Картофельный агар (, 5 дней). Рос хороший,колонии мопочно-бепого цвета с гладкой и м гкой поверхностью; выпуклые на возвышении, цвет среды не измен етс . Лакмусовое молоко пептонизирует. Нитраты не восстанавливает. Реакции денитрировани отрицательна . Индол образует слабо, образование гидросупьфата положительно . Гидролизует крахмал.. Сильно усваивает цитрат. Усваивает нитраты и соли аммони . Пигмента не образует. рН роста 5-9, оптимальный рН роста 7-8. Оптимальна температура роста 24-З Услови аэробные. Штамм Achramobacie В-4О2-2 депонирован в нвстигуте микробиопогической промышпенности , агенства науки и техники, TEIRM-P № 1095. Штамм был также депонирован в отделе сельского хоз йства научно-исследоватепьс кой спужбы сельского хоз йства под номеромЫРкЬ В-5393. Эти штаммы микроорганизмов или их. ферментные препараты обладают специфической активностью к цефапексину , а также способствуют количественному получению цефалексина нз 7.АДиК и Д-феннлглицина, Ацилируюиие ферменты, вырабатываемые микроорганизмами , получают аэробны кульгивировакием в питательной ср&де, содержащей органический ;-1ЛИ неорганическ источник азота, например пептон, м сной экстракт, кукурузный зксгоакт, дрожжевой экстракт, сухие , соевый бепкавый гидроЕизат, нитраты, соли аммони , источ.никн углерода, например, мелассу, глюкозу , гидропизат крахмала и неорганические соли, а также друпю подходшдке в.ажкые вещества дл стимул ции роста при 2035С в течен;ие 12-48 ч. При промышленном получении примен ю погружное культивирование в аэробных усп ви х. Дл ферментативных реакций использую ферментные препараты, микробные культуры , а та.кже кагивные бактериальные кпетки . сэбраннь;.е после культивировани , ипи их суспензии. Можно примен ть микробные клетки, обработанные химическим или физическим путем, например клетки, высушерп-1ые ацетоном , метбналом, или зганопом, клетки, высушенные посредством аиофильной сушки клетки измельченные или обработанные ультразвуком, изагы клеток, получаемые обработкой буферными растворами или хло ристым цетилпиридилием, очищенные ферменты , полученные известными способами разделени и очистки, например высаливанием , осадитепьным фракционированием, ди пизом, абсорбнионной хроматографией , ионообменной хроматографией или фильтрованием через гель измельченных клеток или клеточных изатов, и твердые ферментные препараты игш ферменты в нерастворимом состо нии, полученные абсорбцией аципирующего фермента или микроорганизмов , которые его вырабатьюают, на инертном носителе, неактивном, или субстрата и не активирующем указанную активность аци- лирующего фермента, причем должна поддерживатьс ацилирующа активность ферменга . Процесс ацилировани может обычно предшествовать реакции 7-АДЦК и фенипглицина или его производного в присутствии аципирующих ферментных препаратов. Примен ют свободную 7-АДЦК концентрацией О,1 20 МГУмл, предпочтительно 2-5 мг/мл, Д-фенилгпицин не вл етс субстратом в виде свободной кислоты, и поэтому можно при.мен ть его активные производные, например амид или эфир низшего спирта, предпочтитепько метиловый эфир. Производные фенилглицина примен ют в количестве, составл ющем 2-20-кратный мол рный избыток по отношению к 7-АДЦК,однако это мол рное соотношение можно измен ть в зависимости от концентрации 7-АДЦК в реакционной смеси , причем более предпочтительна примен ть 6-10-кратный мол рный избыток. Температура реакции может быть приспособлена к оптимальным услови м. Обычно она составл ег 20-45 С, предпочтительно 30-37°С. Можно использовать неподвижную культуру, а также Екзбйлтываемую или перемешиваемую культуру. Значение рН реакционной смеси поддерживаетс в интервалах 5,5-7,5, оптимально 6,0-6,5. Bpeivra реакции может варьировать в зависимости от условий реакЦ .НК, обычно оно 0,5-3 ч, и реакцию можно завершать при достижении получени наибольолего копйчества цефаиексина. При проведении ацилировааи на твердых ферментных препаратах сначала ацилирующий фермент ипк микроорганизм, которые его вырабатывают,, абсорбируют на носителе. В случае эндофермента на носитепе абсорбируют нативные микробные клетки, собранные зкультуры микроорганизмов, вырабатывающих ферменты, или из клеток микроорганизмов , вь сушенных ацетоном или этанолом. Можно также абсорбировать на носителе раствор ацилирующего фермента, экстрагированного из микробных клеток. Носители, примен емые в чпредлагаемом способе, подбирают, учитыва их свойства, а именно:абсорбировать фермент и микробные клетки, не инактивировать активность аципирующего фермента (они не допжны удал ть абсорбированный фермент или микр ные кпетки посредством промывани ).Носитель должен быть инертным дл каждого субстрата и не должен абсорбировать полученный цефалексин. При абсорбировании водных растворов ферментов в качестве но сителей примен ютс активированна окись алюмини , диатомова земп , глина кислог характера, активированна глина, каолин, фосфат кальци , оксиацетат и т. п. Дл абсорбироваки микробных клеток преимущест венно примен ют КМ-целлюлсзу, КМ-сефадекс , ДЭАЭ-целлюпозу, ТЭАЭ-целлюлозу, диатомовую землю и т. п. Контролируют наличие стойкого рН ацилирующего фермента или абсорбировани фермента на носителе. Абсорбцию можно осуществл ть периодически или в колонках. Абсорбцию в колонках рекоме 1дуют дл непрерывного ферментативного процесса. Количество носител можно варьировать в зависимости от количества микробных клеток , ферментативной способности фермента или абсорбционной способности носител . При абсорбции периодического типа количество Еюсител может составл ть 5-20кратный избыток (по объему) от нативных клеток. Дл абсорбции в колонках последнюю ,.заполненную носителем, смачивают водой или буферным раствором, значение р которого соответствует оптимальной величи не дл фермента, пропускают через нее кул туралькый бульон или ферментный раствор. Затем указанную колонку промывают водой или буферным раствором. В результате образуетс твердый ферментный препарат колоночного типа. При абсорбировании микробных клеток на носйТел к суспензии микробных клеток в воде присоедин етс носитель, что может оказывать вли ние на рН, так как абсорбци в сильной степени зависит от ионной сипы. Носитель, абсорбирующий ацилирующий фермент или микробные кпетки, а именно твердый ферментный препарат, может обладать нежелательной способностью ухудщать или тер ть свою активность, если он становитс слишком сухим, поэтому его еледует поддерживать во влажном состо нии. Далее 7-АД1ДК вступает в реакцию с фенилглицином или его производным в присутствии твердого ферментного препарата . Концентраци 7-АДЦК составл ет 0,1-2% (по весу и объему), предпочтитель но, 0,2-1% (по весу и объему), а концентраци фенилглицина или его производного должна в 2-10 раз превышать мол рное количество 7-АДЦК. Реакцию ацилировани провод т при оптимальном значении рН и при температуре активности ферментаЛ-еакцию осуществл ют пропусканием через колонну твердого ферментного препарата, а непрерывную операцию осуществл ют непрерывным добавлением субстрата. Если субстраты обнаруживаютс в вытекающем потоке, то скорость этого потока уменьшают или рециркулируют пропусканием его снова через колонну . При уменьшении или потере активности фермента операцию прекращают. Полученный таким образом цефалексин въщел ют известными способами. Например, реакционную смесь пропускают через анионообменную смолу или активированный уголь, элюируют водным раствором кислоты или смесью органического растворител и воды, после чего концентрируют вытекающий поток , содержащий цефалексин, дл осаждени изоэлектрическим способом. Можно также подкисл ть реакционную смесь до рН 1 добавлением трифторуксусной кислоты, после чего полученную смесь экстрагируют органическим растворителем, например метилизобутилкетоном , что приводит к изоэлектрическому осаждению после растворени в подкисленной воде. Реакционную смесь можно обрабатывать анионообменной смолой в присутствии органического растворител , не смешивающегос с водой, и концентрировать посредством лиофильной сушки водный слой с целью вьщелени цефалексина в виде свободной кислоты. Определ ют цефалексин следующим образом . Испытуемый раствор, содержащий цефалексин , подвергают микробиологическому анализу по бумажно-дисковому или чашечному методу с применением штамма микроорганизма subt4 s PCl-219 в течение 16 ч при 37°С. Измер ют полученную зону ингибировани и подсчитывают силу действи цефалексина с использованием стандартной кривой дл цефалексина. Пример 1. 10О мл водной среды (рН 7,0), содержащей,%: глюкоза 3, дрожжевой экстракт 1, К2НРО О,1,,,0 0,05, КС1 0,5 иТе50,О,001, .стерилизуют при 2О мин. Среду заражают штаммом Achh omobaciev B-402-2NRRL В-5393 ипри возвратно-поступательном взбалтьшании культивируют при 26°С 72ч. Довод т рН культивируемой среды до 6,5 и к ней добавл ют 100 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,5), содержащего 2 мг/мл 7-АДЦК и 20 мг/мл хлоргидрата метилового эфира Д-фенилглици- на, после чего провод т ферментацию при 37° С в течение 3 ч. Выход цефалексина в реакционном фильтрате 10О%. Указанный фппьграт нанос т на ппасгинку из сипикагеп д/ш тонкослойной хроматографии, сочержащую флуоресцентное фещество и про вл ют системой растворите 7ей -н-бутанол: уксусна кнсаота: вода (3:1:1). П р и м е р 2. 1,3 п среды (рН 7,0), содержащей %: гпюкоза 3, дролсжевой экстракт 1, К,НРО 0,1,ЛЛЙ50|-7Н20 О,О5, КС1 0,03 (iTIpSaO.OOl, стерилизуют при Б течсНие 20 мин, раздел ют в асептических усгювн х на порции по 10О мл, помещают в мерную копбу емкостью 500 мп, заражают и.ггамм-ом Achi owoboicte В -4О2-2 н культивируют при возвратно-постуаагепьн ом всзбаг( гывании при 26 С в течение 72 ч. 1 /т культивируемого бупьона центри фугируют, и полученные таким образом впа ьые Нг.пнвкые кпетки промьшают дважды физиологическим сопезым раствором, после чего суспендируют Б 1,2 л и 0,1 М фосфатного буферного раствора (рН 6,5). К попучеьпой суспензии цобав ют 4ОО мгт водного раствора, содерл ашего 5 мг/мл 7-АДЦ и 50 мг/мп хпорги рата метилового эфира Д-фен агаацина, и смесь выдерживают при 37 С в течение 2 ч. Выход цефалекс-кна в реакционной смеси 9S.3%. Л р и м е р 3, 500 мг клеток штамма ИТ DO р га HR 3N а А с ,h i-O i-rt о Ьа с i s i В-4 О 2- 2. NTJRL в виде порошка, высушенног;т ШГ:гэиэм, сусгюидизуют в 100 мп 0.1 Л si crr-BDprj фосфлп ог-э буфера (рН 6,5 К ::);i} U::iH;i:i cy:;iTOHSL;u цз6;,1лл ют 50 мл зоапогэ n:jcrbopa 7-ЛД1.;Г(4 мг/мл) и 5О ;-,;. :одн::го раствора мегйпового эфира Д-чj} м нIГ lиднкa (20 мг/мп). После выдерживс .ни при 37С 3 геч.егп е 2 ч реакционную смесь центрифугируют с образованием вецлнегосло жи костк/сопержащего 12вО/ цбф-пехси а с числом аи гпгровак11 80,3%. У.каза,)-ный верхний слой жидкости загру жают Б колонну, заполненную анионообменной сноаай Довекс 2;пос,че промывани водой дспзод т рК 40О мл выпускаемого растйора до 8,0 и сноза загружают в коггонпу , заполн.энную анионообме чной смолой Довсм с 2, эпюируют 0,15 мопь уксусной к)Слось;. ГСаждую фракцию (п ; имерно 15 мл оце и II ва 1О т г онк осг; ойк ой хр ома т огр афией, собиразот фракции, содержащие цефлпексин, и получают 4.9О мг порошка цефапексина, BijicysiiGtiHoro лиофильной сушкой. Чистота поро1.ка оО%, определ етс анализом, проведеннл-тм с использованием метода ультрафкопетовой спекг.роскопии. Этот высушенный JCipDUiOK подвергают очистке изоэлектрическим осаждением и получают 294 мг белого порошка (выход QO%, чист та 9 8%, общи и выход 88%). П р и м е р 4. 20 л водной среды (рН 7,0), содержащей, %: гпюкоза 3, дрожжевой экстракт 1, KHjPO 0,l,MgSO -7H20 0,05, KCl О,О5 иТеЗО 0,ОО1 ввод т в ферментер емкостью ЗО л, стери/шзуют при 20 мин. Попученный раствор заражают 40О мл культуры штамма микроорганизма Achromobacier В-402-2 NRRU В-5393 СРЕТгМ-Р № 1095),предварительно культивированной в такой же среде, и ультивируют в аэробных услови х при аэации со скоростью 20 л/мин, перемешива о скоростью ЗОО об/мин при 2бС в теение 72 ч. После ферментации бактериальые клетки собирают центрифугированием, промывают дваншы физиологическим солеым раствором и получают 170 г увлажненых нативных клеток. 3 г полученных нативных клеток суспендируют в 1ОО МП 0,1 М раст,вора ацетатного буфера (рН 6,0). Полученную суспензию добавл ют к 180 г ДЭАЭ-целлюлозы в 1,5 п 0,1 М раствора ацетатного буфера при О С при перемешивании. После выдерживани в течение б ч получают ферментный препарат, наход щийс в твердой фазе. Указанный ферментный препарат перемещают в копонну (3,5 х47,5 см) промывают 0,1 М раствором ацетатного буфера (рН6,0), а затем 12 л 0,1 М раствора ацетатного (рН 6,0), содержащего 0,1% 7АДЦК и 0,5% хпоргидрата метиловогоэфирД-фенигтгггицина , пропускают через колонну в течение 24 ч. Полученные таким образо.м 12 л элюага пропускают через колонну, заполненную 120 г активированного угл (7,2x13 см), с целью абсорбции цефалексина, промывают .- и элюируют смесью ацетона и 0,5 н. раствора уксусной кислоты (1:1). 1 л активных фракций, содержащих цефа- пексин, концентрируют под вакуумом и остаток перекристаплиаовывают из смеси воды и ацетонитрила, что приводит к выделению цефалексина, который промывают теплой водой и высушивают. Получают 12,3 г кристаллов с выходом 60%, Псодукт дает одиночное п тно при анализе с использованием тонкослойной хроматографии на сипикагеле. Спектр ЯМР показывает идентичность полученного соединени с контрольным образцом. Чистота продукта 9О%. П р и м е р 5. 40 г нативных клеток, полученных по примеру 4, суспендируют в 30 мл дистиллированной воды, к смеси добавл ют 1 л ацетона и получают 1О клеток, высушенных ацетоном путем фильтровани .
9 16О мг высушенных клеток Acht omobacte B-402-2Nl RLB-5393 (FERM-P№ 1О95) суспендируют в 4 мп 0,1 М раствора ацета ного буфера (рН 6.0) и полученную суспензию добавл ют к 10 р ДЭАЗ-цеппюпозы в 2О МП 0,1 М ацетатного раствора (рН 6,0) при перемешивании. Поспе вьщер- живани в течение 6 ч указанный носитель, абсорбировавший микробные клетки, т.е. твердый ферментный препарат, помещают в колонну, промывают 0,1 М раствором ацетатного буфера (рН 6,0) и через колонну пропускают 1ОО мл 0,1 М раствора ацетатного буфера (рН 6,0), содержащего 0,1% 7-АДЦК и 0,5% хпоргидрата метилового эфира Д фенилглицина, в течение 5 ч. Степень ацилировани , определенна в расчете на количество цефапексина в элюате, 85%. П р и М е р 6. К суспензии 4 г высушен ных клеток Achfomobaciei- В-402-2 FERMP № 1095, полученных по примеру 5, в 5ОО мл 0,1 М раствора ацетатного буфера (рН 6,0) добавл ют 5О мг лизоцима, выдерживают при 37 С в течение 6О ч и к полученной суспензии добавл ют 2 мг дезоксирибонуклеазы и полученную смесь выдерживают при посто нной температуре в течение 10 мин. Реакционную смесь центрифугируют и к 2ОО мл верхнего сло жидкости добавл ют 1О г оксиапатита, а затем выдерживают в течение 1 ч. Твердый ферментный препарат помещаю в колонну и провод т ферментативную реакцию ,описанную в примере 5. Выход получен ного цефалексина 9О%. Пример 7. 6ОО л среды (рН 7,О), содержащей,%,: глюкоза 4, дрожжевой экст ракт 1,2, KgHPO f 0,15,Mg50 H200.05, KCl О,05 иTeSO О,OOljзаражают 30 п
10 посева культуры штамма Achi omobacier B-4O2-2NT -Rb В-5393 и культивируют в погружных услови х при аэрации в теение 72 ч при 26 С. После ферментации бактериальные клетки собирают из 57О л бульона посредством ентрифугировани . Нативные влажные клети , количество которых соответствует 97О г высушенных клеток, суспендируют в 27 л 0,1 М раствора ацетатного буфера (рН6,5), к полученной суспензии добавл ют 1,18 кг 7-АДЦК (чистотой 84,8%) и 30 кг хлоргидрата метилового эфира Д-фенипглицина, а затем добавл ют 0,1 М раствора ацетатного буфера (рН 6,5) до 20О л объема реакционной смеси. Выдерживают смесь при в течение 3 ч при перемешивании. В реакционной смеси определ ют содержание 1,28 кг цефалексина по данным ультрафиолетовой спектроскопии (степень ацилировани 8О%). Раствор центрифугируют и снова фильтруют. К прозрачному раствору добавл ют 4 кг активированного угл и после фильтровани водный слой конденсируют под вакуумом. Получают 1,ОЗ кг цефалексина (выход 64%, чистота 98%). рмула изобретени Способ получени 7- (Д -аминофенилацетамидо )-дезацетоксицефалоспорановой кислоты (цефалексина) ацилировани 7-ами н одезаце т оксицефал осп ор ан о- вой кислоты соединением группы Д-фенил- глицина, отличающийс тем, что, с целью упрощени способа, ацилирование осуществл ют в присутствии ферментного препарата из микроорганизма Achromobade 2-2 N RR t,B-5 39 3.