JPS589680B2 - アミノカゴウブツノ セイホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般式 （この式においてＲは低級アルキル基、例えばエチル基
、イソプロビル基、ｎ−プロピル基、第３ブチル基、ま
たは特にメチル基である）で表わされるアミン化合物の
製法に関する。

この化合物は治療に使用できる化合物、特に例えば南ア
特許第４ ０ ５ ０／７ ３号に記載されているよう
な相当するＮ−アシル誘導体、例えば７−（Ｄ−α−ア
ミノーα−フエニルアセトアミド）−３−メトキシセフ
−３−エムー４−カルボン酸の製造にとって価値のある
原料である。

本発明方法は、アシラーゼ活性のある微生物またはアシ
ラーゼ含有抽出物またはアシラーゼ自体を、水溶液中に
おいて、一般式 （この式においてＲは前記の意味を持ち、Ｒ１はフエニ
ルアセチル基又はフエノキシアセチル基である） で表わされる化合物に作用させ、この溶液から一般式（
１）で表わされる化合物を単離することを特徴とするも
のである。

一般式（ＩＩ）で表わされる化合物において、Ｒ１は脂
肪族性の１価または２価カルボン酸のアシル基、例えば
脂肪族、脂環式、芳香脂肪族または複素環式脂肪族カル
ボン酸のアシル基、特にアルキル基またはアルケニル基
が酸素またはいおうで中断されていることのあるような
低級アルカン酸または低級アルケン酸のアシル基、アリ
ールー、アリールオキシーまたはアリールチオー低級ア
ルカン酸（ここでアリール基は特にフエニル基または例
えばヒドロキシ基、低級アルキル基または低級アルコキ
シ基によって置換されているフエニル基であり、低級ア
ルカン酸は特に酢酸である）のアシル基、主に天然に産
出するペニシリンのアシル基、例えばヘプクンー、ヘキ
サンーまたはペンクンカルボン酸、ペンテン−２−カル
ボン酸、プチルチオ酢酸、アリルチオ酢酸、フエニルチ
オ酢酸、Ｐ−ヒドロキシフエニル酢酸、特にフエニル酢
酸およびフエニルオキシ酢酸のアシル基である。

従って一般式（ＩＩ）においてＲがメチル基であり、Ｒ
１がフエニルアセチル基またはフエノキシアセチル基で
あるような化合物から出発するのが好ましい。

アシラーゼ活性のある微生物、またはこれから得られる
抽出物または多少とも精製されたアシラーゼ、およびア
シラーゼ活性の測定法およびアシラーゼの取得法は公知
である。

これらは例えばＥ１Ｈ − Ｆｌｙｎｎ著’ Ｃｅｐｈ
ａｌｏｓｐａｒｉｎ ａｎｄ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ
“、アカデミック・プレス、ニューヨークおよびロンド
ン、１９７２、２９〜３７および４２１〜２２頁、また
はＭ − Ｃｏｌｅの出版物’ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉ−ｓｔｒｙ”、１９６７、３５〜４６頁お
よびＮｆｆｉｅｓｃｈ等によるＰａｔｈｏｌ、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．３ ０， ８ ８ ０ （ １ ９ ６
７ ）に記載されている。

周知のとおり、２つの型のアシラーゼ、すなわち、ペニ
シリンＧを極めて迅速に脱アシル化するがペニシリン■
はそれほど迅速には脱アシル化しない細菌起源（バクテ
リア及びノカルディア）のアシラーゼ、ならびにペニシ
リンＧよりもペニシリンＶを迅速に脱アシル化する真菌
類、たとえば、ペニシリウムもしくはセファロスポリウ
ム（酵母及び連鎖球菌を含む）から得られるアシラーゼ
がある。

同様にしてこのアシラーゼは相当するアシル基Ｒ１を持
つ一般式（ＩＩ）で表わされる化合物の脱アシル化に使
用することができる。

ペニシリンＧのアシル基、すなわちフエニルアセチル基
を持った化合物の脱アシル化に特に適しているアシラー
ゼ含有微生物としては大腸菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ ）、バチルス・サブチリス（ Ｂａｃ−
ｉ１１ｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ ）、バチルス・メガ
テリウム（ Ｂａｃｉｌｌ−ｕｅ ｍｅｇａｔｈｅｒｉ
ｕｍ ）、更にミクロコクス・ロゼウス（ Ｍｉｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｒｏｓｅｕｓ ）、ミクロコクス゜リソ
デイクチクス（ Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｙｓｏｄ
ｅｉｋｔｉｃｕｓ ）、アルカリゲネス・フエカリス（
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エア
０／＜クテル０クロアセ（ Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃ
ｌｏａｃａｅ ）およびノカルジア（ Ｎｏｃａｒｄｉ
ａ ）、またペニシリンＶのアシル基すなわちフエニル
オキシアセチル基を持った化合物の脱アシル化にはフサ
リウム（Ｆｕ−３ａｒｉｕｍ ）、例えばフサリウム・
アベナセウム（ Ｆｕｓａ−ｒｉｕｍ ａｖｅｎａｃｅ
ｕｍ ）、フサリウム・セミテクトム（Ｆ＋ｒｓａｒｉ
ｕｍ ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ ）、エメリセロプシス・
ミニマ（ Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌｏｐｓｉｓ ｍｉｎｉｍ
ａ ）、ペニシリウム゜クリソゲヌム（ Ｐｅｎｉｃｉ
ｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ）、アスペルギ
゛ルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｃ
ｈｒａｃｅｕｓ ）、セファロスポリウム（ Ｃｅｐｈ
ａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ ） ｓｐ ．ＣＭ Ｉ４９１３
７、トリコフイトン例えばトリコフイトン・メンクグロ
フイテス（ Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇ
−ｒｏｐｈｙｔｅｓ ） 、エビテルモフイトン・フロ
コスム（Ｅｐ−ｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃ
ｏｓｕｍ ）、ストレプトミセス例えばストレプトミセ
ス・ラベンデュラ（ Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｍｙｃｅｓ ｌ
ａｖｅｎｄｕｌａｅ ）が挙げられる。

微生物の沈殿物（常法により培養することによって得た
もの）または細胞物質から得られるアシラーゼ抽出物ま
たは精製アシラーゼと一般式（Ｉ）で表わされる化合物
とを水溶液中で互いに作用させる。

この際にアシラーゼは固体担体、例えばけいそう土、シ
リカゲル、バン士、酸化アルミニウム、カオリン、りん
酸カルシウム、カルボキシメチルセルロース、ＤＥＡＥ
−セルロース、ＴＥＡＥ−セルロース、カルボキシメチ
ルデキストランまたはポリスチレン上に存在させること
ができる。

所望により、固体担体上での反応を連続的に行うことが
できる。

溶液のｐＨおよび反応温度は使用するアシラーゼの種類
によってきまる。

これらの反応条件は例えばＦｌｙｎｎの書物の第３４〜
３５頁の表から知ることができる。

脱アシル化が終了した後（９６時間まで）、場合により
細胞物質を分離し、一般式（Ｉ）で表わされる化合物を
それ自体公知の方法により、例えば沈降、蒸発（凍結乾
燥）またはクロマトグラフイーにより溶液から単離する
ことができる。

所望により、一般式（１）で表わされる化合物を含有し
ている溶液は、例えば適当なアシル化剤で処理すること
により所望の治療に有効な製品の製造に直接用いること
ができる。

このアシル化は微生物学的方法により、例えばベルギー
特許第７８７７９３号明細書に記載されているのと同様
にして行うことができる。

以下の実施例によって本発明を更に詳しく説明する。

例１ ペプトン４ｇ、肉エキス４ｇおよび塩化ナトリウム４ｇ
を水道水で２００ｍｌにして得た殺菌培養溶液（殺菌後
のｐＨは６．５〜７）に大腸菌ＡＴＣＣ９６３７を接種
し、この懸濁物を５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ
に入れて毎分２５０回の速度で振動機により２６℃で１
８時間振動する。

次にこの懸濁物１ｒｒＬｌを、上記培養溶液２００ｍｌ
とフエニル酢酸２０■を含有している別の容量５００ｍ
Ａのエルレンマイヤーフラスコに移し、この懸濁物を再
び２６℃で振動機により２５０回／分で振動し、２４時
間これを行う。

次に９ ０ ０ Ｏ ｒｐｍおよび０℃で１５分間遠心
分離し、上澄み液を捨て、沈殿物をｐＨ７の０．１Ｍり
ん酸塩緩衝液に懸濁させ、９０００ｒｐｍで０℃で更に
１５分間遠心分離し、上澄み液を再び捨て、沈殿物をり
ん酸塩緩衝液に懸濁させ、次に遠心分離する。

湿った細胞物質５ ０ ０ｍ９をりん酸塩緩衝液（ ｐ
Ｈ７ ）１ ０ｍｌおよび７−フエニルアセトアミド−
３−メトキシセフ−３−エムー４−カルボン酸５ｍ９と
共に容量５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で懸
濁させ、３０℃の水溶で１５分間振動する。

次に９ ０ ０ ０ ｒｐｍで１５分間遠心分離する。

この水溶液は７−アミノー３−メトキシセフ−３−エム
ー４−カルボン酸を含有している。

この物質はセルロース上薄層クロマトグラムで次のＲｆ
値を示す：（系：ｎブタノールー酢酸一水；１１：３：
７）Ｒｆ＝０．５１；（系二イソフ０ロパノーノレーぎ
酸一水；７４：４二１９）Ｒｆ＝０．３３。

これらのＲｆ値は、それぞれ、標準物質７−アミノー３
−メトキシセフ−３−エムー４−カルボン酸のＲｆ値と
同一であり、この結果から、この例における反応生成物
が７−アミノー３−メトキシセフー３−エムー４−カル
ボン酸であることが確認された。

さらに、７−アミノー３−メトキシセフ−３−エムー４
−カルボン酸は抗菌活性を有しないのに対してこの化合
物のフエニルアセチル誘導体は抗菌活性を有するという
事実及び、この例により得られた抗菌活性を有しない化
合物をフエニルアセチル誘導体に変えることによって抗
菌活性を有するに至るという事実からも、この例の生成
物が７−アミノー３−メトキシセフ−３−エムー４−カ
ルボン酸であることが確認できる。

すなわち、ホワツトマンＮｏ１円形ろ紙（径６ｍｍ）を
標準溶液（７−フエニルアセトアミドセフ−３−エムー
４−カルボン酸０．５■／りん酸塩緩衝液１ｍｌを含有
している）または上記試験溶液中に浸せきし、次に針に
刺し、次の液を順次噴霧する。

すなわち１．アセトン中ピリジン１０％溶液、２．アセ
トン中フエニルアセチルクロライド２％溶液、３．アセ
トン中ピリジン１０％溶液。

次に、バチルス・サブチリスＡＴＣＣ６６３３を接種し
た平板に置く。

３７℃で一晩培養する。

標準溶液中には径２２關の阻止区域ができ、フエニルア
セチル化した試験溶液では径１２ｍｍの阻止区域ができ
る。

フエニルアセチル化してない試験溶液では阻止区域がで
きない。

例２ ペプトン５０ｇ、肉エキス５０ｇ、塩化ナトリウム５０
ｇから成り水道水で５ ０ ０ｍｌにした殺菌培養溶液
で大腸菌ＡＴＣＣ９６３７を２６℃および１８０回／分
で振動しながら約３９時間培養する。

６６０ｍｍで約２．０の光学濃度（希釈度１０％で測定
）で細胞を遠心分離し、ｐＨ７の０．０６−Ｍりん酸塩
緩衝液１００ｍｌで２回洗浄し、次にＸ＝プレス（ Ｂ
ｉｏｘ Ａ Ｂ社、Ｎａｃｋａ−スエーデン）によりほ
ぐす。

破砕した細胞をりん酸塩緩衝液ｐＨ７で抽出し、次に不
透明残さ（粗抽出物）から細胞屑を遠心分離する。

こうして得た粗抽出物を固体硫酸アンモニウムで分別沈
殿する。

４５〜６５％の硫酸アンモニウム溶液でアシラーゼ活性
を含むフラクションが沈殿し、これを遠心分離により分
離する。

固体残さをｐＨ７の０．０６−Ｍりん酸塩緩衝液１５０
ｍｌに溶解し、この溶液を超遠心分離機で４℃でで１５
時間遠心分離する（１１００００ｇ）。

こうしてアシラーゼが沈殿中に濃縮される。

これをりん酸塩緩衝液（ ｐＨ７ ） １ ５ ０ｍｌ
に溶解し、セファデツクス（ ＳｅｐｈａｄｅＰ） Ｇ
− ２ ０ ０ （分子量５０００〜ｓｏｏｏｏｏの
たん白質用分別範囲を持つ架橋ポリデキストランゲル、
ファルマシア・ファイン・ケミカル社製、ウプラサ）で
ろ過する。

２． ５ ｍｌ宛を捕集する。

フラクション２２（アシラーゼの価１７、ＯＵ／ｍＡ）
は大部分のアシラーゼを含有している。

このフラクション２０ｍｌを７−フエニルアセトアミド
ー３−メトキシセフ−３−エムー４−カルボン酸１００
ｍｌＩの水３０７７ｉｌ中の溶液と混合し、３０℃の水
浴中で１５時間振動する。

次にこの溶液を凍結乾燥し、この凍結乾燥物を水−メタ
ノール混合物４：１混合物に溶解し、２０％りん酸でｐ
Ｈを約４．５にする。

沈殿をろ過し、メタノールおよび次にアセトンで洗浄し
、高度の真空中で乾燥する。

７−アミノー３−メトキシー３−セフー４一エムカルボ
ン酸が分子内塩の形で得られる。

この化合物はシリカゲルの薄層クロマトグラムにおいて
ｎ−ブタノールー酢酸一水６７：１０：２３の系で０．
１６のＲｆ値を示す。

このＲｆ値は、標準物質７−アミノー３−メトキシー３
−セフー４−エムカルボン酸の同一条件におけるＲｆ値
と同一であり、この例の反応生成物が７−アミノー３−
メトキシ−３−セフー４−エムカルボン酸であることを
確認した。

例３ 例１に記載した方法と同様の方法により得たエツセリシ
ア・コリ（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）Ａ
ＴＣＣ９６３７の湿菌体５００ｍｐを、１０ｍｌのリン
酸緩衝液ｐＨ７及び５ｍＩ？の７−フエノキシーアセト
アミドー３−メトキシーセフ−３−エムー４−カルボン
酸を収容した５０ｍｌ容量のエルレンマイヤーフラスコ
に入れて懸濁し、そしてこの懸濁液を入れたフラスコを
３０℃の水浴中で１５時間振とうし、次に、この懸濁液
を９ ０ ０ Ｏ ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。

この水性液は７−アミノー３−メトキシーセフ−３−エ
ムー４−カルボン酸を含んでいた。

この物質のセルロース薄層クロマトクラム上でのＲｆ値
は、ｎ−ブタノール／氷酢酸／水１１：３：７系でＲｆ
＝０．５１でありイソプロパノール／蟻酸／水７４：４
：１９系でＲｆ＝０．３３であった。

既知物質７−アミノー３−メトキシーセフ−３ーエムー
４−カルボン酸のＲｆ値も上記と同一であり、これによ
りこの例の反応生成物が７−アミノー３−メトキシーセ
フ−３−エムー４−カルボン酸であることが確認された
。

例１の場合と同様に、この例の反応生成物をフエノキシ
アセチル誘導体に転化し、この誘導体のパシルス・ズフ
゛チリス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）
ＡＴＣＣ６６３３に対する抗菌活性を、標準物質７−フ
エノキシアセトアミドーセフー３−エムーカルボン酸及
びフエノキシアセチル化されていないこの例の生成物の
抗菌活性と比較した。

例１の場合と同様の結果が得られ、これによっても、こ
の例の生成物が７−アミノー３−メトキシーセフ−３−
エムー４−カルボン酸であることが確認された。

例４ ２０ｍｌの例２に記載した方法によって調製したエツシ
エリシア・コリＡＴＣＣ９６３７からのアシラーゼを含
有するフラクション２２を、３０ｍＡ’の水に１００ｍ
ｇの７−フエノキシアセトアミドー３−メトキシーセフ
−３−エムー４−カルボン酸を溶解した溶液と混合し、
この混合物を３０℃の水浴中で１５分間振とうした。

次にこの溶液を凍結乾燥した。

この凍結乾燥物を４０ｍｌの水・メタノール４：１混液
に入れ、そして、２０％リン酸によりｐＨを約４．５に
調製した。

沈殿をろ取し、メタノール及びアセトンで順次洗浄し、
そして高真空で乾燥した。

７−アミノー３−メトキシー３一セフー４−エムーカル
ボン酸を内塩として得た。

シリカゲル薄層クロマトグラム上で、ｎ−ブタノール／
酢酸／水６７：１０：２３系において、この例において
得られた化合物のＲｆは０．１６であり、この値は標準
物質７−アミノー３−メトキシ−３−セフー４−エムー
カルボン酸のＲｆ値と同一であった、、 なお、例２及び４におけるアシラーゼ活性の測定は次に
記載する公知方法によって行った。

各フラクションのアリコート０．２ｍｌを、５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ ７．５ ） １．８
ｍ．ｌ及びＮＩＰＡＢ溶液〔５０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ７．５に６ｍＭ６−ニトロ−３−フエニルア
セトアミドー安息香酸を溶解し、そして、これに水酸化
ナトリウム溶液を加えてｐＨを７．５に調整したもの）
と、１ｃｍのキュベット中で２５℃にて混合した。

この液の光学濃度の増加を、酵素溶液を含まず緩衝液と
ＮＩＰＡＢ基質とからなるブランクと比較して記録した
。

この測定は、６−ニトロ−３−フエニルアセトアミドー
安息香酸〔θ＝１１４ｌ／ｍｏｌｅ・ｃｍ，５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４ ０ ５ ｎｍ ）の酵
素分解により脱アシル生成物３−アミノー６ー二トロ安
息香酸（θ＝ ９ ０ ９ ０ ｌ／ｍｏｌｅ・ｃｍ、
前記と同条件）が生成することに基礎を置いており、後
者の増加を比色法により測定する。

３ｍｌの被験溶液中で１μｍｏｌｅの基質が加水分解し
た場合吸光の差は２．９９である。

従って、活性Ａはとなる。

ここで、Ｅ１一被験溶液の吸光 Ｅｏ＝ブランク溶液の吸光 ｔ一反応時間（ｍｉｎ） Ｖ一被験溶液の容積（ｍｌ） Ｕ−アシラーセ゛のユニット 以上本発明を詳細に説明したが本発明の態様を具体的に
要約すると次の通りである。

（１）一般式（■）においてＲがメチル基であるような
化合物から出発する特許請求の範囲に記載の方法。

（２）一般式（■）においてＲ１がフエニルアセチル基
であるような化合物から出発する特許請求の範囲に記載
の方法。

（３）大腸菌のアシラーゼを使用する前項（２）に記載
の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式（Ｉ）： 〔式中、Ｒは低級アルキル基を表わす〕 のアミン化合物の製造方法であって、一般式（ｎ） ：
   〔式中、Ｒは前述と同一の意味を有し、そしてＲ，はフ
   エニルアセチル基又はフエノキシアセチル基を表わす〕 の化合物を、それ自体公知の方法によって水性媒体中で
   、アシラーゼ活性のある微生物、アシラーゼ含有抽出物
   またはアシラーゼ自体で処理し、そして溶液からそれ自
   体公知の方法によって一般式（Ｉ）の化合物を単離する
   ことを特徴とする製造方法。