JPH02100690A - ４，５−ジヒドロキシフタル酸およびその塩の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［従来の技術］ ４．５−ジヒドロキシフタル酸は、種々のポリマーの原
料モノマーとして有用である。現在、この４，５−ジヒ
ドロキシフタル酸の製造方法の１つとして、フタル酸資
化能を有する微生物の突然変異株、すなわち４．５−ジ
ヒドロキシフタル酸の分解活性の消失した株を用いて、
フタル酸から４．５−ジヒドロキシフタル酸を得る方法
が知られている〔中沢ら、ジャーナル、オブ・バクテリ
オロジー、１３１．４２　（１９７７））。

［発明が解決すべき課題］ しかしながら、前記中沢らの方法においては、フタル酸
資化能を有する微生物の突然変異株を、Ｎ−メチ）Ｉ、
−Ｎ’　−二トローＮ−二トロソグアニジンのような化
学処理剤を用いて得ているため、得られた突然変異株の
復帰変異が起る場合があり、４．５−ジヒドロキシフタ
ル酸の製造を効率良く行えないという問題があった。

［課題を解決するための手段］ かかる実状において、本発明者らは４，５−ジヒドロキ
シフタル酸および／またはその塩を効率よくフタル酸お
よび／またはその塩から製造する方法を開発すべく研究
した結果、フタル酸および／またはその塩を炭素源とし
て生育できるシュードモナス属に属する微生物の放射線
照射による変異株がフタル酸および／またはその塩を分
解し、４，５−ジヒドロキシフタル酸および／またはそ
の塩を効率よく蓄積させることを見出し、本発明を完成
した。

すなわち本発明は、４，５−ジヒドロキシフタル酸およ
び／またはその塩（以下、「４，５−ジヒドロキシフタ
ル酸」と総称する）の分解活性を、放射線を照射するこ
とにより消失もしくは低下させたシュードモナス属に属
する微生物を用いて、フタル酸および／またはその塩（
以下、「フタル酸」と総称する）から４，５−ジヒドロ
キシフタル酸を製造することを特徴とする４、５−ジヒ
ドロキシフタル酸の製造方法を提供するものである。

なお、本発明において、塩とは、ナトリウム塩、カリウ
ム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などを示すもので
ある。

本発明に用いられる微生物は、フタル酸を増殖のための
炭素源として利用し得る能力を有するシュードモナス属
に属する微生物を親株として、４゜５−ジヒドロキシフ
タル酸の分解活性が消失、もしくは低下するように放射
線照射により変異せられたものである。

親株の例としては、例えばシュードモナスアシドボラン
ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｌｄｏｖｏｒａｎｓ
）、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
ｐｕｔｌｄａ）　、シュードモナステストステロニ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎり　、
シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｎｄｏｍｏｎａｓ　
ｃｅｐａｃｉａ）などが挙げられ、これらのうちではシ
ュードモナス・テストステロニが好ましく、最も好まし
い親株の例として、シュードモナス・テストステロニＮ
ＭＨ４２００（微工研菌寄第１０３１６号）が挙げられ
る。ＮＭＨ４２００は、本発明者らが新たに見出した菌
株であり、フタル酸のほかに、４，５−ジヒドロキシフ
タル酸、プロトカテキュ酸またはこの塩を炭素源として
生育でき、またフタル酸で培養した菌体は、４．５−ジ
ヒドロキシフタル酸、プロトカテキュ酸またはこの塩を
すみやかに代謝することができる。

ＮＭＨ４２００の菌学的性質を示すと次のとおりである
。

ａ）形態的性質 （１）形、大きさ （２）運動性 鞭毛 （３）胞　子 （４）ダラム染色 ｂ）培養的性質 （１）肉汁寒天平板 （２）肉汁寒天斜面 （３）肉汁液体 桿菌０．６Ｘ１〜０．６ ×２μｍ あり 極鞭毛　１本 なし 陰性 生育良好、円形、金縁、 淡黄褐色 生育良好、糸状 生育良好、白濁、被膜形 成、沈渣あり 生育良好、液化せず アルカリ性 ４）　肉汁ゼラチン穿刺 （５）　　リドマスミルク Ｃ）生理的性質 （１）脱窒反応　　陰性 （２）好塩性　なし く３）メタノールの資化性　　　なし く４）エタノールから酢酸の生産 陰性 ペプトン培地の生育　　　陽性 ３−ケトラクトースの生産　　　なし ゼラチン加水分解能　　　なし ＹＭＡ培地　　　あり（白） 色素の生成　　　なし オキシダーゼ　　　陽性 カタラーゼ　　　陽性 リパーゼ　　　陽性 アルギニンジヒドロラーゼ プロトカテキュ酸の開裂 ４１℃での生育　　　陰性 ｐＨ３，６での生育　　　陰性 栄養要求性　　　なし 酸素に対する態度　　　好気的 資化性（＋；陽性、−；陰性） ｐ−ヒドロキシ安息香酸；＋ ラクトース；− プロピオン酸；＋ グルコース；− クエン酸；＋ 陰性 メタ開裂 Ｌ−アラビノースニー Ｄ−フラクトース；− Ｄ−マンニトール；− シュクロース；− フタル酸；＋ なお、以」二の菌学的性質は、バージイーズ・マニュア
ル・オブ・システマチック・バクテリオロジー第１巻（
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍ
ａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、］、）
記載のシュードモナス・テストステロニの菌学的性質と
よく一致するものである。

本発明では、このような菌学的性質を有する菌株を親株
として、放射線により変異誘導処理して得た４、５−ジ
ヒドロキシフタル酸の分解活性が消失もしくは低下して
いる変異株（以下、単に「特定変異株」という）が用い
られる。

親株の変異誘導処理に用いる放射線としては、例えば紫
外線照射、Ｘ線照射、γ線などを適用することができる
。

ここで、放射線の照射量は、例えば紫外線の場合、通常
、１〜９ｍＪ／ｃｎｉである。

また、変異株の確認は、例えば変異処理を行った細胞を
培養し、形成されたコロニーについて変異の有無を検討
する直接的な方法のほか、この方法を改良したレプリカ
法、さらにはペニシリンなどの抗生物質を使用する濃縮
法、特殊な基質を用いる自殺基質処理法、ならびにこれ
らを適宜組合せた方法などが挙げられる。

また、これらの変異株の中から特定変異株を見出す方法
としては、増殖菌体または休止菌体にフタル酸を適当な
条件下で接触させ、そのときの蓄積物を適当な分析手段
を用いて分析する方法を挙げることができる。ここで分
析手段としては、紫外線吸収スペクトルを測定する方法
、ＴＬＣ，ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーによる方
法、および蓄積物のフェノール性水酸基を検出する方法
が例示でき、特定変異株か否かを判定するには、これら
の分析結果から総合的に判断される。

かくして得られる特定変異株の例として、親株としてＮ
ＭＨ４２００を用いた紫外線処理による変異株であるシ
ュードモナス・テストステロニＮＭＨ４２９３（微工研
菌寄第１ＱＢ１７号）が挙げられる。この特定変異株の
増殖菌体または休止菌体は、フタル酸から４，５−ジヒ
ドロキシフタル酸を製造し、蓄積させることができるも
のである。

このＮＭＨ４２９３の菌学的性質は、親株であるＮＭＨ
４２００のそれと極めて近似しているが、フタル酸の資
化能を失っている点で親株と相違する。

本発明では、このような特定変異株を用い、液体培養法
、休止菌体法、固定化菌体法などにより、フタル酸から
４．５−ジヒドロキシフタル酸を製造する。

液体培養法は、フタル酸の存在下に特定変異株を培養し
なから４，５−ジヒドロキシフタル酸を生成させる方法
である。この方法で用いられる培地には、炭素源として
酢酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸、安息香酸、ｍ
−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸などの
芳香族化合物、グルコースなどの糖類が用いられ、窒素
源としてアンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物
、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、尿素などの有機窒
素源などが用いられ、無機塩類としてリン酸カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化第二鉄、塩化カ
ルシウムなどが用いられる。

フタル酸の培地への添加は、−括添加または逐次添加が
採用されるが、その合計添加量は、通常、培地の５重量
％以下である。また逐次添加する場合に、その添加周期
は４，５−ジヒドロキシフタル酸が十分生成し、培地中
に蓄積される範囲内で適宜選定され、１回の添加量は、
通常、培地の０゜０１〜０．５重量％である。

また培養温度は、通常、２５〜３７℃、ｐＨは５〜９で
あり、好気的条件下で培養が行われる。

休止菌体法は、予め培養しておいた特定変異株を用いて
、フタル酸を４，５−ジヒドロキシフタル酸に変換させ
る方法である。

この方法では、特定変異株の培養は液体培養法と同様に
して行うことができるが、培養時にフタル酸を添加しな
くてもよい。すなわち、特定変異株の培養後、特定変異
株は遠心分離または凝集法によって集められ、適当な緩
衝液、例えばリン酸緩衝液あるいはトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン緩衝液中に再懸濁される。再懸濁
された液中での４，５−ジヒドロキシフタル酸の産生反
応（以下、単に「産生反応」という）は、フタル酸の添
加により開始され、温度２５〜３７℃、ｐＨ５〜９の範
囲で好気的に行われる。なお、産生反応前に特定変異株
を産生反応に用いる緩衝液で集菌し、再懸濁を繰り返し
、洗浄してから用いてもよい。

また、固定化菌体法の場合、特定変異株の担体への固定
化方法としては、包括法、吸着法、マイクロカプセル法
などいずれも適用することができる。包括用担体として
はカラギーナンなどの多糖類、ポリアクリルアミドなど
の合成高分子などがあり、吸着用担体としてはＤＥＡＥ
セルロースなどがある。

固定化菌体法の場合の培養または産生反応の条件は、液
体培養法または休止菌体法の場合と同様である。

上記の各方法などによる培養または産生反応終了後、４
，５−ジヒドロキシフタル酸は、溶媒による抽出または
晶析により、培養液または産生反応液から回収される。

なお、抽出の際、培養液または生産反応液は、好ましく
はｐＨ２以下に調整される。

ここで、抽出の際に使用しうる溶媒としては、テトラヒ
ドロフラン、アセトン、ブタノール、酢酸エチル、ジエ
チルエーテル、メチルエチルケトンなどの極性溶媒が挙
げられる。この抽出液を濃縮乾固することにより、４．
５−ジヒドロキシフタル酸の粗結晶が得られる。この粗
結晶は、さらに適当な溶媒、例えば水、酢酸エチル、ジ
エチルエーテル、トルエン、クロロホルム、ヘキサンな
どにより再結晶させて精製してもよい。

［実　施　例］ 次に実施例を挙げて本発明の詳細な説明するが、本発明
はこれら実施例により何ら制限されるものではない。

参考例１ 菌体の変異誘導処理と特定変異株の分離（１）下記組成
のｐＨ７の培地（以下、「培地Ａ」という）に、フタル
酸ナトリウム１０ｍＭを添加した培地１０ｍ１にシュー
ドモナス・テストステロニＮＭＨ４２００を１白金耳接
種し、３０℃で２４時間振とう培養を行った。

ＮＨ４ＣＩ　　　　　　　　　１．　０　ｇ。

ＫＨ２ＰＯ４２，０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，５ｇ ＫＣｌ　　　　　　　　　　　０．５ｇＦｅＣｌ３　・
６Ｈ２００，０１ｇ ＣａＣｌ２　　　　　　　　０．Ｉｇ ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　Ｏ，ＩｇＣｕＳＯａ　　
−５Ｈ２０５１１ｇ Ｈ３ＢＯ２１μｇ ＭｎＣ１２１μｇ 蒸留水　　　　１２ （２）　　工程（１）で得られた培養液０．１ｍｌを培
地Ａ１０ｍ１に添加し、３０℃で６時間振とう培養を行
った。

（３）工程（２）の培養液の遠心分離によりＮＭＨ４２
００を集菌し、０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液で
洗浄後、菌体密度が３Ｘ１０ａ個／ｍｌとなるように０
．８５重量％塩化ナトリウム水溶液に懸濁した。

（Ａ）上記懸濁液に紫外線ランプ（波長２５３７人）を
用いて３．ＯｍＪ／ＣＴＩの照射量の紫外線を照射した
。

（５）紫外線を照射した懸濁液０．１ｍｌを１０ｍ１の
ブイヨン液体培地に接種し、３０℃で一夜振とう培養を
行った。

（６）工程（５）の培養液の遠心分離により放射線を照
射したＮＭＨ４２００を集菌し、０．８５重量％塩化ナ
トリウム水溶液で洗浄後、菌体密度がＩ×１０７個／ｍ
ｌになるようにフタル酸ナトリウム１０ＩＩＩＭを添加
した培地Ａに接種した。

（７）３０℃で１時間培養を行った後、ベンジルペニシ
リンカリウムを７ｍｇ／ｍｌの濃度になるように添加し
、さらに４時間培養を行った。

（８）工程（７）の培養液を培地Ａで１００００倍に希
釈し、直径９０ｍｍのブイヨン寒天平板に０．　１ｍｌ
塗布し、３０℃で一夜培養を行った。

（９）工程（８）の培養で生じたコロニーを、コハク酸
ナトリウム含有寒天平板およびフタル酸ナトリウム含有
寒天平板に移植して、３０℃で２日間培養を行った後、
コハク酸ナトリウム寒天平板には生育し、フタル酸ナト
リウム寒天平板上には生育しないＮＭＨ４２００の変異
体からなるコロニー１００個を拾い上げ、別々のブイヨ
ンスラントに移植した。

００）工程（９）でブイヨンスラントに移植されたＮＭ
Ｈ４２００の変異株をブイヨンスラントから、フタル酸
ナトリウム１ｍＭおよびコハク酸ナトリウム１０ｍＭを
含む培地Ａに１白金耳接種し、３０℃で２４時時間上う
培養を行った。

（１１）工程００）の培養中にＮＭＨ４２００の変異株
から生産された蓄積物を紫外線吸収スペクトル、薄層ク
ロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーに
より分析し、４．５−ジヒドロキシフタル酸と性質が一
致した蓄積物を与えるＮＭＨ４２００の特異株を選別し
た。

以上のようにして得られた特定変異株の中から、最も４
，５−ジヒドロキシフタル酸の生産能が高い特定変異株
の１つとして、シュードモナス・テストステロニＮＭＨ
４２９３が得られた。

実施例Ｉ ＮＭＨ４２９３１白金耳を１０ｍＭのｐ−ヒドロキシ安
息香酸を含む培地Ａ３０ｍ１で培養した培養液を、２．
５ｍＭのフタル酸二ナトリウムおよび１０ｍＭのｐ−ヒ
ドロキシ安息香酸を含む培地２２に添加し、３０℃で２
０時間振とう培養を行った。

次いで遠心分離によりＮＭＨ４２９３を集菌し、５０畦
トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７，５）２００ｍｌで２回洗
浄を行った後、４０ｍＭフタル酸二ナトリウムを含む５
０ＩＩＩＭトリスー酢酸緩衝液５００ｍ１に再懸濁した
。その後、回転振とうを行いながら３０℃で４８時間産
生反応を行い、遠心分離によりＮＭＨ４２９３を除去し
た。得られた上澄液を４８℃で回転蒸発法により５０ｍ
１に濃縮し、硫酸アンモニウムを飽和に達するまで加え
、濃塩酸でｐＨ２に調整した。続いて酢酸エチル１００
ｍ１による抽出を５回行い、得られた抽出液を集め、４
０°Ｃで回転蒸発法により濃縮乾固し、４，５−ジヒド
ロキシフタル酸の粗結晶２．４ｇを得た。得られた粗結
晶は、水により再結晶させて精製して４．５−ジヒドロ
キシフタル酸の精製結晶１．２ｇを得た。

［発明の効果コ 本発明の方法によれば、種々の高分子材料や合成中間体
として有用な４，５−ジヒドロキシフタル酸を効率よく
製造することができる。

特許出願人　　日本合成ゴム株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）４，５−ジヒドロキシフタル酸および／またはそ
   の塩の分解活性を、放射線を照射することにより消失も
   しくは低下させたシュードモナス属に属する微生物を用
   いて、フタル酸および／またはその塩から４，５−ジヒ
   ドロキシフタル酸および／またはその塩を製造すること
   を特徴とする４，５−ジヒドロキシフタル酸および／ま
   たはその塩の製造方法。