CN103797128B - 乙醇胺磷酸酯的测定方法 - Google Patents
乙醇胺磷酸酯的测定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103797128B CN103797128B CN201280039054.8A CN201280039054A CN103797128B CN 103797128 B CN103797128 B CN 103797128B CN 201280039054 A CN201280039054 A CN 201280039054A CN 103797128 B CN103797128 B CN 103797128B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phosphate
- ethanolamine
- enzyme
- acetaldehyde
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N O-phosphoethanolamine Chemical compound NCCOP(O)(O)=O SUHOOTKUPISOBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 73
- 238000003556 assay Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 41
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 11
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical group CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 claims description 9
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 claims description 9
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 7
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 claims description 5
- -1 NAD+ Chemical compound 0.000 claims description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 claims description 3
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 claims description 3
- NKKPYEQGRMPARG-UHFFFAOYSA-N C(O)CN.[P] Chemical compound C(O)CN.[P] NKKPYEQGRMPARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-L NADH(2-) Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-L 0.000 claims 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 claims 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 abstract description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 23
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 21
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 101150116670 gabT gene Proteins 0.000 description 11
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical group NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 7
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N (+/-)-DABA Natural products NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 3
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 3
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000588912 Pantoea agglomerans Species 0.000 description 2
- 241000588696 Pantoea ananatis Species 0.000 description 2
- 102000002798 Phenylalanine-tRNA Ligase Human genes 0.000 description 2
- 108010004478 Phenylalanine-tRNA Ligase Proteins 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N Pyridoxal Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZYIWIGXKQKOVNP-UHFFFAOYSA-N 3-aminopropoxy(methyl)phosphinic acid Chemical class CP(O)(=O)OCCCN ZYIWIGXKQKOVNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000637385 Acinetobacter baumannii ACICU Species 0.000 description 1
- 208000017194 Affective disease Diseases 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 241000251557 Ascidiacea Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 1
- 235000002567 Capsicum annuum Nutrition 0.000 description 1
- 241000423302 Clostridium acetobutylicum ATCC 824 Species 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N D-threitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 208000019022 Mood disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000052923 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241001482072 Oikopleura dioica Species 0.000 description 1
- 241001480343 Pantoea vagans Species 0.000 description 1
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000320117 Pseudomonas putida KT2440 Species 0.000 description 1
- 241000187694 Rhodococcus fascians Species 0.000 description 1
- 241001321399 Rhodococcus hoagii 103S Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000225553 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi str. CT18 Species 0.000 description 1
- 241000438274 Sulfolobus tokodaii str. 7 Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000001511 capsicum annuum Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009970 fire resistant effect Effects 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
- C12Q1/52—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving transaminase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明提供用于简便地测定样品中的乙醇胺磷酸酯的方法、以及该方法中使用的试剂、试剂盒、程序等。一种乙醇胺磷酸酯的测定方法，包括：进行第1酶反应的第1工序，向测定样品中添加能够催化由乙醇胺磷酸酯生成乙醛的反应的酶而使之生成乙醛、磷酸和氨；以及第2工序，对生成的前述乙醛、前述磷酸以及前述氨的至少任一者进行定量，确定前述测定样品中的乙醇胺磷酸酯量。
Description
技术领域
本发明涉及样品中存在的乙醇胺磷酸酯的测定方法。
背景技术
抑郁症为情感障碍的一种，主要症状为情绪低落和兴趣喜悦丧失。根据对日本的医疗机构的调查，2008年的抑郁症的患者数达到70万人以上。但是，抑郁症的诊断大体上依赖于医师或心理医生对于患者的精神面貌的主观判断、或者患者自身的主观判断或自诉，难以说进行了客观的判断。因此，为了客观地诊断抑郁症，近年来，尝试着使用患者体液中的成分作为抑郁症的诊断的尺度。
现有的，作为抑郁症的预测标志，报告了使用体液中的色氨酸或其分解物、特定基因的表达量等(专利文献1、2)，本发明人等发现血液中的乙醇胺磷酸酯作为用于诊断抑郁症的生物标志是有用的(专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2006/105907号
专利文献2：日本特开2008-253258号公报
专利文献3：国际公开第2011/019072号
发明内容
发明要解决的问题
乙醇胺磷酸酯作为抑郁症的生物标志可靠性高且优异，但其测定限于使用CE-TOFMS(毛细管电泳飞行时间质谱capillary electrophoresistime-of-flight mass spectrometer)装置的测定方法。但是，CE-TOFMS的测定消耗时间(30～40分钟)；另外，装置为昂贵且精密的分析仪器所以限于大学或分析机构等所有；地方的医院或诊所等中需要一种时间更短且简便的乙醇胺磷酸酯测定方法以便利用乙醇胺磷酸酯作为抑郁症的生物标志。
因此，本发明的目的在于提供用于简便地测定样品中的乙醇胺磷酸酯的方法、以及该方法中使用的试剂、试剂盒、程序等。
用于解决问题的方案
通过以下的本发明达到前述目的。即，本发明提供一种乙醇胺磷酸酯的测定方法，包括：进行第1酶反应的第1工序，向测定样品中添加能够催化由乙醇胺磷酸酯生成乙醛的反应的酶而使之生成乙醛、磷酸和氨；以及第2工序，对生成的前述乙醛、前述磷酸以及前述氨的至少任一者进行定量而确定前述测定样品中的乙醇胺磷酸酯量。
前述酶优选为具有GabT结构域的酶。
发明的效果
通过本发明，提供用于简便地测定样品中的乙醇胺磷酸酯的方法、以及该方法中应用的试剂、能够简便地诊断抑郁症的诊断剂。
附图说明
图1为表示Pan裂解液的乙醇胺磷酸酯(EAP)分解活性的曲线图。
图2为表示Pan裂解液的利用阴离子色谱的分析结果的曲线图(下)和各级分的SDS-PAGE结果(上)。
图3为表示Pan裂解液的利用疏水色谱的分析结果的曲线图(下)和各级分的SDS-PAGE结果(上)。
图4为表示Pan裂解液的利用羟基磷灰石柱的分析结果的曲线图(下)和各级分的SDS-PAGE结果(上)。
图5为表示针对GabT表达系统的乙醇胺磷酸酯分解酶活性的测定结果的曲线图。
图6为表示GabT的比对结果的图。
具体实施方式
本发明的乙醇胺磷酸酯的测定方法中，在第1工序中使用催化乙醇胺磷酸酯(CAS登录号：1071-23-4)水解而生成乙醛、磷酸和氨的下述式(1)所示的反应(以下，有时称为“第1酶反应”)的酶(以下，有时称为“第1酶”)。
到目前为止，催化式(1)的一步反应的酶还没有被鉴定出来，但本发明人等从菠萝泛菌(Pantoea ananatis)菌株中分离出具有催化上述反应的活性的酶，鉴定出该酶为γ-氨基丁酸氨基转移酶(GabT)。
本发明的测定方法中，在第2工序中，通过对前述酶反应生成的乙醛、磷酸以及氨的至少任一者进行定量而确定前述样品中的乙醇胺磷酸酯量。定量的对象可以为1种，然而通过定量2种以上，能够降低测定误差。
在前述第2工序中定量乙醛的情况下，通过利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)良好地吸收波长340nm的紫外线的性质，能够灵敏度良好地定量。具体而言，可列举出包含下述的两个副工序的方法。
作为最初的副工序，向前述第1工序后的测定样品中添加乙醛脱氢酶(ALDH)和氧化型烟酰胺脱氢酶(NAD+)，将样品中的乙醛氧化成醋酸(参照式(2))。
该反应中，NAD+被还原而成为NADH，由于只有NADH较强地吸收340nm的紫外线，所以通过作为其后的副工序的、测定前述反应后的测定样品在340nm中的吸光度，能够定量前述第1工序后的测定样品的乙醛生成量，能够由该值确定测定样品中的乙醇胺磷酸酯量。第2工序中定量乙醛时，可以利用市售的乙醛定量试剂盒(例如，Roche Diagnostics GmbH制“F-KitAcetaldehyde”)。
前述第1工序中，为了进一步提高酶反应的效率优选组合使用辅酶，作为优选的辅酶可列举出磷酸吡哆醛。
上述第1工序中使用的酶，只要是能够催化前述式(1)的反应的酶，就没有特别的限制；所述式(1)的反应将乙醇胺磷酸酯水解，通过一步反应而生成乙醛、磷酸和氨；作为具有该酶活性的酶的例子，可列举出具有GabT结构域的酶。GabT结构域是指由GXXXBADEBQXGFZRXG定义的氨基酸序列区域(此处，X是指任意的氨基酸；B是指选自由I、L和V组成的组的任意支链氨基酸（branched amino acid）；Z是指G或A。)。
如后述的实施例所示，本发明人等在古细菌、原核生物以及包括植物、动物等真核生物的广阔范围的生物种中发现了与γ-氨基丁酸氨基转移酶的GabT结构域具有90%以上的高同源性的酶。因此，作为具有催化前述式(1)的反应的酶活性、能够适用于上述第1工序中的酶的例子，可列举出具有与GabT结构域的同源性为90%以上的氨基酸序列区域的蛋白质。
另外，作为具有催化前述式(1)的反应的酶活性且具有GabT结构域的酶的具体例子，可列举出本发明人等鉴定的来源于菠萝泛菌的具有GabT结构域的蛋白质(序列表的序列号1)、或来源于大肠杆菌的具有GabT结构域的蛋白质(序列号2)。用于本发明的测定方法的第1工序的情况下，只要具有催化前述式(1)的反应的活性，则既可以为由在序列号1或2所表示的氨基酸序列中缺失、置换或附加有1或多个氨基酸的氨基酸序列构成的蛋白质；也可以为由与序列号1或2所示的氨基酸序列的同源性为90%以上的氨基酸序列构成的蛋白质。上述酶也可以不是纯化后的物质，只要具有上述酶活性，任选利用粗纯化物或包含上述酶的细胞裂解液。作为细胞裂解液的例子，可列举出将菠萝泛菌的细胞裂解液离心分离而得到的上清。
本发明的乙醇胺磷酸酯的测定方法的步骤非常地简单，能够组装到现有的生物化学检测装置中。具体而言，将测定样品置于测定装置，向测定样品中添加第1酶，使之生成乙醛、磷酸和氨之后，对前述乙醛、磷酸和氨的至少任一者进行定量。该方法不存在依赖于人的主观的方面，所以适合于利用测定装置进行的常规处理，能够迅速并且简便地测定大量的样品。这样的处理可以通过对测定装置中内置有如下程序的计算机进行读取而进行，所述程序在测定装置内实施向测定样品中添加酶的前述第1工序和对乙醛、磷酸和氨的至少任一者进行定量的前述第2工序。
如前述，血浆中的乙醇胺磷酸酯的浓度与抑郁症之间存在显著的相关(参照专利文献3)。因此，通过在前述程序中追加根据测定样品中的乙醇胺磷酸酯的测定值判断提供测定样品的被检者是否为抑郁症患者的工序、以及将得到的判断结果输出的工序，能够判断提供样品的被检者是否为抑郁症。
上述程序任选存储于能够用计算机读取的存储介质中，也任选存储于附属于测定装置的计算机的存储介质中。存储介质为硬盘、CD、DVD、USB存储器、盘(注册商标)等，没有特别的限定。
另外，通过本发明，提供乙醇胺磷酸酯测定用试剂，其包含能够催化由乙醇胺磷酸酯生成乙醛的反应的酶。能够催化由乙醇胺磷酸酯生成乙醛的反应的酶，可以使用与上述乙醇胺磷酸酯的测定方法的第1工序中使用的酶同样的物质；具体而言，可列举出由序列表的序列号1和序列号2中记载的氨基酸序列构成的蛋白质。
为了进一步提高前述酶的反应效率，前述乙醇胺磷酸酯测定用试剂中优选进一步包含该酶的辅酶，作为辅酶的具体例子可列举出磷酸吡哆醛。前述酶，只要是能够催化前述式(1)的反应的酶，就没有特别的限制；所述式(1)的反应将乙醇胺磷酸酯水解而通过一步反应生成乙醛、磷酸和氨；作为具有该酶活性的酶的例子，可列举出具有GabT结构域的酶。另外，也可以为具有与上述GabT结构域的同源性为90%以上的氨基酸序列区域的蛋白质。
另外，如上所述，由于血浆中的乙醇胺磷酸酯的浓度与抑郁症之间存在显著的相关，所以前述乙醇胺磷酸酯测定用试剂能够用作抑郁症诊断剂。
另外，通过本发明，提供乙醇胺磷酸酯测定用试剂盒，其包括独立收纳有能够催化由乙醇胺磷酸酯生成乙醛的反应的酶的容器。如上所述，由于能够由血浆中的乙醇胺磷酸酯浓度判断是否患有抑郁症，所以，通过使用本发明的乙醇胺磷酸酯测定用试剂盒，在进行健康诊断或社区内体检中，能够从就诊者中进行抑郁症患者的筛选；或者非专业医师进行抑郁症疑似患者的诊断；或者专科医生与问诊一起进行诊断，能够判断治疗效果、确定治疗方针。
前述乙醇胺磷酸酯测定用试剂盒优选进而包括独立收纳有前述酶的辅酶的容器，作为辅酶的例子可列举出磷酸吡哆醛。另外，前述酶，只要是能够催化前述式(1)的反应的酶，就没有特别的限制；所述式(1)的反应将乙醇胺磷酸酯水解通过一步反应而生成乙醛、磷酸和氨；作为具有该酶活性的酶的例子，可列举出具有GabT结构域的酶。另外，也可以为具有与上述GabT结构域的同源性为90%以上的氨基酸序列区域的蛋白质。
实施例
＜1.包含乙醇胺磷酸酯分解酶的细胞裂解液的调制＞
选定欧文氏菌3株(胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)LMG20103株以及欧文氏·藤瘤病菌(Erwinia milletiae))作为具有乙醇胺磷酸酯裂解酶活性的菌株，上述菌株购自独立行政法人农业生物资源研究所(Incorporated Administrative Agency，National Institute ofAgrobiological Sciences)。将前述3株在包含乙醇胺作为唯一氮源的贫营养合成培养基中液体培养，将得到的菌落涂布于LB平板上，30℃下培养一晩，在各个平板上得到菌落。
对于各平板，采集2～3个菌落，将其悬浮于2～5mL的液体培养基中，30℃、170rpm下培养。上述3株中，只有菠萝泛菌可见显著的增殖，将该菌株培养至OD600＝1.0为止，培养后离心分离而收集菌体。
将得到的菌株悬浮于Buffer A(包含2-巯基乙醇(终浓度1mM)的Tris-盐酸缓冲液(终浓度50mM)、pH7.5)中，利用超声处理进行菌体破碎，离心分离后回收上清，调制裂解液(以下，简称为Pan裂解液。)。
＜2.Pan裂解液的乙醇胺磷酸酯分解酶活性的测定＞
[参考例1]
向包含作为反应底物的乙醇胺磷酸酯(终浓度2mM)和作为辅酶的磷酸吡哆醛(终浓度2mM)的反应液1mL中加入Pan裂解液(终体积比5%)，30℃下静置。1小时后，将样品200μL通过过滤(Microcon(注册商标)Mw：5k)去除蛋白，停止反应后，使用四极质谱计(Agilent Technologies,Inc.制Quadropole LC／MS6140)，测定滤液中的乙醇胺磷酸酯的浓度。同样地，对于实验开始起4小时后，20小时后的样品，也进行同样的测定。将结果在图1中用黑圆圈(●)表示。
[参考例2]
使用将Pan裂解液用Buffer A稀释至10倍而成的物质代替Pan裂解液，除此以外，与参考例1同样地进行测定。将结果在图1中用黑三角(▲)表示。
[参考例3]
使用将Pan裂解液用Buffer A稀释至100倍而成的物质代替Pan裂解液，除此以外，与参考例1同样地进行测定。将结果在图1中用黑色菱形(◆)表示。
[参考例4]
作为阴性对照，使用Buffer A代替Pan裂解液。除此以外，与参考例1同样地进行测定。将结果在图1中用黑色方块(■)表示。
由图1所示的结果可知，随着时间的经过，测定样品中的乙醇胺磷酸酯被Pan裂解液中的酶分解而减少。即，表示Pan裂解液中包含乙醇胺磷酸酯分解酶。
＜3.来源于菠萝泛菌的乙醇胺磷酸酯裂解酶的分离＞
在与上述＜1＞相同的培养基、条件下将菠萝泛菌用液体培养基大量培养。将得到的菌体悬浮于Buffer B(包含氯化镁(终浓度10mM)的Tris-盐酸缓冲液(终浓度20mM)、pH7.5)中，利用超声处理进行菌体破碎，离心分离而得到上清级分。将该级分首先用阴离子色谱(GE Healthcare Japan Corporation制DE-52)在100～500mM氯化钠的梯度下洗脱分级，对于各级分进行SDS-PAGE。另外，将上述各级分加入至包含乙醇胺磷酸酯(终浓度1mM)和磷酸吡哆醛(终浓度1mM)的Tris-盐酸缓冲液(终浓度20mM；pH7.5)中至终体积比为30%，分别在30℃下使之反应之后，根据市售的乙醛定量试剂盒(RocheDiagnostics K.K.制F-Kit Acetaldehyde)的操作流程，对于反应后的各样品添加乙醛脱氢酶(ALDH)和氧化型烟酰胺脱氢酶(NAD+)，使之进行式(2)的反应，然后测定340nm的吸光度。由该吸光度将上述式(1)的反应后的样品中的乙醛定量，测定式(1)的反应前的样品中的乙醇胺磷酸酯分解酶活性。将SDS-PAGE的结果示于图2的上侧、将乙醇胺磷酸酯分解酶活性的测定结果示于图2的下侧，两图的级分位于相同列中而表示。最下行的数字为回收级分的序号。ft表示流通（flow through），w表示利用包含100mM氯化钠的BufferB(Buffer C-1)的洗涤液，wo表示利用包含500mM氯化钠的Buffer(Buffer C-2)的洗涤液。如图2所示，序号12至18的回收级分确认有强的乙醇胺磷酸酯分解酶活性。另外，由SDS-PAGE的结果可以认为，75kDa、45kDa和40kDa附近的条带为乙醇胺磷酸酯分解酶的可能性高。
接着，将上述序号12至18的级分回收，将其通过疏水色谱(TOSOHCORPORATION制Ether-650)供于1～0M硫酸铵下的溶出分级。作为洗脱液，使用Buffer B和包含1M硫酸铵的Buffer B(Buffer D-1)。与上述阴离子色谱同样地对于各级分进行SDS-PAGE和使用乙醛定量试剂盒的吸光度测定。将结果示于图3中。如图3所示，序号7至10的回收级分确认有强的乙醇胺磷酸酯分解酶活性。另外，由SDS-PAGE的结果可以认为，75kDa、45kDa和25kDa附近的条带为乙醇胺磷酸酯分解酶的可能性高。
将上述疏水色谱的序号7至10的级分回收，将其供于羟基磷灰石柱(Bio-Rad Laboratories,Inc.制HT-Gel)的分级中。作为洗脱液，使用10mM磷酸钾溶液(pH9.0)(Buffer E-1)和300mM磷酸钾溶液(pH9.0)(Buffer E-2)。与上述阴离子色谱同样地对于各级分进行SDS-PAGE和使用乙醛定量试剂盒的吸光度测定。将结果示于图4中。如图4可知，序号w和1的回收级分确认有强的乙醇胺磷酸酯分解酶活性。另外，由SDS-PAGE的结果可知，45kDa和25kDa附近的条带为乙醇胺磷酸酯分解酶的可能性高。
从上述3种色谱的分级的结果中，作为乙醇胺磷酸酯分解酶的候补，选出75kDa、45kDa和25kDa的3个条带。
另外，上述的实验中，向包含乙醇胺磷酸酯的溶液中添加菠萝泛菌的细胞裂解液而产生乙醛，由此可以确认上述乙醇胺磷酸酯分解酶为催化式(1)的反应的酶。
＜4.来源于菠萝泛菌的乙醇胺磷酸酯裂解酶的鉴定＞
将上述＜3＞中选出的3个条带从SDS-PAGE凝胶中回收，将氨基酸序列的解析委托给专业人员(Hokkaido System Science Co.,Ltd.)。该结果确认，各个条带与以下的蛋白质具有高的同源性，由分子量、N末端氨基酸序列也确认了与以下的蛋白质一致的可能性高。
75kDa：苯丙氨酰-tRNA合成酶、β亚基[成团泛菌(Pantoea vagans)C9-1]
45kDa：GabT(菠萝泛菌LMG20103)
25kDa：WrbA(菠萝泛菌LMG20103)
有报告指出，上述蛋白质中的苯丙氨酰-tRNA合成酶和WrbA催化与脱氨基、脱磷酸基不同的反应，所以从乙醇胺磷酸酯分解酶的候补中排除。
可以确认剩余的GabT基因存在于比较少数种类的微生物以及植物、包含人的动物的基因组中，动物中报告有在脑中的表达。作为GabT的功能，已知有：将γ-氨基丁酸(GABA)作为底物，磷酸吡哆醛依赖性地在GABA和有机酸之间转移氨基。
另外，据报告GabT对于GABA以外的范围比较广的底物也具有氨基转移(脱氨基)活性；据报告来源于大肠杆菌的GabT有与乙醇胺磷酸酯结构类似的3-氨基丙基(甲基)膦酸的氨基转移活性。由于式(1)的乙醇胺磷酸酯分解反应伴随着脱磷酸基，所以即便与GabT的已知反应方式不同，然而考虑到上述类似点则判断GabT为催化式(1)的反应的酶的可能性高。
＜5.菠萝泛菌gabT基因以及大肠杆菌gabT基因的克隆＞
通过利用PCR的已知的克隆方法，由菠萝泛菌的基因组得到与gabT基因一致的条带，将其与pUC18连接并扩增。委托专业人员(Hokkaido SystemScience Co.,Ltd.)进行DNA序列解析，确认得到目标的gabT基因。将得到的来源于菠萝泛菌的GabT的氨基酸序列在附加的序列表中作为序列号1而表示。
同样地，从基因组中确认有gabT基因的存在的大肠杆菌E.coli(wt)中提取基因组，通过已知的克隆方法得到与gabT基因一致的条带，将其与pUC18连接并扩增。由DNA序列解析的结果，确认得到目标的gabT基因。将得到的来源于E.coli的GabT的氨基酸序列在附加的序列表中作为序列号2表示，将来源于E.coli的gabT基因的碱基序列作为序列号3表示。
＜6.GabT表达系统的构建和酶活性的确认＞
[参考例5]
将来源于菠萝泛菌的gabT基因(将表达产物简称为P-GabT)重组入表达载体pET23a中，转化大肠杆菌BL21(DE3)株。将转化的大肠杆菌在LB培养基中培养，在前稳态添加IPTG而诱导P-GabT的表达。从诱导起5小时后离心分离而收集菌体，将得到的菌体悬浮于包含磷酸吡哆醛的溶菌缓冲液(10mM磷酸吡哆醛、100mM氯化钾、1mM乙二胺四乙酸、100mM氯化钾、1mM二硫苏糖醇、50mM Tris-盐酸、pH7.5)中，利用超声处理进行菌体破碎。
将该菌体裂解液离心分离并回收上清级分，分别将离心分离前的菌体裂解液(简称为total)和上清级分(简称为sup)加入至包含乙醇胺磷酸酯(终浓度1mM)和磷酸吡哆醛(终浓度1mM)的Tris-盐酸缓冲液(终浓度20mM；pH7.5)中以成为终体积比30%，分别在30℃下使之反应之后，根据市售的乙醛定量试剂盒(Roche Diagnostics K.K.制F-Kit Acetaldehyde)的操作流程，对于反应后的各样品添加乙醛脱氢酶(ALDH)和氧化型烟酰胺脱氢酶(NAD+)，使之进行式(2)的反应后测定340nm的吸光度。由该吸光度将上述式(1)的反应后的样品中的乙醛定量，测定式(1)的反应前的样品中的乙醇胺磷酸酯分解酶活性。将结果在图5中用P-表示。图中，纵轴表示340nm的吸光度，误差线表示3次重复测定而得到的标准偏差。
[参考例6]
使用来源于大肠杆菌E.coli的gabT基因(将表达产物简称为E-GabT)代替来源于菠萝泛菌的gabT基因，除此以外，按照与参考例5同样的方法、步骤进行实验，得到菌体裂解液和上清级分，分别对其测定乙醇胺磷酸酯分解酶活性。将结果在图5中用E-表示。
[参考例7]
作为阴性对照，只使用pET23a进行转化，除此以外，按照与参考例5同样的方法、步骤进行实验，分别对于菌体裂解液和上清级分测定乙醇胺磷酸酯分解酶活性。将结果在图5中用NC表示。
由参考例5～7的结果可以确认，图5左侧的菌体裂解液中，P-GabT与E-GabT两者与阴性对照比较，均具有高的乙醇胺磷酸酯分解酶活性。另一方面，图5右侧的上清级分中，P-GabT与E-GabT两者的酶活性均与阴性对照为相同程度。另外，SDS-PAGE中，菌体裂解液中P-GabT、E-GabT在45kDa处均确认有浓的条带，上清级分则与对照是同程度的(未图示)。由以上的结果可知，P-GabT与E-GabT均以包涵体形式存在于沉淀级分中。
＜7.GabT结构域序列的确定＞
[参考例8]
使用市售的程序(CLC Bio Japan,Inc.制CLC Sequence Viewer)，对参考例5～7中使用的菠萝泛菌、大肠杆菌以及来源于古细菌中的超嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii str.7；序列号4)、哺乳类中的人(Homo sapiens；序列号5)和小鼠(Mus musculus；序列号6)以及植物中的拟南芥(Arabidopsis thaliana；序列号7)的GabT(哺乳类中氨基丁酸转氨酶)的氨基酸序列进行比对。将结果示于图6中。图6中，提取出用粗线包围的包含第301位至第317位的氨基酸的区域作为保守性高的区域。需要说明的是，图中“consensus”行中所示的氨基酸为60%以上保守的残基。
[参考例9]
除了前述6种生物的GabT序列以外，还对于沙门氏菌(Salmonella entericasubsp.enterica serovar Typhi strain CT18)、梭状芽胞杆菌(丙酮丁醇梭菌ATCC824)、假单胞菌(恶臭假单胞菌KT2440)、红球菌(马红球菌103S)、不动杆菌属(鲍氏不动杆菌ACICU)、分枝杆菌属(Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis K-10)、牛(Bos taurus)、海鞘(Oikopleura dioica)、玉米(Zeamays)以及辣椒(Capsicum annuum)，验证参考例8中设定的结构域区域的保守性。上述第301位起至第317位的氨基酸序列在上述16种生物种中具有90%以上的同源性，将该区域定义为GabT结构域。
GabT结构域为由以下的氨基酸序列构成的氨基酸序列区域：
GXXXBADEBQXGFZRXG
(其中，X是指任意的氨基酸；B是指选自由I、L和V组成的组的任意支链氨基酸；Z是指G或A。)。将各生物种的GabT结构域序列示于表1中。表1的序列中，与GabT结构域不同的碱基划有下划线。
[表1]
Claims (10)
1.一种乙醇胺磷酸酯的测定方法，包括：
进行第1酶反应的第1工序，向测定样品中添加能够催化由乙醇胺磷酸酯生成乙醛的反应的酶而使之生成乙醛、磷酸和氨；以及
第2工序，对生成的所述乙醛、所述磷酸以及所述氨的至少任一者进行定量，确定所述测定样品中的乙醇胺磷酸酯量；
所述酶为由序列号1或2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，所述第2工序包括：
进行第2酶反应的副工序，向所述第1酶反应后的测定样品中添加乙醛脱氢酶即ALDH和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即NAD+，使之生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即NADH；以及
利用光谱化学方式对生成的所述还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即NADH进行定量，从而对所述第1酶反应后的测定样品中的所述乙醛进行定量的副工序。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其中，在所述第1工序中，进而向所述测定样品中添加辅酶。
4.根据权利要求3所述的测定方法，其中，所述辅酶为磷酸吡哆醛。
5.一种能够催化由乙醇胺磷酸酯生成乙醛的反应的酶在制备乙醇胺磷酸酯测定用试剂中的用途，所述乙醇胺磷酸酯测定用试剂包含能够催化由乙醇胺磷酸酯生成乙醛的反应的酶，
所述酶为由序列号1或2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。
6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述乙醇胺磷酸酯测定用试剂进而包含所述酶的辅酶。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述辅酶为磷酸吡哆醛。
8.一种抑郁症诊断剂，其含有乙醇胺磷酸酯测定用试剂，所述乙醇胺磷酸酯测定用试剂包含能够催化由乙醇胺磷酸酯生成乙醛的反应的酶，
所述酶为由序列号1或2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。
9.一种包括独立收纳有能够催化由乙醇胺磷酸酯生成乙醛的反应的酶的容器在制备乙醇胺磷酸酯测定用试剂盒中的用途，所述乙醇胺磷酸酯测定用试剂盒包括独立收纳有能够催化由乙醇胺磷酸酯生成乙醛的反应的酶的容器，
所述酶为由序列号1或2所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。
10.根据权利要求9所述的用途，所述乙醇胺磷酸酯测定用试剂盒进而包括独立收纳有所述酶的辅酶的容器。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610780708.2A CN106399458A (zh) | 2011-11-10 | 2012-11-06 | 乙醇胺磷酸酯的测定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011246881 | 2011-11-10 | ||
| JP2011-246881 | 2011-11-10 | ||
| PCT/JP2012/078749 WO2013069645A1 (ja) | 2011-11-10 | 2012-11-06 | エタノールアミンリン酸の測定方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610780708.2A Division CN106399458A (zh) | 2011-11-10 | 2012-11-06 | 乙醇胺磷酸酯的测定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103797128A CN103797128A (zh) | 2014-05-14 |
| CN103797128B true CN103797128B (zh) | 2016-09-07 |
Family
ID=48290019
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610780708.2A Pending CN106399458A (zh) | 2011-11-10 | 2012-11-06 | 乙醇胺磷酸酯的测定方法 |
| CN201280039054.8A Active CN103797128B (zh) | 2011-11-10 | 2012-11-06 | 乙醇胺磷酸酯的测定方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610780708.2A Pending CN106399458A (zh) | 2011-11-10 | 2012-11-06 | 乙醇胺磷酸酯的测定方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9631224B2 (zh) |
| EP (1) | EP2778233B1 (zh) |
| JP (2) | JP5688163B2 (zh) |
| CN (2) | CN106399458A (zh) |
| DK (1) | DK2778233T3 (zh) |
| WO (1) | WO2013069645A1 (zh) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10087717B2 (en) | 2011-10-17 | 2018-10-02 | Schlumberger Technology Corporation | Dual use cable with fiber optics for use in wellbore operations |
| GB2518774B (en) | 2012-06-28 | 2020-01-29 | Schlumberger Holdings | High power opto-electrical cable with multiple power and telemetry paths |
| EA034419B1 (ru) * | 2014-09-26 | 2020-02-06 | Хьюман Метаболоми Текнолоджис Инк. | Способ выбора лекарственного препарата для лечения депрессии |
| US11725468B2 (en) | 2015-01-26 | 2023-08-15 | Schlumberger Technology Corporation | Electrically conductive fiber optic slickline for coiled tubing operations |
| US10049789B2 (en) | 2016-06-09 | 2018-08-14 | Schlumberger Technology Corporation | Compression and stretch resistant components and cables for oilfield applications |
| WO2018062204A1 (ja) * | 2016-09-30 | 2018-04-05 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | エタノールアミンリン酸の測定方法 |
| WO2018061194A1 (ja) * | 2016-09-30 | 2018-04-05 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | エタノールアミンリン酸の測定方法 |
| JP7283469B2 (ja) * | 2018-03-26 | 2023-05-30 | 東洋紡株式会社 | エタノールアミンリン酸リアーゼ組成物 |
| WO2020013302A1 (ja) | 2018-07-13 | 2020-01-16 | 株式会社生命科学インスティテュート | 精神・神経系疾患の推定システム、推定プログラムおよび推定方法 |
| CN113166794A (zh) * | 2018-12-13 | 2021-07-23 | 龟甲万株式会社 | 磷酸乙醇胺的定量方法、定量用的氧化还原酶、定量用组合物、定量用试剂盒和定量用传感器 |
| EP4170041A1 (en) | 2020-06-17 | 2023-04-26 | Kikkoman Corporation | Method for quantifying ethanolamine phosphate, oxide reductase for quantification, quantification composition, quantification kit, sensor chip, and sensor |
| US11754536B2 (en) | 2021-11-01 | 2023-09-12 | Matterworks Inc | Methods and compositions for analyte quantification |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001157579A (ja) * | 1998-09-25 | 2001-06-12 | Kikkoman Corp | ヒスタミンデヒドロゲナーゼ及びその製造法 |
| WO2011019072A1 (ja) * | 2009-08-12 | 2011-02-17 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | うつ病のバイオマーカー、うつ病のバイオマーカーの測定法、コンピュータプログラム、及び記憶媒体 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60192257A (ja) * | 1984-03-13 | 1985-09-30 | Horiba Ltd | アンモニア濃度測定装置 |
| JP2534859B2 (ja) * | 1987-03-04 | 1996-09-18 | オリエンタル酵母工業株式会社 | 生体物質のエンザイムアツセイ |
| DE3932015A1 (de) * | 1988-12-15 | 1991-04-04 | Hoechst Ag | Gen und genstruktur, codierend fuer eine aminotransferase, mikroorganismen, die dieses gen exprimieren, und transaminierungsverfahren unter verwendung des expressionsprodukts |
| JPH0937796A (ja) * | 1995-07-31 | 1997-02-10 | Oji Paper Co Ltd | 還元糖の還元末端残基数の測定方法 |
| US6103471A (en) * | 1998-01-29 | 2000-08-15 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Human beta-alanine-pyruvate aminotransferase |
| US7314974B2 (en) * | 2002-02-21 | 2008-01-01 | Monsanto Technology, Llc | Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties |
| WO2006105907A1 (en) | 2005-04-06 | 2006-10-12 | Diamed-Eurogen N.V. | Neurodegenerative markers for psychiatric conditions |
| JP5442208B2 (ja) | 2007-03-15 | 2014-03-12 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | うつ病の検査方法 |
-
2012
- 2012-11-06 DK DK12848737.8T patent/DK2778233T3/en active
- 2012-11-06 CN CN201610780708.2A patent/CN106399458A/zh active Pending
- 2012-11-06 CN CN201280039054.8A patent/CN103797128B/zh active Active
- 2012-11-06 WO PCT/JP2012/078749 patent/WO2013069645A1/ja active Application Filing
- 2012-11-06 US US14/237,488 patent/US9631224B2/en active Active
- 2012-11-06 JP JP2013542990A patent/JP5688163B2/ja active Active
- 2012-11-06 EP EP12848737.8A patent/EP2778233B1/en active Active
-
2014
- 2014-09-08 JP JP2014182003A patent/JP2014236749A/ja active Pending
-
2017
- 2017-03-10 US US15/456,063 patent/US10294509B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001157579A (ja) * | 1998-09-25 | 2001-06-12 | Kikkoman Corp | ヒスタミンデヒドロゲナーゼ及びその製造法 |
| WO2011019072A1 (ja) * | 2009-08-12 | 2011-02-17 | ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ株式会社 | うつ病のバイオマーカー、うつ病のバイオマーカーの測定法、コンピュータプログラム、及び記憶媒体 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CAA00691.1;Bartsch,K. et al;《GenBank》;19930706;第1-1页 * |
| The Metabolism of O-Phosphorylethanolamine in Animal Tissues;FLESHOOD H.L. et al;《The Journal of Biological Chemistry》;19701231;第245卷(第17期);第4414-4420页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2014236749A (ja) | 2014-12-18 |
| US9631224B2 (en) | 2017-04-25 |
| CN106399458A (zh) | 2017-02-15 |
| DK2778233T3 (en) | 2017-03-20 |
| CN103797128A (zh) | 2014-05-14 |
| WO2013069645A1 (ja) | 2013-05-16 |
| JPWO2013069645A1 (ja) | 2015-04-02 |
| US10294509B2 (en) | 2019-05-21 |
| EP2778233A4 (en) | 2015-06-03 |
| EP2778233B1 (en) | 2017-01-11 |
| EP2778233A1 (en) | 2014-09-17 |
| JP5688163B2 (ja) | 2015-03-25 |
| US20160208310A1 (en) | 2016-07-21 |
| US20170198334A1 (en) | 2017-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103797128B (zh) | 乙醇胺磷酸酯的测定方法 | |
| McLean | Advancements toward a systems level understanding of the human oral microbiome | |
| Hou et al. | Complete genome sequence of the extremely acidophilic methanotroph isolate V4, Methylacidiphilum infernorum, a representative of the bacterial phylum Verrucomicrobia | |
| Forbes et al. | Highlighting clinical metagenomics for enhanced diagnostic decision-making: a step towards wider implementation | |
| Ragot et al. | phoD alkaline phosphatase gene diversity in soil | |
| Fischer et al. | Evaluation of 16S rRNA gene primer pairs for monitoring microbial community structures showed high reproducibility within and low comparability between datasets generated with multiple archaeal and bacterial primer pairs | |
| Cabezas et al. | How to use molecular biology tools for the study of the anaerobic digestion process? | |
| McRose et al. | Diversity and activity of alternative nitrogenases in sequenced genomes and coastal environments | |
| Chistoserdova | Methylotrophy in a lake: from metagenomics to single-organism physiology | |
| Pfeiffer et al. | Improved group‐specific primers based on the full SILVA 16 S r RNA gene reference database | |
| Peng et al. | Comparative genomics of molybdenum utilization in prokaryotes and eukaryotes | |
| Hart et al. | Tracking the fate of microbially sequestered carbon dioxide in soil organic matter | |
| Sun et al. | HD-[HD-GYP] phosphodiesterases: activities and evolutionary diversification within the HD-GYP family | |
| Chin et al. | Probes of a role for remote binding interactions on hydrogen tunneling in the horse liver alcohol dehydrogenase reaction | |
| Teigen et al. | Methanogen abundance thresholds capable of differentiating in vitro methane production in human stool samples | |
| CN106479999A (zh) | 一种l‑谷氨酸氧化酶‑cbd融合酶及其表达基因和应用 | |
| Tao et al. | Experimental warming accelerates positive soil priming in a temperate grassland ecosystem | |
| Bennett et al. | Distribution and functional potential of photoautotrophic bacteria in alkaline hot springs | |
| Patra et al. | Complete gammaproteobacterial endosymbiont genome assembly from a seep tubeworm Lamellibrachia satsuma | |
| Colman | Diversity of understudied archaeal and bacterial populations from Yellowstone National Park: from genes to genomes | |
| Li et al. | Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology | |
| Klaes et al. | Analyzing bacterial community compositions by GroEL-taxoproteomics | |
| Sarisky et al. | Investigating the Determinants of Substrate Binding through a Semester-Long, Project-Oriented Biochemistry Laboratory Course | |
| Shanmugam et al. | Ring-opening of the γ-OH-PdG adduct promotes error-free bypass by the Sulfolobus solfataricus DNA polymerase Dpo4 | |
| Shaw | From prediction to function: Polyamine biosynthesis and formate metabolism in the α-and ε-Proteobacteria |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |