, welche komplementär zu einem Teil der Reste 293–1993 von SEQ ID NR: 1 sind, welcher der codierende Bereich für das Glutaryl-7-ACA-Protein ist. Besonders bevorzugt sind die Fragmente, die mindestens 74% komplementär sind, stärker bevorzugt 84% komplementär und am meisten bevorzugt mindestens 94% komplementär zu einem Bereich der Reste 239–1993 von SEQ ID NR: 1. Sonde #7 (SEQ ID NR: 2) war zum Beispiel 94% komplementär (16 Übereinstimmungen aus 17 Basen). Die 77 Basen lange Guess-mer-Sonde (SEQ ID NR: 22) war 74% komplementär (57 Übereinstimmungen), was die Nützlichkeit von Sonden beweist, die mindestens diesen Grad an Homologie aufweisen.
Die prozentuale Sequenzidentität im Hinblick auf die hierin identifizierten Aminosäure- und Nucleotidsequenzen wird als der Prozentanteil an Resten in einer Sequenz definiert, welche nach dem Ausrichten der Sequenzen und, falls nötig, dem Einführen von Lücken, um sich an die maximale prozentuale Sequenzidentität anzunähern oder sie zu erreichen, mit den Resten in einer zweiten Sequenz identisch sind. Von konservativen Austauschen wird nicht erwogen, dass sie zur Sequenzidentität in Aminosäuresequenzen beitragen. Die Ausrichtung für Zwecke der Bestimmung der prozentualen Sequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, welche im Rahmen des Fachgebiets liegen, zum Beispiel die Verwendung einer öffentlich erhältlichen Computer-Software wie zum Beispiel BLAST (S. Altschul et al., Nlucleic Acids Res., 1997, 25: 3389–3402) oder ALIGN (E. Myers und W. Miller, 1989, CABIOS 4: 11–17). Fachleute können geeignete Parameter und Algorithmen bestimmen, die notwendig sind, um die maximale Ausrichtung über die gesamte Länge der verglichenen Sequenzen zu erreichen.
Der Homologiegrad oder die Komplementarität von kurzen Sequenzen kann durch Überprüfung leicht bestimmt werden, oder für längere Sequenzen durch Verwendung der BLAST- oder ALIGN-Software. Zum Beispiel wurde das letztere Programm (Version 2.0u) mit der BLOSUM50-Auswertungs-Matrix und End-Gap-Gewichtung unter Verwendung einer Gap-Opening-Strafe von –16 und einer Gap-Extension-Strafe von –4 von Smith-Waterman verwendet, um SEQ ID NR: 1 mit bekannten 7-ACA-Amidasegenen zu vergleichen. Mit einer Gap-Opening-Strafe von –12 und einer Gap-Extension-Strafe von –2 wurde dasselbe Programm verwendet, um die entsprechenden Aminosäuresequenzen zu vergleichen.
Die hierin beschriebenen Nucleotidsequenzen stellen nur eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes versteht es sich, dass zahlreiche Nucleotide ausgewählt werden können, welche zu einer Sequenz führen, die im Stande ist die Produktion der Glutaryl-7-ACA-Amidasen der Erfindung oder der Untereinheiten oder Peptidfragmente davon, zu lenken. Als solches sind Nucleinsäuresequenzen, die funktionell äquivalent zu den hierin beschriebenen Sequenzen sind, vorgesehen in der vorliegenden Erfindung beinhaltet zu sein. Zu solchen Sequenzen kann man gelangen, indem man zum Beispiel Codons austauscht, die vorzugsweise vom Wirtsorganismus verwendet werden. Die Nucleinsäuren der Erfindung können durch im Fachgebiet bekannte Verfahren isoliert und im Wesentlichen gereinigt werden.
Die Nucleinsäuren der Erfindung können in Vektoren und/oder in gezüchteten Wirtszellen vorliegen. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Vektoren und Wirtszellen, welche die Nucleinsäuren der Erfindung umfassen.
Die Erfindung stellt Verfahren zum Erhalt von Zusammensetzungen, welche, wie auf Seite 4 definiert, Glutaryl-7-ACA-Amidaseaktivität aufweisen, durch Züchtung von Pseudomonas diminuta BS-203 in einem geeigneten Medium unter Bedingungen, die für die Expression der Glutaryl-7ACA-Amidase geeignet sind, und ggf. Gewinnung einer Proteinfraktion, die Amidaseaktivität aufweist, bereit. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung der Nucleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen der Erfindung, um die Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung zu erzeugen. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Erhalt von 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) oder Desacetyl-7-ACA von 7-β-(4-Carboxybutanamido)-Cephalosporansäure (Glutaryl-7-ACA) oder Desacetyl-7-β-(4-Carboxybutanamido)-Cephalosporansäure durch Inkontaktbringen solcher Substrate mit einer Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung.
Die Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung kann durch Züchtung einer Wirtszelle erzeugt werden, welche mit einem Expressionsvektor transformiert ist, umfassend eine DNA-Sequenz, welche die Aminosäuresequenz des Enzyms codiert, zum Beispiel einer DNA-Sequenz, welche SEQ ID NR: 2 codiert. Die Wirtszellen können in einem Nährmedium gezüchtet werden und die 7-ACA-Amidase kann anschließend von den Zellen und/oder dem Medium gewonnen werden. Die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht kommenden Wirtszellen können Mikroorganismen, Hefe, Pilze, Pflanzen, Insekten oder tierische Zelllinien sein. Im Allgemeinen wird jeder Wirt verwendbar sein, der im Stande ist das Glutaryl-7-ACA-Amidase Enzym in einer aktiven Form zu exprimieren.
Geeignete Wirtszellen schließen Mikroorganismen (z.B.: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae), tierische Zelllinien und gezüchtete Pflanzenzellen ein. Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, besonders bevorzugt Stämme, die der Gattung Escherichia (z.B.: E. coli JM109, ATCC 53323; E. coli HB101, ATCC 33694; E. coli HB101-16, FERM BP-1872; E. coli 294, ATCC 31446), oder der Gattung Bacillus angehören (Bacillus subtilis ISW 1214). Bevorzugte Hefewirte schließen Stämme ein, welche zur Gattung Saccharomyces (z.B.: Saccharomyces cerevisiae AH22) gehören. Geeignete Tierzelllinien schließen Maus-L929-Zellen, Ovar-Zellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) und ähnliche ein. Beispiele von geeigneten Insektenzellen sind jene, die von Spodoptera (z.B.: Sf9, Sf21), Tricholplusia (z.B.: High Five^TM, Tn), Drosophila und Heliothis abgeleitet sind. Wenn Bakterien als Wirtszellen verwendet werden, setzt sich der Expressionsvektor in der Regel aus mindestens einem Promotor, einem Initiationscodon, einer DNA-Sequenz, welche SEQ ID NR: 2 (oder einen Teil davon) codiert, einem Stopp-Codon, Terminatorbereich und einer Replikationseinheit zusammen. Wenn Hefe oder Tierzellen als Wirtszellen verwendet werden, kann der Expressionsvektor eine Enhancersequenz, Spleißstellen und eine Polyadenylierungsstelle einschließen.
Der Promotor für die Expression in Bakterien umfasst üblicherweise eine Shine-Dalgarno-Sequenz. Bevorzugte Promotoren für die bakterielle Expression sind im Handel erhältliche, herkömmlich angewandte Promotoren wie zum Beispiel der PL-Promotor und der trp-Promotor für E. coli. Geeignete Promotoren für die Expression in Hefe schließen den Promotor des TRP1-Gens, der ADHI oder ADHII-Gene und das saure Phosphatase(PH05)-Gens für S. cerevisiae ein. Der Promotor für die Expression in Säugerzellen kann den frühen oder späten SV40-Promotor, HTLV-LTR-Promotor, Maus-Metallothionein I (MMT)-Promotor, Vaccinia-Promotor und ähnliche einschließen. Fachleuten sind zahlreiche, andere, geeignete Promotoren bekannt.
Die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht kommenden Vektoren schließen beliebige Vektoren ein, in die eine wie vorstehend beschriebene Nucleinsäuresequenz, gemeinsam mit beliebigen bevorzugten oder benötigten funktionellen Elementen, inseriert werden kann und dieser Vektor kann dann anschließend in eine Wirtszelle transferiert und vorzugsweise in einer solchen Zelle repliziert werden. Bevorzugte Vektoren sind jene, deren Restriktionsstellen gut dokumentiert sind und welche die für die Transkription der Nucleinsäuresequenz bevorzugten oder benötigten funktionellen Elemente enthalten. Vektoren können auch verwendet werden, um große Mengen an Nucleinsäuren der Erfindung zu erzeugen, die verwendet werden können, um z.B. Sonden und andere Nucleinsäurekonstrukte zu erzeugen. Solche Sonden können verwendet werden, um homologe Glutaryl-7-ACA-Amidaseenzyme von anderen bakteriellen Arten zu identifizieren.
Die Vektoren dieser Erfindung können in Bakterien und/oder eukaryontischen Zellen wirken. Geeignete Plasmide schließen Plasmid pBR322 oder Änderungen davon für E. coli, Hefe-2μ-Plasmid oder chromosomale Hefe-DNA für Hefe, Plasmid pRSVneo ATCC 37198, Plasmid pSV2dhfr ATCC 37145, Plasmid pdBPV-MMTneo ATCC 37224 und Plasmid pSV2neo ATCC 37149 für Säugerzellen ein. Für Säugerzellen können die Enhancersequenz, die Polyadenylierungsstelle und Spleißstellen von SV40 abgeleitet sein. Die Vektoren können wahlweise ein spaltbares Signalpeptid codieren, um die Sekretion zu erhöhen.
Der Promotor, das Initiationscodon, die codierende DNA-Sequenz, Terminationscodon(s) und der Terminatorbereich und zusätzliche, für die Wirtszelle geeignete Sequenzen können unter Verwendung z.B. eines Linkers und von Restriktionsstellen in eine geeignete Replikationseinheit (z.B.: ein Plasmid) in einer herkömmlichen Art und Weise (z.B.: Spaltung mit Restriktionsenzymen, Ligierung mit T4 DNA-Ligase) eingebaut werden, um einen Expressionsvektor zu ergeben. Wirtszellen können mit dem Expressionsvektor durch im Fachgebiet bekannte Verfahren transformiert (transfiziert) werden (z.B.: Calcium-Phosphatausfällung, Mikroinjektion, Elektroporation, usw.).
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung der Nucleinsäuren der Erfindung zur Herstellung der Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Glutaryl-7-ACA-Amidase durch ein rekombinantes Verfahren erzeugt, welches umfasst:

a) Erzeugen einer Nucleinsäure, die im Stande ist eine Wirtszelle zu steuern, um die Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung herzustellen;
b) Clonieren der Nucleinsäure in einen Vektor, der im Stande ist in eine Wirtszelle transferiert und dort repliziert zu werden; ein solcher Vektor enthält ggf. funktionelle Elemente zur Expression der Nucleinsäure;
c) Transferieren des Vektors, welcher die Nucleinsäure und funktionelle Elemente enthält, in eine Wirtszelle, die im Stande ist die Glutaryl-7-ACA-Amidase zu exprimieren;
d) Züchten des Wirts unter Bedingungen, die für die Expression der Glutaryl-7-ACA-Amidase geeignet sind; und
e) Isolieren der Glutaryl-7-ACA-Amidase.

In einer weiteren Ausführungsform wird die Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung von einer Kultur von Pseudomonas diminuta isoliert. Ein Beispiel eines Verfahrens zur Isolierung von Glutaryl-7-ACA-Amidase von P. diminuta wird nachstehend in den Beispielen beschrieben.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, um 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) von 7-β-(4-Acylamido)-Cephalosporansäure (z.B. Glutaryl-7-ACA) unter Verwendung einer Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung zu erhalten. Das Verfahren wird durch Behandlung von Glutaryl-7-ACA oder einem äquivalentem Acyl-7-ACA-Substrat mit einer Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung unter Bedingungen durchgeführt, welche die Hydrolyse der Acyl-7-ACA zu 7-ACA erlauben. Die Glutaryl-7-ACA-Amidasen der Erfindung können durch im Fachgebiet bekannte Verfahren in Lösung angewandt werden oder durch Quervernetzung oder durch Anhaftung an oder Einschluss in einen unlöslichen Trägerstoff immobilisiert werden. Siehe zum Beispiel Cambiaghi et al., US 5.424.196 ; J. Woodward, US 5.846.762 ; M. Bigwood, US 4.612.288 ; und M. Navia, US 5.618.710 .
Die Glutaryl-7-ACA-Amidasen der Erfindung können durch die Wirtszellen in das Kulturmedium abgesondert werden. In diesen Ausführungsformen wird das Enzym, falls erwünscht, leicht durch die herkömmlichen Verfahren isoliert. Repräsentative Zusammensetzungen der Erfindung, welche zur Erzeugung der 7-ACA-Amidase nützlich sind, sind die Kulturbrühe selbst und Konzentrate, Ausfällungen und Peptidfraktionen, abgeleitet davon, welche die Glutaryl-7-ACA-Amidaseaktivität enthalten. Wenn die exprimierte 7-ACA-Amidase in der Wirtszelle verbleibt, sind die folgenden Zusammensetzungen repräsentative Ausführungsformen der Erfindung:

(1) Wirtszellen; abgetrennt vom Kulturmedium in einer herkömmlichen Art und Weise, wie zum Beispiel Filtration oder Zentrifugation;
(2) Getrocknete Zellen; erhalten durch Trocknen der vorstehend erwähnten Wirtszellen in einer herkömmlichen Art und Weise;
(3) Zellfreier Extrakt; erhalten durch Zerstörung der vorstehend erwähnten Wirtszellen in einer herkömmlichen Art und Weise (z.B.: Lyse mit einem organischen Lösungsmittel, Homogenisierung, Zermahlung oder Beschallung mit Ultraschall) und wahlweisem Entfernen der Zelltrümmer durch Filtration oder Zentrifugation;
(4) Ausgefällte Enzyme, erhalten durch Behandlung des vorstehend erwähnten zellfreien Extrakts mit einem Ausfällungsmittel (z.B.: Natriumsulfat, Trichloressigsäure, Poly(ethylenimin), usw.);
(5) Enzymlösung; erhalten durch Reinigung oder teilweise Reinigung des vorstehend erwähnten zellfreien Extrakts in einer herkömmlichen Art und Weise (z.B.: lonenaustausch oder hydrophobe Interaktions-Chromatographie);
(6) Immobilisierte Zellen oder Enzym; hergestellt durch Immobilisieren der Wirtszellen oder des Enzyms in einer herkömmlichen Art und Weise (z.B.: Anhaftung an ein Polymer oder Einschließen innerhalb eines Polymers, Anhaftung an einen teilchenförmigen Trägerstoff, Crosslinking usw.).

Der Prozess des Inkontaktbringens der Glutaryl-7-ACA-Amidase der Erfindung mit Glutaryl-7-ACA kann in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt werden, d.h. einem Lösungsmittel, in welchem das Substrat löslich ist und in welchem das Enzym aktiv ist. Das Lösungsmittel ist vorzugsweise ein wässriges Medium wie Wasser oder eine Pufferlösung. Üblicherweise wird der Prozess durch Auflösen oder Suspendieren der Kulturbrühe oder einer der vorstehend erwähnten repräsentativen Zusammensetzungen in einer Pufferlösung durchgeführt, welche Glutaryl-7-ACA oder ein äquivalentes Substrat enthält. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches, die Konzentration des Substrats, Reaktionszeit und Reaktionstemperatur können mit den Eigenschaften einer Kulturbrühe oder seines verarbeiteten Materials, das verwendet werden soll, variieren. Vorzugsweise wird die Reaktion bei pH-Werten zwischen 6 und 10, stärker bevorzugt zwischen 7 und 9; und vorzugsweise zwischen 0°C und 40°C, stärker bevorzugt zwischen 4°C und 15°C für 0,5 bis 5,0 Stunden durchgeführt. Die Konzentration des Substrats im Reaktionsgemisch ist vorzugsweise zwischen 1 und 100 mg/ml. Das produzierte 7-ACA kann vom Reaktionsgemisch durch im Fachgebiet bekannte Verfahren gereinigt und isoliert werden.
Es wird erwartet, dass die Enzyme der vorliegenden Erfindung wie früher bekannte Glutaryl-7-ACA-Amidasen im Stande sein werden andere Acyl-7-ACA-Substrate wie zum Beispiel Succinyl-7-ACA und Malonyl-7-ACA zu hydrolysieren und daher für die Umwandlung von solchen alternativen und äquivalenten Substraten in 7-ACA nützlich sein werden. Der Begriff 7-β-(Acylamido)-Cephalosporansäure bezieht sich auf 7-ACA-Derivate, welche als Substrate für andere Cephalosporin-Amidasen und Acylasen (E.C. 3.5.1.11) bekannt sind. Im Allgemeinen besteht diese Klasse aus Verbindungen, wo Acylamido eine Carboxy-substituierte Acylamidogruppe von drei bis sechs Kohlenstoffatomen ist; genauer gesagt schließt es Verbindungen ein, wo Acylamido von einer Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus Malonylamido, Succinylamido, Glutarylamido und 5-Carboxy-5-Oxopentanamido.
Die Enzyme der vorliegenden Erfindung sind auch zur Hydrolyse der Desacetyl-Derivate von Glutaryl-7-ACA und anderen 7-β-(Acylamido)-Cephalosporansäuren im Stande, die dabei Desacetyl-7-ACA produzieren. Demgemäß stellt die Erfindung auch Verfahren zur Produktion von Desacetyl-7-ACA von diesen Derivaten bereit.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch Beispiele beschrieben, welche den Bereich der Erfindung erläutern, aber nicht limitieren sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Identifizierung von Stamm BS-203
Das als BS-203 bezeichnete Bakterium wurde während des Verlaufs einer Untersuchung an Mikroorganismen mit Glutaryl-7-ACA-Amidaseaktivität aus dem Erdreich isoliert. Das Bakterium wurde unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens bei der American Type Culture Collection mit der ATCC Referenznr. PTA-2517 hinterlegt.
Dieses Bakterium, welches erhebliche Amidaseaktivität gegen Glutaryl-Cephalosporansäure enthielt, hatte die folgenden Merkmale:
A. Morphologie
Das Bakterium ist ein grundsätzlich aerobes, Gram-negatives, nicht sporulierendes, freibewegliches Stäbchen. Es misst 0,5–0,8 × 2–4 μm mit gerundeten Enden und einem einzelnen polaren Flagellum. B. Züchtungs- und physiologische Merkmale
Kolonien auf einem Nähragar sind kreisrund, konvex, glatt und farblos. Glucose wird oxidativ metabolisiert und die Produktion von Indol ist negativ. Wachstum wird bei 20°C und 28°C beobachtet, aber nicht bei 5°C oder 37°C. Darüber hinaus kann der Stamm nicht in synthetischen Medien wachsen, was darauf hindeutet, dass ein Wachtumsfaktor benötigt wird (Tabelle 1). Wenn synthetische Medium mit Hefe-Extrakt ergänzt werden, wächst der Stamm gut. Die physiologischen Eigenschaften sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 1 Wachstum des Stammes BS-203 auf verschiedenen Medien
Tabelle 2 Physiologische Eigenschaften des Stammes BS-203
Tabelle 3 Vergleich von BS-203 mit verwandten Pseudomonas Arten
C. Taxonomische Position
Die taxonomischen Merkmale von Stamm BS-203 zeigen, dass der Stamm in die Gattung Pseudomonas eingeordnet werden kann (N. Palleroni, Familie I. Pseudomonadeacae, Seiten 141–199, in N. Krieg (Her.) Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, 9. Ausgabe, Bd. 1 (1986), Williams & Wilkins, Baltimore; H. Stolp und D. Gadkari, Nonpatholgenic members of the genus Pseudomonas, Seiten 719–741, in M. P. Starr et al. (Her.) The Prokaryotes: a handbook on habitats, Isolation and identihcation of bacteria. Bd. I (1981), Springer Verlag, Berlin.) Stamm BS-203 scheint mit der Gruppe P. diminuta nahe verwandt zu sein, die spezifische Wachstumsfaktoren benötigt (Palleroni, vorstehend, S. 184) (Tabelle 3).
Beispiel 2: Isolierung und Reinigung von aktiver Glutaryl-Ceghalosporin-Amidase
BS-203 wurde in 500 Litern Medium gezüchtet, welches 1% Casein-Hydrolysat (NZAmine A, Sheffield), 1% Hefeextrakt (Amberex 1003), 1% Casein-Hydrolysat (CER90C, Deltown), pH-Wert 7,0, bei 28°C unter Verwendung eines Luftstroms von 0,2 WM bei 5 PSIG unter starkem Schütteln gezüchtet. Nach 44 Stunden Wachstum wurde 1 kg Zellen durch Zentrifugation geerntet.
Die Zellen wurden in 2,5 Liter Wasser resuspendiert und unter Verwendung eines Homogenisiergeräts der Marke TISSUEMIZER^TM (Tekmar), betrieben bei maximaler Geschwindigkeit, homogenisiert. Die Viskosität des Homogenisats wurde durch Hinzufügen von 100 mg DNAse (Sigma) kontrolliert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (7000 × g für 20 Minuten) in der Anwesenheit von 0,1% Poly(ethylenimin) entfernt. Zusätzliche 0,3% Poly(ethylenimin) wurden hinzugefügt und die ausfällende Glutaryl-7-ACA-Amidaseaktivität wurde durch eine zusätzliche Zentrifugation entfernt.
Die aktive Amidase wurde durch Auflösen des Pellets in 80 ml einer 0,6 M NaCl, 20 mM Tris-Puffer (pH-Wert 8,0)-Lösung resuspendiert. Diese Suspension wurde dreifach mit Wasser verdünnt und zentrifugiert, um die Lösung zu klären. Der klare Überstand wurde auf eine 40 ml-Q-Sepharose-lonenaustauschsäule geladen, die mit 0,15 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,5) äquilibriert worden war. Die Aktivität wurde unter Verwendung eines 0,15 bis 0,75 M NaCl-Salzgradienten eluiert. Die aktiven Peakfraktionen, welche nahe 300 mM NaCl eluierten, wurden vereinigt, konzentriert und auf eine S-200-Größenausschlußsäule geladen. Die Säule wurde mit 0,25 M NaCl, 0,05 M Tris-Cl (pH-Wert 8) eluiert. Fraktionen, welche Glutaryl-7-ACA-Amidaseaktivtät enthielten, wurden vereinigt, gegen 10 mM Kaliumphosphatpuffer dialysiert und auf eine 13 ml-Hydroxyapatitsäule geladen (Biorad HTP). Die Amidase wurde mit einem Kaliumphosphatgradienten (10 bis 600 mM) eluiert. Fraktionen, welche Amidasepeakaktivität enthielten, wurden vereinigt und auf eine DEAE-Trisacryl^TM-lonenaustauschsäule geladen, welche mit 30 mM Tris-Cl (pH-Wert 8,4) äquilibriert war. Diese Klärsäule wurde mit einem Salzgradienten (0 bis 600 mM) eluiert, der 30 mM Tris-HCl enthielt. Die Peakfraktionen, die von dieser Säule eluiert wurden, enthielten noch immer erhebliche Mengen an verunreinigenden Proteinen, eine weitere Reinigung wurde daher unter Verwendung einer präparativen nativen Gelelektrophorese gemäß dem Verfahren von Davis durchgeführt (Davis, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1964, 121: 404–427).
Native Gelelektrophorese der teilweise gereinigten Amidase der zweiten DEAE-Trisacrylsäule trennte verunreinigende Proteine von der Amidase. Die Identität wurde durch Aktivtätstests von Protein bestätigt, welches von Stücken des nativen Gels eluiert wurde; Homogenität wurde sowohl durch native als auch durch SDS-Gelelektrophorese des eluierten Proteins bestätigt. Eine präparative SDS-Gelelektrophorese wurde mit der eluierten nativen Amidase von dem nativen Gel gefahren, um die zwei Untereinheiten des Proteins aufzutrennen. Sowohl die große Untereinheit, welche ein Molekulargewicht von 42.000 Daltons aufweist, als auch die kleine Untereinheit, welche ein Molekulargewicht von 26.000 Daltons hat, wurden von dem präparativen SDS-Gel eluiert, dialysiert und konzentriert. Diese Präparationen wurden mit Trypsin gespalten und isolierte Fragmente wurden verwendet, um N-terminale Aminosäuresequenzen von Fragmenten von den zwei Untereinheiten zu bestimmen. Diese Aminosäuresequenzen werden in 2 und 3 gezeigt.
Beispiel 3: Isolierung des Gens, welches Glutaryl-Cephalosporin-Amidase von BS-203 codiert.
A. Präparation chromosomaler DNA von BS-203
100 ml Luria Bertani (LB)-Medium wurden mit 1 ml einer konfluenten Kultur von BS-203 inokuliert. Die Kultur wurde bei 28°C für 24 Stunden bei 200 UpM geschüttelt. Die Zellen wurden für 15 Minuten in einer TJ-6-Beckman Tischzentrifuge bei 6000 UpM pelletiert. Die Zellen wurden in 4 ml 50 mM Glucose/10 mM EDTA / 25 mM Tris-HCl pH-Wert 8,0 resuspendiert und mit 10 mg pulverisiertem Lysozym (Sigma) für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Hinzufügen von 1 ml 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 50 μg/ml Proteinase K bei 50°C für 3 Stunden lysiert. Die Suspension wurde nacheinander mit 1 ml Phenol, 1 ml Chloroform und 1 ml Ether extrahiert. Sie wurde dann durch Hinzufügen von 30 μl 5 M NaCl, 2 ml 100% Ethanol präzipitiert und sanft durch Umdrehen, bis ein Klumpen gebildet war, gemischt. Der DNA-Klumpen wurde unter Verwendung einer versiegelten, hakenförmigen Pasteurpipette entfernt und dann nacheinander in 70%, 85% und 100% Ethanollösung gespült. Die 70% und 85% Ethanollösungen wurden mit 10 mM Tris pH-Wert 8,0, 10 mM EDTA und 150 mM NaCl verdünnt. Der DNA wurde ermöglicht sich in 0,5 ml TE (10 mM Tris-HCl pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA pH-Wert 8,0) bei 22°C für 16 Stunden zu lösen. RNase A wurde zu 50 μg/ml hinzugefügt und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert, gefolgt von einer zweiten Spaltung in 0,5% SDS und 50 μg/ml Proteinase K bei 37°C für 16 Stunden. Die organischen Extraktionen und Ethanolpräzipitationen wurden wiederholt. Der endgültige DNA-Knoten wurde in 0,4 ml TE aufgelöst. Die DNA-Konzentration wurde spektrophotometrisch bei 260 nm bestimmt.
B. Konstruktion einer genomischen Cosmid-DNA-Bank von BS-203
Um eine genomische Cosmidbank von BS-203 zu erzeugen, wurde ein neuer Cosmidvektor pWB70 verwendet. Der Vektor wurde, wie in 6 gezeigt, von den Plasmiden pNEO (R. A. Jorgensen et al., Mol. Gene Genet. 177: 65–72 (1979)) und pJP1A (J. J. Portmore et al., Biotech. Letters 9: 7–12 (1987)) konstruiert. Das Plasmid pNEO wurde teilweise mit PstI gespalten und mit EcoRI komplett gespalten. Ein 4,2 Kilobasen (Kb)-Fragment wurde durch präparative Agarosegelelektrophorese isoliert und unter Verwendung von Geneclean^TM (BIO 101) gereinigt. pJP1A wurde mit PstI und EcoRI gespalten und ein 1,1 Kb-Fragment wurde isoliert, welches die Cos-Stelle des Bakteriophagen Lambda enthielt, welche der DNA ermöglicht in die Lambda-Phagenköpfe verpackt zu werden. Die beiden Fragmente wurden ligiert und die Transformanten wurden auf Neomycinresistenz und Ampicillinsensitivität durchmustert. Dieser Vektor, der keine β-Lactamaseaktivität erzeugt und Resistenz gegen Neomycin vermittelt, erlaubt die Insertion von großen (30–45 Kb) chromosomalen DNA-Fragmenten in E. coli und dadurch die Bildung einer genomischen Cosmidbank.
Das folgende Verfahren wurde verwendet, um eine genomische Cosmidbank von BS-203 zu erzeugen: Cosmid pWB70 wurde mit BamHI gespalten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) dephosphoryliert, um Selbstligierung zu verhindern. Um optimale Bedingungen zur Bildung von DNA-Fragmenten zwischen 30–45 Kb zu etablieren, die für die Cosmidclonierung nötig sind, wurde chromosomale DNA von BS-203 mit hohem Molekulargewicht mit verschiedenen Mengen an Sau3AI für eine Stunde bei 37°C gespalten. Sau3AI erkennt die 4-Basenpaar(bp)-Sequenz GATC und erzeugt kohäsive Enden, die an kohäsive BamHI-Enden ligiert werden können. Eine Enzymkonzentration von 0,016 Einheiten/μg DNA ergab die größte Konzentration an DNA-Fragmenten im 30–45 Kb-Bereich. Diese Bedingungen wurden verwendet, um eine große Menge an teilweise gespaltener BS-203-DNA zu erzeugen. Die DNA wurde durch einen 10–40% Saccharosegradienten fraktioniert, um DNA-Fragmente zwischen 30–45 Kb anzureichern. Fraktionen (0,4 ml) wurden gesammelt und jede dritte Fraktion wurde durch Elektrophorese auf einem 0,4% Agarosegel analysiert. Fraktionen, welche Fragmente in der richtigen Größe enthielten, wurden vereinigt und zweimal ethanolpräzipitiert. Eine endgültige Analyse durch Agarosegelelektrophorese zeigte, dass die DNA in der richtigen Größe zur Cosmidclonierung war.
Die angereicherten BS-203-DNA-Fragmente (30–45 Kb) wurden bei 22°C für 16 Stunden mit T4 DNA-Ligase (BRL) an mit BamHI gespaltenem pWB70 ligiert. Folgend den Anleitungen des Herstellers wurde das Ligierungsgemisch in vitro unter Verwendung des Gigaspack II Gold^TM-Kits (Stratagene) verpackt. Die Transfektanten wurden auf LB-Agar selektiert, der 30 μg/ml Neomycin enthielt. Die Verpackungseffizienz war etwa 7,2 × 10³ Transfektanten/μg an Insertions-DNA.
Kolonienblots der genomischen Cosimdbank von BS-203 wurden erzeugt, um auf das Glutaryl-7-ACA-Amidasegen zu durchmustern. Transfektanten wurden auf einen 82-mm, 0,45-μm-Nitrocellulosefilter (Schleicher & Schüll) transferiert. Die Transfektanten wurden dann durch Transferierung der Filter auf eine LB-Agarplatte amplifiziert, die 170 μg/ml Chloramphenicol enthielt, und bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. Die DNA wurde durch Transferieren der Filter (Seite mit Kolonien nach oben) auf 3MM-Papier an die Filter gebunden, welches mit den folgenden Lösungen gesättigt war: 10% SDS für 3 Minuten, 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl für 5 Minuten, 1,5 M NaCl/0,5 M Tris-CI pH-Wert 7,5 für 5 Minuten und 2 × SSPE für 5 Minuten. Die Filter wurden für 30 Minuten luftgetrocknet und dann bei 80°C für 30 Minuten in einem Vakuumofen gebacken. Um die bakteriellen Trümmer zu entfernen, wurde der Filter für 30 Minuten bei 42°C in 1 × SSPE/0,5% SDS/50 μg/ml Proteinease K inkubiert. Die bakteriellen Trümmer wurden durch sanftes Reiben des Filters mit einem behandschuhten Finger, in 2 × SSPE/0,1%SDS, vorgeheizt auf 65°C, entfernt. Der Filter wurde dann zweimal in 2 × SSPE für jeweils 5 Minuten gewaschen, luftgetrocknet und bis zur Hybridisierung zugedeckt.
C. Auswahl der Clone, welche das Glutaryl-Cephalosporin-Amidasegen enthielten
16 degenerierte 17-mer-Oligonucleotidsonden, abgeleitet von der Aminosäuresequenz der Glutaryl-7-ACA-Amidase, wurden mit einem Applied Biosystems 391 DNA Synthesizer PCR-MATE^TM (2) synthetisiert, mit [γ-³²P]-ATP (Amersham) endmarkiert und verwendet, um einen Southern-Blot (Southern, E. M. 1975, J. Mol. Biol. 98: 503–517) von chromosomaler BS-203-DNA, welche mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und PstI gespalten war, zu durchsuchen. Die Hybridisierung wurde in 4 × SSPE, 10% PEG 6000, 0,5% SDS, 5 × Denhardt (0,1% FicoII, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Rinderserumalbumin) und 50 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA-Puffer bei 42°C für 72 Stunden durchgeführt. Die Waschbedingungen der Hybridisierung waren wie folgt: zweimal in 5 × SSPE/0,1% SDS bei 20–25°C (Raumtemperatur) für jeweils 5 Minuten, zweimal in 5 × SSPE/0,1% SDS bei 45°C für jeweils 5 Minuten und zweimal in 5 × SSPE bei 20–25°C für jeweils 5 Minuten. Neun dieser Sonden hybridisierten an die Southern-Blots. Von diesen neun Sonden wurden vier ausgewählt, um die Kolonieblots der genomischen Cosmidbank zu durchmustern. Jede Sonde wurde unter Verwendung der gleichen Hybridisierungs- und Waschbedingungen wie vorstehend verwendet, um vier Kolonieblots zu durchmustern, die je etwa 200 Transfektanten enthielten, außer dass die Hybridisierungszeit auf 48 Stunden verkürzt wurde. Zwölf Transfektanten, identifiziert mit Sonde #3 (SEQ ID NR: 8) und Sonde #7 (SEQ ID NR: 12), wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Plasmid-DNA wurde von jeder Transfektante unter Verwendung des TELT-Mini-Prep-Verfahrens (He et al., 1990, Nucl. Acids Res., 18:1660) isoliert. Southern-Analyse dieser Clone identifizierte fünf Cosmidclone, welche an beide 17-mer-Oligonucleotidsonden und an eine 77-Basen-Guess-mer-Sonde (Lathe, R., 1985, J. Mol. Biol. 183: 1–12) hybridisierte. Die 77-Basen-Guess-mer-Sonde (3) wurde basierend auf der in 2 beschriebenen Aminosäuresequenz entworfen und synthetisiert. Die Hybridisierung wurde in 2 × SSC, 5 × Denhardt, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturiertem Lachssperma-DNA-Puffer bei 50°C für 48 Stunden durchgeführt. Die Waschbedingungen der Hybridisierung waren wie folgt: zweimal in 2 × SSC/0,5% SDS bei 20–25°C für jeweils 10 Minuten, einmal in 2 × SSC/0,5% SDS bei 60°C für 20 Minuten und einmal in 2 × SSC bei 20–25°C für 5 Minuten. Diese fünf Cosmidclone wurden weiter auf Glutaryl-7-ACA-Amidaseaktivität untersucht. Drei zeigten eine erhebliche Menge an Aktivität und Clon 7.10 zeigte die höchste.
Aufgrund seiner günstigen Größe wurde ein 2,3-Kb-PstI-Fragment vom Cosmidclon 7.10 isoliert, welcher an die Oligonucleotidsonde hybridisiert hatte, und in den Bakteriophagen M13mp-Vektor subcloniert, welcher mit PstI gespalten und mit BAP dephosphoryliert worden war. Die Nucleotidsequenzierung des 2,3-Kb-PstI-Fragments des Cosmidclons 7.10 identifizierte die Sequenzen, die komplementär zu den 17-mer- und 77-Basen-Guess-mer-Sonden waren, welche zur Identifizierung des Gens verwendet wurden. Translation der angrenzenden DNA-Sequenz erzeugte eine Aminosäuresequenz, welche identisch zu den früher bestimmten Aminosäuresequenzen (2 und 3) war.
Die Translation der Nucleotidsequenz des gesamtem 2,3-Kb-PstI-Fragments zeigte, dass das 3'-Ende des Glutaryl-7-ACA-Amidasegens fehlte. Daher musste das 3'-Ende subcloniert werden, um das 3'-Ende des Gens zu sequenzieren und das Volllängengen zu rekonstruieren. Die Sequenzierung hatte, etwa 100 Basenpaare stromaufwärts von der Translations-Startstelle, eine HindIII-Stelle identifiziert. Es wurde daher vom Cosmidclon 7.10, der sowohl an die 17-mer-Oligonucleotidsonde als auch an die 77-Basen-Guess-mer-Sonde hybridisierte, ein 11-Kb-HindIII-Fragment isoliert und in pUC19 subcloniert, welches mit HindIII gespalten worden war. Die Transformanten wurden durchmustert und einer wurde für weitere Untersuchung ausgewählt. Um den nicht-codierenden Bereich des 3'-Terminus dieses Clons zurechtzuschneiden, der das 11-Kb-HindIII-Fragment enthielt, wurde der Clon ganz mit BamHI gespalten und dann teilweise mit Sau3AI gespalten. Aliquots wurden bei 5, 10 und 20 Minuten entnommen, vereinigt und auf einem präparativen Agarosegel der Elektrophorese unterzogen. Ein 4,8-5,8-Kb-Bereich wurde vom Gel ausgeschnitten und isoliert. Das 4,8-5,8-Kb-Fragment wurde wieder mit sich selbst ligiert und verwendet, um DH5α-Zellen zu transformieren. Mini-Prep-DNA wurde von 12 Transformanten präpariert und über EcoRI-Spaltungen durchmustert. Clon #6 enthielt ein 1,8-kb-EcoRI-Fragment, welches zusätzliche 1000 Basen der Sequenz stromabwärts der PstI-Stelle enthielt. Dieses Fragment wurde isoliert, in M13mp19 cloniert und verwendet, um das 3'-Ende des Gens zu sequenzieren.
D. Bestimmung der Nucleotidsequenz
Die Nucleotidsequenz des Glutaryl-7-ACA-Amidasegens, welches auf den 2,3-Kb-PstI- und den 1,8-Kb-EcoRI-Fragmenten codiert ist, wurde durch das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467) unter Verwendung des TAQ TRACK^TM-Sequenziersystems (Promega) bestimmt. Zwei Clone wurden identifiziert, welche das 2,3-Kb-PstI-Fragment in entgegengesetzter Richtung enthielten. Eine Reihe von unidirektionalen, ineinander gesetzte Deletionen von einem Ende der Insertion wurde unter Verwendung von Exonuclease III erzeugt. Einzelsträngige DNA (M13 Cloning/Dideoxy Sequencing Instruction Manual, Bethesda Research Laboratories Life Technologies, Inc., Form #19541: 44–49) wurde von den Deletionen isoliert und zum Sequenzieren verwendet. Einzelsträngige DNA wurde auch von dem 1,8-Kb-EcoRI-Fragment, in M13mp19 cloniert, isoliert und verwendet, um das 3'-Ende des Gens zu sequenzieren. Der M13 (-20) Primer 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' (SEQ ID NR: 23) (Stratagene) und synthetisierte interne Primer wurden verwendet, um das gesamte Gen von beiden Strängen zu sequenzieren. Elektrophorese wurde auf einem 8% Polyacrylamidgel, welches 8 M Harnstoff in TBE (0,089 M Tris-Borat, 0,089 M Borsäure, 0,002 M EDTA)-Puffer enthielt und einem 5% HYDROLINK LONG RANGER^TM (FMC BioProducts, USA) Polyacrylamidgel, welches 7 M Harnstoff in TBE-Puffer enthielt, bei 2700 Volt durchgeführt.
Die gesamte Nucleotidsequenz wird in 4 gezeigt. Der codierende Bereich ist 1701 bp lang und codiert ein 567-Aminosäurenprotein (MCW = 60 kD). Die Sequenzen komplementär zu dem 17-mer-und dem 77-Basen-Guess-mer-Sonden, die verwendet wurden, um das Gen zu identifizieren, sind in 4 unterstrichen.
Die von der Translation der DNA-Sequenz bestimmte Proteinsequenz (SEQ ID NR: 2) enthält Aminosäuresequenzen, welche identisch zu den in den 2 und 3 identifizierten Aminosäuresequenzen sind.
Beispiel 4: Glutaryl-7-ACA-Amidase-Subclonierung und -Expression in E. coli
Um die Subclonierung des Glutaryl-7-ACA-Amidasegens in die Plasmidvektoren zur Enzymexpression in E. coli zu erleichtern, wurde die Oligonucleotid-gerichtete ortsspezifische Mutagenese auf dem genomischen Clon der Glutaryl-7-ACA-Amidase durchgeführt, um eine Restriktionsenzymstelle am Translationsinititationscodon (ATG) des Gens unter Nutzung des Verfahrens von Morinaga (Morinaga et al., 1984, Bio/Technology 7: 636–639) einzuführen. Das synthetische Oligonucleotidmutagen, welches einen Einzelbasenaustausch (A nach T) enthält, der eine BspHI-Stelle (TCATGA) erzeugt, wird nachstehend dargestellt:

a) eine Glutaryl-7-ACA-Amidasesequenz, die mutiert werden soll:
b) synthetisches Oligonucleotid (21 mer):

Erfolgreich mutagenisierte Glutaryl-7-ACA-Amidase-DNA wurde durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym BspHI identifiziert und durch DNA-Sequenzanalyse bestätigt. Das Glutaryl-7-ACA-Amidasegen wurde dann vom Plasmid mit dem genomischen Clon durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen BspHI und BamHI isoliert, in das E. coli-Expressionsplasmid pBMS2000 (1) ligiert und in den E. coli-Stamm BL21 transformiert. Rekombinante Kulturen, die auf LB-Agar-Platten (1% Bactotrypton, 0,5% NaCl, 0,5% Hefeextrakt und 1,5% Agar, der mit 30 μg/ml Neomycin ergänzt war) selektiert wurden, wurden in LB-Medium mit 30 μg/ml Neomycin gezüchtet und während des exponentiellen Wachstums mit 60 μM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) für vier Stunden induziert. Lysate von IPTG-induziertem rekombinantem E. coli BL21, welche Plasmid pBMS2000/GCA beinhalteten, wandelten Glutaryl-7-ACA erfolgreich in 7-Aminocephalosporansäure um, was auf aktive enzymatische Aktivität von Glutaryl-7-ACA-Amidase hinweist (nicht transformierter BL21 wies keine Glutaryl-7-ACA-Amidaseaktivität auf). Die gleichen Lysate, welche einer SDS-PAGE (reduziert)-Analyse unterzogen wurden, offenbarten neue Proteinbänder von 26 und 42 Kilodaltons (kD), welche mit der kleinen und großen Untereinheit der Glutaryl-7-ACA-Amidase übereinstimmten.
Für Produktion im größeren Maßstab wird ein bevorzugter Fermentationsvorgang wie folgt durchgeführt: der rekombinante E. coli BL21 wird in einem Medium gezüchtet, welches Dikaliumphosphat 3 g/l; Monokaliumphosphat 2 g/l; Magnesiumsulfat 2 g/l; Hefeextrakt 3 g/l; Ammoniumsulfat 0,5 g/l; Eisen(II)-Sulfat 0,03 g/l; und Kanamycin 0,03 g/l enthält. Die Fermentation wird bei 30°C mit einem Luftstrom von 1.0 WM @ 7 PSIG durchgeführt; der pH-Wert wird mit Ammoniakgas bei 7,0 gehalten. Die Kultur wird mit einer Lösung von 20% Casein-Hydrolysat und 20% Glucose versorgt, um eine lineare Wachstumsgeschwindigkeit beizubehalten. Amidaseproduktion wird mit 150 μM IPTG nach 10 Stunden Fermentation induziert. Die Fermentation wird gestoppt, wenn der Amidase-Titer ein Maximum erreicht, üblicherweise bei einer Zelldichte von ungefähr 40 Gramm pro Liter (Zell-Trockengewicht) nach ungefähr 45 Stunden. Die gesamte Brühe wird homogenisiert, um Amidase freizusetzen, und durch Filtration geklärt.
Zur Immobilisierung des Enzyms ist ein bevorzugtes Verfahren, das aktive Filtrat mit 5% Diatomeenerde, 0,5% Polyallylamin und 0,2% Polyethylenimin zu behandeln. Das Gemisch wird dann mit 0,15% Glutaraldehyd bei pH-Wert 8,0 behandelt, um die Amidase auf Kieselerde zu immobilisieren. Die Amidase kann dann durch Filtration wiedergefunden werden.
Die immobilisierte Amidase kann verwendet werden, um Glutaryl-7-ACA durch Rühren einer wässrigen Suspension bei 4°C, wobei der pH-Wert mit Ammoniak bei 9,0 gehalten wird, in 7-ACA umzuwandeln, wobei die Substratkonzentration 100 g/l Glutaryl-7-ACA-Amidase ist. Die Ausbeute ist ungefähr 90% mit einer Massenbilanz von 95%.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nucleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nucleinsäure, die Glutaryl-7-ACA-Amidase mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 codiert; (b) der Nucleinsäure gemäß (a), wobei die Nucleinsäure aus der Sequenz von SEQ ID NO: 1 besteht; (c) einer Nucleinsäure, die eine Glutaryl-7-ACA-Amidase mit den folgenden Eigenschaften codiert: isolierbar aus Pseudonomas diminuta BS-203 (ATCC PTA-2517), katalysiert die Hydrolyse von 7-β-(4-Carboxybutanamido)-cephalosporansäure zu 7-Aminocephalosporansäure und Glutarsäure und ist zusammengesetzt aus zwei Untereinheiten mit offensichtlichen Molekulargewichten von 42 kD und 26 kD gemäß SDS-PAGE-Elektrophorese; (d) der Nucleinsäure, die Glutaryl-7-ACA-Amidase gemäß (c) codiert, wobei die Amidase die in SEQ ID NO: 2 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst; (e) der Nucleinsäure, die die Glutaryl-7-ACA-Amidase gemäß (c) codiert, wobei die Amidase aus der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz besteht; (f) einer Nucleinsäure, die eine Glutaryl-7-ACA-Amidase mit mindestens 80% Identität zur Amidase von (e) codiert; (g) einer Nucleinsäure, die die Glutaryl-7-ACA-Amidase gemäß (f) codiert, wobei die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 mit bis zu 113 konservierten Aminosäureaustauschen umfasst; und (h) der Nucleinsäure, die die Glutaryl-7-ACA-Amidase gemäß (f) codiert, wobei die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 mit der Hinzufügung oder Deletion von bis zu 20 Aminosäureresten umfasst.
Vektor, umfassend eine Nucleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1.
Wirtszelle, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 2 transformiert ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 3, wobei die Wirtszelle ein Bakterium ist.
Verfahren zur Herstellung der Glutaryl-7-ACA-Amidase gemäß Anspruch 7 aus Pseudonomas diminuta BS-203, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Züchten des Pseudonomas diminuta BS-203-Bakteriums (ATCC PTA-2517) unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Medium; und (b) das Gewinnen einer Proteinfraktion mit Glutaryl-7-ACA-Amidase-Aktivität von der erhaltenen Kultur.
Verfahren zur Herstellung einer Glutaryl-7-ACA-Amidase, wobei das Verfahren umfasst: (a) das Züchten von Wirtszellen gemäß Anspruch 3 unter Bedingungen, die für die Expression der Glutaryl-7-ACA-Amidase geeignet sind; und (b) das Gewinnen einer Proteinfraktion mit Glutaryl-7-ACA-Amidase-Aktivität aus der erhaltenen Kultur.
Glutaryl-7-ACA-Amidase, die durch die Nucleinsäure gemäß Anspruch 1 codiert wird, oder erhältlich durch das Verfahren gemäß Anspruch 6.
Glutaryl-7-ACA-Amidase gemäß Anspruch 7, wobei die Glutaryl-7-ACA-Amidase auf einem unlöslichen Träger immobilisiert ist.
Verfahren zum Erhalten von 7-Aminocephalosporansäure aus 7-β-(Acylamido)-cephalosporansäure, umfassend das Inkontaktbringen einer 7-β-(Acylamido)-cephalosporansäure mit der Glutaryl-7-ACA-Amidase gemäß Anspruch 7 oder 8 in einem geeigneten Lösungsmittel.
Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die 7-β-(Acylamido)-cephalosporansäure 7-β-(4-Carboxybutanamido)-cephalosporansäure ist.
Verfahren zum Erhalten von Desacetyl-7-aminocephalosporansäure aus einer Desacetyl-7-β-(acylamido)-cephalosporansäure, umfassend das Inkontaktbringen einer Desacetyl-7-β-(acylamido)-cephalosporansäure mit der Glutaryl-7-ACA-Amidase gemäß Anspruch 7 oder 8 in einem geeigneten Lösungsmittel.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Desacetyl-7-β-(acylamido)-cephalosporansäure Desacetyl-7-β-(4-carboxybutanamido)-cephalosporansäure ist.
Verwendung einer Nucleinsäure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nucleinsäure mit zwischen 10 und 1722 Nucleotiden, die unter stringenten Bedingungen entweder an ein DNA-Molekül bestehend aus SEQ ID NO: 1 oder an ein DNA-Molekül bestehend aus dem Gegenstrang von SEQ ID NO: 1 hybridisiert; (b) der Nucleinsäure gemäß (a), wobei die Nucleinsäure zwischen 17 und 1722 Nucleotide lang ist; und (c) der Nucleinsäure gemäß (a), wobei die Nucleinsäure zwischen 20 und 1722 Nucleotide lang ist; für den Nachweis der Sequenz von SEQ ID NO: 1.