DK158316B - Fremgangsmaade til fremstilling af 3-substituerede 7-amino-3-cephem-4-carboxylsyrederivater - Google Patents

Description

- 1 -

DK 158316 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til ud fra cephalospo-rinanaloge at fremstille 7-aminocephemforbindelser. Nærmere angivet vedrører opfindelsen mikrobiologisk fremstilling af 3-substituerede 7-amino-3-cephem-4-carboxylsyre-5 derivater med den almene formel I

S

Η .N-/ \ 2 10 CHX· c.n

COOH

hvor X betyder et hydrogenatom, en hydroxy-, acetoxy-, pyridin- eller (5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiogruppe, ^ hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Det har vist sig, at en mikroorganisme tilhørende slægten Comamonas af stammen SY-77-1 isoleret fra jordprøver har evne til at fremstille 7-aminocephemforbindelser ud fra en forbindelse med formlen II

s JR-CCH ) -comi-( A/ cn o Y ch2x

25 COOH

hvor R betyder -COOH eller -COCOOH, og X har samme betydning som ovenfor, ved spaltning af amidbindingen deri.

2Q Den ovennævnte mikroorganisme har følgende taksonomiske egenskaber: A. Morphologi

Iagttagelserne foretages ved hjælp af optisk eller elek-__ trisk mikroskop på agarbouillonskråfladekultur ved 30°C.

OD

1) Form og størrelse: Kort stav, rund ende, 0,1-0,3 x 0,3-0,5 u.

2) Metamorfose: enkelt eller kort kæde, ingen kapsel.

DK 158316B

- 2 - 3) Motilitet: Ja, flagellat.

4) Spore: Ingen sporedannelse.

5) Gram-farvning: Negativ.

6) Syrefasthed: Negativ.

5 B. Vækstbetingelser på forskellige medier 1) Agarbouillonplade (30°C, 24 timer):

Koloni rund, konveks hævning, glat overflade, bølget kant, hvid til svagt gullighvid, svagt klæbende, gen-10 nemskinnelig til opak, ingen dispersion.

2) Agarbouillonskråflade (30°C, 24 timer):

God vækst, lineær vækst, glat overflade, glansfuld, fugtig, opalescerende til svagt gullighvid overflade, gennemskinnelig til opak, medium ingen farveændring.

15 3) Bouillon (30°C, 1-3 dage):

Homogent uklar, sporudfældning, trådagtig suspension ved rystning, ingen film og ring.

4) Gelatinebouillonstikkultur (30°C, 24 timer):

Lineær vækst langs stiklinien, især fra midten til bun-20 den.

5) Sojabønneagarskråflade (30°C, 24 timer):

God vækst, den samme som på agarbouillon, glat overflade, glansfuld.

6) Kartoffelagarskråflade: 25 God vækst, hvid kolonioverflade, glat vækst, svagt klæbrig, gennemskinnelig til opak, fugtig, glansfuld, ingen pigmentdannelse.

7) Lakmusmælk (30°C, 25 dage): Næsten ingen flydendegørelse.

30 8) Glucosebouillonagarskråflade (30°C, 24 timer):

Bedre vækst i sammenligning med agarbouillonskråflade, svagt klæbrig.

9) Glucosenitratagarskråflade (30°C, 1-3 dage): Næsten ingen vækst.

35 10) Tyrosinagarskråflade (30°C, 48 timer): Vækst, mediet bliver svagt brunligt.

- 3 -

DK 158316 B

11) Manitolgærekstraktagarplade (30°C, 48timer):

God vækst, hvid til svagt gul, glat overflade, fugtig, konveks, ingen farveændring af mediet.

12) Bouillonagarplade tilsat 7% NaCl (30°C, 10 dage): 5 Næsten ingen vækst.

13) Glycerinpeptonagarplade 30°C, 3 dage):

God vækst, glat overflade, glartsfuld, konveks, mediet bliver brunt.

14) Mælkeagarplade (30°C, 5 dage): 10 Ingen caseinhydrolyse.

15) Taurocholatagarplade (30°C, 15 dage):

Ingen vækst.

C. Fysiologiske egenskaber 15 1) Nitratreduktion: 2) Denitrificering: 3) Methylrødtprøve: - (gul) 4) Voges-Proskauer's reaktion: + 5) Indoldannelse: 20 6) Hydrogensulfatdannelse: 7) Stivelsehydrolyse: 8) Citratudnyttelse: + 9) Udnyttelse af uorganisk nitrogenkilde: ingen udnyttelse af nitrat 25 10) Pigmentdannelse: afhænger af medium 11) Urease: 12) Oxidase: + 13) Catalase: + 14) Gelatineforflydning: 30 15) Argininhydrolyse: 16) Gluconatoxidation: 17) Vækstområde: vækst: pH 5-12, 5-42°C, optimal vækst: pH 7,0-8,5, 28-35°C.

^ 18) Aerob eller anaerob: aerob - 4 -

DK 158316 B

19) O-F-prøve: ingen ændring ved O-type- og F-type-prøve 20) Forgæring af carbohydrat: 5 syredannelse gasdannelse L-arabinose D-xylose D-glucose D-mannose 10 D-fructose D-galactose

Maltose - -

Saccharose

Lactose 15 Treharose

Sorbitol -

Mannitol

Inositol

Stivelse 20

Ved undersøgelse af den taksononomiske situation for mikroorganismen af stammen SY-77-1 med ovennævnte mykologiske egenskaber med reference til "Manual for the Identification of Medical Bacteria" af Cowan og Steel 25 (udgave 1965) og "Bergey's Manual of Determinative Bacteri ology" (7. udgave 1961) under sammenligning med typekulturer af beslægtede stammer identificeres den som tilhørende slægten Comamonas. Følgelig har man sammenlignet stammen SY-77-1 med typekulturen fra American Type Cul-30 ture Collection (ATCC) og erkendt, at stammen ligner Coma monas terrigena, men adskiller sig fra denne ved, at stammen SY-77-1 har en kraftigere aktivitet til spaltning af amidbindingen i forbindelsen II.

35 Af ovenstående fremgår det, at stammen SY-77-1 er en ny stamme tilhørende slægten Comamonas og betegnet Comamonas sp. SY-77-1. Denne stamme er blevet deponeret under numme- ret "FERM-P 2410" i Research Institute for Microbiological

Industry and Technology, Agency of Industrial Science and

Technology, Japan.

, DK 158316 B

- 5 - 5 Det har også vist sig, at Pseudomonas ovalis ATCC 950 har samme virkning.

Således angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af 7-aminocephemforbindelser med formlen lø Ir i det følgende kaldet aminoforbindelsen I, bestående i deacylering af forbindelsen II ved behandling i nærværelse af et vandigt medium med mikrobekultur eller et præparat deraf med evne til deacylering af forbindelsen II til dannelse af forbindelsen I, hvilket præparat er afledt fra 15 dyrkningen af en mikrobestamme, som danner deacylerings- enzym.

Formålet med opfindelsen er således at anvise en ny mikrobiologisk fremgangsmåde til fremstilling af 7-aminocephem-20 forbindelser ud fra analoge forbindelser af cephalospo rin C.

Aminoforbindelsen I er vigtige mellemprodukter til fremstilling af farmaceutisk værdifulde cephalosporinderivater.

25

Ved deacyleringsreaktionen ifølge den foreliggende opfindelse kan der benyttes mikroorganismer tilhørende stammen Comamonassp. SY-77-1 FERM-P 2410 eller stammen Pseudomonas ovalis ATCC 950 til dannelse af forbindelsen I ud fra 3ø forbindelsen II.

Til opnåelse af højere aktivitet til dannelse af aminoforbindelsen I ud fra forbindelsen II (i det følgende skal denne aktivitet betegnes som N-deacyleringsaktivitet) kan 35 der med fordel anvendes kendte mutationsmetoder til behand ling af bakterier såsom selektiv behandling af stammer med ultraviolet lys, røntgenstråler og mutagene midler og ud-

DK 158316B

- 6 - vælgelse af medier og forgæringsbetingelser.

Dyrkningen af mikroorganismerne kan med fordel udføres ved aerobe betingelser, fortrinsvis ved submers dyrkning med 5 luftning. Næringsmedierne kan omfatte en assimilerbar car- bonkilde, en assimilerbar nitrogenkilde og salte. Dyrkningstemperaturen er fortrinsvis 25-37°C, og dyrkningsperioden er normalt 2-10 dage, og på det tidspunkt, hvor N-dea-cyleringsaktiviteten når maksimum, bør dyrkningen naturlig-10 vis afsluttes.

Den således opnåede mikrobekultur eller et præparat deraf kan benyttes til N-deacyleringsreaktion af forbindelsen II. Præparat af mikrobekulturen vil sige den dyrkede 15 masse, som behandles således, at N-deacyleringsaktiviteten til fortrinsvis fremstilling af aminoforbindelsen I forøges, og den omfatter fx som følge af en endoenzymatisk egenskab af N-deacyleringsaktiviteten, vaskede mikrobeceller indsamlet fra dyrkningsmassen, cellefri ekstrakt 20 såsom formalede eller ultralydbehandlede celler, celle- lysat behandlet med stødpudeopløsning eller cetyl- pyridiniumchlorid, renset eller delvis renset N-deacyle-ringsenzym opnået fra cellefri ekstrakt ved kendte metoder såsom udsaltning, chromatografi eller lignende, immobo-25 liseret enzympræparat eller mikrokapsel indeholdende mikrobeceller eller et præparat deraf med N-deacylerings aktivitet.

Mikrokapslen kan fortrinsvis være en tredimensional struk-30 tur (gelstruktur) bestående af polymer med semipermeabel membranvæg, som ikke inaktiverer N-deacyleringsaktivi- teten, og som indeslutter en kernesubstans af det N-deacy1eringsaktive præparat.

35 Eksempler på indkapslingsmetoder er fx mundingsmetoden, hvor kernesubstansen opløses eller dispergeres i et med vand blandbart opløsningsmiddel, som opløser den semiperme-

DK 158316 B

- 7 - able membran, som danner vægpolymeren i vandigt medium (japansk offentliggørelsesskrift nr. 49-25128); kompleksemulsionsmetoden i vandigt medium som består i opløsning af vægpolymeren i et med vand ikke-blandbart opløsningsmiddel, 5 som har et lavere kogepunkt end vand og et større damptryk end vand, og som ikke inaktiverer N-deacyleringsaktiviteten, efterfulgt af dispergering af en kernesubstans deri og uddrypning af den dispergerede opløsning til suspendering i vandig opløsning indeholdende overfladeaktivt 10 stof eller beskyttelseskolloid og fjernelse af opløsnings midlet fra mikrokapslen (offentliggjort japansk patent-ans.nr. 47-43803, japansk offentliggørelsesskrift nr. 49-49679); mikrokapseldannelse ved opløsningsmiddelfjernelse ved ikke-opløsningsmiddelemulsion, fx dispergering 15 eller opløsning af kernesubstans i et organisk opløsnings middel indeholdende opløst vægpolymer, emulgering af opløsningen i et bærestof, som er dårligt blandbart med opløsningsmidlet for vægpolymeropløsningen, tilsætning til emulsionen af et ikke-opløsningsmiddel for vægpolymeren, idet 20 ikke-opløsningsmidlet er blandbart med opløsningsmidlet for vægpolymeren, men dårligt blandbart eller vanskeligt blandbart med bærestoffet og som ikke modvirker N-deacy-leringsaktiviteten, til dannelse af mikrokapsler (fransk patentskrift nr. 2.166.062) og kompleksemulsionsmetoden i 25 et lipofilt bærestof, fx opløsning af vægpolymeren i et opløsningsmiddel, idet opløsningsmidlet er dårligt blandbart med bærestoffet, men blandbart med vand og har et kogepunkt under vands kogepunkt og ikke har indflydelse på N-deacyleringsaktiviteten. Derefter opløses eller disper-30 geres en kernesubstans i opløsningen, emulgerer den fremkomne opløsning i et bærestof indeholdende flydende paraffin eller en siliconeolie og fjernelse af det organiske opløsningsmiddel til dannelse af en mikrokapsel (USA patentskrift nr. 3.714.065).

N-deacyleringsreaktionen af forbindelsen II foretages normalt i vandigt medium, fortrinsvis ved en pH-værdi på 6-8.

35

DK 158316B

- 8 -

Alternativt benyttes vanduopløselige mikrobeceller eller præparater deraf i form af en suspension eller i form af en søjle, hvori forbindelsen II N-deacyleres medens en vandig opløsning af forbindelsen II passerer gennem søjlen.

5

Reaktionsperioden er normalt 3-30 timer, og den bør afsluttes, når produktionen af aminoforbindelsen I har nået maksimum. Reaktionstemperaturen kan ligge ved 20-45°C, fortrinsvis 30-37°C. Substratkoncentration afhænger af N-acy-10 leringsaktiviteten, og den er normalt 0,1-5%.

Udgangsmaterialet, forbindelserne II, ifølge den foreliggende opfindelse kan fremstilles ved kendte processer. Fx kan forbindelsen II hvori R betyder -C00H fremstilles ud 15 fra forbindelsen med formlen III

-00C >. % / s \ +/ ch(ch2)3.conh i i i [m] K3N * *—N X^·

C00II

20 hvor X har samme betydning som ovenfor, eller salte deraf ved indvirkning af D-aminosyreoxidase afledt af mikroorganismer Trigonopsis variabilis osv. under aerobe betingelser (engelsk patentskrift nr. 1.272.769). Forbindelsen III eller et salt deraf behandles med aktiverede celler af 25 Trigonopsis variabilis eller Fusarium sp. (japansk offent liggørelsesskrift nr. 47-39595 og japansk patentansøgning nr. 49-117205). Forbindelsen II hvori R betyder -COCOOH kan fremstilles ud fra forbindelsen III i nærværelse af catalaseaktivitet og D-aminosyreoxidaseaktivitet.

30

Substituenten X i formlen II betyder et hydrogenatom, en hydroxygruppe, en acetoxygruppe en pyridingruppe eller en (5-methyl-l,3,4-theadiazol-2-yl)-thio-gruppe, hvilken gruppe kan være dannet ud fra cephalosporin C ved en kendt 35 metode. Fx kan en forbindelse III, hvori X betyder et hydrogenatom fremstilles ved katalytisk reduktion i nærværelse af palladiumkul (USA patentskrift nr. 3.124.576).

- 9 -

DK 158316 B

En forbindelse III, hvori X betyder en hydroxygruppe i gruppen X kan fremstilles ved indvirkning af esterase (offentliggjort japansk patentansøgning nr. 42-7553).

5 Forbindelsen II kan benyttes i form af vandopløseligt salt såsom natrium-, kalium eller ammoniumsaltet.

Den således dannede aminoforbindelse I kan isoleres og renses ved kendte metoder såsom søjlechromatografi, ionbyt-10 ning, udfældning eller lignende.

Nedenstående eksempler illustrerer opfindelsen.

Forsøgsmetode for aminoforbindelse I: 15

En portion af reaktionsblandingen indstilles til pH 2,5 med 1 N saltsyre, og efter at opløsningen er vasket 3 gange med det halve rumfang butylacetat, indstilles den til pH 7,5 med 1 N natriumhydroxidopløsning. Yderligere en portion 20 deraf omsættes med phenylacetylchlorid og prøves på Bacil lus subtilis PI 211 i 16 timer ved 37°C.

Tyndtlagschromatografi (TLC): Bærer: Pre-coated silicagel.

25 Fremkalder I: n-butylalkohol, eddikesyre og vand 3:1:1.

Fremkalder II: n-butylalkohol, eddikesyre, pyridin og vand 15:3:10:12.

Fremkalder III:n-butylalkohol, eddikesyre, formaldehyd og vand 3:1:5:1.

30

Eksempel 1-5 100 ml af et vandigt medium (pH-værdi 10,0) bestående af kødekstrakt 0,5%, pepton 1%, gærekstrakt 0,1%, glutarsyre 0,05% og NaCl 0,5% indføres i en 500 ml Erlenmeier kolbe, 35 · steriliseres ved 120°C i 15 minutter, podes med Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 og dyrkes i roterende rystekultur ved 30°C i 8 dage. Efter dyrkning centrifugeres dyrknings-

DK 158316 B

- ίο - væsken ved 12000 omdrejninger pr. minut i 10 minutter under afkøling til samling af bakterieceller. Massen suspenderes i 50 ml 0,1 mol phosphatstødpudeopløsning (pH-værdi 7,0).

Der tilsættes 50 ml 0,1 mol phosphatstødpude (pH-værdi 7,0) 5 hver indeholdende 3% 3-acetoxymethyl-7-(4-carboxybutan amid )-ceph-3-em-4-carboxylsyre og inkuberes ved 37°C i 10 timer til opnåelse af aminoforbindelsen I. Dyrkning af bakterier på samme måde gentages, og hver følgende substans inkuberes dermed: 3-methyl-7-(4-carboxybutanamid)-ceph-3- 10 em-4-carboxylsyre, 3-hydroxymethyl-7-(4-carboxybutanamid)- ceph-3-em-4-carboxylsyre, N-(7-(4-carboxybutanamid)-ceph-3-em-3-yl-methyl)-pyridinium-4-carboxylat og 7-(4-carboxybutanamid) -3- (5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiomethyl-ceph-3-em-4-carboxylsyre.

15

Resultaterne fremgår af følgende tabel.

20 25 30 35 - 11 -

DK 158316 B

Aminoforbindelse I (R = -COOH)

Tyndtlagschromatografi

Eksem- dannelses- opløsningsmiddel- pel _X_ forhold, % Rf__system_

51 H 72 0,32 I

2 -OCOCH3 53 i0,,15 I

3 -OH ی (0,3 3 II

4 \ 58 ©,23 III

10 ^

'Jf-rJST

5 -S-il II 50 0,17 I

S/XCH3 15

Aminoforbindelserne identificeres ved tyndtlagschromatografi med ninhydrinfremkalder, ultraviolet og biologiske forsøg.

20 Eksempel 6-9 I eksempel 1-5 erstattes 3-acetoxymethyl-7-(4-carboxybutan-amid)-ceph-3-em-4-carboxylsyre og øvrige med følgende forbindelser, og der fås de nedenfor angivne resultater: 3-methy1-7-(5-carboxy-5-oxopentanamido)-ceph-3-em-4-carb-25 oxylsyre, 3-acetoxymethyl-7-(5-carboxy-5-oxopentanamido)-ceph-3-em-4- carboxylsyre, 3-hydroxymethyl-7-(5-carboxy-5-oxopentanamido)-ceph-3-em-4-carboxlsyre og 30 N- (7- (5-carboxy-5-oxopentanamido) -ceph-3-em—3-yl-methyl) - pyridinium-4-carboxylat.

35 - 12 -

DK 158316 B

Aminoforbindelse I (R = -COCOOH)

Tyndtlagschromatografi

Eksem- dannelses- opløsningsmiddel- pel_X_forhold, % Rf_system_

5 6 H 65 0,32 I

7 -OCOCH3 50 0,15 I

8 -OH 58 0,34 II

j~\ 10 9 \ / 52 0,23 111

Eksempel 10-13 100 ml af et vandigt medium (pH-værdi 7,0) bestående af kødekstrakt 0,5%, pepton 1%, gærekstrakt 0,1%, glutarsyre 15 0,05% og NaCl 0,5% indføres i en 500 ml Erlenmeier kolbe, steriliseres ved 120°C i 15 minutter, podes med Pseudomonas ovalis ATCC 950 og dyrkes i roterende rystekultur ved 30°C i 8 dage. Efter dyrkningen centrifugeres dyrkningsvæsken ved 2000 omdrejninger pr.minut i 10 minutter under afkøling 20 til samling af' bakteriecellerne. De dyrkede celler suspen deres i 50 ml 0,1 mol phosphatstødpude (pH-værdi 7,0). Dyrkningen gentages på samme måde, og dyrkede celler suspenderes. Cellesuspensionerne inkuberes ved 37°C i 10 timer med hvert stof (2% i 0,1 mol phosphatstødpudeopløsning) 25 som vist i tabellen nedenfor, og resultaterne fremgår af den efterfølgende tabel:

Forbindelse II: 3-methyl-7-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-carboxylat, 3-hydroxymethyl-7-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-carb-30 oxylat, 3-acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-4-carb-oxylat, og N-(7-{4-carboxybutanamido)-ceph-3-em-3-yl-methyl)-pyridi-nium-4-carboxylat.

35 - 13 -

DK 158316 B

Aminoforbindelse I

Eksempel_X_Rf ved tyndtlaqschromatograf i_ 10 H 0,33 (opløsningsmiddelsystem I) 11 -OH 0,33 (opløsningsmiddelsystera II) 5 12 -OCOCH^ 0,15 (opløsningsmiddelsystem I) Γ~\ 13 j 0,22 (opløsningsmiddelsystem III)

Eksempel 14 10 Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 dyrkes på samme måde som i eksempel 4 til opnåelse af 6 liter dyrkningsvæske. Cel lerne samles ved centrifugering ved 12000 omdrejninger pr. minut i 10 minutter og vaskes. De således opnåede celler suspenderes i 0,1 mol phosphatstødpude (pH 7,0) til frem- 15 stilling af 300 ml suspension. Der tilsættes 15 ml kation- overfladeaktivt stof, omrøres ved stuetemperatur i 30 minutter og centrifugeres ved 10000 omdrejninger pr. minut i 10 minutter til opnåelse af 288 ml overlejret væske.

20 Den overlejrede væske dialyseres i 0,1 ml phosphatstødpude opløsning (pH-værdi 7,0) under anvendelse af et rør af regenereret cellulose ved 4°C i 48 timer. Der fås 300 ml dialysat med N-deacyleringsaktivitet.

25 Det således opnåede dialysat omfattes under fremstillingen af mikrobiel kultur ifølge den foreliggende opfindelse og kan fremstilles som mikrokapselpræparat, pulverpræparat ved . tørring, lyofilisering eller ammoniumsulfatfældning 30 Eksempel 15 3 g celluloseacetat (triacetatform) opløses i 100 ml methy-lenchlorid. 3 g dyrkede celler af Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410, fremstillet på samme måde som i eksempel 1, suspenderes i destilleret vand og emulgeres dispergerbart 35 deri. Den således opnåede emulsion omrøres, dispergeres i - 14 -

DK 158316 B

800 ml 2%'s vandig gelatineopløsning ved stuetemperatur og omrøres yderligere indtil afdampning af methylenchloridet til opnåelse af mikrokapsler (diameter 0/1-0,3 mm) indeholdende Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410. Disse mikrokaps-5 ler kan bruges til fremstilling af aminoforbindelsen I som eksemplificeret nedenfor.

Eksempel 16

Eksempel 15 gentages, idet der dog bruges 2 g celluloseace-10 tat, 70 ml methylenchlorid og 2 g Pseudomonas bvalis ATCC 950. Der fås mikrokapsler indeholdende bakterien.

Eksempel 17

Eksempel 15 gentages, idet der dog bruges 20 ml overlejret 15 væske med N-deacyleringsaktivitet fra eksempel 14 i stedet for 3 g Comamonas-celler suspenderet i 20 ml vand til opnåelse af mikrokapslerne med samme størrelse.

Eksempel 18 20 21,9 g (våd vægt) mikrokapsler fra eksempel 15 pakkes i en søjle med kappe (2 x 9,6 cm, V = 30 ml) og vaskes med 0,1 mol phosphatstødpude (pH-værdi 7,0). 840 ml opløsning 3-acetoxymethyl-7-(4-carboxybutanamid)-3-cephem-4-carboxyl-syre i 0,1 mol phosphatstødpude (9,92 mg/ml) tilføres ved 25 SV ca. 0,4. 865 ml eluat indeholdende 7-ACA fås (dannel sesforhold 84,5%), og man inddamper til 80 ml efter indstilling til en pH-værdipå 3,2. Koncentratet henstår natten over til udfældning af 7-ACA ved 4°C. Udbytte 4,6 g, renhed 86,2%.

30

Eksempel 19

Eksempel 18 gentages, men mikrokapslerne indeholdende Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 erstattes med mikrokapsler indeholdende Pseudomonas ovalis ATCC 950 fra eksempel 16, 35 og der benyttes en 1% opløsning af stofferne angivet nedenfor i stedet for substratet i eksempel 18 til opnåelse af aminoforbindelse I nedenfor:

DK 158316B

- 15 -

Stof_ Udbytte af forbindelse I

3-methyl-7-(4-carboxybutanamid)--3-cephem-4-carboxylat 84,2% 3- hydroxymethyl-7-(4-carboxybutanamid) -3-cephem-4-carboxylat 83,1% N-(7-(4-carboxybutananmid)-3--cephem-yl-methyl)-pyridinium- -4-carboxylat 79,2%

Eksempel 20 10 I eksempel 18 erstattes mikrokapslerne indeholdende Comamo- nas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 med mikrokapslerne indeholdende overlejret væske med N-deacyleringsaktivitet fra eksempel 17, og substratet erstattes med 1%'s opløsinger af 3-acet-oxymethyl-7-(4-carboxybutanamid)-3-cephem-4-carboxylat, 3- 15 methyl-7-(5-carboxy-5-oxo-pentanamid)-3-cephem-4-carboxylat og 3-hydroxymethy1-7-(5-carboxy-5-oxopentanamid)-3-cephem- 4- carboxylat til opnåelse af aminoforbindelse 1 med udbytter på henholdsvis 87,5%, 78,8% og 79,5%.

20 25 30 35

Claims (1)

1. DK 158316 B - 16 - Fremgangsmåde til fremstilling af 3-substituerede 7-amino- 3-cephem-4-carboxylsyrederivater med den almene formel I 5 /Sv b2n——r Λ o CUZK [τ) COOH 10 hvor X betyder et hydrogenatom, en hydroxy-, acetoxy-, py-ridin- eller (5-methyl-l,3,4-thiadiazol-2-yl)-thiogruppe, kendetegnet ved, at man behandler en vandig opløsning af en forbindelse med formlen II 15 h-(chz)3-c°nh-r ^ o^"hY^ch2x (I11 COOH hvor R betyder -COOH eller -COCOOH og X har den ovenfor 20 angivne betydning, med en mikrobekultur eller et præparat deraf afledt af Comamonas sp. SY-77-1 FERM-P 2410 eller Pseudomonas ovalis ATCC 950 i et vandigt medium. *25 30 35