JP2001157579A - ヒスタミンデヒドロゲナーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】食品産業、水産業、食品衛生、医療及び分析機
器産業などの広い分野で行われるヒスタミンの定量に、
好適に利用可能なヒスタミンデヒドロゲナーゼを得る。 【解決手段】リゾビウム属に属し、ヒスタミンに特異的
に作用するという特徴を有し下記の理化学的性質を有す
るヒスタミンデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を培
地に培養し、その培養物から該ヒスタミンデヒドロゲナ
ーゼを採取する。また、上記培養に際し、培地中にヒス
タミン又はヒスタミン塩を含有させて、該培養物に該酵
素を著量生産蓄積せしめる。 （理化学的性質） 作用：１モルのヒスタミンを電子受容体の存在下、酸化
的脱アミノ反応により１モルの４―イミダゾリルアセト
アルデヒドと１モルのアンモニアを生成する。基質特異
性：ヒスタミンに特異的に作用する。 至適温度：６５〜７５℃。 温度による失活の条件：ｐＨ８．０、１５分処理で、０
〜６０℃で安定。 分子量：約１５０，０００（サブユニット約７１，００
０×２）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、食品産業、水産
業、食品衛生、医療及び分析機器産業などの広い分野で
行われるヒスタミンの定量に、好適に利用可能なヒスタ
ミンデヒドロゲナーゼ及びその製造法に関する。そして
本発明は、ヒスタミンに対して特異性が高く、カダベリ
ンやプトレッシンといった生体アミンなどには作用（反
応）せず、ヒスタミンのみによく作用し、かつ至適温度
が６５〜７５℃であるヒスタミンデヒドロゲナーゼに関
する。また本発明は、安定剤を添加しなくとも、酵素を
水性溶液に溶解した後、常温で少なくとも１週間は安定
に保存することができるヒスタミンデヒドロゲナーゼに
関する。また、本発明は前記のヒスタミンデヒドロゲナ
ーゼを効率よく製造する方法に関する。また本発明は、
試料中から妨害物質（不純物）を除去する面倒な、前処
理操作を行うことなく、短時間に簡便な装置を用いて、
開放系で、しかも測定値の信頼性を損なうことなく、極
く微量の（すなわち感度よく）測定が可能なヒスタミン
デヒドロゲナーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒスタミンは、細菌ばかりでなく動物、
植物の殆どすべての組織に存在する。そして、ヒスタミ
ンはそれらの細胞の増殖、核酸及びタンパク質合成、酵
素活性の調節など生物的機能において多岐にわたり関与
していることが明らかにされている。

【０００３】また、ヒスタミンは血圧降下、平滑筋収
縮、腺分泌促進など、人体において種々の生理作用をお
こす作用のあることが明らかになっており、特にアレル
ギー反応における伝達物質の役割をしており、ヒスタミ
ンはアレルギー反応の診断及び病態解析の手掛かりとな
ることから重要視されている。

【０００４】ヒスタミンは、分子式Ｃ₅Ｈ₉Ｎ₃、分子量
１１１であり、後述の「化１」に示す化学反応式に記載
の化学構造式を有するアミンである。そして、ヒスタミ
ンは新鮮な魚介類や食肉には殆ど存在しないが、その腐
敗過程に出現し、ヒスチジン脱炭酸酵素活性の強い微生
物などに汚染されることにより、蛋白質組織中の遊離ア
ミノ酸のヒスチジンから後述の「化１」に示す脱炭酸作
用（化学反応式）で生成する。

【０００５】さらにまた、ヒスタミンは時にアレルギー
食中毒の原因となる。食品が腐敗する過程では微生物の
作用により、タンパク質、核酸、多糖類、脂肪など種々
の食品成分が分解され、アンモニア、硫化水素、アミン
類、有機酸類など多種類の腐敗産物が生成される。特に
遊離アミノ酸を多量に含む魚介類では、アミノ酸を前駆
物質とするアミン類が極めて初期に生成されるため、鮮
度低下が顕著でない時期でもこれらアミンを多量に含ん
だものを食してしまう恐れがある。アミンのうち食品衛
生上注意しなければならないのは先に述べたヒスタミン
で、これを含んだ食品を摂取すると、顔面などに熱感、
頭痛、じん麻疹などが現われ、ときには下痢や嘔吐とい
った症状を伴い、アレルギ−様の食中毒を起こすとされ
ている。したがって、ヒスタミンの定量は食品衛生上重
要であるばかりでなく、食品の腐敗の程度を知る手掛か
りとなる。

【０００６】従来、ヒスタミンをはじめとするアミン類
を酸化分解する酵素としてアミンオキシダーゼとアミン
デヒドロゲナーゼがある。前者の酵素のうちヒスタミン
に作用するものは微生物から高等動物まで広く存在して
いるが、その特異性については広いものが多く、多少な
りとも他のアミン類に作用する。後者の酵素はアミン分
解の活性発現に酸素以外の電子受容体を必要とする脱水
素酵素であるが、このような酵素の報告例は少ない。こ
れまでに報告されているアミンデヒドロゲナーゼとして
シュードモナス属由来（Ｒ．Ｒ．Ｅａｄｙ ｅｔ ａ
ｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，１０６，２４５〜２５５
１９６８）のものが知られているが、この酵素はヒス
タミンに作用するが、他のアミン類にもかなり作用する
（後記、表１「基質と相対活性」における「比較例の
欄」参照）。そのため、ヒスタミンと他のアミン類が混
在する試料からヒスタミンのみを精度よく定量すること
が難しい問題点を有する。

【０００７】またＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｉｍｐ
ｌｅｘ ＩＦＯ １２０６７の微生物が、ヒスタミン
を特異的に分解し、ヒスタミン以外ではアグマチンに弱
く作用し、その他の芳香族・脂肪族モノアミン、ジアミ
ン及びポリアミンには全く作用しない、最適ｐＨ及び
安定ｐＨは、ともに８．５を有し、ヒスタミンに対す
るＫｍ値が０．０９５ｍＭ、分子量が１７０，０００
で分子量８４，０００の同一サブユニットからなる二量
体である、アミンデヒドロゲナーゼを生産することが知
られている（９８、日本農芸化学会、大会講演要旨、３
３５頁）。しかし、この酵素の至適温度及び温度安定性
の範囲については知られていない。また、一般に酵素は
水溶液において非常に不安定である。また、常温では速
やかに失活するため、冷蔵又は冷凍保存を余儀なくされ
る。そのため、酵素は、使用の際、その都度、必要量を
水性液体に溶解して用いられており、一旦調製すると短
期間のうちに使用しなければならないという問題点を有
している。したがって、通常、ヒスタミンデヒドロゲナ
ーゼは、安定剤を添加しなければ水性溶液で長期間安定
性を確保することができない欠点を有している。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、ヒスタミンの酵素的定量法にとって極めて有用
で、ヒスタミンを従来になく簡便な操作で、容易に、
精度良く測定することが可能な、そして、安定剤を
加えることなく、緩衝液に溶解し、水性溶液とした後で
も極めて長期間安定で、高い温度安定性を有するヒス
タミンデヒドロゲナーゼを得ること、また、試料中の
アミン類のうち、ヒスタミンに対して特異性の高い、す
なわちカダベリンやプトレッシンといった生体アミンに
は作用せず、検出目的のヒスタミンのみによく作用し
て、これを定量することが可能な、ヒスタミンデヒドロ
ゲナーゼを得ること、そしてその効率的な製造法を提
供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記目的を
達成するために種々検討を重ねた結果、リゾビウム属
に属する菌株が、アミン類のうちカダベリンやプトレッ
シンなどには作用せず、ヒスタミンのみによく作用し、
かつ至適温度が６５〜７５℃であるヒスタミンデヒドロ
ゲナーゼを生産することを見出した。そしてこの酵素
は、安定化剤を加えることなく、緩衝液に溶解し水性溶
液とした後でも極めて長期間安定な、しかも高い温度
安定性を有すること、さらにこの酵素は、ヒスタミン
の酵素的定量法にとって極めて有用で、ヒスタミンを従
来になく簡便な操作で、容易に、精度良く測定するこ
とが可能であること、そしてこの菌は培養の際培地中
に、ヒスタミン又はヒスタミン塩を含有させるとき、こ
の酵素を著量生産蓄積せしめることができることを見出
し、これらの知見に基づいて本発明を完成した。

【００１０】すなわち、本発明の第１の発明は、ヒスタ
ミンに特異的に作用しかつ至適温度が６５〜７５℃であ
るヒスタミンデヒドロゲナーゼである。

【００１１】また第２の発明は、リゾビウム属に属し、
前記ヒスタミンデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を
培地に培養し、その培養物から該ヒスタミンデヒドロゲ
ナーゼを採取することを特徴をするヒスタミンデヒドロ
ゲナーゼの製造法である。

【００１２】また第３の発明は、リゾビウム属に属し、
前記ヒスタミンデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株
を、ヒスタミン又はヒスタミン塩を含有する培地に培養
し、その培養物から該ヒスタミンデヒドロゲナーゼを採
取することを特徴をするヒスタミンデヒドロゲナーゼの
製造法である。

【００１３】以下、本発明を詳細に説明する。まず、本
発明の新規な酵素、ヒスタミンデヒドロゲナーゼ（以下
「本酵素」ということもある）の理化学的性質を以下に
示す。

【００１４】（作用）１モルのヒスタミンを電子受容体
の存在下、酸化的脱アミノ反応により１モルの４―イミ
ダゾリルアセトアルデヒドと１モルのアンモニアを生成
する。この結果より次の反応式で示される反応を触媒す
ることが認められた。

【００１５】

【化１】

【００１６】（基質特異性）ヒスタミンに特異的に作用
する。すなわち、ヒスタミンに特異的に作用するが、他
のアミンに対しては全く作用しないか、又は弱く作用す
る。本酵素の各種基質に対する相対活性を調べた結果を
表１に示す。

【００１７】 表１ 基質と相対活性（％） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 基質（１０ｍＭ） 本酵素 比較例（注１） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− チラミン ０ ０．４ プトレッシン ０ １０５．０ セロトニン ０ カダベリン ０ ６０．３ ヒスタミン １００．０ １００．０ アグマチン ９．９ フェニルエチルアミン ０ スペルミジン ０ ５０．６ トリプタミン ０ ０ スペルミン ０ １３．４ １，２−シクロヘキサンジアミン ０ １，３−プロパンジアミン １２．９ ２８１．３ １，４−シクロヘキサンジアミン ０ １，６−ヘキサンジアミン ０ １６０．０ １，７−ヘプタンジアミン ０ １，８−ジアミノオクタン ０ １，９−ジアミノナノン ０ １，１０−ジアミノデカン ０ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 注１）比較例：シュードモナス属由来アミンデヒドロゲナーゼ（Ｒ．Ｒ．Ｅａ ｄｙ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．，１０６，２４５〜２５５ １９６ ８参照。数値は計算により求めた）。

【００１８】（至適ｐＨ）至適ｐＨは、緩衝液としてブ
リットン―ロビンソン広域緩衝液（ｐＨ２〜１１．５）
を用い、３０℃で各ｐＨにおける本酵素活性の測定を行
って求めた。酵素活性の測定は、各緩衝液２．４ｍｌ、
０．３ｍＭ １−ＭｅｔｈｏｘｙＰＭＳ ０．１ｍｌ、
１ｍＭ ＷＳＴ―８ ０．３ｍｌを混和し、３０℃でプ
レインキュベーションした後、１０ｍＭ ヒスタミン溶
液 ０．１ｍｌ及び本酵素液０．１ｍｌを加え、３０℃
で反応を行い、６０分間に生成した還元型１―Ｍｅｔｈ
ｏｘｙ ＰＭＳの増加量を測定することにより行った。
すなわち、還元型１―Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳと反応し
て生じるＷＳＴ―８の発色を４６０ｎｍ の吸光度で測
定し、還元型１―Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳの増加量を測
定して求めた。図１は本酵素の至適ｐＨを示すグラフで
あって、この図に示す通り本酵素の至適ｐＨは、９．０
〜１１．５である。

【００１９】（安定ｐＨ範囲）安定ｐＨ範囲は、緩衝液
としてブリットン―ロビンソン広域緩衝液（ｐＨ２〜１
１．５）を用い、各ｐＨにおいて、３０℃で１５分間処
理し、各ｐＨにおける本酵素の残存活性を測定して求め
た。図２は、本酵素の安定ｐＨ範囲を示すグラフであっ
て、この図に示す通り、本酵素の安定ｐＨ範囲は７．０
〜１１．５である。そして、特にｐＨ４以下ではほぼ完
全に失活する。

【００２０】（至適温度）後述する力価の測定法におけ
る同一の基質・酵素混合液を用い、種々の温度（３０〜
８０℃）にて本酵素の酵素活性の測定を行った。すなわ
ち、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２．４ｍｌ、
０．３ｍＭ １―Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳ水溶液０．１
ｍｌ、１ｍＭ ＷＳＴ―８ ０．３ｍｌ及び１０ｍＭ
ヒスタミン溶液０．１ｍｌを混合し、所定温度でプレイ
ンキュベーションした後、０．１ｍｌの本酵素液を加
え、所定温度で反応させ、６０分間に生成した還元型１
―Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳの増加量を測定することによ
り本酵素の活性測定を行った。図３は、本酵素の作用適
温の範囲を示すグラフであって、この図に示す通り、本
酵素の作用適温の範囲は、６５〜７５℃である。

【００２１】（温度による失活の条件）後述する力価の
測定法における基質・酵素混合液を用い、種々の温度に
て１５分間処理（ｐＨ８．０）し、本酵素の残存活性を
測定して求めた。図４は、本酵素の熱安定性を示すグラ
フであって、この図に示す通り、本酵素は６０℃近辺ま
で安定。それ以上では、急激に失活する。

【００２２】（分子量）本酵素の分子量を、ＴＳＫ−Ｇ
ｅｌＧ３０００ＳＷカラム（東ソー社製）を用いた高速
液体グロマトグラフィーにより測定した。その結果、分
子量は約１５０，０００と推定された。また、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動法により、本酵素のサブユ
ニットは約７１，０００と推定された。

【００２３】（Ｋｍ値）ラインウエバー・バークのプロ
ットからＫｍ値は０．０６７ｍＭ（ｐＨ８．０）（ヒス
タミンに対して）である。

【００２４】（力価の測定法）酵素の力価の測定は以下
の方法で行い、１分間に１μｍｏｌの４―イミダゾリル
アセトアルデヒドを生成する酵素量を１単位（１Ｕ）と
する。５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２．４ｍ
ｌ、０．３ｍＭ １−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳ水溶液
０．１ｍｌ、１ｍＭ ＷＳＴ―８水溶液 ０．３ｍ
ｌ、１０ｍＭ ヒスタミン溶液 ０．１ｍｌ及び本酵素
液０．１ｍｌを加え、３０℃で３０〜６０分間反応を行
った。なお、本酵素の活性は本酵素反応において生成し
た還元型１−ＭｅｔｈｏｘｙＰＭＳと反応して生じるＷ
ＳＴ−８の発色を４６０ｎｍの吸光度にて測定した。

【００２５】（精製方法）本酵素の単離、精製は常法に
従って行うことができ、例えば硫安塩析法、有機溶媒沈
澱法、イオン交換体などによる吸着処理法、イオン交換
クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィー、電気泳動法などを単独
又は適宜組み合わせて用いられる。

【００２６】本酵素は前記した作用、基質特異性などの
主要な理化学的性質を有するものであればよく、その他
の理化学的性質が多少の相違を示すものであっても、本
発明の酵素として包含される。本酵素は、魚肉の鮮度測
定などをする場合に、該測定対象の魚肉中のヒスタミン
の定量や、人の血清や尿などの体液中に含まれる微量の
ヒスタミンの定量に極めて有用である。そして本酵素を
用いることにより、測定対象の魚肉あるいは体液中に含
まれる種々のアミンのうち、検出する必要のないカダベ
リンやプトレッシンなどには作用せず、目的とするヒス
タミンのみによく作用して、これを精度よく定量するこ
とが可能となる。また、カダベリンやプトレッシンは、
魚肉が腐敗する際、ヒスタミンとほぼ同時に生成するア
ミンであり、従来のヒスタミンの酵素的定量法ではこれ
らを何らかの方法で分離除去する必要があったのに対
し、本酵素を用いるヒスタミンの定量法では、そのすぐ
れた特性を有するため、面倒で時間を要する分離操作は
全く不要となる利点を有する。

【００２７】次に、ヒスタミンに特異的に作用するヒス
タミンデヒドロゲナーゼの製造法について説明する。本
発明に使用される微生物としては、本酵素生産能を有す
る菌株であればいかなる菌でもよく、またこの菌の変種
または変異株でもよい。そして、この微生物の具体例と
しては、リゾビウム属に属する任意の微生物が挙げられ
る。例えばリゾビウム・エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
ｓｐ．）４−９（以下、「本菌株」ということがあ
る）が挙げられ、該菌株の変種又は変異株も用いること
ができる。このリゾビウム・エスピー ４−９は、本発
明者らが千葉県内の土壌より分離して得た菌株であり、
その菌学的性質は以下に示すとおりである。なお、菌学
的性質の同定のための実験は、主として長谷川武治編
著、「微生物の分類と同定」、東京大学出版会（１９７
５年）によって行った。また、分類同定の基準として
「バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ
・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ）」、第８版（１９７４年）を参考にした。
また、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に基づく系統解析に
は、日本ＤＮＡデータバンクのＤＮＡデータベースを用
いた。

【００２８】リゾビウム・エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕ
ｍ ｓｐ．）４−９の菌学的性質 （Ａ）形態的性質 顕微鏡観察［ベンネット培地（ｐＨ８．０）、３０℃、
２４〜４８時間培養］ ａ）細胞の形及び大きさ：０．５〜０．６×１．２〜
２．３μｍの直状桿菌である。 ｂ）細胞の多形性の有無：無し。 ｃ）運動性の有無：有り。２〜４の鞭毛が認められる。 ｄ）胞子の有無：無し。 ｅ）グラム染色性：陰性。 ｆ）抗酸性：陰性。

【００２９】（Ｂ）各培地における生育状態 ａ）ベンネット寒天培養：３０℃、６０時間の静置培養
で、直径１．５〜２．５ｍｍの円形コロニーを形成す
る。コロニーは白っぽいクリーム色を呈し、表面は中央
がやや隆起し、光沢があり、粘性物質を生成する。色素
の生産は観察されない。 ｂ）ベンネット液体培養：３０℃、２４時間の静置培養
では、わずかに濁り、底に糸状の生育が見られる。振盪
培養では、培地全体が混濁する。 ｃ）肉汁ゼラチン穿刺培養：穿刺孔に沿って生育する
が、ゼラチンは液化しない。 ｄ）リトマスミルク培養：無変化である。

【００３０】（Ｃ）生理学的性質 ａ）硝酸塩の還元：還元する。 ｂ）脱窒反応：無し。 ｃ）ＭＲテスト：陰性。 ｄ）ＶＰテスト：陽性。 ｅ）インドールの生成：生成しない。 ｆ）硫化水素の生成：生成しない。 ｇ）デンプンの加水分解：加水分解しない。 ｈ）クエン酸の利用：利用する。 ｉ）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用するが、アンモニ
ウム塩は利用しない。 ｊ）色素の生成：生成しない。 ｋ）ウレアーゼ：陽性。 ｌ）オキシダーゼ：陰性。 ｍ）カタラーゼ：弱陽性。 ｎ）生育の範囲：温度４〜４０℃、ｐＨ５.５〜９.０。 ｏ）酸素に対する態度：好気的。 ｐ）Ｏ―Ｆテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ法）：酸
化。 ｑ）エスクリンの分解：分解する。 ｒ）デオキシリボヌクレアーゼ：陰性。 ｓ）チロシン分解：分解しない。 ｔ）カゼイン分解：分解しない。 ｕ）フェニルアラニンデアミナーゼ：陰性。 ｖ）トリプトファンデアミナーゼ：陰性。 ｗ）糖類からの酸及びガスの生成：表２のとおり、Ｄ―
メレジトース以外の糖類からの酸生成が認められる。ガ
スの生成は認められない。

【００３１】 表２ 糖類からの酸及びガスの生成 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 糖類 酸の生成 ガスの生成 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｌ−アラビノース ＋ − Ｄ−キシロース ＋ − Ｄ−グルコース ＋ − Ｄ−マンノース ＋ − Ｄ−フラクトース ＋ − Ｄ−ガラクトース ＋ − 麦芽糖 ＋ − ショ糖 ＋ − 乳糖 ＋ − トレハロース ＋ − Ｄ−ソルビトール ＋ − Ｄ−マンニトール ＋ − イノシトール ＋ − グリセロール ＋ − デンプン ＋ − Ｄ−リボース ＋ − ラフィノース ＋ − Ｄ−セルビオース ＋ − ラムノース ＋ − メリビオース ＋ − Ｄ−メレジトース − − −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００３２】本菌株は、以上のごとき菌学的性質を有す
ることから、リゾビウム属に属するものと判定された。
また、本菌の分類学的位置を推定するために、１６Ｓｒ
ＤＮＡの塩基配列に基づく系統解析を行ったところ、本
菌株はリゾビウム属の細菌であることが確認された。ま
た、本菌株は、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｅｇｕｍｉｎｏ
ｓａｒｕｍ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｅｔｌｉ，Ｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｉ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｈ
ａｉｎａｎｅｎｓｉｓ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｏｎｇ
ｏｌｅｎｓｅ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｇａｌｌｉｃｕｍ
と同一のクラスターに位置していた。しかし、このクラ
スターの中で本菌株は単独の系統枝を形成しており、１
６ＳｒＤＮＡの塩基配列からは近縁種の推定はできなか
った。また、本菌株の性状試験の結果をこれらリゾビウ
ム属に属する細菌と比較したところ、本菌株は、いずれ
の種とも性状が異なっていた。このような理由から、本
菌株をリゾビウム・エスピー（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓ
ｐ．）４−９と命名した。なお、本菌株は工業技術院生
命工学技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番）に、
平成１０年（１９９８）９月１４日付けでＦＥＲＭ Ｐ
−１６９９２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６１）として寄託
されている。

【００３３】次に、本酵素の製造法について説明する。
本酵素生産のための微生物の種類、培養法及びその条件
には、本発明の目的を特に阻害しない限りにおいて制約
されない。すなわち、本酵素生産能を有する微生物、例
えばリゾビウム属に属し本酵素生産能を有する微生物の
生育及び本酵素の生産が可能な環境を与えるいかなる培
養方法及びいかなる培養条件が採用され得る。培養法と
しては、通常の固体培養でもよいが、液体培養法が好ま
しい。そしてその培地としては、炭素源、窒素源、無機
物、その他の栄養素を適度に含有するものであれば、合
成培地、天然培地又は半合成培地のいずれでも使用でき
る。

【００３４】上記炭素源としては、同化可能な炭素化合
物であればよく、例えばマルトース、グルコース、グリ
セリン、フラクトースなどが使用される。また窒素源と
しては、本酵素は、ヒスタミンにより誘導生成されるた
めヒスタミン又はヒスタミン塩が望ましいが、本酵素を
発現する窒素源であれば任意のものが利用できる。例え
ば酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、コーンスチー
プリカー、大豆粉、アミノ酸、硫安、硝酸アンモニウム
などが使用される。

【００３５】本酵素は、培地中に窒素源として、ヒスタ
ミン又はヒスタミン塩を添加すると、酵素の生産蓄積量
を著しく増大できる。このヒスタミン塩としてはヒスタ
ミン塩酸塩及びヒスタミンリン酸塩などが好ましい。

【００３６】また無機物としては、食塩、塩化カリウ
ム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウムなどの種
々の塩類が好ましい。

【００３７】またその他の栄養源としては、各種ビタミ
ン類などが使用できる。これらの栄養源はそれぞれ単独
で用いることもでき、また組み合わせて用いることもで
きる。なお、このほか必要により消泡剤などを添加して
もよい。

【００３８】このようにして調製した液体培地を用いて
本酵素を製造するには、通気撹拌深部培養又は振盪培養
などにより好気的に培養するのが好ましい。その際に、
培地の初発ｐＨを６．０〜７．０程度に調整し、２５〜
３７℃、好ましくは３０℃前後の温度で２４〜９６時
間、好ましくは４８時間前後培養する。かかる培養によ
り、培養物中に本酵素が生成し、蓄積される。

【００３９】この培養物から本酵素を採取するには、通
常の酵素採取手段を用いることができる。本酵素は、主
に菌体内に存在する酵素であるため、培養物から、例え
ば濾過、遠心分離などの操作により菌体を分離し、この
菌体から本酵素を採取するのが好ましい。この場合、菌
体をそのまま用いることができるが、例えば超音波破砕
機、フレンチプレス、ダイナミルなどの種々の機械的破
砕手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームなどの
細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、ト
リトンＸ−１００などの界面活性剤を用いて菌体から酵
素を抽出する方法などを単独又は組み合わせて採用する
ことができる。次いで、これを濾過又は遠心分離などに
よって不溶物を除き、本酵素の粗酵素液を得る。

【００４０】このようにして得られた粗酵素液から本酵
素を単離精製するには、前記精製方法が適用できる。本
酵素の単離、精製は常法にしたがって行うことができ、
例えば硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換体など
による吸着処理法、イオン交換クロマトグラフィー、疎
水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、
吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、電気泳動法などを単独又は適宜組み合わせて用
いられる。

【００４１】ここで、本発明のヒスタミンデヒドロゲナ
ーゼを用いたヒスタミンの定量法について説明する。

【００４２】上記定量法に用いるヒスタミン定量用試薬
の好適な具体例としては、（ａ）本発明のヒスタミンデ
ヒドロゲナーゼ、（ｂ）電子キャリアーおよび（ｃ）還
元型電子キャリアー発色剤を含むものが挙げられる。

【００４３】定量用試薬の有利な系としては、０．０
３〜０．３Ｕ／ｍｌの本発明のヒスタミンデヒドロゲナ
ーゼおよび１０〜２００ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨ８
〜１０の系、０．０３〜３．０ｍＭの電子キャリアー
（例えば１−ＭｅｔｈｏｘｙＰＭＳ）および１０〜２０
０ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨ８〜１０の系および
０．１〜１０ｍＭのＷＳＴ−８を含有する１０〜２００
ｍＭの緩衝剤を含有するｐＨ８〜１０の系の組合せが挙
げられる。

【００４４】これらの系に用いられる緩衝剤としては、
例えばリン酸カリウムなどのリン酸塩、トリス−塩酸
塩、酢酸塩などが挙げられる。

【００４５】これらの系に、前記成分以外に、必要に応
じて慣用の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定化
剤などを添加することもできる。

【００４６】このような具体例としては、界面活性剤
（トリトンＸ−１００、ブリッＪ３５、ツイーン８０、
コール酸など）、還元剤（メルカプトエタノール、ジチ
オスレイトール、Ｌ−システインなど）、牛血清アルブ
ミン、糖類（グリセリン、乳糖、ショ糖など）などが挙
げられる。

【００４７】これらの成分は、前記の系を調製する適当
な段階で添加し、１種または２種以上を組合せて用いる
こともできる。このような試薬（添加剤）は、乾燥物ま
たは溶解したものを用いてもよいし、薄膜状の担体、例
えばシート含浸性の紙などに含浸させてもよい。また、
使用する本発明のヒスタミンデヒドロゲナーゼは、常法
により固定化させて反復使用してもよい。上述した試薬
は、各種の試料中に含有されるヒスタミンを簡単な操作
で精度よく定量することができる。

【００４８】次に、ヒスタミンの定量を行うには、ヒス
タミン含有試料に本発明のヒスタミンデヒドロゲナーゼ
を添加作用させて、生成物を測定することにより行うも
のである。

【００４９】ヒスタミン含有試料としては、ヒスタミン
（またはその塩でもよい）を含有するものであれば、如
何なるものでもよく、例えば液状または固形状の食品、
尿や血清などの生体内物質や生体組織などが挙げられ
る。

【００５０】そして、該試料は、そのまま、または水、
緩衝液などで抽出、濾過した後、ヒスタミンが適当な濃
度となるように、濃縮して、または水、アルコール、緩
衝液などで希釈して定量に供してもよい。

【００５１】定量に際して、これらの試料のｐＨは、無
調整でもよいが、適当なｐＨ調整剤、例えば塩酸、硫
酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど酸やアルカ
リを用いてｐＨ８〜１０に調整することが望ましい。

【００５２】また、ヒスタミン含有試料に作用させる本
酵素の添加量は、該試料中に含まれるヒスタミン含有
量、酵素作用条件などにより適宜選択されるが、通常本
酵素を終濃度０．０３〜３Ｕ／ｍｌになるように添加す
る。

【００５３】ヒスタミン含有試料に本酵素を作用させ、
生成物を測定する手段としては、任意の手段を採用する
ことができるが、ヒスタミン含有試料に本酵素および電
子キャリアーを作用させ、生成する還元型電子キャリア
ー、４−イミダゾリルアセトアルデヒドまたはアンモニ
アなどを測定する方法が好ましい。

【００５４】この場合、本酵素を作用させるときの温度
は、２０〜７０℃、好ましくは３０〜５０℃である。こ
のときの作用時間は、ヒスタミン含有試料の該ヒスタミ
ンを分解するのに十分な時間であればよく、１〜６０
分、好ましくは２〜２０分である。

【００５５】作用終了後、作用液中に生成する還元型電
子キャリアー、４−イミダゾリルアセトアルデヒド、ア
ンモニアなどを定量する方法は、特に制限されず、公知
の測定手段を用いて行えばよい。

【００５６】そして、予め同方法で定量して作成したヒ
スタミンの検量線を用いて、試料中のヒスタミンの定量
を行う。

【００５７】還元型電子キャリアーの定量方法として
は、例えばヒスタミン含有試料にフェナジンメトサルフ
ェートやメルドラブルーなどのテトラゾリウム系の電子
キャリアーおよびＭＴＴ、Ｎｉｔｒｏ−ＴＢ、ＷＳＴ−
８などのテトラゾリウム系の還元型発色試薬の存在下、
ヒスタミンデヒドロゲナーゼを添加して酵素作用を行わ
せ、生成する色素を定量する。

【００５８】また、４−イミダゾリルアセトアルデヒド
の定量方法としては、例えば４−イミダゾリルアセトア
ルデヒドにアルデヒドデヒドロゲナーゼを作用させ、こ
の際の共役作用、すなわち、酸化型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤ ⁺）→還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）で生成したＮＡ
ＤＨ量を３４０ｎｍにおける吸光度増加にて測定する方
法などが挙げられる。

【００５９】また、アンモニアの定量法に関してはニン
ヒドリン作用法、インドフェノールブルー吸光光度法、
イオン電極法など既知の種々の方法を利用することがで
きる。

【００６０】次に、本酵素を利用するヒスタミンの定量
法の好適な一例を示す。ヒスタミンを含有する試料に、
０．０３〜０．３Ｕ／ｍｌの本発明のヒスタミンデヒド
ロゲナーゼ、電子キャリアー及び緩衝剤１０〜２００ｍ
Ｍを加え、ｐＨ８〜１０、温度３０〜５０℃で酵素作用
させる。

【００６１】このときの作用時間はヒスタミンを分解す
るに十分な時間であればよく、１〜６０分間、好ましく
は２〜２０分間である。

【００６２】次いで、生成する還元型電子キャリアー、
４―イミダゾリルアセトアルデヒド、アンモニアなどの
含有量を公知の方法によって定量し、予め同方法で定量
して作成したヒスタミンの検量線を用いて、試料中のヒ
スタミンの定量値を算出する。

【００６３】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例により限
定されるものではない。

【００６４】実施例１ （ヒスタミンデヒドロゲナーゼの製造法）グルコース
０．１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス０．２％（Ｗ／Ｖ）、
ヒスタミン二塩酸塩０．１％（Ｗ／Ｖ）、Ｋ₂ＨＰＯ₄
０．０５％（Ｗ／Ｖ）及び水道水からなる培地（ｐＨ
６．７５）１００ｍｌを坂口コルベンに入れて、１２０
℃で１５分間殺菌し、培地を調製した。これを２本分調
製した。それぞれにリゾビウム・エスピー （Ｒｈｉｚ
ｏｂｉｕｍ ｓｐ．）４−９（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６
１）の保存スラントより１白金耳接種し、それぞれ３０
℃で約７２時間、振盪数１４０ｒｐｍで振盪培養して種
培養液を調製した。

【００６５】次いで、前記と同様にして殺菌し、調製し
た培地２０リットル（Ｌ）を３０Ｌ容ジャーファーメン
ターへ入れ、これに前記の種培養液約２００ｍｌ（坂口
コルベン２本分）を無菌的に接種し、３０℃、回転数２
００rｐｍ、通気量１０Ｌ／ｍｉｎの条件で４８時間通
気撹拌培養した。培養終了後、培養液２０Ｌをマイクロ
ーザ（旭化成工業社製、限外濾過膜、登録商標名）を用
いて菌体を集め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
にて菌体を洗浄した後、菌体を同緩衝液約１Ｌに懸濁し
た。

【００６６】次いで以下の方法により本酵素の精製を行
なった。 ステップ１： （粗酵素液の調製）：前記菌体懸濁液に、トリトンＸ−
１００、リゾチウム、ＥＤＴＡをそれぞれ０．５％、
０．１％（Ｗ／Ｖ）、２０ｍＭ添加混合し、室温で一晩
放置した。その後遠心分離（８０００ｒｐｍ、６０ｍｉ
ｎ）して、上清を採取し、粗酵素液を調製した。

【００６７】ステップ２： （硫安分画）粗酵素液に硫安を添加し、４０〜６０％飽
和で沈澱するタンパクを遠心分離（８０００ｒｐｍ、６
０ｍｉｎ）によって回収した。得られた沈殿物を１３％
（Ｗ／Ｖ）硫安を含んだ２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で溶解した。

【００６８】ステップ３： （ブチルトヨパール６５０・クロマトグラフィー）上記
の酵素溶解液をブチルトヨパール６５０カラム（２．５
×３０ｃｍ）に吸着させたのち、１３％（Ｗ／Ｖ）硫安
を含んだ２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて洗
浄し、次に、１３％（Ｗ／Ｖ）硫安を含んだ２０ｍＭの
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）と２０ｍＭのリン酸緩衝液
（ｐＨ８．５）を用い、直線濃度勾配法により溶出さ
せ、約７〜９％（Ｗ／Ｖ）硫安を含有するリン酸緩衝液
にて溶出された活性画分を集めた。これに６０％飽和と
なるように硫安を添加し、低温で一晩放置し、その後遠
心分離（８０００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ）により得られた
沈殿物を２０ｍＭトリス―塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で
溶解した。この酵素溶解液を透析膜を用いて前記緩衝液
に対して透析した。

【００６９】ステップ４： （ＤＥＡＥ−セファセル・クロマトグラフィー）透析液
をＤＥＡＥ−セファセルの充填したカラム（２．５×３
０ｃｍ ）の該セファセルに吸着させたのち、２０ｍＭ
トリス―塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて洗浄し、次に、
０Ｍ〜１．０Ｍ塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液
にて直線濃度勾配法により溶出させ、約０．４Ｍ塩化ナ
トリウムを含有するリン酸緩衝液にて溶出された活性画
分を集めた。

【００７０】（酵素精製標品）以上の精製操作により得
た該活性画分は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動によりほぼ均一と判断され、精製標品であることが
確認された。この標品は、全タンパク量が１．０６ｍ
ｇ、全活性が６．６４Ｕ、比活性が６．２６Ｕ／ｍｇで
あった。

【００７１】実施例２ （溶液状ヒスタミンデヒドロゲナーゼの安定性試験）ｐ
Ｈ９の５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液に上記実施例１で
得られたヒスタミンデヒドロゲナーゼを０．０３Ｕ／ｍ
ｌの濃度となるように添加溶解し、２５℃で保存し、４
日後及び７日後に、活性を測定した。初発（０日目）の
活性を１００％としたとき、４日後の残存活性は８８
％、７日後のそれは８０％であって、非常に安定である
ことが判明した。

【００７２】参考例１ （ヒスタミン含有試料にヒスタミンには作用するが、カ
ダベリン及びプトレッシンには作用しない、実施例１で
得られた本酵素を作用させ、生成する還元型電子キャリ
アーを測定するヒスタミンの定量法において、使用する
ヒスタミン定量用試薬の調製例） 精製水に以下の３の成分をそれぞれ以下の濃度又は単位
で溶解し、３つの成分からなるヒスタミン定量用試薬を
調製した。

【００７３】 表３ ヒスタミン定量用試薬の成分組成 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 成 分 濃度又は単位 容量 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９） ５０ｍＭ ２．４ｍｌ １−Ｍｅｔｈｏｘｙ ＰＭＳ（注１）（電子キャリアー） ０．３ｍＭ ０．１ｍｌ ＷＳＴ−８（注２）（還元型電子キャリアー発色剤） １ｍＭ ０．３ｍｌ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 注１：１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサルフェイト 注２：２（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル ）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−１ナトリウ ム塩

【００７４】応用例１ （ヒスタミン含有試料に、ヒスタミンには作用するが、
カダベリン及びプトレッシンには作用しない、実施例１
で得られた本酵素を作用させ、生成する還元型電子キャ
リアーを測定するヒスタミンの定量法）参考例１で示し
た表３記載の３つの成分を測定直前に混合することによ
り、ヒスタミン定量用試薬（反応試薬液）を調製した。
このヒスタミン定量用試薬を用いて既知濃度のヒスタミ
ン定量を行った。先ず反応試薬液２．８ｍｌに各濃度の
ヒスタミン標準溶液を０．１ｍｌ加え、３７℃で５分間
保温した。これを９６穴のマイクロプレートのウェルに
２００μlずつ分注し、その後ヒスタミンデヒドロゲナ
ーゼ（０．０３Ｕ／ｍｌ）を１０μl添加し、３７℃で
３０分間作用させた。そして作用開始後、経時的にプレ
ートリーダーにより、４９０ｎｍにおける吸光度を測定
し、該吸光度増加量（△ＯＤ）の値を求めた。この値
（Ｙ）とヒスタミン含有量（Ｘ）との関係から検量線を
作成した。その検量線を図５に示す。該検量線の式は、
ｙ＝０．４５７５ｘ−０．００１６（ｒ＝０．９９９）
となる。これから、△ＯＤとヒスタミン含有量との間に
は直線的な相関があって、検量線として有効であること
がわかり、しかも試料に含まれるヒスタミン濃度が０．
０５ｍＭ〜０．５ｍＭ（即ち約５〜５０ｐｐｍ）の極微
量のヒスタミンを迅速かつ高感度に定量できることが判
る。

【００７５】応用例２ （サバ水煮缶詰中の該サバ肉に含まれるヒスタミンの定
量） １）試料の調製 サバ水煮缶詰の該サバ肉を５ｇ定量し５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を３５ｍｌ加え、ストマッカ
ーにて試料を細かくした後、電子レンジにて加熱させ
た。放冷後、同緩衝液にて５０ｍｌにメスアップし、こ
れをＮｏ．２の濾紙及び０．４５μｍのディスミックフ
ィルターで濾過したものを分析試料とした。

【００７６】２）ヒスタミンの定量用試薬の調製及び定
量法 ヒスタミンの定量用試薬の調製及び定量法については参
考例１及び応用例１と同様に行った。分析試料のヒスタ
ミン量については分析して得られた各△ＯＤを用い応用
例１で求めた検量線の式から算出した。

【００７７】比較例 比較のため、同一の分析試料に含まれるヒスタミンを精
度よく定量できると言われるＨＰＬＣ法（従来法）にて
定量した。

【００７８】応用例２と従来法の測定値の相関関係を調
べた。その結果を図６に示す。図６の結果から応用例２
の結果（本酵素を用いたヒシタミンの定量法）と従来法
との間には、直線的な相関があり、相関を示す式はｙ＝
１．００４５ｘ−４．６６５６（ｒ＝０．９９８）とな
る。そして本酵素を用いたヒシタミンの定量法は、従来
のＨＰＬＣ法と非常に良好な相関性を示すことが判明し
た。このことから、本酵素を用いたヒスタミンの定量法
は、測定値の信頼性が高いことが判る。また、試料中よ
り面倒な妨害物質（不純物）を除去する前処理操作の要
らない、定量に要する時間が短時間である、極めて高感
度で定量することができる、簡便な装置を用いて測定す
ることができる、作用セルは液密的条件下で操作する必
要がない（すなわち開放系で操作することが可能であ
る）ことが判る。

【００７９】応用例３ （ヒスタミンばかりでなく、カダベリン及びプトレッシ
ンも含有する試料に「ヒスタミンには作用するが、カダ
ベリン及びプトレッシンには作用しない、実施例１で得
られた本酵素」を作用させ、生成する還元型電子キャリ
アーを測定するヒスタミンの定量法）上記応用例１のヒ
スタミンの定量法において、「各濃度のヒスタミン標準
溶液」に代えて、「各濃度のヒスタミン標準溶液に該ヒ
スタミンと同濃度のカダベリン及びプトレッシンを含有
させた試料液」を用いる以外は、全く同様にして、ヒス
タミンの定量を行った。また、比較のため、上記と同一
の試料液についてＨＰＬＣ法（従来法）によりヒスタミ
ンを定量した。これらの測定値の相関関係を調べたとこ
ろ、図６と全く同じ結果が得られた。即ち、「各濃度の
ヒスタミン標準溶液に該ヒスタミンと同濃度のカダベリ
ン及びプトレッシンを含有させた試料液」を用いた場合
も、ヒスタミンの標準液を用いた場合と比べ、反応液の
発色量に差が全くみられなかった。従って本酵素を用い
たヒスタミンの定量法は、他のアミン類には影響されず
にヒスタミンだけを効率よく定量できることが判る。特
にカダベリン及びプトレッシンは、魚肉が腐敗する際、
ヒスタミンとほぼ同時に生成するアミンであり、従来法
ではこれらを何らかの方法で、分画（分離）除去する必
要があったのに対し、本発明では、ヒスタミンには作用
するが、カダベリン及びプトレッシンには作用しない基
質特異性を有する酵素を用いることにより、面倒で時間
を要する分離操作は全く行うことなくヒスタミンの定量
を行うことができることが判る。

【００８０】

【発明の効果】本発明によれば、ヒスタミンに対して特
異性の高い、すなわち試料中のアミン類のうち、カダベ
リンやプトレッシンといった生体アミンなどには反応せ
ず、検出目的のヒスタミンのみによく作用（反応）し
て、これを選択的に定量することが可能な、ヒスタミン
デヒドロゲナーゼを得ることができる。また 本発明
は、安定剤を添加しなくとも、水性溶液に溶解した後、
常温で少なくとも１週間は安定に保存することができる
ヒスタミンデヒドロゲナーゼを得ることができる。ま
た、試料中より面倒な妨害物質（不純物）を除去する前
処理操作を行うことなく、短時間に、極微量の（すなわ
ち感度よく）ヒスタミンを、簡便な装置を用いて、開放
系で、しかも測定値の信頼性を損なうことなく、測定す
ることが可能なヒスタミンデヒドロゲナーゼを得ること
ができる。また、本発明はこのような特徴を有するヒス
タミンデヒドロゲナーゼを、効率よく得ることができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素の至適ｐＨを示すグラフ。

【図２】本酵素の安定ｐＨ範囲を示すグラフ。

【図３】本酵素の作用適温の範囲を示すグラフ。

【図４】本酵素の熱安定性を示すグラフ。

【図５】本酵素を用いたヒスタミンの定量法に利用され
る検量線を示すグラフ。

【図６】サバ水煮缶詰の該サバ肉に含まれるヒスタミン
量を、本酵素を用いたヒスタミンの定量法と従来のＨＰ
ＬＣ法とで分析したときの相関関係を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈴木 勝 千葉県野田市野田250番地 キッコーマン 株式会社内 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 FF04E FF09E LL03

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒスタミンに特異的に作用しかつ至適温度
   が６５〜７５℃であるヒスタミンデヒドロゲナーゼ。
2. 【請求項２】以下の理化学的性質を有することを特徴と
   する請求項１に記載のヒスタミンデヒドロゲナーゼ。作
   用：１モルのヒスタミンを電子受容体の存在下、酸化的
   脱アミノ反応により１モルの４―イミダゾリルアセトア
   ルデヒドと１モルのアンモニアを生成する。 基質特異性：ヒスタミンに特異的に作用する。 至適温度：６５〜７５℃。 温度による失活の条件：ｐＨ８．０、１５分処理で、０
   〜６０℃で安定。 分子量：約１５０，０００（サブユニット約７１，００
   ０×２）。
3. 【請求項３】リゾビウム属に属し、請求項１記載のヒス
   タミンデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を培地に培
   養し、その培養物から該ヒスタミンデヒドロゲナーゼを
   採取することを特徴とするヒスタミンデヒドロゲナーゼ
   の製造法。
4. 【請求項４】リゾビウム属に属し、請求項１記載のヒス
   タミンデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を、ヒスタ
   ミン又はヒスタミン塩を含有する培地に培養し、その培
   養物から該ヒスタミンデヒドロゲナーゼを採取すること
   を特徴とするヒスタミンデヒドロゲナーゼの製造法。